DE10220115A1

DE10220115A1 - CYP74-Enzyme und die sie kodierenden Nukleotidsequenzen sowie Verfahren zur Herstellung von pathogenresistenten Pflanzenzellen und deren Nachkommen

Info

Publication number: DE10220115A1
Application number: DE10220115A
Authority: DE
Inventors: Ivo Feusner; Michael Stumpe
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 2001-07-12
Filing date: 2002-05-06
Publication date: 2003-01-23
Also published as: US20090144856A1; US7786348B2

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Enzyme der Cytochrom-P450-Familie und die sie kodierenden Nukeotidsequenzen sowie deren Einsatz in einem Verfahren zur Herstellung pathogenresistenter Pflanzen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Enzyme der Cytochrom-P450-Klasse und die Isolierung der entsprechend kodierenden Nukleotidsequenzen sowie deren Einsatz in einem Verfahren zur Herstellung pathogenresistenter Pflanzenzellen und deren Nachkommen.
Zu der Klasse der Cytochrom P450-Enzyme gehören die Enzyme Allenoxid- Synthase (AOS), die Hydroperoxid-Lyase (HPL) und die Divinylether-Synthase (DES). Sie bilden eine eigene Unterfamilie mit dem Namen CYP74.
Aufgrund der Vielzahl von Cytochrom P450-Enzymen wurde eine Nomenklatur entwickelt, die jedem Protein dieser Klasse aufgrund der Primärstruktur eine spezifische Familie und Unterfamilie zuordnet. So bilden alle AOS die eigene Unterfamilie CYP74A, unter CYP74B sind die 13-HPL, unter CYP74C die 9/13-HPL und unter CYP74D die 9-DES zusammengefasst (Feussner et al.; 2001, Trends Plant Sci. 6, 268-273). Proteine der gleichen Unterfamilie werden chronologisch durchnummeriert.
CYP74-Enzyme sind Monooxygenasen mit einem Häm-Molekül als prosthetischer Gruppe. Obwohl sie als prosthetische Gruppe auch eine Protoporphyrin IX Gruppe (Häm b) tragen, besitzen sie nur eine sehr geringe Affinität zu CO (Matsui, 1998, Belgian Journal of Botany. 131, 50-62).
Sie sind wichtige Enzyme im Metabolismus von Polyenfettsäuren, dem sogenannten Lipoxygenase (LOX)-Reaktionsweg (Feussner and Wasternack, 1998, Fett/Lipid. 100, 146-152).
LOXs sind Dioxygenasen, bei denen das Eisen im katalytischen Zentrum an Aminosäureseitenketten gebunden ist (Brash, 1999, J. Biol. Chem. 274, 23679-23682). Sie katalysieren den Einbau von molekularem Sauerstoff in das (1Z,4Z)- Pentadiensystem von mehrfach ungesättigten Fettsäuren. In Pflanzen sind das vor allem Linol- und α-Linolensäure. Als Produkte können in Abhängigkeit von der Regioselektivität der eingesetzten LOX zwei verschiedene Positionsisomere von Hydroxyperoxiden, nämlich (9S)-Isomere oder (13S)-Isomere entstehen. Z. B. wird aus α-Linolensäure (13S,9Z,11E,15Z)-13-Hydroperoxy-9,11,15-octadecatriensäure (13S-HPOTE) und aus Linolsäure (13S,9Z,11E)-13-Hydroperoxy-9,11- octadecadiensäure (13S-HPODE).
In Pflanzen werden diese Hydroperoxide schnell durch eine Vielzahl von Enzymen weiter umgesetzt. Zur Zeit sind sieben verschiedene Enzymfamilien im Pflanzenreich bekannt, die Hydroperoxide umsetzen und damit um LOX-Produkte konkurrieren: die Allenoxid-Synthase (AOS)-Reaktion, die Hydroperoxid-Lyase (HPL)-Reaktion, die Divinylether-Synthase (DES)-Reaktion, die Reduktase-Reaktion, die Peroxygenase- Reaktion, die Epoxyalkohol-Synthase (EAS)-Reaktion und die LOX-Reaktion selbst (Feussner et al.; 2001, Trends Plant Sci. 6, 268-273).
Bei der Umsetzung von 13-HPOTE in Gegenwart des Enzyms Allenoxid-Cyclase (AOC) beobachtet man eine Zyklisierung zu 12-Oxo-phytodiensäure (12-Oxo-PDA) (Ziegler et al.; 2000, J. Biol. Chem. 275, 19132-8), die wiederum die Vorstufe der Jasmonsäure ist, die den Pflanzenhormonen zugeordnet wird.
Die AOS (EC4.2.1.92; CYP74A) ist das erste beschriebene CYP74-Enzym und wurde erstmalig als homogenes Protein aus Flax isoliert (Song and Brash, 1991, Sience. 253, 781-784). Sie katalysiert die Umsetzung zu einem instabilen Allenoxid, welches zu den entsprechenden α- und γ-Ketolen in Gegenwart von Wasser zerfallen kann. Die AOS ist an der Biosynthese von Jasmonsäure (Vick and Zimmerman, 1983, Biochem. Biophys. Res. Commun. 111, 470-7) beteiligt. Jasmonsäure selbst ist an der Induktion der Transkription spezifischer mRNA und der Regulation der Translation von Jasmonat-induzierten Proteinen (JIP), wie LOX, AOS und Proteinase-Inhibitoren beteiligt. Dies macht Jasmonsäure zu einem wichtigen Signalstoff bei der pflanzlichen Stressantwort (Wasternack and Parthier, 1997, Trends Plant Sci. 2, 302-307). Eine Beteiligung an Prozessen der Wachstumsregulation und Seneszenzförderung wird ebenfalls diskutiert (Sembdner and Parthier, 1993, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 44, 569-589).
Zahlreiche AOS wurden schon kloniert und in E. coli funktionell exprimiert, darunter die AOS aus Arabidopsis thaliana, Lycopersicon esculentum, Linum usitatissimum und Hordeum vulgare. Abgesehen von den AOS der Gerste besitzen alle bisher klonierten AOS eine Substratspezifität für (13S)-Hydroperoxide (Maucher et al.; 2000, Plant J. 21, 199-213).
Die HPL (CYP748 und C) spaltet die Hydroperoxide zu (3Z)-Aldehyden und ≙-Oxo- Säuren (Matsui, 1998, Belgian Journal of Botany. 131, 50-62). Noch bevor das Enyzm selbst entdeckt wurde, waren die Reaktionsprodukte der HPL als "Blattaldehyde" bekannt, die für den charakteristischen Geruch von Pflanzen und Früchten mit verantwortlich (Hatanaka, 1996, Food Rev. Int. 12, 303-350) sind. Im Falle von 13-HPOTE als Substrat entsteht (32)-Hexenal und (9Z)-12-Oxo-9- Dodecensäure, die zu (10E)-12-Oxo-10-Dodecensäure (Traumatin) isomerisiert, welches als Wundhormon diskutiert wird. Eine Funktion als pflanzlicher Botenstoff wird ebenso diskutiert (Bate and Rothstein, 1998, Plant J. 16, 561-569). Traumatin kann noch weiter zur Traumatinsäure oxidiert werden, das ebenfalls an der Wundantwort von Pflanzen beteiligt zu sein scheint (Zimmerman and Vick, 1970, Plant Physiol. 46, 445-453).
Kloniert und in E. coli als aktives Protein exprimiert wurden unter anderem die HPL aus A. thaliana, Cucumis sativus, Medicago sativus und L. esculentum. Auch hier zeigt sich eine Substratspezifität für (13S)-Hydroperoxide bei den meisten Enzymen. Lediglich je eine HPL aus Gurke und aus Melone sind ohne Substratspezifität und werden daher als 9/13-HPL bezeichnet (McIntyre et al.; 1999, J. Biol. Chem. 274, 25189-25192; Matsui et al.; 2000, FEBS Lett. 481, 183-188). Werden beide Sequenzen auf ihre Verwandtschaft zu anderen Mitgliedern der CYP74-Familie untersucht, so zeigt sich ein höherer Grad der Homologie zu AOS als zu den 13- HPL. Daher werden diese Enzyme in eine eigene Subfamilie, CYP74C, eingeordnet (Matsui et al.; 2000, FEBS Lett. 481, 183-188). Bei der HPL von Arabidopsis konnte gezeigt werden, daß sie durch Verwundung induziert wird.
Die DES (CYP74D) katalysiert die Bildung von Divinylethern, die fungizide Wirkung aufweisen (Weber et al. 1999). Ebenso wird diskutiert, daß die Divinylether, wie die Aldehyde im Falle der HPL-Produkte, bei der Abwehr von pathogenen Pilzen und Bakterien eine Rolle spielen (Weber et al.; 1999, Plant Cell. 11, 485-493; Göbel et al.; 2001, J. Biol. Chem. 276, 6267-6273). Die erste DES aus L. esculentum wurde von Itoh and Howe 2001 kloniert. Dabei zeigte sich, daß sie auf Sequenzebene hohe Homologien zur AOS und HPL besitzt, so daß sie auch zur Cytochrom P450-Klasse, Subfamilie CYP74D, gerechnet wird. Darüber hinaus ist die DES in der Gruppe der CYP74 einzigartig darin, daß sie als einzige hoch spezifisch für 9S-Hydroperoxide ist (Itoh and Howe, 2001, J. Biol. Chem. 276, 3620-3627).
In der Natur sind P450-Enzyme vielfach in die Biosynthese und den Metabolismus von zahlreichen endogenen Stoffen involviert. Eine besondere Rolle spielt ihre Beteiligung an der Detoxifikation von Xenobiotika. Pflanzliche P450-Enzyme sind ferner an der Biosynthese von Wundsignalen (Jasmonsäure, Salicylsäure, Traumatin) und Hormonen (Gibberelline, Brassinosteroide) beteiligt.
Auslöser von Wundsignalen in Pflanzen und nachfolgende Signaltransduktionskaskaden sind vielgestaltig. Sie können durch Beschädigung oder Verletzung der Pflanze ausgelöst werden, aber auch (künstlich) durch von außen zugeführte chemische Verbindungen induziert werden.
Darüber hinaus ist aber insbesondere das Auftreten von Pflanzenkrankheiten und vor allem die Steigerung der pflanzlichen Abwehr gegen solche Krankheitserreger agrarwirtschaftlich von enormer Relvanz. Dabei kann die pflanzliche Antwort auf einen Krankheitserreger auf einem vollkommen anderen Weg erfolgen, als dies bei der Stessabwehr durch Verwundung der Fall ist. Das Auftreten von Pflanzenkrankheiten, beispielsweise hervorgerufen durch Viren, Bakterien oder Pilze, führt in der Regel zu erheblichen Schädigungen oder sogar zum Ausfall der ganzen Pflanze, verbunden mit einer drastisch verringerten Menge oder Qualität des Erntegutes.
Um die Ertragsverluste auf ein wirtschaftlich vertretbares Maß zu begrenzen, sind Pflanzenschutzmaßnahmen unabdingbar. Insbesondere wünschenswert wäre es, wenn auch ohne den Einsatz von Chemikalien, die eine zusätzliche Belastung für Boden, Grundwasser sowie den Anwender darstellen, die Abwehr von Pflanzen gegenüber Krankheitserregern und/oder Schädlingen zu verbessern.
Die vorliegende Erfindung hat sich daher zur Aufgabe gemacht, transgene Pflanzenzellen, Pflanzen und deren Nachkommen zur Verfügung zu stellen, die über eine erhöhte Pathogenresistenz verfügen sowie entsprechend verbesserte Verfahren zu deren Herstellung bereitzustellen.
Diese Aufgabe wird gelöst, durch eine Allenoxid-Synthase mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 2 oder deren Isoenzyme und/oder eine Divinylether-Synthase mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 4 oder deren Isoenzyme.
Die beiden zuvor genannten Enzyme gehören zur Familie der CYP74-Enzyme. Eine gesteigerte spezifische Aktivtät dieser CYP74-Enzyme, einzeln oder in Kombination, mit Bezug auf die in einer Pflanzenzelle endogen vorliegende spezifische Aktivität dieser Enzyme führt in einer Pflanzenzelle zu einer gesteigerten Resistenz gegenüber Krankheitserregern.
Dabei bewirkt eine erfindungsgemäß erhöhte spezifische Aktivtät der CYP-Enzyme gegenüber der in Pflanzenzellen oder Pflanzen endogen vorliegenden spezifischen Aktivität eine Steigerung der Resistenz der Pflanzenzellen oder Pflanzen gegenüber Krankheitserregern um 20-90%, bevorzugt um 30-80% und besonders bevorzugt um 40-70%. Die Resistenz der Pflanze wird dabei über die Abnahme der Penetrationsfrequenz ermittelt.
Unter Penetrationsfrequenz ist erfindungsgemäß die Anzahl der Infektionsstellen mit erfolgreich penetrierten Epidermiszelle zu verstehen, dividiert durch die Gesamtzahl der Infektionsstellen.
Die erfindungsgemäßen CYP74-Enzyme, einzeln oder in Kombination, bewirken in vorteilhafter Weise in Pflanzen eine erhöhte Resistenz gegenüber Krankheitserregern, wie z. B. biotrophen Pilzen. Bevorzugt bewirkt eine erhöhte Konzentration (erhöhte spezifische Aktivität) an erfindungsgemäßen CYP74- Protein/en eine erhöhte Resistenz gegenüber Mehltaupilzen, besonders bevorzugt Blumeria graminis f. sp. hordei oder f. sp. tritici. Eine erhöhte Resistenz gegenüber weiteren Pflanzenpathogenen ist dadurch jedoch nicht ausgeschlossen.
Weitere Beispiele solcher Pflanzenpathogene sind Pythium spec., Albugo spec., Rhizoctonia solani, Peronospora parasitica, Erysiphe crucifearum, E. cichoreacearum, Alternaria brassicicola, Botrytis cinerea, Sclerotium rolfsii, Sclerotinia sclerotium, Fusarium oxysporum, F. culmorum, F. graminearum, F. nivale, Phytophtora infestans oder Pseudomonas syringae.
Bemerkenswert ist, daß die zuvor genannten erfindungsgemäßen CYP74-Enyzme ein sehr viel breiteres Substratspektrum aufweisen als bislang bekannte CYP- Enzyme dieser Klasse. Die erfindungsgemäßen CYP74-Enyzme können sowohl 9- HPOD/TE als auch 13-HPOD/TE als Substrat umsetzen.
Erfindungsgemäß stammen die hier vorliegenden CYP74-Enzyme aus Moos oder höheren Pflanzen. Bevorzugt stammen die erfindungsgemäßen CYP74-Enzyme aus Physcomitrella patens.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch eine isolierte Nukleotidsequenz kodierend für eine Allenoxid-Synthase der zuvor genannten Art, beteiligt an der Biosynthese von mehrfach ungesättigten Fettsäuren zur Steigerung der Resistenz von Pflanzenzellen oder Pflanzen gegenüber Krankheitserregern ausgewählt aus

a) einer Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1,
b) einer Nukleotidsequenz, die wenigstens 70% Identität mit der in SEQ ID No. 1 gezeigten Nukleotidsequenz aufweist,
c) einer zu a) oder b) komplementären Nukleotidsequenz.

Die Erfindung umfaßt auch Nukleotidsequenzen, die mit a) oder b) hybridisieren.
Ebenso ist erfindungsgemäß eine isolierte Nukleotidsequenz umfaßt, kodierend für eine Divinylether-Synthase der zuvor genannten Art beteiligt an der Biosynthese von mehrfach ungesättigten Fettsäuren zur Steigerung der Resistenz von Pflanzenzellen oder Pflanzen gegenüber Krankheitserregern, ausgewählt aus

a) einer Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 3,
b) einer Nukleotidsequenz, die wenigstens 70% Identität mit einer der in SEQ ID No. 3 gezeigten Nukleotidsequenz aufweist,
c) einer zu a) oder b) komplementären Nukleotidsequenz.

Die Erfindung umfaßt auch Nukleotidsequenzen, die mit a) oder b) hybridisieren.
Unter einer isolierten Nukleinsäure oder einem isolierten Nukleinsäurefragment ist erfindungsgemäß ein Polymer aus RNA oder DNA zu verstehen, das einzel- oder doppelsträngig sein kann und optional natürliche, chemisch synthetisierte, modifizierte oder artifizielle Nukleotide enthalten kann. Der Begriff DNA-Polymer schließt hierbei auch genomische DNA, cDNA oder Mischungen davon ein.
Unter hybridisierenden Nukleotidsequenzen im Sinne der Erfindung sind Oligo- oder Polynukleotide zu verstehen, die unter Standard-Hybridisierungsbedingungen an die entsprechende erflndungsgemäße Nukleotidsequenz kodierend für CYP74-Enzyme binden. Der Begriff Standard-Hybridisierungsbedingungen ist breit zu verstehen und meint stringente und weniger stringente Hybridisierungsbedingungen. Solche Bedingungen sind unter anderem bei Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press,) beschrieben. Der Begriff hybridisierende Sequenzen schließt erfindungsgemäß substanziell ähnliche Nukleotidsequenzen aus der Gruppe von DNA oder RNA ein, die unter an sich bekannten Standard-Hybridisierungsbedingungen eine spezifische Wechselwirkung (Bindung) mit den erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen eingehen. Hierzu zählen auch kurze Nukleotidsequenzen mit einer Länge von beispielsweise 10 bis 30, bevorzugt 12 bis 15 Nukleotiden. Dies umfaßt erfindungsgemäß u. a. auch sogenannte Primer oder Sonden.
Unter komplementären Nukleotidsequenzen sind erfindungsgemäß DNA- oder RNA- (mRNA)Sequenzen zu verstehen, die eine Abschrift der entsprechenden Ausgangssequenz gemäß den Basenpaarungsregeln darstellt.
Unter Allelen sind erfindungsgemäß funktionell äquivalente, d. h. im wesentlichen gleichwirkende Nukleotidsequenzen zu verstehen. Funktionell äquivalente Sequenzen sind solche Sequenzen, welche trotz abweichender Nukleotidsequenz, beispielsweise durch die Degeneriertheit des genetischen Codes noch die gewünschten Funktionen besitzen. Funktionelle Äquivalente umfassen somit natürlich vorkommende Varianten der hierin beschriebenen Sequenzen sowie künstliche, z. B. durch chemische Synthese erhaltene und gegebenenfalls an den Kodon-Gebrauch des Wirtsorganismus angepaßte Nukleotid-Sequenzen. Darüber hinaus umfassen funktionell äquivalente Sequenzen solche, die eine veränderte Nukleotidsequenz aufweisen, welche dem Protein beispielsweise eine Desensitivität oder Resistenz gegenüber Inhibitoren verleiht.
Unter einem funktionellen Äquivalent versteht man insbesondere auch natürliche oder künstliche Mutationen einer ursprünglich isolierten Sequenz, welche weiterhin die gewünschte Funktion zeigen. Mutationen umfassen Substitutionen, Additionen, Deletionen, Vertauschungen oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleotidreste.
Inbegriffen sind hier auch sogenannte Sinnmutationen (sense mutations), die auf Proteinebene beispielsweise zum Austausch konservierter Aminosäuren führen können, welche aber zu keiner grundsätzlichen Veränderung der Funktionalität des Proteins führen, d. h. funktionsneutral sind. Dies beinhaltet auch Veränderungen der Nukleotidsequenz, die auf Proteinebene den N- oder C-Terminus eines Proteins betreffen, ohne jedoch die Funktion des Proteins wesentlich zu beeinträchtigen. Diese Veränderungen können sogar stabilisierenden Einfluß auf die Proteinstruktur ausüben. Funktionelle Äquivalente sind auch solche Varianten, deren Aktivität, verglichen mit dem Ausgangsgen bzw. Genfragment, abgeschwächt oder verstärkt ist.
Außerdem sind artifizielle DNA-Sequenzen Gegenstand der vorliegenden Erfindung, solange sie, wie oben beschrieben, die gewünschten Eigenschaften vermitteln. Solche artifiziellen DNA-Sequenzen können beispielsweise durch Rückübersetzung von mittels computergestützten Programmen (molecular modelling) erstellten Proteinen oder durch in-vitro-Selektion ermittelt werden. Besonders geeignet sind kodierende DNA-Sequenzen, die durch Rückübersetzung einer Polypeptidsequenz gemäß der für den Wirtsorganismus spezifischen Kodon-Nutzung erhalten wurden. Die spezifische Kodon-Nutzung kann ein mit molekulargenetischen Methoden vertrauter Fachmann durch Computerauswertungen anderer, bereits bekannter Gene des zu transformierenden Organismus leicht ermitteln.
Der Begriff des funktionellen Äquivalents bezieht sich auch auf das durch die entsprechende Nukleotidsequenz kodierte Protein. In diesem Fall beschreibt der Begriff funktionelles Äquivalent ein Protein, dessen Aminosäuresequenz mit der des Referenzproteins (hier der CYP74-Enzyme) bis zu einem bestimmten Prozentsatz homolog ist. Der Prozentsatz liegt bei mindestens 75%, bevorzugt 80%, besonders bevorzugt 90-95% und insbesondere bei 99,9%.
Ferner werden beispielsweise auch solche Nukleotidsequenzen durch die vorliegende Erfindung mit umfaßt, welche man durch Modifikation der Nukleotidsequenz, resultierend in entsprechenden Derivaten, erhält. Ziel einer solchen Modifikation kann z. B. die weitere Eingrenzung der darin enthaltenen kodierenden Sequenz oder z. B. auch die Einfügung weiterer Restriktionsenzym- Schnittstellen sein.
Die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen zeichnen sich ferner dadurch aus, daß sie aus Moos oder höheren Pflanzen stammt. Bevorzugt stammen sie aus Physcomitrella patens.
Zur Begriffsklärung sei bemerkt, daß das durch die SEQ ID No. 1 kodierte Protein ein Cytochrom P450-Enzym der Klasse CYP74A (Allenoxid-Synthase; AOS) ist. Das durch die SEQ ID No. 3 kodierte Enzym wird, u. a. aufgrund seiner Substratspezifität, der Klasse CYP74E (Divinylether-Synthase; DES) zugeordnet.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Genkonstrukt enthaltend eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1 und/oder eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 3 sowie operativ damit verknüpfte regulatorische Nukleotidsequenzen. Zu den erfindungsgemäßen Genkonstrukten zählen auch solche, die Derivate, Allele oder Teile der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1 und/oder SEQ ID No. 3 enthalten. Hierbei können die kodierenden Bereiche einzeln oder in Kombination (d. h. gemeinsam) unter der Kontrolle derselben regulatorischen Sequenzen oder verschiedener separater regulatorischer Sequenzen stehen.
Unter einer operativen Verknüpfung versteht man die sequenzielle Anordnung beispielsweise von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und ggf. weiterer regulatorischer Elemente derart, daß jedes der regulatorischen Elemente seine Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann. Diese regulatorischen Nukleotidsequenzen können natürlichen Ursprungs sein oder durch chemische Synthese erhalten werden. Als Promotor ist grundsätzlich jeder Promotor geeignet, der die Genexpression in dem entsprechenden Wirtsorganismus steuern kann. Hierbei kann es sich erfindungsgemäß auch um einen natürlichen oder synthetisch erzeugten chemisch induzierbaren Promotor handeln, durch den die Expression der ihm unterliegenden Gene in der Wirtszelle zu einem bestimmten Zeitpunkt gesteuert werden kann. Hierzu zählen auch gewebespezifische Promotoren. Die Herstellung einer Genstruktur erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit wenigstens einer erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz nach gängigen Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E. F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratury, Cold Spring Harbor, NY (1989) beschrieben sind. Für die Verbindung der DNA-Fragmente miteinander können an die Fragmente Adaptoren oder Linker angesetzt werden.
Erfindungsgemäß sind auch die den kodierenden Bereichen (Strukturgenen) vorausgehenden (5'- oder upstream) und/oder nachfolgenden (3'- oder downstream) Sequenzbereiche eingeschlossen. Insbesondere sind hierin Sequenzbereiche mit regulatorischer Funktion inbegriffen. Sie können die Transkription, die RNA-Stabilität oder das RNA processing sowie die Translation beeinflussen. Beispiele für regulatorische Sequenzen sind u. a. Promotoren, Enhancer, Operatoren, Terminatoren oder Translationsverstärker.
In der vorliegenden Erfindung umfaßt ist außerdem ein Vektor enthaltend eine isolierte Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1, Allele, Derivate oder Teile davon und/oder eine isolierte Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No 3, Allele, Derivate oder Teile davon und/oder ein Genkonstrukt der zuvor genannten Art sowie zusätzliche Nukleotidsequenzen zur Selektion und/oder Replikation in einer Wirtszelle und/oder zur Intregration in das Genom einer Wirtszelle.
Erfindungsgemäß geeignete Wirtszellen können allgemein Zellen höherer Pflanzen sein. Bevorzugt sind Zellen von Nutzpflanzen, bevorzugt monocotyledonen Nutzpflanzen, besonders bevorzugt Getreide und insbesondere Gerste und/oder Weizen. Bevorzugte Zellen dicotyledoner Nutzpflanzen sind solche der Familie der Solanaceen.
Die vorliegende Erfindung umfaßt somit auch wenigstens eine transgene Pflanzenzelle, ganze Pflanze und/oder deren Nachkommen, enthaltend in replizierbarer Form eine isolierte Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1, Allele, Derivate oder Teile davon und/oder eine isolierte Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 3, Allele, Derivate oder Teile davon und/oder ein Genkonstrukt der zuvor genannten Art und/oder einen Vektor der zuvor genannten Art, wobei die transgene Pflanzenzelle, ganze Pflanze und/oder deren Nachkommen eine verstärkte Expression der Nukleotidsequenz kodierend für eine Allenoxid-Synthase und/oder der Nukleotidsequenz kodierend für eine Divinylether-Synthase im Vergleich zu der endogen vorliegenden Genexpression (d. h. natürlicherweise vorliegende Genexpression, wie sie z. B. in einer nicht-transformierten Pflanze oder Pflanzenzelle vorliegt) aufweist, die zu einer gesteigerten Resistenz von Pflanzen gegenüber Krankheitserregern führt.
Eine verstärkte Genexpression kann in einer erhöhten Kopienzahl der entsprechenden Nukleotidsequenz begründet sein. Oder sie beruht beispielsweise darauf, daß die kodierende Region einer Nukleotidsequenz operativ mit einer oder mehreren regulatorischen Sequenzen verknüpft ist, die eine verstärkte Initionation der Genexpression bewirken. Dies kann z. B. durch einen starken und/oder induzierbaren Promotor und/oder Enhancer und/oder andere regulatorische Sequenzen bewirkt werden.
Hinsichtlich der Kopienzahl kann in einer Variante der vorliegenden Erfindung eine oder beide der genannten Nukleotidsequenzen in 2-100, bevorzugt 5-50 und besonders bevorzugt in 2-15 Kopien vorliegen.
In den zuvor genannten erfindungsgemäßen transgenen Pflanzenzellen, Pflanzen und/oder deren Nachkommen können die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen (einzeln oder in Kombination), Allele, Derivate oder Teile davon und/oder Genkonstrukte und/oder Vektoren der zuvor genannten Art extrachromosomal vorliegen und/oder stabil in das pflanzliche Genom integriert sein.
Entsprechende Vorgehensweisen und Hilfsmittel, wie Genkonstrukte oder Vektoren und geeignete Hilfsorganismen zur Integration der Nukleotidsequenz in das pflanzliche Genom sind dem Fachmann geläufig und werden nicht näher ausgeführt.
Die transgene Pflanzenzelle, ganze Pflanze und/oder deren Nachkommen, welche eine Allenoxid-Synthase gemäß SEQ ID No. 2 und/oder eine Divinylether-Synthase gemäß SEQ ID No. 4 und/oder entsprechende Isoenzyme, Derivate und/oder Teile davon aufweist, wobei die entsprechende spezifische Aktivität der Enzyme in den transgenen Wirtssystemen gegenüber der entsprechenden endogenen Enzymaktivität (z. B. in den Wildtypzellen) erhöht ist, ist ebenfalls von der vorliegenden Erfindung umfaßt.
Unter Isoenzymen sind Enzyme mit gleicher oder vergleichbarer Substrat- und Wirkungsspezifität zu verstehen, die jedoch eine unterschiedliche Primärstruktur aufweisen.
Unter Derivaten sind erfindungsgemäß Enzyme zu verstehen, bei denen Änderungen in der Sequenz, beispielsweise am N- und/oder C-Teminus des Polypeptids oder im Bereich konservierter Aminosäuren vorliegen, ohne jedoch die Funktion des Enzyms zu beeinträchtigen. Diese Veränderungen können in Form von Aminosäureaustauschen nach an sich bekannten Methoden vorgenommen werden.
Eine besondere Ausführungsvariante der vorliegenden Erfindung umfaßt Varianten der erfindungsgemäßen Enzyme, deren Aktivität beispielsweise durch Aminosäureaustausche, verglichen mit dem jeweiligen Ausgangsprotein, abgeschwächt oder verstärkt ist. Gleiches gilt für die Stabilität der erfindungsgemäßen Enzyme in den Zellen, die beispielsweise gegenüber dem Abbau durch Proteasen verstärkt oder vermindert anfällig sind.
Ferner sind Enzyme mit der Funktion einer Allenoxid-Synthase oder Divinylether- Synthase Gegenstand der vorliegenden Erfindung, die in ihrer Aminosäuresequenz derart verändert sind, daß sie gegenüber regulatorisch wirkenden Verbindungen, beispielsweise die sie in ihrer Aktivität regulierenden Stoffwechsel-Endprodukte, desensitiv sind (feedback-desensitiv).
Erfindungsgemäß handelt es sich bei der zuvor genannten transgenen Pflanzenzelle, ganzen Pflanze und/oder deren Nachkommen um eine Nutzpflanze oder deren Zellen, bevorzugt der Familie der Solanaceae oder Getreide, besonders bevorzugt Kartoffel, Gerste oder Weizen.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch ein Verfahren zur Steigerung der Resistenz von Pflanzenzellen oder Pflanzen gegenüber Krankheitserregern, wobei eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1 und/oder eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 3 und/oder ein Genkonstrukt und/oder ein Vektor der zuvor erläuterten Art in replizierbarer Form in Pflanzenzellen übertragen wird und aus den so transformierten Pflanzenzellen ganze Pflanzen regeneriert werden.
Verfahren zur Herstellung solcher erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen gehören zur gängigen Laborpraxis. In einer vorteilhaften Variante der vorliegenden Erfindung werden die Nukleotidsequenz und/oder Genkonstrukte und/oder Vektoren durch sogenanntes "particle bombardment" und/oder Agrobakterien-vermittelte Transformation in die Pflanze oder Pflanzenteile oder Zellen übertragen.
Ein besonderer Vorteil der erfindungsgemäß erhaltenen transgenen Pflanze und deren Nachkommen ist, daß eine Erhöhung der Kopienzahl wenigstens einer der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen oder analog das Vorliegen einer erhöhten Konzentration wenigstens eines entsprechend kodierten Proteins zu einer wesentlich gesteigerten Krankheitsresistenz führt. D. h. das/die erfindungsgemäßen Gene bzw. das/die kodierten Proteine ist kausal an der Ausbildung der Resistenz gegenüber pathogenen Schädlingen beteiligt.
Beispiele für pathogene Schädlinge sind u. a. Blumeria graminis f. sp. hordei oder f. sp. tritici, Pythium spec., Albugo spec., Rhizoctonia solani, Peronospora parasitica, Erysiphe crucifearum, E. cichoreacearum, Alternaria brassicicola, Botrytis cinerea, Sclerotium rolfsii, Sclerotinia sclerotium, Fusarium oxysporum, F. culmorum, F. graminearum, F. nivale, Phytophtora infestans oder Pseudomonas syringae.
In einer bevorzugten Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens werden als pflanzliche Zellen solche von Nutzpflanzen, bevorzugt der Familie der Solanaceae oder von Getreide, besonders bevorzugt Kartoffel, Gerste oder Weizen eingesetzt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner die Verwendung einer Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1 und/oder einer Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 3 und/oder deren Allele, Derivate und/oder Teile davon zur Steigerung der Resistenz transgener Pflanzenzellen, ganzer Pflanzen und/oder deren Nachkommen gegenüber Krankheitserregern.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch die Verwendung von wenigstens einem Polypeptid gemäß SEQ ID No. 2 und/oder einem Polypeptid gemäß SEQ ID No. 3 und/oder Isoenzyme und/oder Derivate davon zur Steigerung der Resistenz transgener Pflanzenzellen, ganzer Pflanzen und/oder deren Nachkommen gegenüber Krankheitserregern.
Erfindungsgemäß ist auch die Verwendung von wenigstens einem der zuvor genannten Enzyme umfaßt, wobei eine erhöhte spezifische Aktivität wenigstens eines Enzyms gegenüber der entsprechenden endogenen spezifischen Enzym-Aktivität eine Steigerung der Resistenz der Pflanzenzellen oder Pflanzen gegenüber Krankheitserregern um 20-90%, bevorzugt um 30-80% und besonders bevorzugt um 40-70% bewirkt.
Hierbei bewirkt die Verwendung von wenigstens einem der erfindungsgemäßen Enzyme beispielsweise eine erhöhte Resistenz gegenüber Mehltaupilzen, bevorzugt Blumeria graminis f. sp. hordei oder f. sp. tritici und/oder Phytophtera infestans.
Die nachfolgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung und sind nicht limitierend.

Allgemeine Methoden

Allgemeine DNA- und Klonierungstechniken, Gelelektrophoresen, Sequenzierung, PCR, Northern-Blots, Expression und Reinigung rekombinanter Proteine, Western- Blots, HPLC- und GC-Analysen sowie die Kultivierung von Mikroorganismen sind gängige Labormethoden und u. a. in Sambrook et al. (Molecular cloning. A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press) beschrieben.
Die Behandlung von Moos- und Pflanzenmaterial ist ebenfalls gängige Laborpraxis und u. a. in Gelvin et al. (Plant Molecular Biology Manual, 1995, Dovdrecht/Holland, Kluwer Academic Publ.) beschrieben.

Klonierung der Gene kodierend für CYP74-Enzyme via PCR

Für die RACE-PCR standen zwei Lambda ZapII-cDNA-Banken von Physcomitrella patens, eine aus Protonema- und eine aus Gametophytengewebe, zur Verfügung. Als Vektor-Primer diente für die 5'-RACE-PCR der T7-lang Primer (5'-GTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG CGA ATT GGG-3'). Die Durchführung erfolgte nach Standardmethoden.
Für die nested RACE-PCR wurde erst eine PCR mit M13rev-Primer (5'-GGA AAC AGC TAT GAC CAT G-3') und einem RACE-Primer durchgeführt. Dieser Ansatz diente als Template für eine zweite PCR mit T7-lang Primer und einem (genspezifischen) nested-RACE-Primer ausgewählt aus:
PP291AOS5R: 5'-TCA CCT CAT CCG ATA CGC TAG TC-3'
PP364AOS5R: 5'-GTC GAT GTC GTC TCA ATG TTC C-3'
PP364AOS5R2: 5'-CCA TTC GTG ATT GCC AGA ACT GC-3'.
Zur Klonierung der vollständigen Fragmente wurden diese mit Hilfe des Expand™- PCR-Systems amplifiziert. Neben der Taq-Polymerase enthält dieses System eine Pwo-Polymerase mit einer Proof-Reading-Aktivität. Diese dient dazu, die Lesefehlerrate niedrig zu halten, um möglichst wenig Mutationen in der zu klonierenden DNA zu erhalten. Als Template wurden folgende cDNA-Bänke verwendet: P. patens-cDNA- Lambda ZapII aus Protonema und P. patens-cDNA-Lambda ZapII aus Gametophyten. Folgende primer wurden eingesetzt:
PP291/5'SphI
5'-AAA GCA TGC ATG GCA GTC CCT TCA TCC AAG C-3'
PP291/3'PstI
5'-AAA CTG CAG TCA CTT TTT GAG ATC GGA AAA GAA AAC CTT GGT CGC-3'
PP364/5'BamHI
5'-GGA TCC CGT ACG GTT GTA GCC AGT CTT GGG-3'
PP364/3'HindIII
5'-AAG CTT TCA ATC TGA TCG CGG CGT CAG TG-3'.
Zur Kontrolle der Klone während der Klonierung von RACE- und vollständigen cDNAs wurde eine sogenannte "Kolonie"-PCR mit der Tfl-Polymerase durchgeführt, da hier die Fehlerrate nicht von Bedeutung war. Die Primer wurden beibehalten und das Programm nach Standardvorgaben durchgeführt.

Isolierung von CYP74-Enzymen

Aus zwei Lambda ZapII-cDNA-Banken von Physcomitrella patens wurden 2 Gene kodierend für CYP74-Enzyme isoliert.

Klon Pp291

Der isolierte Klon Pp291 hatte einen offenen Leserahmen für 322 Aminosäuren. Dieses Protein zeigte 48% Identität zu einer AOS aus Parthenium argentatum (Pan et al.; 1995, J. Biol. Chem. 270, 8487-8494). Ein Vergleich seiner Nukleotidsequenz mit anderen bekannten AOS zeigte, dass jedoch noch ca. 500 bis 650 bp am 5'-Ende fehlten. Aus diesem Grund wurde eine 5'-RACE-PCR mit einer Lambda ZapII-cDNA- Bank aus Protonema- und einer Lambda ZapII-cDNA-Bank aus Gametophytengewebe durchgeführt. Mit dem RACE-Primer PP291AOS5R (siehe oben) und einer Annealingtemperatur von 60°C gelang es aus der Protonema-Bank drei Fragmente unterschiedlicher Länge zu amplifizieren. Im Vergleich mit dem im Agarosegel mitgeführten Größenstandard ließen sich die Längen der Fragmente abschätzen. Sie betrugen 600 bp, 700 bp und 800 bp. Die beiden längeren Fragmente wurden in den Vektor pGEM-T kloniert und sequenziert. Die beiden erhaltenen Sequenzen stellten beide eine Verlängerung des 5'-Endes des Ausgangs-Klons dar. In beiden Sequenzen befand sich 15 bp oberhalb vom ersten Start-Codon (ATG) ein Stop-Codon. Für eine Klonierung der vollständigen cDNA wurden, ausgehend von der cDNA-Sequenz aus der RACE-PCR, die Expressionsprimer (PP291/5'SphI und PP291/3'PstI, siehe oben) mit Restriktionsschnittstellen für SphI und PstI abgeleitet. Die erhaltene vollständige cDNA-Sequenz ist in SEQ ID No. 1 dargestellt und codiert für ein Protein von 475 Aminosäuren (SEQ ID No. 2).

Klon Pp364

Der zweite cDNA-Klon enthielt einen offenen Leserahmen, der für ein Protein von 489 Aminosäuren codierte. Dieses zeigte auf Aminosäureebene 42% Identität zur AOS aus Arabidopsis thaliana (Laudert et al.; 1996, Plant Mol. Biol. 31, 323-335) und 41% Identität zur AOS aus L. usitatissimum. Dieser Klon enthielt trotz seiner Länge kein Start-Codon. Die Expressionsprimer PP364/5'BamHI und PP364/3'HindIII mit den Restriktionsschnittstellen für BamHI und HindIII wurden aus der bekannten Klon- Sequenz abgeleitet. Durch RACE-PCR und inverted PCR wurde die vollständige cDNA-Sequenz erhalten. Die vollständige cDNA-Sequenz ist in SEQ ID No. 3 dargestellt und kodiert für ein Protein von 532 Aminosäuren (SEQ ID No. 4).

Expression und Reinigung rekombinanter Proteine

Für die Expression mussten die isolierten cDNAs in einen Expressionsvektor ligiert werden. Hier wurde der Vektor pQE30 (Qiagen, Hilden) verwendet, um die Proteine mit N-terminalen His₆-Tag zu exprimieren. Die Ligation zwischen vorgeschnittenen pQE30 und Donor-DNA (im Verhältnis ca. 3 : 1) erfolgte mit T4-DNA-Ligase.
Die Expression der rekombinanten Proteine erfolgte im E. coli-Stamm SG13009 (Gottesmann et al.; 1981, J. Bacteriol. 148, 265-73). Die Expressionsklone wurden zunächst bis zu einer OD₆₀₀ von 0,6-0,8 in LB-Medium (mit Carbenicillin und Kanamycin) bei 37°C inkubiert. Nach der Induktion mit IPTG (Endkonzentration: 1 mM) wurden die Bakterien für weitere 2-3 Tage bei 10°C kultiviert.
Die Reinigung erfolgte soweit wie möglich auf Eis, die Zentrifugationsschritte erfolgten bei 4°C. Die Zellen wurden durch eine Zentrifugation bei 4000 × g 15 min sedimentiert.
Dieses Zellsediment wurde vollständig in 50 mM Na-Phosphat, pH 8, resuspendiert und mit Ultraschall (Sonopuls GM 70, Bandelin, Berlin) für 5 × 1 min bei 50% Leistung und 50% Impuls aufgeschlossen. Die Zelltrümmer wurden 15 min bei 4000 × g abzentrifugiert und aus dem Überstand wurden durch eine weitere Zentrifugation (1 h bei 100000 × g) die Zellmembranen sedimentiert.
Die Reinigung der rekombinant hergestellten Proteine erfolgte für beide Klone Pp291 und Pp364 über eine Affinitätschromatographie. Anschließend wurde mit einem pH- Gradienten (Fig. 1A) und alternativ mit einem Imidazol-Gradienten (Fig. 1 B) eluiert. Von allen Wasch- und Elutionsschritten wurden gleiche Volumina (1 ml) gefällt und auf das Gel aufgetragen.
Wie in Fig. 1A zu sehen ist, wurde sauberes Pp291-Protein bei einem pH von 4 von der Säule eluiert. Beim Imidazolgradient eluierte das Protein ab einer Imidazol- Konzentration von 100 mM relativ sauber. Beim Vergleich beider Methoden konnte kein Unterschied festgestellt werden. Aus diesem Grund wurde im folgenden das Protein nur noch mit dem pH-Gradient gereinigt.

Aktivitätstests

Da Sequenzvergleiche keine Rückschlüsse auf die katalytische Aktivität zufassen, wurden die bei der Katalyse der Enzyme entstehenden Produkte mittels einem photometrischen Aktivitätstest sowie HPLC- und GC-Analysen analysiert, die nach Standardmethoden durchgeführt wurden.
Beim photometrischen Aktivitätstest wird die Abnahme der Extinktion bei 234 nm gemessen. Sie beruht auf der Zerstörung des konjugierten Dien-Systems der Hydroperoxide beim Umsatz mit Cyp74-Enzymen. Dazu wurde in Phosphatpuffer (pH je nach pH-Optimum des Enzyms) das entsprechende Substrat gelöst (zum reinen Aktivitätstest in der Regel eine Endkonzentration von 20 µM 13-HPOTE bzw. 9-HPODE) und die Reaktion durch Zugabe des Enzyms gestartet. Die Substratkonzentration wurde photometrisch über die Extinktion bei 234 nm verfolgt. Der molare Extinktionskoeffizient (λ_{234 nm}) ist gleich 25 000 M^-1cm^-1.
Es wurden sowohl von dem Enzym kodiert durch den Klon Pp291 als auch von dem Enzym kodiert von dem Klon Pp364 beide Substrate (13-HPOTE und 9-HPODE) umgesetzt. Eine graphische Darstellung findet sich in Fig. 2.
Bei der Umsetzung von Hydroperoxiden mit DES entstehen Divinylether, die im sauren zu Aldehyden hydrolysieren. Diese sind leicht flüchtig. Um diese entstehenden Aldehyde zu identifizieren, besteht die Möglichkeit sie mit DNPH zu derivatisieren (Kohlmann et al.; 1999, Eur. J. Biochem. 260, 885-895). Die so gebildeten Hydrazone sind nicht mehr flüchtig und können über ihre Retentionszeit mit Hilfe einer HPLC-Analyse identifiziert werden. Wie Fig. 3 zeigt, können auch Divinylether bei der Behandlung mit dem Derivatisierungsreagenz in Aldehyde zerfallen, die dann als DNPH-Derivate nachgewiesen werden können.
Mit dieser Methode konnte gezeigt werden, dass in dem Reaktionsansatz des Enzyms kodiert durch den Klon Pp364 mit den Substraten 13-HPOTE und 9-HPODE Aldehyde entstehen (Fig. 4). Diese wurden als (2E)-Hexenal und (2E)-Nonenal anhand ihrer Retentionszeiten identifiziert. Sie zeigten auch ein typisches UV- Spektrum für Aldehyd-DNPH-Derivate. Bei Pp291 wurden keine Aldehyde nachgewiesen (Daten nicht gezeigt).
Bei der HPLC-Analyse der nicht flüchtigen Verbindungen setzt man Hydroperoxide um, die 1-¹⁴C markiert sind. Es entstehen markierte Produkte, die mit Hilfe eines Radiodetektors anstelle eines UV-Detektors sichtbar gemacht werden können. So kann man auch Substanzen, die kein typisches UV-Maximum besitzen über ihre Retentionszeit identifizieren. Ein weiterer Vorteil ist die höhere Sensitivität dieser Detektion gegenüber der UV-Detektion. Setzt man [1-¹⁴C]-13-HPOTE als Substrat in der Enzymreaktion ein, so zeigt sich in dem in Fig. 5 dargestellten Chromatogramm für Pp291 das gleiche Elutionsprofil wie die 9/13-AOS1 aus Gerste (Maucher et al.; 2000, Plant J. 21, 199-213), die als Referenz verwendet wurde. Bei anderen AOSs wurde bereits gezeigt, dass das Hauptprodukt der Reaktion in Abwesenheit von Allenoxid-Cyclase das α-Ketol ist.
Das Chromatogramm der Expression und dem anschließenden Umsatz von Pp364 zeigte ein Signal bei ca. 30 min (Fig. 6). Dieses wurde weder bei der 9/13-HPL der Gurke noch bei der 9/13-AOS1 der Gerste gefunden. Pp364 zeigte zusätzlich noch Signale, mit der gleichen Retentionszeit wie die Produkte der 9/13-HPL der Gurke. Da bei der Radio-HPLC dem Säuleneluat Flüssigszintillator zugesetzt wird, wurde der gleiche HPLC-Lauf mit nicht markierten Substraten durchgeführt, um die Produkte aufzufangen und weiter zu analysieren. Da α-Ketole kein typisches UV- Maximum besitzen erfolgte hier die Detektion bei 210 nm (Gardner, 1997, Advances in Lipid Methodology - four (Christie, W. W., ed) pp. 1-43, The Oily Press, Dundee).
Bei Pp291 wurde eine Substanz mit der gleichen Retentionszeit wie der Standard für das α-Ketol, das aus 13-HPOTE entsteht, aufgefangen, derivatisiert und mit Hilfe des GC/MS untersucht. Dabei zeigte sich das in (Fig. 7) dargestellte Chromatogramm. Das Massenspektrum ist identisch mit dem des entsprechenden α-Ketol-Standards.

Bestimmung von Enzymcharakteristika

pH-Optimum

Das pH-Optimum wurde für den Klon Pp291 am Photometer bestimmt. Dazu wurde 13-HPOTE als Substrat genutzt (ca. 25 µM in 50 mM Na-Phosphat des entsprechenden pH-Wertes). Die größte Aktivität zeigt das Enzym in einem pH- Bereich von 5,0 bis 6,0. Dies ist in Fig. 8 dargestellt.

Enzymkinetische Parameter

Pp291 wurde hinsichtlich seiner Substratspezifität vor allem gegenüber Hydroperoxiden der Arachidonsäure (HPETE) untersucht, da sie die dominierende Fettsäure dieses Organismus darstellt (Girke et al.; 1998, Plant J. 15, 39-48). Dabei zeigte sich das in Fig. 9 dargestellte Verhältnis der Umsetzungsgeschwindigkeiten. Demnach wird 8-HPETE von den hier untersuchten Hydroperoxiden am schnellsten umgesetzt. Danach folgen 13-HPOTE, 9-HPODE und 11-HPETE im Verhältnis 8- HPETE : 13-HPOTE : 9-HPODE : 11-HPETE, 100 : 70 : 60 : 57.

Überexpression zur Erzeugung einer erhöhten Pathogenresistenz

Zur Klonierung in binäre Vektoren werden die cDNAs von Pp291 und Pp364 mit BamHI und NotI restringiert und in einen mit BamHI und NotI geschnittenen pCRScript-Vektor überführt. Aus diesem Vektor werden sie anschliessend mit SaII herausgeschnitten und in einen entsprechend mit SaII geschnittenen pBinAR Vektor ligiert. Durch Kontrollschnitte mit BamHI und Sequenzierung werden die Klone ermittelt, in denen die Gene in sense-Orientierung vorliegen.

Transformation in Arabidopsis thaliana

Unter Verwendung dieser pBinAR Vektoren enthaltend je eine Pp291 und Pp364 cDNA in sense-Orientierung wird Agrobacterium tumefaciens (C58C1 pMP90) transformiert. Anschließend werden Wildtyp Arabidopsis thaliana-Pflanzen (cv. Columbia) mit dem jeweiligen transformierten Agrobacterium tumefaciens Stamm auf Grundlage einer modifizierten Methode der Vakuum Infiltrationsmethode nach Clough und Bent (Clough, S. and Bent A., Plant J. 1998, 16 (6): 735-43) und nach Bechtold, et al. (Bechtold, N. et al., CRAcad Sci Paris 1993, 1144 (2): 204-212) transformiert.
Samen der Primärtransformanden werden auf Grundlage der Kanamycin-Resistenz gescreent, indem Saatgut auf Kanamycin-haltigen MS-Platten (MS-Medium (Sigma) mit 40 mg/l, Kanamycin, 10 mg/l, Benomyl und 100 mg/l, Timentin) ausgelegt wird. Kanamycin-resistente Keimlinge werden nach 2 Wochen in Erde transferiert und als vollentwickelte Pflanzen zur phänotypischen und molekularen Analyse verwendet.
Aus den transgenen Pflanzen, die mit Pp291 und Pp364 in sense-Orientierung transformiert worden sind, werden diejenigen ausgewählt, in denen es zu keinem Kosuppressionseffekt gekommen ist. Dazu wird gesamt-RNA aus den Pflanzen isoliert und mittels Real-Time PCR (Perkin-Elmer) das Vorliegen des Messengers nachgewiesen. Die so identifizierten transgenen Pflanzen wurden mit verschiedenen Pathogenen infiziert. Dazu zählten Blumeria graminis f. sp. hordei und f. sp. tritici, Pythium spec., Albugo spec., Rhizoctonia solani, Peronospora parasitica, Erysiphe crucifearum, E. cichoreacearum, Alternaria brassicicola, Botrytis cinerea, Sclerotium rolfsii, Sclerotinia sclerotium, Fusarium oxysporum, F. culmorum, F. graminearum, F. nivale oder Pseudomonas syringae.
Das Ergebnis, d. h. der makroskopische Resistenzgrad der Pflanze gegenüber dem pathogenen Pilz bzw. Bakterium, wurde u. a. unter Zuhilfenahme von Fluoreszenz- und Lichtmikroskopie analysiert. Dabei zeigte sich, dass die Pp291- und Pp364- transgenen Arabidopsis-Pflanzen eine erhöhte Resistenz gegen die erwähnten Pathogene aufwiesen im Vergleich zum Wildtyp.

Transformation in Gerste

Gerste cv Pallas Blattsegmente wurden mit einer cDNA von Pp291 bzw. Pp364, die in dem GFP-Expressionsvektor (Green Fluorescence Protein) vorlagen, transformiert. Anschließend wurden die Blätter mit dem pathogenen Pilz Blumeria graminis f. sp. hordei (Echter Gerstenmehltau) inokuliert und das Ergebnis nach 48 h mittels Licht- und Fluoreszenzmikroskopie analysiert. Die Penetration in GFPexprimierenden Zellen wurde mittels Detektion von Haustorien in lebenden Zellen und durch Bewertung der Pilzentwicklung in eben diesen Zellen beurteilt. In allen sechs Experimenten führte die Bombardierung von Gerste cv Pallas mit Pp291- bzw. Pp364-cDNA zu einer verminderten Anzahl von erfolgreich durch Blumeria graminis f. sp. hordei (Echter Gerstenmehltau) penetrierten Zellen im Vergleich zu Zellen die mit einer fremden Kontroll-cDNA (humaner Thyroidhormonrezeptor dsRNA, TR) bombardiert wurden. Der resistenzinduzierende Effekt der Pp291- bzw. Pp364-cDNA bedingte eine durchschnittliche Verminderung der Penetrationseffizienz durch Blumeria graminis f. sp. hordei um 44%.
Zur transienten Transformation von Gerste wurde ein Verfahren eingesetzt das bereits für die biloistische Einführung von cDNA in epidermale Zellen von Gerstenblättern beschrieben wurde (Schweizer P et al. (1999) Mol Plant Microbe Interact 12: 647-54; Schweizer P et al. (2000) Plant J. 2000 24: 895-903). Wolframpartikel mit einem Durchmesser von 1,1 mm (Partikeldichte 25 mg/ml) wurden mit cDNA zusammen mit Plasmid-DNA des Vektors pGFP (GFP unter Kontrolle des CaMV 35S Promotors) als Transformationsmarker beschichtet. Dazu wurden pro Schuss die nachfolgender Mengen an cDNA bzw. Reporterplasmid zur Beschichtung verwendet: 1 mg pGFP und 2 mg cDNA. Zur Microcarrier-Präparation wurden 55 mg Wolframpartikel (M 17, Durchmesser 1,1 mm; Bio-Rad, München) zweimal mit 1 ml autoklaviertem destilliertem Wasser und einmal mit 1 ml absolutem Ethanol gewaschen, getrocknet und in 1 ml 50%igem Glycerin aufgenommen (ca. 50 mg/ml Stammlösung). Die Lösung wurde mit 50%igem Glycerin auf 25 mg/ml verdünnt, vor Gebrauch gut gemischt und im Ultraschallbad suspendiert. Zur Microcarrier-Beschichtung wurden pro Schuss 1 mg Plasmid, 2 mg cDNA (1 mL), 12,5 ml Wolframpartikel-Suspension (25 mg/ml), 12,5 ml 1 M Ca(NO3)2-Lösung (pH 10) tropfenweise unter ständigem Mischen zusammengegeben, 10 min bei RT stehengelassen, kurz zentrifugiert und 20 ml vom Überstand abgenommen. Der Rest mit den Wolframpartikeln wird resuspendiert (Ultraschallbad) und ins Experiment eingesetzt.
Es wurden ca. 4 cm lange Segmente von Gerstenprimärblättern verwendet. Die Gewebe wurden auf 0,5% Phytagar (GibcoBRLt Life Technologiest, Karlsruhe) mit 20 mg/m) Benzimidazol in Petrischalen (6,5 cm Durchmesser) gelegt und direkt vor dem Partikelbeschuss an den Rändern mit einer Schablone mit einer rechteckigen Aussparung von 2,2 cm × 2,3 cm abgedeckt. Die Schalen wurden nacheinander auf den Boden der Vakuumkammer (Schweizer P. et al. (1999) Mol Plant Microbe Interact 12: 647-54) gestellt, über dem ein Nylonnetz (Maschenweite 0,2 mm, Millipore, Eschborn) als Diffusor auf einer Lochplatte eingeschoben war (5 cm über dem Boden, 11 cm unterhalb des Macrocarriers, s. u.), um Partikelklumpen zu zerstreuen und den Partikelstrom abzubremsen. Der oben an der Kammer angebrachte Macrocarrier (Plastik-Sterilfilterhalter, 13 mm, Gelman Sciences, Swinney, UK) wurde je Schuss mit 5,8 ml DNA-beschichteten Wolframpartikeln (Microcarrier, s. u.) beladen. Mit einer Membranvakuumpumpe (Vacuubrand, Wertheim) wurde der Druck um 0,9 bar in der Kammer reduziert und die Wolframpartikel mit 9 bar Heliumgasdruck auf die Oberfläche des Pflanzengewebes geschossen. Sofort danach wurde die Kammer belüftet.
Zur Markierung transformierter Zellen wurden die Blätter mit dem Plasmid (pGFP; Vektor auf pUC₁₈-Basis, CaMV 35S-Promoter/Terminator-Kassette mit insertiertem GFP-Gen; Schweizer P. et al. (1999) Mol Plant Microbe Interact 12: 647-54; zur Verfügung gestellt von Dr. P. Schweizer Schweizer P., Institut für Pflanzengenetik IPK, Gatersleben, Deutschland) beschossen. Vor dem Schießen eines anderen Plasmids wurde der Macrocarrier jeweils gründlich mit Wasser gereinigt. Nach vierstündiger Inkubation nach dem Beschuss bei leicht geöffneten Petrischalen, RT und Tageslicht wurden die Blätter mit 100 Konidien/mm des Echten Gerstenmehltaupilzes (Rasse A6) inokuliert und für weitere 40 bis 48 h unter gleichen Bedingungen inkubiert.
Blattsegmente wurden mit den beschichteten Partikeln unter Verwendung einer "particle inflow gun" bombardiert. Pro Schuss wurden 312 mg Wolframpartikel appliziert. 4 h nach der Bombardierung wurde Inokulation mit Blumeria graminis Mehltau (Rasse A6) inokuliert und nach weiteren 40 h bezüglich der Infektionsanzeichen ausgewertet. Das Ergebnis (z. B. die Penetrationseffizienz, definiert als prozentualer Anteil angegriffener Zellen, die ein reifes Haustorium und eine Sekundärhyphe ("secondary elongating hyphae") ausbilden; Berechnung siehe weiter unten) wurde mittels Fluoreszens- und Lichtmikroskopie analysiert. Eine Inokulation mit 100 Conidia/mm² ergibt eine Angriffsfrequenz von ca. 50% der transformierten Zellen. Für jedes einzelne Experiment wurde eine minimale Anzahl von 100 Interaktionsstellen ausgewertet. Transformierte (GFP exprimierende) Zellen wurden unter Anregung mit blauem Licht identifiziert. Drei verschiedene Kategorien von transformierten Zellen konnten unterschieden werden:

1. Penetrierte Zellen, die ein leicht erkennbares Haustorium beinhalten. Eine Zelle mit mehr als einem Haustorium wurde als eine Zelle gewertet.
2. Zellen, die durch ein Pilz-Appressorium zwar angegriffen wurden, aber kein Haustorium beinhalten. Eine Zelle die mehrfach von Blumeria graminis ssp. hordeum angegriffen wurden, aber kein Haustorium enthält, wurde als eine Zelle gewertet.
3. Zellen die nicht durch Blumeria graminis ssp. hordeum angegriffen sind.

Stomatazellen und Stomatanebenzellen wurden von der Bewertung ausgeschlossen. Oberflächenstrukturen von Blumeria graminis ssp. hordeum wurden mittels Lichtmikroskopie und Fluoreszenzfärbung des Pilzes mit 0.1% Calcofluor (w/v in Wasser) für 30 sec analysiert. Die Entwicklung des Pilzes kann leicht durch Fluoreszenzmikroskopie nach Anfärbung mit Calcofluor evaliert werden. In Pp291- bzw. Pp364-dsRNA transformierten Zellen entwickelt der Pilz zwar ein primäres und ein appressoriales "Germ-Tube" aber kein Haustorium. Haustoriumausbildung ist eine Vorbedingung für die Bildung einer Sekundärhyphe.
Die relative Penetrationseffizien (RPE) errechnet sich als Differenz aus der Penetrationseffizien bei transformierten Zellen (Transformation mit Pp291- bzw. Pp364-cDNA) und der Penetrationseffizienz bei untransformierten Zellen (hier: durchschnittliche Penetrationseffizienz 57%). Die prozentuale RPE (%-RPE) errechnet sich aus der RPE minus 1 und multipliziert mit 100.
RPE = [PE bei transformierten Zellen]
[PE bei untransformierten Zellen]
%-RPE = 100 × (RPE-1).
Der %-RPE-Wert (Abweichung von der durchschnittlichen Penetrationseffizienz der Kontrolle) dient der Bestimmung des Suszeptibilität von Zellen, die mit pp291- bzw. Pp364-cDNA transfiziert sind.
Bei der Kontroll-cDNA wurde bei fünf unabhängigen Versuchen kein Unterschied zwischen der Transfektion mit der Kontroll-cDNA und Wasser bezüglich der PenetrationsefFizienz von Blumeria graminis ssp. hordeum beobachtet.
Um einen Einfluss der cDNA auf die Transformationsrate oder Überlebensrate der angegriffenen Zellen auszuschließen, wurde die Anzahl der GFP-exprimierenden Zellen zwischen Kontroll- und Pp291- bzw. Pp364-cDNA Experimenten verglichen. Die Pp291- bzw. Pp364-cDNA hatten keinen Einfluß auf die Gesamtanzahl- oder die Anzahl der angegriffenenen GFP-exprimierenden Zellen.
Die Transfektionsrate mit Pp291 und Pp364 führte zu einer drastischen Abnahme der Penetrationsfrequenz von Blumeris graminis f. sp. hordei (durchschnittlicher %-RPE- Wert = -30%). Figurenbeschreibung Fig. 1:
Affinitätsaufreinigung des Klons Pp291 (A) Elution mit pH-Gradient: M = Marker; 1 = Leervektor pQE30 (nicht induziert); 2 = pQE30 (mit IPTG induziert); 3 = nicht induzierter Pp291; 4 = induzierter Pp291; 5 = Überstand nach 1. Ultrazentrifugation; 6 = Überstand nach 2. Ultrazentrifugation; 7 = Durchfluß; 8, 9, 10 = Waschschritte pH 8, pH 7, pH 6; 11, 12 = Elutionsschritte pH 5, pH 4; (B) Elution mit Imidazolgradient: M = Marker; 1 bis 11 steigende Imidazolkonzentration (mM): 0, 20, 40, 60, 80, 100, 125, 150, 200, 250, 300.
Fig. 2:
Photometrischer Aktivitätstest: Dargestellt ist die Abnahme der Absorption bei 234 nm einer Hydroperoxid-Lösung nach Zusatz eines Zelllysats des Klons Pp291 (C), einer 1 : 50 Verdünnung dieses Zelllysats (B) bzw. des Leervektors pQE30 (A).
Fig. 3:
Elutionsprofil der HPLC-Analyse von Hydrazonen als Derivate flüchtiger Aldehyde, die bei der Umsetzung von Hydroperoxiden mit Divinylether- Synthase entstehen: Nachweis von (2E)-Nonenal nach Behandlung von Colnelsäure (einem Divinylether) mit dem Derivatisierungsreagenz für Aldehyde.
Fig. 4:
Elutionsprofil der HPLC-Analyse von Katalyseprodukten (Aldehyden) des Enzyms DES kodiert durch den Klon Pp364 mit den Substraten 13-HPOTE und 9-HPODE. Diese wurden als (2E)-Hexenal und (2E)-Nonenal anhand ihrer Retentionszeiten identifiziert.
Fig. 5:
Elutionsprofil der HPLC-Analyse nicht-flüchtiger Produkte der Umsetzung von Hydroperoxiden durch das Enzym AOS kodiert durch den Klon Pp291.
Fig. 6:
Elutionsprofil der HPLC-Analyse nicht-flüchtiger Produkte der Umsetzung von Hydroperoxiden durch das Enzym DES kodiert durch den Klon Pp364; a = Zellysat; b = gereinigtes Enzym.
Fig. 7:
GC/MS-Chromatogramm des Produkts des durch Katalyse des CYP74- Enzyms kodiert durch den Klon Pp291 entstanden ist. Das Signal bei 18,2 min hat das im Fenster dargestellte Massenspektrum.
Fig. 8:
Relative Enzymaktivität des Enzyms kodiert durch den Klon Pp291 in Abhängigkeit vom pH-Wert.
Fig. 9:
Relative Umsetzungsgeschwindigkeiten verschiedener Substrate durch das CYP74-Enzym kodiert durch den Klon Pp291 (Substratspezifität); Substratkonzentration jeweils 20 µM; die Bestimmung erfolgte am Photometer; n. m. = nicht messbar.

Claims

1. Allenoxid-Synthase mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 2 oder deren Isoenzyme.

2. Divinylether-Synthase mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 4 oder deren Isoenzyme.

3. Enzyme gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie sowohl 9-HPOD/TE als auch 13-HPOD/TE als Substrat umsetzen.

4. Enzyme gemäß einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Moos oder höheren Pflanzen stammen.

5. Enzyme gemäß einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Physcomitrella patens stammen.

6. Isolierte Nukleotidsequenz kodierend für eine Allenoxid-Synthase gemäß Anspruch 1 beteiligt an der Biosynthese von mehrfach ungesättigten Fettsäuren ausgewählt aus

a) einer Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1,

b) einer Nukleotidsequenz, die wenigstens 70% Identität mit der in SEQ ID No. 1 gezeigten Nukleotidsequenz aufweist,

c) einer zu a) oder b) komplementären Nukleotidsequenz.

7. Isolierte Nukleotidsequenz kodierend für eine Divinylether-Synthase gemäß Anspruch 2 beteiligt an der Biosynthese von mehrfach ungesättigten Fettsäuren ausgewählt aus

a) einer Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 3,

b) einer Nukleotidsequenz, die wenigstens 70% Identität mit einer der in SEQ ID No. 3 gezeigten Nukleotidsequenz aufweist,

c) einer zu a) oder b) komplementären Nukleotidsequenz.

8. Isolierte Nukleotidsequenz gemäß einem der Ansprüche 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Moos oder höheren Pflanzen stammt.

9. Isolierte Nukleotidsequenz gemäß einem der Ansprüche 6-8, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Physcomitrella patens stammt.

10. Genkonstrukt enthaltend wenigstens eine Nukleotidsequenz gemäß einem der Ansprüche 6-9, Allele, Derivate oder Teile davon sowie operativ damit verknüpfte regulatorische Nukleotidsequenzen.

11. Vektor enthaltend wenigstens eine isolierte Nukleotidsequenz gemäß einem der Ansprüche 6-9, Allele, Derivate und/oder Teile und/oder ein Genkonstrukt gemäß Anspruch 10 sowie zusätzliche Nukleotidsequenzen zur Selektion und/oder Replikation in einer Wirtszelle und/oder zur Intregration in das Genom einer Wirtszelle.

12. Transgene Pflanzenzelle, ganze Pflanze und/oder deren Nachkommen, enthaltend in replizierbarer Form wenigstens eine isolierte Nukleotidsequenz gemäß einem der Ansprüche 6-9, Allele, Derivate und/oder Teile davon und/oder ein Genkonstrukt gemäß Anspruch 10 und/oder einen Vektor gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine verstärkte Expression der Nukleotidsequenz kodierend für eine Allenoxid-Synthase und/oder der Nukleotidsequenz kodierend für eine Divinylether-Synthase im Vergleich zu der endogen vorliegenden Genexpression aufweist, die zu einer gesteigerten Resistenz von Pflanzen gegenüber Krankheitserregern führt.

13. Transgene Pflanzenzelle, ganze Pflanze und/oder deren Nachkommen gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens eine Nukleotidsequenz gemäß einem der Ansprüche 6-9, Allele, Derivate und/oder Teile davon und/oder ein Genkonstrukt gemäß Anspruch 10 und/oder ein Vektor gemäß Anspruch 11 extrachromosomal vorliegt und/oder stabil in das pflanzliche Genom integriert ist.

14. Transgene Pflanzenzelle, ganze Pflanze und/oder deren Nachkommen gemäß einem der Ansprüche 12 oder 13, welche eine Allenoxid-Synthase gemäß Anspruch 1, Isoenzyme, Derivate und/oder Teile davon und/oder eine Divinylether-Synthase gemäß Anspruch 2, Isoenzyme, Derivate und/oder Teile davon mit einer erhöhten spezifischen Aktivität, im Vergleich zu der entsprechenden endogenen spezifischen Enzymaktivität in einer Pflanzenzelle, aufweist.

15. Transgene Pflanzenzelle, ganze Pflanze und/oder deren Nachkommen gemäß einem der Ansprüche 12-14, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Nutzpflanze oder deren Zellen, bevorzugt der Familie der Solanaceae oder Getreide ist, besonders bevorzugt Kartoffel, Gerste oder Weizen ist.

16. Verfahren zur Steigerung der Resistenz von Pflanzen gegenüber Krankheitserregern, dadurch gekennzeichnet, daß eine Nukleotidsequenz gemäß einem der Ansprüche 6-9 einzeln oder in Kombination und/oder ein Genkonstrukt gemäß Anspruch 10 und/oder ein Vektor gemäß Anspruch 11 in replizierbarer Form in Pflanzenzellen übertragen wird und aus den so transformierten Pflanzenzellen ganze Pflanzen regeneriert werden.

17. Verfahren gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß als pflanzliche Zellen solche von Nutzpflanzen, bevorzugt der Familie der Solanaceae oder von Getreide, besonders bevorzugt Kartoffel, Gerste oder Weizen eingesetzt werden.

18. Verwendung wenigstens einer Nukleotidsequenz gemäß einem der Ansprüche 6-9 zur Steigerung der Resistenz von Pflanzenzellen, ganzen Pflanzen und/oder deren Nachkommen gegenüber Krankheitserregern.

19. Verwendung von wenigstens einem Enzym gemäß einem der Ansprüche 1-8 zur Steigerung der Resistenz von Pflanzenzellen, ganzen Pflanzen und/oder deren Nachkommen gegenüber Krankheitserregern.

20. Verwendung gemäß Anspruch 19, wobei eine erhöhte spezifische Aktivität wenigstens eines Enzyms gegenüber der entsprechenden endogenen spezifischen Enzym-Aktivität eine Steigerung der Resistenz der Pflanzenzellen oder Pflanzen gegenüber Krankheitserregern um 20-90%, bevorzugt um 30-80% und besonders bevorzugt um 40-70% bewirkt.

21. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 19 oder 20, wobei wenigstens ein Enzym eine erhöhte Resistenz gegenüber Mehltaupilzen, bevorzugt Blumeria graminis f. sp. hordei oder f. sp. tritici und/oder Phytophtora infestans bewirkt.