DE10229645A1

DE10229645A1 - Zellaufschluss von Bakterien

Info

Publication number: DE10229645A1
Application number: DE10229645A
Authority: DE
Inventors: Frank Prof. Dr. Mayer; Andreas Dr. Schwienhorst
Original assignee: Hempel Rene Dr; KUCHENREUTHER ULRICH; Kuchenreuther Ulrich Dr
Current assignee: Novologix GmbH
Priority date: 2002-07-02
Filing date: 2002-07-02
Publication date: 2004-05-19
Also published as: AU2003249934A8; AU2003249934A1; US20060172407A1; WO2004005506A2; WO2004005506A3; EP1517986A2

Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Substanzen, die an den bakteriellen Elongationsfaktor EF-Tu binden zum Zellaufschluss bzw. zur Lyse von Zellen. Weiterhin betrifft die Erfindung ein Zellaufschlusssystem bzw. ein Zellaufschlussverfahren.

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Substanzen, die an den bakteriellen Elongationsfaktor EF-Tu bin den zum Zellaufschluss bzw. zur Lyse von Zellen. Weiterhin betrifft die Erfindung ein Zellaufschlusssystem bzw. ein Zellaufschlussverfahren.

Zellen, insbesondere Bakterienzellen, werden häufig eingesetzt, um unter Anwendung molekulargenetischer Techniken, beispielsweise durch homologe oder heterologe Genexpression und Expression synthetisch wirksamer Enzyme, Verbindungen zu produzieren. Bevorzugt werden peptidische Verbindungen, Triglyceride, Wachsester und PHAs produziert und insbesondere solche Verbindungen, welche in der Biotechnologie, der Medizin, auf dem Pharmasektor oder in anderen Bereichen Anwendung finden können. Im Falle der heterologen Genexpression sind die gebildeten Verbindungen nicht-natürliche Komponenten der verwendeten Zellen bzw. der verwendeten Bakterien. Die Herstellung von verschiedensten Verbindungen mittels Genexpression ist im Stand der Technik umfangreich beschrieben (siehe z.B. Q. Bi et al., Applied Biochemistry & Biotechnology, 95(1) (2001) 23–30; D. Macmillan et al., Chemistry & Biology, 8(2) (2001) 133–45; J.E. de Oliveira et al., Journal of Chromatography, A, 852(2) (1999) 441–50 und M. Schmidt et al., Journal of Biotechnology, 68(1) (1999), 71–83). Auf diese Weise wurde beispielsweise rekombinantes humanes Erythropoietin, rekombinates humanes Insulin sowie rekombinantes humanes Wachstumshormon hergestellt.

Die Gewinnung der in den Zellen produzierten Verbindungen, insbesondere wenn es sich um intrazellulär synthetisierte Substanzen handelt, bedingt in der Regel, dass die Zellen bzw. Bakterien lysiert werden müssen. Eine solche Lyse ist immer dann zwingend, wenn die gewünschten Verbindungen nicht aus der lebenden Zelle ausgeschleust werden können. In diesem Fall können die gewünschten Verbindungen nur durch Lyse freigesetzt und der weiteren Verarbeitung (down-stream processing) zugeführt werden.

Um eine Lyse der Zellen zu bewirken, können beispielsweise Enzyme, wie etwa Lysozym, zugesetzt werden, welche die Zellhülle lysieren, wobei eine Lyse durch induzierte Lysozym-Expression nicht erreicht werden konnte. Ist die Zellhülle zerstört, kann die Zelle als "aufgeschlossen" gelten (T. R. Hopkins, Bioprocess Technology (New York) 12 (19911, 57–83; J.A. Asenjo et al., Bioprocess Technology (New York) 9 (1990) 143–75). Zur Lyse können auch Verfahren eingesetzt werden, bei denen mechanische Scherkräfte zur Zerstörung der Zellen zur Wirkung kommen. Ein Beispiel für ein solches Verfahren ist die Verwendung einer French Press.

Der Aufschluss von Bakterien in biotechnologischen Produktionsprozessen stellt einen erheblichen Kostenfaktor dar. Zudem treten bei den bekannten Zellaufschlussverfahren oftmals störende Nebeneffekte auf, wie beispielsweise starke Proteolyse oder das überstarke Vorhandensein von Zelltrümmern.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es deshalb, ein verbessertes Verfahren für einen Zellaufschluss bereitzustellen, insbesondere ein Verfahren, welches in biotechnologischen Produktionsprozessen vorteilhaft eingesetzt werden kann.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch die Verwendung von Substanzen, die an Bestandteile des Cytoskeletts, insbesondere an EF-Tu binden zum Zellaufschluss.

Die Entdeckung der Existenz eines bakteriellen Cytoskeletts und die Charakterisierung von Bestandteilen davon, insbesondere die Charakterisierung des Elongationsfaktors EF-Tu als einem strukturell bedeutsamen Protein für dieses Cytoskelett öffnen den Weg für ein neues System für den Zellaufschluss, insbesondere den Zellaufschluss von Bakterien. Damit wird erfindungsgemäß eine Alternative zu konventionellen Zellaufschlussverfahren bereitgestellt. Durch Destabilisierung des Cytoskeletts kann die Zellhülle zerstört und somit eine Lyse der Zellen bewirkt werden.

Erfindungsgemäß bevorzugt werden zur Destabilisierung des Cytoskeletts Substanzen verwendet, die an EF-Tu binden.

Das bakterielle Protein EF-Tu enthält die Domänen 1, 2 und 3 (H. Song et al., J. Mol. Biol. 285 (1999) 1245–1256). Die Sequenzen des Proteins EF-Tu und seines codierenden Gens sind für Escherichia coli und eine Reihe anderer Eu-Bakterien publiziert und in Datenbanken zugänglich. EF-Tu ist ein Protein, welches drei Domänen enthält. Von den 394 Aminosäuren, welche EF-Tu (von E.coli) umfasst, gehören zur Domäne 1 die Aminosäuren 8 bis 204, wobei die Aminosäuren 172 bis 204 eine Verbindungsstruktur zur Domäne 2 bilden. Zur Domäne 2 gehören die Aminosäuren 205 bis 298 und zur Domäne 3 gehören die Aminosäuren 299 bis 394.

Erfindungsgemäß wurde überraschenderweise festgestellt, dass man beim bakteriellen Cytoskelett durch Hemmung des Self-Assembly von EF-Tu-Fibrillen eine Destabilisierung und in der Folge eine Lyse der Zellen erreichen kann.

EF-Tu ist ein 3-Domänen-Protein, wie in 1 dargestellt. Die Protofilamente des Cytoskeletts entstehen in der lebenden Zelle dadurch, dass die Domänen 2 und 3 von EF-Tu-Proteinen (Monomer oder integriert in ein Protofilament und nur transient frei) mit den Domänen 3 und 2 benachbarter EF-Tu-Proteine wechselwirken. Durch Ausbildung spezifischer nicht-kovalenter Bindungen, wobei Domäne 2 des einen EF-Tu mit Domäne 3 des benachbarten EF-Tu wechselwirkt, während eines self assembly Prozesses entstehen auf diese Weise Ketten, sogenannte Protofilamente, welche sich zu einem Netzwerk verbinden (vgl. 2). Mit diesem Netzwerk können weitere Faktoren assoziiert sein, wie z.B. FtsZ, MreB oder/und M6I.

Stabilität und/oder Ausprägung solcher Protofilamente und Netzwerke in Bakterienzellen können erfindungsgemäß unterbunden werden, wobei als Folge der Tod der Bakterienzelle durch Lyse eintritt.

Eine besonders vorteilhafte Vorgehensweise der Erfindung ist wie folgt. Der DNA-Abschnitt des EF-Tu-Gens von Escherichia coli, welcher für die Domäne 3 codiert, wird gewonnen und mittels molekulargenetischer Techniken in E.coli-Zellen transferiert und exprimiert. Neben diesem rekombinanten Abschnitt, welcher ausschließlich die Domäne 3, nicht aber die Domänen 1 und 2 von EF-Tu enthält, verfügen die Zellen nach wie vor über das native EF-Tu-Gen und können es exprimieren. Die zusätzlich synthetisierten Domäne 3-Polypeptide konkurrieren jedoch mit den nativen EF-Tu-Proteinen um die Bindungsplätze für die Ausbildung der Protofilamente. Wird ein Domäne-3-Polypeptid anstelle eines nativen EF-Tu-Proteins als Kettenglied eingebaut, führt dies aufgrund des Fehlens der zweiten Bindestelle (die Domäne 2 ist für die Kettenbildung unabdingbar) am Domäne-3-Polypeptid zum Kettenabbruch. Das Protofilament wächst nicht weiter, das cytoskelettale Netzwerk wird geschwächt und kollabiert schließlich. Als Folge des Verlustes der Integrität des Cytoskelettes verliert die cytoplasmatische Membran der Zelle ihre Aufhängung. Die cytoplasmatische Membran ist, wie aus 4 ersichtlich, am Cytoskelett aufgehängt. Dadurch wird die Zellwand, die in der lebenden Bakterienzelle durch die cytoplasmatische Membran positioniert und gestützt wird, zerstört (siehe 5). Der Verlust von Zellwand und cytoplasmatischer Membran bedeutet eine Exposition des Zellinhalts, sodass die Zelle lysiert ist (vgl. 5 und 6). Der Zellinhalt kann somit ohne weiteren Zellaufschluss gewonnen werden.

Zellen, welche für biotechnologische Produktionsprozesse eingesetzt werden, wie etwa heterologe Expression, Produktion von Proteinen, insbesondere für biotechnologische oder medizinische Zwecke, können somit aufgeschlossen werden, indem man in sie vor ihrem Einsatz für die Produktion eine Sequenz einbringt, welche für die der Zellen-Species entsprechende Domäne des EF-Tu codiert.

In einer bevorzugten Ausführungsform enthalten die zum Zellaufschluss verwendeten Substanzen Anteile, die im Bereich der Aminosäuren 218 bis 224 von Domäne 2 und/oder im Bereich der Aminosäuren 317 bis 328 oder/und 343 bis 354 von Domäne 3 an EF-Tu binden. Innerhalb der Domänen 2 und 3 treten unterschiedliche Sekundärstrukturen auf. Von besonderem Interesse sind dabei die Aminosäuresequenzen von 317 bis 328 und von 343 bis 354, welche in Domäne 3 liegen und Schleifen bilden, die frei in den Raum ragen und Kandidatensequenzen für eine Wechselwirkung mit Aminosäuresequenzen sind, welche in einer entsprechend positionierten Eindellung an der Peripherie von Domäne 2 liegen, wobei diese Sequenzen von Aminosäuren 218 bis 224 reichen.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden intrazellulär exprimierte peptidische Substanzen eingesetzt, welche auf Oligopeptiden basieren, welche an EF-Tu, vorzugsweise im Bereich der Passungsstellen der Domänen 2 oder/und 3 binden. Diese Oligopeptide können Teilabschnitte der Aminosäuresequenzen der Domänen 2 oder/und 3 mit einer Länge von vorzugsweise 4 bis vorzugsweise 20 Aminosäuren, besonders bevorzugt 5 bis 15 Aminosäuren und insbesondere bevorzugt mit einer Länge von 6 bis 12 Aminosäuren enthalten.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthalten die Substanzen Teilabschnitte oder den Gesamtbereich der Aminosäuresequenzen aus der Domäne 3 mit einer Länge von mindestens 4 und insbesondere mindestens 5 Aminosäuren und der gleichzeitig keinem Abschnitt der Aminosäuresequenzen aus der Domäne 2 entspricht.

Neben intrazellulär exprimierten peptidischen Verbindungen können auch intrazellulär exprimierte Peptidomimetika vorteilhafterweise eingesetzt werden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Aufschluss von Zellen, bei dem man in den Zellen Bestandteile des Cytoskeletts destabilisiert. Cytoskelettale Elemente, die verändert werden können, um eine Schwächung des Cytoskeletts zu bewirken, umfassen beispielsweise FtsZ, MReB, MbI und kontraktile Proteine und insbesondere EF-Tu.

Besonders bevorzugt werden bei diesem Verfahren Substanzen eingesetzt, welche an Bestandteile des Cytoskeletts, insbesondere an EF-Tu binden und hierin zuvor erläutert sind.

Die Erfindung kann besonders vorteilhaft angewendet werden in einem Verfahren zur Herstellung einer Verbindung, beispielsweise eines Proteins, indem man Zellen verwendet, in welchen dieses Protein, beispielsweise durch einen biotechnologischen Produktionsprozess exprimiert wird und indem man in diese Zellen zuvor eine Sequenz einbringt, die für eine Substanz codiert, welche Bestandteile des Cytoskeletts der Zellen destabilisiert. Die bei einer herkömmlichen biotechnologischen Prozessführung zur Gewinnung der gebildeten Verbindungen in gentechnisch manipulierten Bakterien üblicherweise erforderliche Lyse kann hier mit dem hierin beschriebenen Zellaufschluss durchgeführt werden. Vorteilhaft ist, dass der Zellaufschluss zu einem genau definierten Zeitpunkt durchgeführt werden kann. Ein Indikator hierfür kann das Erreichen der gewünschten Zelldichte (quorum sensing) sein. Eine Induktion der Lyse durch quorum sensing erfolgt dadurch, dass die Zellkultur in ihrem Wuchsverhalten kontrolliert wird und bei Feststellung, dass der gewünschte Zustand der Zellkultur erreicht ist, das eingebrachte Gen exprimiert wird.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird in die Zellen ein Konstrukt eingebracht, welches neben dem Gen für die destabilisierende Substanz weitere codierende Sequenzen enthält, die es erlauben, den Beginn der Synthese der Substanz, beispielsweise des Domäne-3-Polypeptids von außen zu induzieren. Auf diese Weise ist es möglich, den Zeitpunkt der Zell-Lyse in der Zellkultur von außen exakt zu steuern.

Die Induktion durch einen quorum-gekoppelten oder/und Zellkultur-autarken Prozess ist eine weitere geeignete Form zur Einleitung der Zell-Lyse.

Die Erfindung umfasst weiterhin ein Konstrukt, umfassend eine Sequenz, welche für eine Bestandteile des Cytoskeletts von Zellen destabilisierende Substanz codiert. Dieses Konstrukt umfasst bevorzugt weiterhin mindestens einen Genabschnitt, welcher die Induktion der Synthese der das Cytoskelett destabilisierenden Substanz erlaubt.

Vorteilhafte Auslegungen des Konstrukts sind in 7 dargestellt. Sobald die Induktion erfolgt ist, wird innerhalb einer Zellgeneration durch das Zusammenspiel von EF-Tu, Domäne-3-Polypeptid, cytoplasmatischer Membran und Zellwand die Lyse der Zellen herbeigeführt.

Die Erfindung wird durch die beigefügten Figuren und die nachfolgenden Beispiele weiter erläutert.

In den Figuren zeigt:

1
a) EF-Tu (GDP-Form aus E.coli; Ergebnis einer Röntgenstrukturanalyse; Abbildung aus der Literatur entnommen und modifiziert). Die 3 Domänen des Proteinmoleküls sind markiert. A' und b bezeichnen Verbindungssequenzen
b) Wie a), jedoch andere Form der Darstellung. Die Zahlen markieren die Positionen der Aminosäure-Reste; N-Terminus und C-Terminus sind angegeben.

2,
a) EF-Tu-Molekül
b) und c) Prinzip der "Kettenbildung" (Self-Assembly von EF-Tu-Monomeren zu Protofilamenten). Die Bindung erfolgt durch Kontakt zwischen den Domänen 2 und 3 benachbarter Moleküle
d) Elektronenmikroskopische Abbildung eines solchen Protofilaments, isoliert aus dem Bakterium Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum
e) Netzwerk, bestehend aus Protofilamenten. Elektronenmikroskopische Aufnahme eines aus dem Bakterium Th. Thermosaccharolyticum isolierten Netzwerks. Die schwarzen Punkte sind für Markierungszwecke eingesetzte Gold-Marker.

3
Es sollen EF-Tu-GFP-His-Fusionsklone generiert werden. Idealer Fusionspunkt bei EF-Tu ist der C-Terminus, der zwischen Domäne 2 und 3 hervorragt (Song et al., 1999). Der gleiche Fusionspunkt kann auch für ein Domäne-3-Fusionskonstrukt gewählt werden. Das Domäne-3-Fusionskonstrukt kann für in vivo-Kompetitionsexperimente eingesetzt werden. Dabei scheint es sinnvoll, für chemische Labeling-Alternativen ein C-terminales Cystein (das einzige in Domäne 3) einzuführen.

Ausgangspunkt ist genomische DNA eines E.coli-K-12-Stammes. Im Hinblick auf mögliche, spätere Experimente in vitro erscheint es sinnvoll, alle Konstrukte auch mit His-Tag zu versehen.
(a1) Einführung eines His-Tag in die BsrGI/EcoRI-Schnittstellen des Vektors pEGFP
(a2) Einführung des EF-Tu-Gens in die HindIII/NcoI-Schnittstellen des Vectors pEGFP(His)
(a3) Einführung des Domäne-3-Genabschnitts in die HindIII/NcoI-Schnittstellen des Vektors pEGFP(His)
(b1) Basensequenz des Konstruktes pEGFP-EF-Tu-His am Beispiel des Klons HE1 (SEQ ID NO:1)
(b2) Basensequenz des Konstruktes pEGFP-Domäne3-His am Beispiel des Klons HD1 (SEQ ID NO:2)

4
"Aufhängung" der cytoplasmatischen Membran (CM) bei dem wandlosen Bakterium Mycoplasma pneumoniae. Elektronenmikroskopische Aufnahmen.
a) Unbehandeltes Bakterium. Der Pfeil deutet auf die CM
b), c), d) Nach Ablösen der CM (durch ein Detergenz) wird erkennbar, dass die CM an Stützen ("stalks") aufgehängt war, welche ihrerseits dem peripheren Teil des Cytoskeletts aufsitzen. Wird dieser Teil des Cytoskeletts geschwächt oder zerstört, verlieren die "stalks" ihre feste Verankerung und die CM kollabiert.

5
Versuche mit E.coli. Elektronenmikroskopische Aufnahmen, Negativkontrastierung
a) Intakte Bakterienzellen, enthaltend ihr Chromosom und zusätzlich einen Leervektor (Plasmid), welcher in weiterführenden Versuchen als Vektor zum Einbringen des Domäne-3-Genabschnitts verwendet wurde. Diese Zellen stellen also Kontrollen dar.
b) Zellen einer jungen Kultur. In diese Zellen war vor Beginn der Kultivierung zusätzlich zum eigenen nativen Chromosom (welches ja das Gen enthält, welches intaktes EF-Tu codiert) ein Plasmid eingebracht worden, welches in exprimierbarer Form den Genabschnitt enthält, weicher für Domäne-3 von EF-Tu codiert. Der Effekt der Expression dieses "truncated" Gens ist deutlich zu sehen: Neben einigen intakt erscheinenden Zellen (sie sind bei genauerer Analyse als bereits in ihrer Zellhülle geschwächt erkennbar), wird das Bild bestimmt durch Zellreste, welche noch die ursprüngliche Zellform erkennen lassen, jedoch weder Wand noch CM besitzen. Wand und CM haben durch die Destabilisierung des Cytoskeletts ihre Aufhängung verloren. Der Zellinhalt ist exponiert. Ein solcher Zustand wird gemeinhin als "aufgeschlossen" bezeichnet.
c) Endstadium der Auflösung der Zellen (alte Kultur). Eine ehemalige Zellform ist nicht mehr erkennbar; die Zellreste bilden unorganisierte Aggregationen

6
Versuche mit E.coli. Elektronenmikroskopische Aufnahmen
a) Endstadium der Auflösung der Zellen einer Kultur, in denen Domäne 3 von EF-Tu zusätzlich zum zelleigenen EF-Tu exprimiert wurde; Ultradünnschnitt (vgl. 5b)und c))
b) Kontrolle: Zelle mit Leervektor; die Zelle ist intakt (vgl. 5a))
c) Kontrolle: In der Zelle wurde zusätzlich zum zelleigenen EF-Tu noch per genetic engineering eingebrachtes EF-Tu exprimiert; die Zelle ist intakt

7
Chromosomale Integration eines möglichen Konstrukts der Domäne 3 von Ef-Tu mit regulierbarem Promotor und Resistenzmacker unter Zuhilfenahme der Attachment sites des Phagen Lambda. Promotor und Resistenz können je nach Bedarf auch in anderen Kombinationen eingesetzt werden.
Att attachment sites
Spec R Spektinomycin-Resistenz
LacI Repressor
P_LIacO-1 modifizierter Lac-Promotor (nach LUTZ und BUJARD, 1997)

Als Alternativen zum angegebenen Promotor können beispielsweise auch die Promotoren ara, T7 oder bdA (quorum sensing) eingesetzt werden.

Beispiele

Beispiel 1

Ablauf von der Klonierung bis zur Expression und Aufreinigung der Konstrukte EF-Tu-His bzw. Domäne 3-His (schematisiert):

i . Präparation der genomischen DNA von E.coli XL1-Blue (K12-Derivat)
2. PCR mit den entsprechenden Primern zur Hochverstärkung der Volllängenprodukte
3. Identifizierung und Aufreinigung der PCR-Volllängenprodukte
4. Restriktionsverdau der PCR-Produkte und des Zielvektors
5. Ligation der PCR-Produkte in den Zielvektor
6. Elektroporation der ligierten Plasmid-DNA in den Stamm XL1-Blue
7. Identifizierung der Klone mit dem richtigen Insert durch Restriktionsverdau und Sequenzanalyse
8. Sicherung der Klone als Kryokulturen
9. Ausplattierung der Klone auf Selektionsagar (hier: LB/Ampicillin) und Anzucht über Nacht bei 37 °C
10. Animpfen einer 50 ml LB/Ampicillin-Flüssigkultur, Inkubation über Nacht bei 37 °C
11. Animpfen einer 1 l LB/Ampicillin-Flüssigkultur, Inkubation bei 37 °C bis zu einer OD600 von ca. 0,5 bis 0,7, Induktion mit IPTG für mindestens 4 h
12. Zellernte
13. Homogenisierung durch Druck/Ultraschall
14. Abzentrifugieren der Zelltrümmer
15. Aufreinigung des so geklärten Zelllysats über IMAC-Säulen IPTG Isopropylthiogalaktosid IMAC Ion Metal Affinity Cromatographie

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verwendung von Substanzen, die an Bestandteile des Cytoskeletts, insbesondere an EF-Tu binden, zum Zellaufschluss.
Verwendung nach Anspruch 1 zum Zellaufschluss von Bakterienzellen.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanzen im Bereich der Domäne 2 (Aminosäuren 205 bis 298) oder/und der Domäne 3 (Aminosäuren 299 bis 349) an EF-Tu binden.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanzen im Bereich der Aminosäuren 218 bis 224 von Domäne 2 oder/und im Bereich der Aminosäuren 317 bis 328 oder/und 343 bis 354 von Domäne 3 an EF-Tu binden.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanzen Teilabschnitte der Aminosäuresequenzen aus den Domänen 2 oder/und 3 mit einer Länge von mindestens vier Aminosäuren enthaften.
Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Teilabschnitte eine Länge von 5 bis 15 Aminosäuren, insbesondere von 6 bis 12 Aminosäuren aufweisen.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanzen die Domäne 3 von EF-Tu und keine weitere Domäne von EF-Tu enthalten.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanzen ausgewählt werden aus linearen oder cyclischen peptidischen Verbindungen oder Peptidomimetika.
Verfahren zum Aufschluss von Zellen, dadurch gekennzeichnet, dass man in den Zellen Bestandteile des Cytoskeletts destabilisiert.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Destabilisierung Substanzen einsetzt, welche an Bestandteile des Cytoskeletts binden.
Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass man Substanzen, die an EF-Tu binden einsetzt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 1 1, dadurch gekennzeichnet, dass man Substanzen einsetzt, die im Bereich der Domäne 2 (Aminosäuren 205 bis 298) oder/und der Domäne 3 (Aminosäuren 299 bis 394) an EF-Tu binden, insbesondere im Bereich der Aminosäuren 218 bis 224 von Domäne 2 oder/und im Bereich der Aminosäuren 317 bis 328 oder/und 343 bis 354 von Domäne 3.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass man Substanzen einsetzt, welche Teilabschnitte der Aminosäuresequenzen aus den Domänen 2 oder/und 3 mit einer Länge von mindestens 4 Aminosäuren, insbesondere von mindestens 5 Aminosäuren enthalten.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass Nukleinsäuren in die Zellen eingebracht werden, die für die das Cytoskelett destabilisierenden Substanzen codieren.
Verfahren zur Herstellung einer Verbindung, dadurch gekennzeichnet, dass man Zellen verwendet, in welche eine Sequenz eingebracht worden ist, codierend für eine Verbindung, welche Bestandteile des Cytoskeletts der Zellen destabilisiert, die Zellen kultiviert und so die gewünschte intrazelluläre Verbindung gewinnt.
Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass man die gewünschte Verbindung durch Kultivierung der Zellen intrazellulär produziert und in einem zweiten Schritt eine Lyse der Zellen durch Induktion der Expression der das Cytoskelett destabilisierenden Verbindung. bewirkt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16, dadurch gekennzeichnet, dass die gewünschte Verbindung durch heterologe Expression gebildet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16, dadurch gekennzeichnet, dass die gewünschte Verbindung durch homologe Expression gebildet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Induktion durch quorum sensing erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die für eine das Cytoskelett der Zellen destabilisierende Verbindung codierende Sequenz in einem Konstrukt in die Zellen eingebracht wird, wobei das Konstrukt weitere Regionen enthält, die eine Induktion der Synthese der Verbindung erlauben.
Konstrukt, umfassend eine Sequenz, welche für eine Bestandteile des Cytoskeletts von Zellen destabilisierende Verbindung codiert.
Konstrukt nach Anspruch 21, weiterhin umfassend einen Genabschnitt, welcher die Induktion der Synthese der das Cytoskelett destabilisierenden Verbindung erlaubt.