DE10224824A1 - Verfahren zur Analyse von Target-Nukleinsäuresequenzen - Google Patents

Abstract

Verfahren zur Analyse von Target-Nukleinsäuremolekülen, bei dem markierte Oligonukleotidsonden mit unterschiedlichen Sequenzen unter Hybridisierungsbedingungen mit an definierten Trägern oder in definierten Bereichen von Trägern immobilisierten als Einzelstrang vorliegenden Nukleinsäuremolekülen in Kontakt gebracht werden, und dann überprüft wird, an welchen Trägern bzw. in welchen Bereichen eines Trägers eine Hybridisierung der Oligonukleotidsonden an die immobilisierten Nukleinsäuremoleküle erfolgt ist, wobei an einem definierten Träger bzw. in einem definierten Bereich eines Trägers immer eine Vielzahl von Nukleinsäuremolekülen mit mindestens teilweise übereinstimmender Sequenz immobilisiert ist und die immobilisierten Nukleinsäuremoleküle den Target-Nukleinsäuremolekülen bzw. Abschnitten davon entsprechen, wobei Oligonukleotidsonden eingesetzt werden, die in Abhängigkeit von ihrer Bindungsstärke mit unterschiedlichen Markierungen versehen sind.

Description

• Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren nach dem Oberbegriff des Anspruches 1.
• Gattungsgemäße Verfahren kommen insbesondere dort zur Anwendung, wo immobilisierte, in der Regel überwiegend als Einzelstrang vorliegende Nukleinsäuremoleküle unter Hybridisierungsbedingungen mit markierten Oligonukleotidsonden in Kontakt gebracht werden.
• Generell sind bei solchen oder auch weiteren unter die Erfindung fallenden Verfahren immer eine Vielzahl von Nukleinsäuren mit wenigstens teilweise übereinstimmender Sequenz in einem definierten Bereich eines Trägers immobilisiert. Die immobilisierten Nukleinsäuremoleküle haben in der Regel eine Basensequenz, die einer Target-Nukleinsäuresequenz bzw. Abschnitten davon entspricht.
• Der Bereich eines Trägers, in dem die Nukleinsäuremoleküle immobilisiert sind, wird im weiteren auch als Spot bezeichnet werden.
• Denkbar ist aber auch, daß Nukleinsäuremoleküle mit übereinstimmender Sequenz jeweils auf einem Träger, z. B. einem Bead oder dergleichen immobilisiert sind.
• Wie oben erwähnt, werden bei gängigen Verfahren die immobilisierten Nukleinsäuremoleküle mit markierten Oligonukleotidsonden in Kontakt gebracht. In der Regel wird eine Vielzahl unterschiedlicher Oligonukleotidsonden eingesetzt, die jeweils unterschiedliche Basensequenzen aufweisen. Bei bekannten Sequenzierungsverfahren werden unterschiedliche Oligonukleotidsonden mit allen statistisch möglichen Basensequenzen gleicher Länge eingesetzt. Die Nukleinsäuremoleküle können dabei chemisch auf dem Träger immobilisiert werden. Insbesondere bei z. B. Oligonukleotid-Ligationsassays können aber auch Träger eingesetzt werden, an die kurze Oligonukleotidsonden gekoppelt sind. Hier erfolgt die Immobilisierung der Nukleinsäuremoleküle über Hybridisierung an die entsprechenden Oligonukleotidsonden.
• Nach Inkubation der immobilisierten Nukleinsäuremoleküle mit den markierten Sonden wird überprüft, in welchen Bereichen des Trägers bzw. an welchen Trägern eine Markierung nachweisbar ist. In diesen Bereichen hat eine Hybridisierung zwischen den immobilisierten Nukleinsäuremolekülen und den markierten Oligonukleotidsonden stattgefunden.
• Abhängig von den Verfahren kann dann mittels z. B. Kombinatorik oder anderer bekannter Verfahren die weitere Auswertung, z. B. eine Sequenzierung, vorgenommen werden.
• Problematisch an dem bekannten Verfahren ist allerdings, daß nicht immer sicher gestellt ist, daß in den markierten Spots tatsächlich eine hundertprozentig komplementäre Hybridisierung stattgefunden hat. Der Grund dafür ist, daß Hybridisierungen in Abhängigkeit von den Basenzusammensetzungen der beteiligten hybridisierenden Sequenzen deutlich unterschiedlichen Bindungskinetiken folgen können. Die Bindungsstärke, im allgemeinen charakterisiert durch die Schmelztemperatur (Tm), der eingesetzten Sonden hängt von dem Verhältnis der Basen Guanin und Cytosin (GC-Anteil) zu den Basen Adenosin und Thymidin (AT- Anteil) ab. Ist der GC-Anteil hoch, so weisen die Sonden eine hohe Bindungsstärke auf. Ist dagegen der AT-Anteil hoch, so ist die Bindungsstärke geringer. Weiterhin spielt die Sequenzanalyse in der unmittelbaren Umgebung der Paarungsbasen eine Rolle, da zum Teil Sekunkärstrukturen ausgebildet sind oder Stabilisierungseffekte verursachen.
• Übliche Verfahren werden bei einer Hybridisierungstemperatur durchgeführt und es wird in Kauf genommen, daß die meisten der Hybridisierungsreaktionen nicht unter optimalen Temperaturbedingungen ablaufen. Die Folge ist, daß es zu den oben beschriebenen nicht hundertprozentig stringenten Hybridisierungen kommen kann, die eine Auswertung erschweren bzw. die Ergebnisse verfälschen.
• Diesem Problem kann z. B. dadurch begegnet werden, daß man die Hybridisierungen in einem Temperaturgradienten durchführt, wie z. B. in "nature biotech ology, Vol. 20 April 2002" beschrieben. Ein solches Verfahren ist jedoch relativ aufwendig.
• Aufgabe der Erfindung ist es, ausgehend von dem Stand der Technik ein Verfahren zu schaffen, mit dem sich in einfacher Weise dem obigen Problem begegnen läßt.
• Gelöst wird die Aufgabe mit einem Verfahren, das die kennzeichnenden Merkmale des Anspruches 1 aufweist.
• Erfindungsgemäß ist vorgesehen, daß die Oligonukleotidsonden in Abhängigkeit von ihrer Bindungsstärke mit unterschiedlichen Markierungen versehen sind.
• Es sind dabei alle gängigen Markierungen geeignet, wie z. B. Fluoreszenz-, Chemolumineszenz- oder Radioaktivmarkierungen bzw. Kombinationen solcher Markierungen, um nur einige Beispiele zu nennen. Denkbar sind selbsverständlich auch indirekt nachweisbare Markierungen wie z. B. Enzyme oder dergleichen.
• Eine besonders bevorzugte Ausgestaltung sieht vor, daß die Oligonukleotidsonden in mindestens zwei Untergruppen mit jeweils unterschiedlichen Markierungen aufgeteilt werden, wobei eine der Gruppen bindungsstärkere und die andere der Gruppen bindungsschwächere Sonden umfasst. Bevorzugt ist vorgesehen, daß beide Gruppen im wesentlichen ähnliche Sonden enthalten, also daß sich z. B. die in einer Gruppe enthaltenen Sonden jeweils nur in einer bzw. wenigen Basen bzw. z. B. bis zu 10% der Basenfolge von einer bzw. mehreren Sonden der anderen Gruppe unterscheiden.
• Die Differenzierung in bindungsstarke und bindungsschwache Sonden kann wie oben angesprochen z. B. über ihren Anteil der Basen Guanin und Cytosin (GC- Anteil) erfolgen. Die eine Gruppe würde demnach Sonden mit hohem GC-Anteil, die andere Gruppe Sonden mit hohem AT-Anteil umfassen.
• Wird das erfindungsgemäße Verfahren mit z. B. zwei Untergruppen unterschiedlich markierter Oligonukleotidsonden durchgeführt, so können zwei unterschiedliche gut zu detektierende Bindungsereignisse auftreten.
• In dem einen Fall beobachtet man in einem Spot ein einheitliches Signal, das ausschließlich von einer der beiden Markierungen herrührt. In diesem Fall ist davon auszugehen, daß die Hybridisierung in diesen Spots mit den jeweils beteiligten Sonden stringent erfolgt ist.
• Beobachtet man dagegen in einem Spot ein Mischsignal aus beiden Markierungen, so muß davon ausgegangen werden, daß hier zwei Sonden mit unterschiedlicher Bindungsstärke an die immobilisierten Nukleinsäuremoleküle hybridisiert haben. In der Regel kann dann davon ausgegangen werden, daß die Sonde mit der höheren Bindungsstärke diejenige ist, die nicht hundertprozentig paßt und man wird bei der Auswertung das Signal der Sonde mit der geringeren Bindungsstärke zugrundelegen.
• Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt damit auf einfache Weise eine eindeutige Auswertung unklarer Bindungsereignisse, die bislang in gattungsgemäßen Verfahren über zusätzliche Hybridisierungen erkannt bzw. ausgeschlossen werden mußten.
• Solche unklaren Bindungsereignisse können z. B. bei der in der EP 1164201 beschriebenen "Reverse-Array-Technik", bei dem "Sequencing by Hybridisation" (SBH)- Verfahren, bei Arrays zur "Single Nucleotide Polymorphism" (SNP)- Detektion bzw. Arrays zur Untersuchung homologer Sequenzen verschiedener Arten auftreten, um nur einige Beispiele zu nennen.
• Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann man dagegen einfache Auswerteregeln aufstellen, die eine sicherere Interpretation der Bindungsereignisse ermöglichen.
• Insbesondere von Vorteil ist das erfindungsgemäße Verfahren bei der Untersuchung von Polymorphismen, die bislang im wesentlichen z. B. mittels des relativ aufwendigen in der US 5,487,985 beschriebenen Primer-Extension-Verfahrens oder mit Hybridisierungen, die einen zusätzlichen Ligationsschritt beinhalten (Oligonukleotid-Ligationsassays), erfolgten.
• Auch gattungsgemäße Sequenzierungsverfahren, die Oligonukleotidsonden mit allen statistisch möglichen Basensequenzen verwenden, werden aus Kostengründen häufig als Oligonukleotid-Ligationsassays konzipiert. Dabei werden z. B. statt Oligonukleotidsonden mit einer Länge von 10 Basen (Dekamere) Sonden mit jeweils 5 Basen (Pentamere) eingesetzt. In einem ersten Schritt werden die Nukleinsäuremoleküle durch Hybridisierung mit einem ersten Satz trägergekoppelter Pentamere immobilisiert. Dann wird in Gegenwart von Ligase mit einem zweiten Satz markierter Pentamere inkubiert und aus nachgewiesenen Markierungen in Parallelverfahren mit anders belegten Arrays über Kombinatorik auf die Sequenz der Nukleinsäuremoleküle geschlossen. Zu Einzelheiten wird z. B. auf die WO 96/17957 verwiesen. Hauptvorteil des beschriebenen Verfahrens ist, daß anstelle von 410 Oligonukleotidsonden (beim Einsatz von Dekameren) nur jeweils 45 verschiedene Varianten des unmarkierten und des markierten Oligonukleotidsondentyps (beim Einsatz von Pentameren) synthetisiert werden müssen, um bei einer Sequenzlänge von 10 Basen alle möglichen Sequenzen zu erfassen.
• Gerade bei dieser Methode erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren eine direkte Hybridisierung und anschließende Detektion. Eventuelle fehlerhafte Hybridisierungen können dabei sofort erkannt und bei der Interpretation der Ergebnisse berücksichtigt werden.
• Die Durchführung der Erfindung z. B. bei der eindeutigen Hybridisierung von drei Nukleinsäuremolekülen ist wie folgt möglich:
  Immobilisierte Nukleinsäuremoleküle 1, 2 und 3 mit den folgenden Sequenzen befinden sich in verschiedenen Spots auf einem Array:
  
  
  
• Die Nukleinsäuremoleküle 1 und 2 unterscheiden sich an drei Positionen (Basen 5, 6 und 12). Die Nukleinsäuremoleküle 1 und 3 unterscheiden sich ebenfalls an drei Positionen (Basen 5, 6 und 12). Die Nukleinsäuremoleküle 2 und 3 unterscheiden sich nur an Base 5.
• Es werden in einem Beispiel 3 Oligonukleotidsonden (1-3) eingesetzt, die jeweils zu den vollständigen Nukleinsäuremolekülen (Basen 1-20) komplementär sind. In zwei weiteren Beispielen werden Oligonukleotid-Ligationsassays beschrieben, in denen 6 Oligonukleotidsonden eingesetzt werden, die jeweils zu den Bereichen 1-10 und 11-20 komplementär sind. Diese Sonden werden mit 1' (Basenbereich 1-10 der Oligonukleotidsonde 1) und 1" (Basenbereich 11-20 der Oligonukleotidsonde 1) etc. bezeichnet.
• Bei 50 mM Salzkonzentration liegen die errechneten Tm-Werte nach SantaLucia et al. (1996) für Hybridisierungsreaktionen des Nukleinsäuremoleküls 1 bei 52,2°C, des Nukleinsäuremoleküls 2 bei 52,1°C und des AT-ärmeren Nukleinsäuremoleküls 3 bei 54,6°C.
• In der Ausgestaltung des Anspruchs 2 würden damit die komplementären Sonden 1, 1' und 2, 2' für die Nukleinsäuremoleküle 1 und 2 in eine Gruppe und die für das Nukleinsäuremolekül 3 komplementären Sonden 3, 3' in die andere Gruppe eingeordnet.
• Wenn man ein Hybridisierungsexperiment mit vollständigen markierten Oligonukleotidsonden 1-3 durchführt, so erhält man bei 52,0-52,5°C Hybridisierungstemperatur (und 50 mM Salzkonzentration) folgende Hybridisierungssignale (+ bedeutet Hybridisierung, - bedeutet keine Hybridisierung):
  
  
  
• In Anwesenheit des Oligonukleotidsonde 3 ist stets gleichzeitig ein Signal an den Positionen von Nukleinsäuremolekül 2 und 3 zu finden, ungeachtet der Tatsache, ob die Oligonukleotidsonde 2 ebenfalls in der Sondenmolekülpopulation vorhanden ist, denn die Oligonukleotidsonde 3 bindet wegen der zu geringen Hybridisierungstemperatur nicht stringent, so daß es zu fehlerhaften Signalen kommt. Diesen Fehler kann man bei einheitlich markierten Sonden allerdings nur dann entdecken, wenn man die Oligonukleotidsonden jeweils einzeln mit einem Array inkubiert, was in Praxis nicht gemacht wird.
• Bei Durchführung eines Experimentes zum Nachweis derselben Nukleinsäuremoleküle auf dem Wege eines Oligonukleotid-Ligationsassays mit Vorlage der unmarkierten Oligonukleotidsonden 1"-3", und anschließender Zugabe von mit fluoreszenzgelabelten Cytosin (Cy3) markierten Oligonukleotidsonden 1'-3', die den ersten 10 Basen (1-10) der Nukleinsäuremoleküle 1 bis 3 entsprechen, erhält man nach Ligation bei 52,0-52,5°C Hybridisierungstemperatur und 50 mM Salzkonzentration dieselben Ergebnisse.
• Erfindungsgemäß kann man nun bei dem gleichen Oligonukleotid-Ligationsassay die geschilderten Nachteile verhindern, wenn man die Oligonukleotidsonden 1' und 2' mit Cy3 und die Sonde 3' mit einem anders fluoreszenzgelabelten Cytosin (Cy5) markiert. Man erhält dann folgende, bei gleichzeitiger Zugabe der Sonden einwandfrei differenzierbare Hybridisierungssignale.
  
  
• Das Vorhandensein eines Signals von ausschließlich Cy5 auf der Position von Nukleinsäuremolekül 2 bedeutet eine Fehlpaarung, so dass geschlossen werden kann, daß nur komplementäre Sequenzen zu Oligonukleotidsonde 3' vorhanden ist, während das gleichzeitige Vorhandensein eines Signals von Cy5 und Cy3 an Position 2 das Vorhandensein komplementärer Sequenzen zu Oligonukleotidsonde 2' bei gleichzeitigem Vorliegen komplementärer Sequenzen zu Oligonukleotidsonde 3' (Signal an Position von Nukleinsäuremolekül 3) zeigt. Literatur SantaLucia, Jr., J. S, Allawi, H. T., Seneviratne, P. A. (1996) "Improved nearest-neighbor parameters for predicting DNA duplex stability" Biochemistry 35: 3555-3562. SEQUENZPROTOKOLL
  
  
  
  

Claims (3)

1. Verfahren zur Analyse von Target-Nukleinsäuremolekülen, bei dem markierte Oligonukleotidsonden mit unterschiedlichen Sequenzen unter Hybridisierungsbedingungen mit an definierten Trägern oder in definierten Bereichen von Trägern immobilisierten mindestens überwiegend als Einzelstrang vorliegenden Nukleinsäuremolekülen in Kontakt gebracht werden, und dann überprüft wird, an welchen Träger bzw in welchen Bereichen eines Trägers eine Hybridisierung der Oligonukleotidsonden an die immobilisierten Nukleinsäuremoleküle erfolgt ist, wobei an einem definierten Träger bzw. in einem definierten Bereich eines Trägers immer eine Vielzahl von Nukleinsäuremolekülen mit mindestens teilweise übereinstimmender Sequenz immobilisiert ist und die immobilisierten Nukleinsäuremoleküle den Target-Nukleinsäuremolekülen bzw. Abschnitten davon entsprechen, dadurch gekennzeichnet, daß Oligonukleotidsonden eingesetzt werden, die in Abhängigkeit von ihrer Bindungsstärke mit unterschiedlichen Markierungen versehen sind.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Oligonukleotidsonden in mindestens zwei Gruppen aufgeteilt sind, die jeweils innerhalb der Gruppe übereinstimmende und im Vergleich zu der jeweils anderen Gruppe unterschiedliche Markierungen aufweisen, wobei der einen Gruppe Oligonukleotidsonden mit niedrigerer Bindungsstärke und der anderen Gruppe Oligonukleotidsonden mit höherer Bindungsstärke zugeordnet sind.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Oligonukleotidsonden einer Gruppe sich jeweils von mindestens einer Oligonukleotidsonde einer anderen Gruppe nur bezüglich höchstens 10% der Basenabfolge unterscheiden.