DE10219934A1

DE10219934A1 - New proteins with (R) -hydroxynitrile lyase activity

Info

Publication number: DE10219934A1
Application number: DE10219934A
Authority: DE
Inventors: Thomas Friedrich; Maria Keseler; Bernhard Hauer
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 2002-05-03
Filing date: 2002-05-03
Publication date: 2003-11-20
Also published as: WO2003093467A1; AU2003232256A1

Abstract

Die Erfindung betrifft neuartige Proteine mit (R)-Hydroxynitril Lyase-Aktivität pflanzlichen Ursprungs, dafür kodierende Nukleinsäuresequenzen, Expressionskassetten, Vektoren und rekombinante Mikroorganismen; Verfahren zur Herstellung dieser Proteine und deren Verwendung zur enzymatischen, insbesondere enantioselektiven enzymatischen Synthese von Mandelonitril und/oder Mandelsäure.The invention relates to novel proteins with (R) -hydroxynitrile lyase activity of plant origin, nucleic acid sequences coding therefor, expression cassettes, vectors and recombinant microorganisms; Process for the production of these proteins and their use for the enzymatic, in particular enantioselective, enzymatic synthesis of mandelonitrile and / or mandelic acid.

Description

Die Erfindung betrifft neuartige Proteine mit (R)-Hydroxynitril Lyase ((R)-Mandelonitril Lyase)- Aktivität pflanzlichen Ursprungs, dafür kodierende Nukleinsäuresequenzen, Expressionskassetten, Vektoren und rekombinante Mikroorganismen; Verfahren zur Herstellung dieser Proteine und deren Verwendung zur enzymatischen, insbesondere enantioselektiven enzymatischen Synthese von Mandelonitril und/oder Mandelsäure. The invention relates to novel proteins with (R) -hydroxynitrile lyase ((R) -mandelonitrile lyase) - Activity of plant origin, nucleic acid sequences coding therefor, Expression cassettes, vectors and recombinant microorganisms; Process for the production of these proteins and their use for enzymatic, in particular enantioselective enzymatic Synthesis of mandelonitrile and / or mandelic acid.

Background of the Invention

Mandelsäure ist ein wichtiges, optisch aktives Zwischenprodukt in der chemischen Synthese. (R)- und (S)-Mandelsäure werden beide nachgefragt. Optisch aktive Mandelsäure wird entweder aus (R/S)-Mandelonitril durch enzymatische Verseifung eines Enantiomeren oder direkt aus HCN und Benzaldehyd durch enzymatische Synthese mit Hilfe von Hydroxynitril Lyasen hergestellt. Diese Lyasen sind insbesondere aus Pflanzen zugänglich. Es gibt bisher nur eine begrenzte Anzahl von Hydroxynitril Lyasen. Mandelic acid is an important, optically active intermediate in chemical synthesis. (R) - and (S) -mandelic acid are both in demand. Optically active mandelic acid is either from (R / S) -mandelonitrile by enzymatic saponification of an enantiomer or directly from HCN and benzaldehyde by enzymatic synthesis using hydroxynitrile lyases manufactured. These lyases are particularly accessible from plants. So far there is only one limited number of hydroxynitrile lyases.

Brief description of the invention

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war daher die Bereitstellung weiterer (R)-Hydroxynitril Lyasen aus neuen pflanzlichen Quellen, um für die enzymatische Synthese von Mandelonitril- und Mandelsäure-Enantiomeren auf eine breitere Palette von brauchbaren Enzymen zurückgreifen zu können. Insbesondere sollten Enzyme bereitgestellt werden, welche im Vergleich zum entsprechenden Enzym aus Mandel (Prunus dulcis) eine erhöhte Stabilität gegenüber oberflächenaktiven Substanzen, wie z. B. SDS (Natriumdodecylsulfat), aufweisen. The object of the present invention was therefore to provide further (R) -hydroxynitrile Lyases from new plant sources, for the enzymatic synthesis of mandelonitrile and Mandelic acid enantiomers fall back on a wider range of useful enzymes to be able to. In particular, enzymes should be provided which are compared to the corresponding enzyme from almond (Prunus dulcis) an increased stability against surface-active substances, such as. B. SDS (sodium dodecyl sulfate).

Diese Aufgabe konnte überraschenderweise durch die Bereitstellung neuer Proteins mit (R)- Hydroxynitril Lyase-Aktivität (E.C.4.1.2.10) isolierbar aus Blättern von Prunus laurocerasus oder Samen von Sorbus aucuparia, gelöst. Surprisingly, this task was accomplished by providing new protein with (R) - Hydroxynitrile lyase activity (E.C.4.1.2.10) isolable from leaves of Prunus laurocerasus or Sorbus aucuparia seeds, dissolved.

Detailed description of the invention

Insbesondere wurde die obige Aufgabe gelöst durch Bereitstellung von

a) Proteinen isolierbar aus Blättern von Prunus laurocerasus, die gekennzeichnet sind durch eine Aminosäuresequenz umfassend wenigstens 10, wie z. B. 10 bis 15, aufeinanderfolgende Aminosäurereste gemäß SEQ ID NO: 1, 2, oder 3 oder funktionale Äquivalente davon; sowie
b) Proteinen isolierbar aus Samen von Sorbus aucuparia, gekennzeichnet durch eine Aminosäuresequenz umfassend wenigstens 10, wie z. B. 10 bis 24, aufeinanderfolgende Aminosäurereste gemäß SEQ ID NO: 4 oder funktionale Äquivalente davon;

wobei das funktionale Äquivalent ebenfalls wenigstens eine Teilsequenz von wenigstens 5, wie z. B. 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr aufeinanderfolgenden Aminosäureresten aus einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, 2, 3 oder 4 umfasst.
LAETSAHDFSYLKFV (SEQ IN NO: 1)
LAXTSAHDFSYLKFV (SEQ IN NO: 2)
SPTHDFEYLKFVYNA (SEQ IN NO: 3)
LATPSEHDFSYXLVVVDATDLETE (SEQ IN NO: 4)
worin X für eine beliebige Aminosäure steht. In particular, the above object was achieved by providing

a) Proteins isolable from leaves of Prunus laurocerasus, which are characterized by an amino acid sequence comprising at least 10, such as. B. 10 to 15, consecutive amino acid residues according to SEQ ID NO: 1, 2, or 3 or functional equivalents thereof; such as
b) Proteins isolable from seeds of Sorbus aucuparia, characterized by an amino acid sequence comprising at least 10, such as. B. 10 to 24, consecutive amino acid residues according to SEQ ID NO: 4 or functional equivalents thereof;

the functional equivalent also having at least a partial sequence of at least 5, such as. B. 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more consecutive amino acid residues from an amino acid sequence according to SEQ ID NO: 1, 2, 3 or 4.
LAETSAHDFSYLKFV (SEQ IN NO: 1)
LAXTSAHDFSYLKFV (SEQ IN NO: 2)
SPTHDFEYLKFVYNA (SEQ IN NO: 3)
LATPSEHDFSYXLVVVDATDLETE (SEQ IN NO: 4)
where X stands for any amino acid.

Nichtlimitierende Beispielen für bevorzugte Teilsequenzen sind:
SEQ ID NO: 3: aa1-aa5, aa1-aa6 oder aa1-aa7
SEQ ID NO: 4: aa1-aa5, aa1-aa7, aa4-aa8, aa13-aa17, aa13-aa18, aa13-aa23 (aa = Aminosäurerest). Non-limiting examples of preferred partial sequences are:
SEQ ID NO: 3: aa1-aa5, aa1-aa6 or aa1-aa7
SEQ ID NO: 4: aa1-aa5, aa1-aa7, aa4-aa8, aa13-aa17, aa13-aa18, aa13-aa23 (aa = amino acid residue).

Die oben genannten Proteine werden im Folgenden der Einfachheit halber als (R)-Hydroxynitril Lyasen bezeichnet. The above proteins are hereinafter referred to as (R) -hydroxynitrile for simplicity Denoted lyases.

"Funktionale Äquivalente" oder Analoga der konkret offenbarten Polypeptide oder Proteine sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung insbesondere von den konkret Beschriebenen verschiedene Polypeptide oder Proteine, welche weiterhin die gewünschte biologische Aktivität, insbesondere Enzymaktivität besitzen. "Functional equivalents" or analogs of the specifically disclosed polypeptides or proteins in the context of the present invention, in particular from those specifically described various polypeptides or proteins that continue to have the desired biological activity, in particular have enzyme activity.

Unter "funktionalen Äquivalenten" versteht man erfindungsgemäß insbesondere Mutanten, welche in wenigstens einer der oben genannten Sequenzpositionen eine andere als die konkret genannte Aminosäure aufweisen aber trotzdem wenigstens eine erfindungsgemäße biologische Aktivität besitzen. "Funktionale Äquivalente" umfassen somit die durch eine oder mehrere Aminosäure-Additionen, -Substitutionen, -Deletionen und/oder -Inversionen erhältlichen Mutanten, wobei die genannten Veränderungen in jeglicher Sequenzposition auftreten können, solange sie zu einer Mutante mit dem erfindungsgemäßen Eigenschaftsprofil führen. Funktionale Äquivalenz ist insbesondere auch dann gegeben, wenn die Reaktivitätsmuster zwischen Mutante und unverändertem Polypeptid qualitativ übereinstimmen, d. h. beispielsweise gleiche Substrate mit unterschiedlicher Geschwindigkeit umgesetzt werden. According to the invention, “functional equivalents” means in particular mutants, which in at least one of the above sequence positions a different one than that specifically said amino acid nevertheless have at least one biological according to the invention Possess activity. "Functional equivalents" thus include those by one or more Amino acid additions, substitutions, deletions and / or inversions available mutants, the changes mentioned can occur in any sequence position as long as they lead to a mutant with the property profile according to the invention. Functional equivalence is particularly given when the reactivity pattern between mutant and unchanged qualitative match the unchanged polypeptide, d. H. for example with the same substrates different speeds can be implemented.

"Funktionale Äquivalente" umfassen natürlich auch Polypeptide welche aus anderen Quellen oder Organismen zugänglich sind, sowie natürlich vorkommende Varianten. Beispielsweise lassen sich durch Sequenzvergleich Bereiche homologer Sequenzregionen festlegen und in Anlehnung an die konkreten Vorgaben der Erfindung äquivalente Enzyme ermitteln. "Functional equivalents" naturally also include polypeptides from other sources or organisms are accessible, as well as naturally occurring variants. For example can be determined by sequence comparison areas of homologous sequence regions and in Determine equivalent enzymes based on the specific requirements of the invention.

"Funktionale Äquivalente" umfassen ebenfalls Fragmente, vorzugsweise einzelne Domänen oder Sequenzmotive, der erfindungsgemäßen Polypeptide, welche z. B. die gewünschte biologische Funktion aufweisen. "Functional equivalents" also include fragments, preferably individual domains or sequence motifs of the polypeptides according to the invention, which e.g. B. the desired one have biological function.

"Funktionale Äquivalente" umfassen außerdem Enzymformen, welche durch Variation des Kohlenhydratanteils (chemischen Modifikation, teilweise oder vollständige Abspaltung oder Hinzufügung von Kohlehydratresten) aus der ursprünglichen Form erhältlich sind. "Functional equivalents" also include enzyme forms which can be obtained by varying the Carbohydrate content (chemical modification, partial or complete splitting or Addition of carbohydrate residues) are available from the original form.

"Funktionale Äquivalente" sind außerdem Fusionsproteine, welche ein der oben genannten Polypeptidsequenzen oder davon abgeleitete funktionale Äquivalente und wenigstens eine weitere, davon funktionell verschiedene, heterologe Sequenz in funktioneller N- oder C-terminaler Verknüpfung (d. h. ohne gegenseitigen wesentliche funktionelle Beeinträchtigung der Fusionsproteinteile) aufweisen. Nichtlimitierende Beispiele für derartige heterologe Sequenzen sind z. B. Signalpeptide, Enzyme oder Immunoglobuline. "Functional equivalents" are also fusion proteins which are one of the above Polypeptide sequences or functional equivalents derived therefrom and at least one further, Functionally different, heterologous sequence in functional N- or C-terminal Linking (i.e. without mutual significant functional impairment of the Have fusion protein parts). Non-limiting examples of such heterologous sequences are e.g. B. Signal peptides, enzymes or immunoglobulins.

Erfindungsgemäß mit umfasste "funktionale Äquivalente" sind Homologe zu den konkret offenbarten Polypeptiden oder Proteinen. Diese besitzen wenigstens 60%, vorzugsweise wenigstens 75% ins besondere wenigsten 85%, wie z. B. 90, 95, 96, 97 98 oder 99%, Homologie zu einer der konkret offenbarten Sequenzen, berechnet nach dem Algorithmus von Pearson und Lipman, Proc. Natl. Acad, Sci. (USA) 85(8), 1988, 2444-2448. "Functional equivalents" encompassed according to the invention are homologs to the concrete disclosed polypeptides or proteins. These have at least 60%, preferably at least 75% especially at least 85%, e.g. B. 90, 95, 96, 97 98 or 99%, homology to one the specifically disclosed sequences, calculated according to the algorithm of Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad, Sci. (USA) 85 (8), 1988, 2444-2448.

Homologe der erfindungsgemäßen Proteine oder Polypeptide können durch Mutagenese erzeugt werden, z. B. durch Punktmutation oder Verkürzung des Proteins. Der Begriff "Homolog", wie er hier verwendet wird, betrifft eine variante Form des Proteins, die als Agonist oder Antagonist der Protein-Aktivität wirkt. Homologs of the proteins or polypeptides according to the invention can be obtained by mutagenesis are generated, e.g. B. by point mutation or shortening of the protein. The term "homolog", as used here relates to a variant form of the protein, known as an agonist or Antagonist of protein activity acts.

Homologe des erfindungsgemäßen Proteine können durch Screening kombinatorischer Banken von Mutanten, wie z. B. Verkürzungsmutanten, identifiziert werden. Beispielsweise kann eine variegierte Bank von Protein-Varianten durch kombinatorische Mutagenese auf Nukleinsäureebene erzeugt werden, wie z. B. durch enzymatisches Ligieren eines Gemisches synthetischer Oligonukleotide. Es gibt eine Vielzahl von Verfahren, die zur Herstellung von Banken potentieller Homologer aus einer degenerierten Oligonukleotidsequenz verwendet werden können. Die chemische Synthese einer degenerierten Gensequenz kann in einem DNA-Syntheseautomaten durchgeführt werden, und das synthetische Gen kann dann in einen geeigneten Expressionsvektor ligiert werden. Die Verwendung eines degenerierten Gensatzes ermöglicht die Bereitstellung sämtlicher Sequenzen in einem Gemisch, die den gewünschten Satz an potentiellen Proteinsequenzen codieren. Verfahren zur Synthese degenerierter Oligonukleotide sind dem Fachmann bekannt (Z. B. Narang, S. A. (1983) Tetrahedron 39: 3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura et al., (1984) Science 198: 1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11: 477). Homologs of the proteins according to the invention can be obtained by screening combinatorial libraries of mutants such as B. shortening mutants can be identified. For example, a varied bank of protein variants by combinatorial mutagenesis Nucleic acid level are generated, such as. B. by enzymatic ligation of a mixture of synthetic Oligonucleotides. There are a variety of processes that are potential for making banks Homologs from a degenerate oligonucleotide sequence can be used. The Chemical synthesis of a degenerate gene sequence can be done in a DNA synthesizer and the synthetic gene can then be converted into an appropriate one Expression vector can be ligated. The use of a degenerate gene set enables the Provision of all sequences in a mixture, which the desired set of potential Encode protein sequences. Methods for the synthesis of degenerate oligonucleotides are the Known to those skilled in the art (e.g. Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39: 3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura et al., (1984) Science 198: 1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11: 477).

Zusätzlich können Banken von Fragmenten des Protein-Codons verwendet werden, um eine variegierte Population von Protein-Fragmenten zum Screening und zur anschließenden Selektion von Homologen eines erfindungsgemäßen Proteins zu erzeugen. Bei einer Ausführungsform kann eine Bank von kodierenden Sequenzfragmenten durch Behandeln eines doppelsträngigen PC(R)-Fragmentes einer kodierenden Sequenz mit einer Nuklease unter Bedingungen, unter denen ein Nicking nur etwa einmal pro Molekül erfolgt, Denaturieren der doppelsträngigen DNA, Renaturieren der DNA unter Bildung doppelsträngiger DNA, die Sense-/Antisense-Paare von verschiedenen genickten Produkten umfassen kann, Entfernen einzelsträngiger Abschnitte aus neu gebildeten Duplices durch Behandlung mit S1-Nuclease und Ligieren der resultierenden Fragmentbank in einen Expressionsvektor erzeugt werden. Durch dieses Verfahren kann eine Expressionsbank hergeleitet werden, die N-terminale, C-terminale und interne Fragmente mit verschiedenen Größen des erfindungsgemäßen Proteins kodiert. In addition, banks of fragments of the protein codon can be used to generate a varied population of protein fragments for screening and subsequent To generate selection of homologues of a protein according to the invention. In one embodiment can a bank of coding sequence fragments by treating a double stranded PC (R) fragment of a coding sequence with a nuclease under conditions under which are nicked only about once per molecule, denaturing the double-stranded DNA, Renaturate the DNA to form double-stranded DNA, the sense / antisense pairs of can include various nodded products, removing single-stranded sections newly formed duplexes by treatment with S1 nuclease and ligating the resulting Fragment bank can be generated in an expression vector. Through this procedure, a Expression bank can be derived using the N-terminal, C-terminal and internal fragments encoded different sizes of the protein according to the invention.

Im Stand der Technik sind mehrere Techniken zum Screening von Genprodukten kombinatorischer Banken, die durch Punktmutationen oder Verkürzung hergestellt worden sind, und zum Screening von cDNA-Banken auf Genprodukte mit einer ausgewählten Eigenschaft bekannt. Diese Techniken lassen sich an das schnelle Screening der Genbanken anpassen, die durch kombinatorische Mutagenese von erfindungsgemäßer Homologer erzeugt worden sind. Die am häufigsten verwendeten Techniken zum Screening großer Genbanken, die einer Analyse mit hohem Durchsatz unterliegen, umfassen das Klonieren der Genbank in replizierbare Expressionsvektoren, Transformieren der geeigneten Zellen mit der resultierenden Vektorenbank und Exprimieren der kombinatorischen Gene unter Bedingungen, unter denen der Nachweis der gewünschten Aktivität die Isolation des Vektors, der das Gen codiert, dessen Produkt nachgewiesen wurde, erleichtert. Recursive-Ensemble-Mutagenese (REM), eine Technik, die die Häufigkeit funktioneller Mutanten in den Banken vergrößert, kann in Kombination mit den Screeningtests verwendet werden, um Homologe zu identifizieren (Arkin und Yourvan (1992) PNAS 89: 7811-7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3): 327-331). There are several techniques for screening gene products in the prior art combinatorial banks created by point mutations or truncation, and at Screening of cDNA libraries for gene products with a selected property is known. These techniques can be adapted to the rapid screening of the gene banks by combinatorial mutagenesis of homologs according to the invention have been generated. The most Most commonly used techniques for screening large gene banks that are analyzed using High throughput include cloning the gene bank into replicable ones Expression vectors, transform the appropriate cells with the resulting vector library and Express the combinatorial genes under conditions under which the detection of desired activity the isolation of the vector encoding the gene, its product was proven relieved. Recursive Ensemble Mutagenesis (REM), a technique that measures frequency Functional mutants in banks can be enlarged in combination with the screening tests used to identify homologues (Arkin and Yourvan (1992) PNAS 89: 7811-7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6 (3): 327-331).

Bevorzugte erfindungsgemäße funktionale Äquivalente weisen eine von SEQ ID NO: 1, 2, 3 oder 4 in mindestens einer Position abweichende Sequenz auf, wobei diese Veränderung in der Sequenz die (R)-Hydroxynitril Lyase-Aktivität vorzugsweise nur unwesentlich, d. h. nicht um mehr als etwa 90%, insbesondere 50% oder nicht mehr als 30% verändert. Diese Veränderung kann unter Verwendung eines Referenzsubstrates, wie z. B. (R)-Mandelonitril unter standardisierten Bedingungen (wie z. B. 40 mM Substrat, 0,2 M Citratpuffer, pH 5, T = 20°C) bestimmt werden. Preferred functional equivalents according to the invention have one of SEQ ID NO: 1, 2, 3 or 4 in at least one position differing sequence, this change in the Sequence the (R) -hydroxynitrile lyase activity preferably only insignificantly, i. H. not more than changed about 90%, especially 50% or not more than 30%. This change can using a reference substrate, such as. B. (R) -mandelonitrile under standardized Conditions (such as 40 mM substrate, 0.2 M citrate buffer, pH 5, T = 20 ° C) can be determined.

Gegenstand der Erfindung sind insbesondere solche funktionalen Äquivalente, welche wenigstens eine Teilsequenz von mindestens 10 aufeinanderfolgenden Aminosäuren aus der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1, 2, 3 oder 4 umfassen und obige Aktivität gegenüber dem Referenzsubstrat besitzen. The invention relates in particular to such functional equivalents which at least one partial sequence of at least 10 consecutive amino acids from the sequence according to SEQ ID NO: 1, 2, 3 or 4 and the above activity against the Have reference substrate.

Die erfindungsgemäßen (R)-Hydroxynitril Lyasen weisen vorzugsweise ein Molekulargewicht von etwa 85 ± kDa, bestimmt durch SDS-Gelelektrophorese unter reduzierenden Bedingungen auf. The (R) -hydroxynitrile lyases according to the invention preferably have a molecular weight of about 85 ± kDa, determined by SDS gel electrophoresis under reducing conditions.

Die Erfindung umfasst auch Polynukleotide, die für die obigen (R)-Hydroxynitril Lyasen kodieren. The invention also encompasses polynucleotides encoding the above (R) -hydroxynitrile lyases.

Gegenstand der Erfindung sind insbesondere Nukleinsäuresequenzen (einzel- und doppelsträngige DNA- und RNA-Sequenzen, wie z. B. cDNA und mRNA), kodierend für eines der obigen Polypeptide oder Proteine und deren funktionalen Äquivalenten, welche z. B. unter Verwendung künstlicher Nukleotidanaloga zugänglich sind. The invention relates in particular to nucleic acid sequences (single and double-stranded DNA and RNA sequences, such as. B. cDNA and mRNA) coding for one of the above Polypeptides or proteins and their functional equivalents, which e.g. B. using artificial nucleotide analogs are accessible.

Die Erfindung betrifft sowohl isolierte Nukleinsäuremoleküle, welche für erfindungsgemäße Polypeptide bzw. Proteine oder biologisch aktive Abschnitte davon kodieren, sowie Nukleinsäurefragmente, die z. B. zur Verwendung als Hybridisierungssonden oder Primer zur Identifizierung oder Amplifizierung von erfindungsgemäßer kodierenden Nukleinsäuren verwendet werden können. The invention relates both to isolated nucleic acid molecules which are suitable for the invention Encode polypeptides or proteins or biologically active sections thereof, and Nucleic acid fragments, e.g. B. for use as hybridization probes or primers for identification or amplification of coding nucleic acids according to the invention can be used can.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle können zudem untranslatierte Sequenzen vom 3'- und/oder 5'-Ende des kodierenden Genbereichs enthalten The nucleic acid molecules of the invention can also untranslated sequences from Contain 3 'and / or 5' end of the coding gene region

Ein "isoliertes" Nukleinsäuremolekül wird von anderen Nukleinsäuremolekülen abgetrennt, die in der natürlichen Quelle der Nukleinsäure zugegen sind und kann überdies im wesentlichen frei von anderem zellulären Material oder Kulturmedium sein, wenn es durch rekombinante Techniken hergestellt wird, oder frei von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien sein, wenn es chemisch synthetisiert wird. An "isolated" nucleic acid molecule is separated from other nucleic acid molecules which are in the natural source of nucleic acid is present and can also be essentially free of other cellular material or culture medium if by recombinant Techniques are manufactured, or be free of chemical precursors or other chemicals, if it is chemically synthesized.

Ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül kann mittels molekularbiologischer Standard- Techniken und der erfindungsgemäß bereitgestellten Sequenzinformation isoliert werden. Beispielsweise kann cDNA aus einer geeigneten cDNA-Bank isoliert werden, indem eine der konkret offenbarten vollständigen Sequenzen oder ein Abschnitt davon als Hybridisierungssonde und Standard-Hybridisierungstechniken (wie z. B. beschrieben in Sambrook, J., Fritsch, E. F. und Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) verwendet werden. Überdies läßt sich ein Nukleinsäuremolekül, umfassend eine der offenbarten Sequenzen oder ein Abschnitt davon, durch Polymerasekettenreaktion isolieren, wobei die Oligonukleotidprimer, die auf der Basis dieser Sequenz erstellt wurden, verwendet werden. Die so amplifizierte Nukleinsäure kann in einen geeigneten Vektor kloniert werden und durch DNA-Sequenzanalyse charakterisiert werden. Die erfindungsgemäßen Oligonukleotide können ferner durch Standard- Syntheseverfahren, z. B. mit einem automatischen DNA-Synthesegerät, hergestellt werden. A nucleic acid molecule according to the invention can be Techniques and the sequence information provided according to the invention are isolated. For example, cDNA can be isolated from a suitable cDNA library by using one of the full sequences or a portion thereof specifically disclosed as a hybridization probe and standard hybridization techniques (as described, for example, in Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). In addition, a nucleic acid molecule comprising one of the disclosed sequences or a Isolate section thereof by polymerase chain reaction, the oligonucleotide primers which were created based on this sequence. The so amplified Nucleic acid can be cloned into a suitable vector and by DNA sequence analysis be characterized. The oligonucleotides according to the invention can furthermore be Synthetic processes, e.g. B. with an automatic DNA synthesizer.

Die Erfindung umfasst weiterhin die zu den konkret beschriebenen Nukleotidsequenzen komplementären Nukleinsäuremoleküle oder einen Abschnitt davon. The invention further includes the nucleotide sequences specifically described complementary nucleic acid molecules or a portion thereof.

Die erfindungsgemäß Nukleotidsequenzen ermöglichen die Erzeugung von Sonden und Primern, die zur Identifizierung und/oder Klonierung von homologer Sequenzen in anderen Zelltypen und Organismen verwendbar sind. Solche Sonden bzw. Primer umfassen gewöhnlich einen Nukleotidsequenzbereich, der unter stringenten Bedingungen an mindestens etwa 12, vorzugsweise mindestens etwa 25, wie z. B. etwa 40, 50 oder 75 aufeinanderfolgende Nukleotide eines Sense-Stranges einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz oder eines entsprechenden Antisense-Stranges hybridisiert. The nucleotide sequences according to the invention enable the generation of probes and Primers used to identify and / or clone homologous sequences in others Cell types and organisms can be used. Such probes or primers usually include one Nucleotide sequence region which, under stringent conditions, on at least about 12, preferably at least about 25, e.g. B. about 40, 50 or 75 consecutive nucleotides one Sense strand of a nucleic acid sequence according to the invention or a corresponding one Antisense strands hybridized.

Weitere erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen sind abgeleitet von den für obige Aminosäuresequenzen (umfassend Teilsequenzen gemäß SEQ ID NO: 1, 2, 3 oder 4) kodierenden Nukleinsäuresequenzen und unterscheiden sich davon durch Addition, Substitution, Insertion oder Deletion einzelner oder mehrerer Nukleotide, kodieren aber weiterhin für Polypeptide mit dem gewünschten Eigenschaftsprofil, wie insbesondere die erfindungsgemäße (R)-Hydroxynitril Lyase-Anktivität. Further nucleic acid sequences according to the invention are derived from those for the above Amino acid sequences (comprising partial sequences according to SEQ ID NO: 1, 2, 3 or 4) coding Nucleic acid sequences and differ from them by addition, substitution, insertion or deletion of one or more nucleotides, but continue to code for polypeptides the desired property profile, such as in particular the (R) -hydroxynitrile according to the invention Lyase Anktivität.

Erfindungsgemäß umfasst sind auch solche Nukleinsäuresequenzen, die sogenannte stumme Mutationen umfassen oder entsprechend der Codon-Nutzung eins speziellen Ursprungs- oder Wirtsorganismus, im Vergleich zu einer konkret genannten Sequenz verändert sind, ebenso wie natürlich vorkommende Varianten, wie z. B. Spleißvarianten oder Allelvarianten, davon. Gegenstand sind ebenso durch konservative Nukleotidsubstutionen (d. h. die betreffende Aminosäure wird durch eine Aminosäure gleicher Ladung, Größe, Polarität und/oder Löslichkeit ersetzt) erhältliche Sequenzen. The invention also includes those nucleic acid sequences, the so-called dumb Mutations include or according to the codon usage of a specific origin or Host organism, are changed compared to a specifically named sequence, as well naturally occurring variants, such as B. splice variants or allele variants thereof. It is also subject to conservative nucleotide substitutions (i.e. the amino acid in question is replaced by an amino acid of the same charge, size, polarity and / or solubility) available sequences.

Gegenstand der Erfindung sind auch die durch Sequenzpolymorphismen von den konkret offenbarten Nukleinsäuren abgeleiteten Moleküle. Diese genetischen Polymorphismen können zwischen Individuen innerhalb einer Population aufgrund der natürlichen Variation existieren. Diese natürlichen Variationen bewirken üblicherweise eine Varianz von 1 bis 5% in der Nukleotidsequenz eines Gens. The invention also specifically relates to sequence polymorphisms disclosed nucleic acid derived molecules. These genetic polymorphisms can exist between individuals within a population due to natural variation. This natural variations usually cause a variance of 1 to 5% in the Nucleotide sequence of a gene.

Weiterhin umfasst die Erfindung auch Nukleinsäuresequenzen, welchen mit oben genannten kodierenden Sequenzen hybridisieren oder dazu komplementär sind. Diese Polynukleotide lassen sich bei Durchmusterung von genomischen oder cDNA-Banken auffinden und gegebenenfalls daraus mit geeigneten Primern mittels PCR vermehren und anschließend beispielsweise mit geeigneten Sonden isolieren. Eine weitere Möglichkeit bietet die Transformation geeigneter Mikroorganismen mit erfindungsgemäßen Polynukleotiden oder Vektoren, die Vermehrung der Mikroorganismen und damit der Polynukleotide und deren anschließende Isolierung. Darüber hinaus können erfindungsgemäße Polynukleotide auch auf chemischem Wege synthetisiert werden. Furthermore, the invention also encompasses nucleic acid sequences which are those mentioned above hybridize coding sequences or are complementary thereto. These polynucleotides can be found by screening genomic or cDNA banks and if necessary, multiply from it with suitable primers by means of PCR and then, for example isolate with suitable probes. Another more suitable option is the transformation Microorganisms with polynucleotides or vectors according to the invention, the multiplication of Microorganisms and thus the polynucleotides and their subsequent isolation. About that In addition, polynucleotides according to the invention can also be synthesized chemically become.

Unter der Eigenschaft, an Polynukleotide "hybridisieren" zu können, versteht man die Fähigkeit eines Poly- oder Oligonukleotids unter stringenten Bedingungen an eine nahezu komplementäre Sequenz zu binden, während unter diesen Bedingungen unspezifische Bindungen zwischen nicht-komplementären Partnern unterbleiben. Dazu sollten die Sequenzen zu 70-100%, vorzugsweise zu 90-100%, komplementär sein. Die Eigenschaft komplementärer Sequenzen, spezifisch aneinander binden zu können, macht man sich beispielsweise in der Northern- oder Southern-Blot-Technik oder bei der Primerbindung in PCR oder RT-PCR zunutze. Üblicherweise werden dazu Oligonukleotide ab einer Länge von 30 Basenpaaren eingesetzt. Unter stringenten Bedingungen versteht man beispielsweise in der Northern-Blot-Technik die Verwendung einer 50-70°C, vorzugsweise 60-65°C warmen Waschlösung, beispielsweise 0,1 × SSC-Puffer mit 0,1% SDS (20 × SSC: 3 M NaCl, 0,3 M Na-Citrat, pH 7,0) zur Elution unspezifisch hybridisierter cDNA-Sonden oder Oligonukleotide. Dabei bleiben, wie oben erwähnt, nur in hohem Maße komplementäre Nukleinsäuren aneinander gebunden. Die Einstellung stringenter Bedingungen ist dem Fachmann bekannt und ist z. B. in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. beschrieben. The ability to "hybridize" to polynucleotides means the ability a poly or oligonucleotide under stringent conditions to an almost complementary one Sequence bind, while under these conditions nonspecific bindings between non-complementary partners. To do this, the sequences should be 70-100%, preferably 90-100% complementary. The property of complementary sequences, To be able to bind specifically to one another is done, for example, in the Northern or Southern blot technique or use in primer binding in PCR or RT-PCR. Usually For this, oligonucleotides with a length of 30 base pairs or more are used. Under stringent Conditions are understood, for example, in the Northern blot technique to use a 50-70 ° C, preferably 60-65 ° C warm washing solution, for example 0.1 × SSC buffer 0.1% SDS (20 × SSC: 3 M NaCl, 0.3 M Na citrate, pH 7.0) for the non-specific hybridization cDNA probes or oligonucleotides. As mentioned above, this only remains to a high degree complementary nucleic acids bound together. The setting of stringent conditions is known to the person skilled in the art and is e.g. B. in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989) 6.3.1-6.3.6. described.

Gegenstand der Erfindung sind auch Expressionskassetten, die wenigstens ein erfindungsgemäßes Polynukleotid umfassen, das mit regulatorischen Nukleinsäuresequenzen operativ verknüpft ist. Vorzugsweise liegt 5'-stromaufwärts vom erfindungsgemäßen Polynukleotid eine Promotorsequenz und ermöglicht auf diese Weise eine kontrollierte Expression der (R)- Hydroxynitril Lyase. Besonders bevorzugt liegt 3'-stromabwärts vom erfindungsgemäßen Polynukleotid eine Terminatorsequenz sowie gegebenenfalls weitere übliche regulatorische Elemente, und zwar jeweils operativ verknüpft mit der die (R)-Hydroxynitril Lyase kodierenden Sequenz. Unter einer operativen Verknüpfung versteht man die sequentielle Anordnung von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und gegebenenfalls weiterer regulatorische Elemente derart, dass jedes der regulatorischen Elemente seine Funktion vor, während oder nach Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann. Beispiele für weitere operativ verknüpfbare Sequenzen sind Targeting-Sequenzen sowie Translationsverstärker, Enhancer, Polyadenylierungssignale und dergleichen. Weitere brauchbare regulatorische Elemente umfassen selektierbare Marker, Reportergene, Amplifikationssignale, Replikationsursprünge und dergleichen. The invention also relates to expression cassettes which have at least one comprise polynucleotide according to the invention which is operative with regulatory nucleic acid sequences is linked. Preferably there is a 5 'upstream of the polynucleotide according to the invention Promoter sequence and in this way enables controlled expression of the (R) - Hydroxynitrile lyase. It is particularly preferably 3'-downstream of the invention Polynucleotide, a terminator sequence and, if appropriate, further customary regulatory Elements, each operatively linked to the sequence encoding the (R) -hydroxynitrile lyase. An operational link is the sequential arrangement of the promoter, coding sequence, terminator and possibly further regulatory elements such that each of the regulatory elements perform its function before, during or after expression of the coding sequence as intended. Examples of further operational linkable sequences are targeting sequences as well as translation enhancers, enhancers, Polyadenylation signals and the like. Other useful regulatory elements include selectable markers, reporter genes, amplification signals, origins of replication and like.

Zusätzlich zu den artifiziellen Regulationssequenzen kann die natürliche Regulationssequenz vor dem eigentlichen Strukturgen noch vorhanden sein. Durch genetische Veränderung kann diese natürliche Regulation gegebenenfalls ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht oder erniedrigt werden. Die Expressionskassette kann aber auch einfacher aufgebaut sein, d. h. es werden keine zusätzlichen Regulationssignale vor das Strukturgen insertiert und der natürliche Promotor mit seiner Regulation wird nicht entfernt. Stattdessen wird die natürliche Regulationssequenz so mutiert, dass keine Regulation mehr erfolgt und die Genexpression gesteigert oder verringert wird. Die Nukleinsäuresequenzen können in einer oder mehreren Kopien in der Expressionskassette enthalten sein. In addition to the artificial regulatory sequences, the natural regulatory sequence be present before the actual structural gene. Genetic change can this natural regulation may be switched off and the expression of the genes increased or be humiliated. The expression cassette can also have a simpler design, i. H. no additional regulatory signals are inserted in front of the structural gene and the natural promoter with its regulation is not removed. Instead, the natural Regulation sequence mutated so that regulation no longer takes place and gene expression is increased or is reduced. The nucleic acid sequences can be in one or more copies in the Expression cassette may be included.

Beispiele für brauchbare Promotoren sind: cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, laclq-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, I-P(R)- oder I-PL-Promotor, die vorteilhafterweise in gram- negativen Bakterien Anwendung finden; sowie die gram-positiven Promotoren amy und SPO2, die Hefepromotoren ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH oder die Pflanzenpromotoren CaMV/35S, SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, nos oder der Ubiquitin- oder Phaseolin-Promotor. Besonders bevorzugt ist die Verwendung induzierbarer Promotoren, wie z. B. licht- und insbesondere temperaturinduzierbarer Promotoren, wie der PrPl-Promotor. Examples of useful promoters are: cos, tac, trp, tet, trp-tet, lpp, lac, lpp-lac, laclq, T7, T5, T3, gal, trc, ara, SP6, I-P (R) or I-PL promoter, which are advantageously in gram negative bacteria find application; as well as the gram-positive promoters amy and SPO2, the yeast promoters ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH or the plant promoters CaMV / 35S, SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, nos or the ubiquitin or phaseolin promoter. The use of inducible promoters, such as, for. B. light and in particular temperature-inducible promoters, such as the PrPl promoter.

Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regulationssequenzen verwendet werden. Darüber hinaus können auch synthetische Promotoren vorteilhaft verwendet werden. In principle, all natural promoters with their regulatory sequences can be used become. In addition, synthetic promoters can also be used advantageously.

Die genannten regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Nukleinsäuresequenzen und die Proteinexpression ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, dass das Gen erst nach Induktion exprimiert oder überexprimiert wird, oder dass es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird. The regulatory sequences mentioned are intended for the targeted expression of the Enable nucleic acid sequences and protein expression. This can vary depending on, for example Host organism means that the gene is only expressed or overexpressed after induction, or that it is immediately expressed and / or overexpressed.

Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugsweise die Expression positiv beeinflussen und dadurch erhöhen oder erniedrigen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder Enhancer verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA erhöht wird. The regulatory sequences or factors can preferably be the expression influence positively and thereby increase or decrease. So can reinforce the regulatory elements are advantageously done at the transcriptional level by using strong Transcription signals such as promoters and / or enhancers are used. But there is also one Translation can be enhanced, for example, by increasing the stability of the mRNA.

Weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins gemäß obiger Definition, wobei man einen mit einem geeigneten Expressionsvektor transformierten Mikroorganismus kultiviert und das Protein aus der Kultur isoliert; sowie die dafür verwendeten rekombinanten Mikroorganismen. Another object of the invention is a method for producing a protein according to above definition, where one is transformed with a suitable expression vector Cultivated microorganism and isolated the protein from the culture; as well as the ones used for it recombinant microorganisms.

Weitere bevorzugte Verfahren betreffen die Isolierung eines Proteins mit (R)-Hydroxynitril Lyase- Aktivität, wobei man Blätter von Prunus laurocrasus zerkleinert, einen wässrigen Extrakt herstellt und diesen durch Ionenaustauscherchromatogrophie aufreinigt; oder Samen von Sorbus aucuparia zerkleinert, einen wässrigen Extrakt herstellt und diesen durch Gelchromatographie und Ionenaustauscherchromatogrophie aufreinigt. Further preferred methods concern the isolation of a protein with (R) -hydroxynitrile lyase- Activity by crushing leaves of Prunus laurocrasus, producing an aqueous extract and purifies it by ion exchange chromatography; or Sorbus seeds crushed aucuparia, produces an aqueous extract and this by gel chromatography and Ion exchange chromatography purified.

Gegenstand der Erfindung sind auch die nach obigen Verfahren hergestellten Proteine. The invention also relates to the proteins produced by the above processes.

Die Isolierung bevorzugter Enzyme wird in den Ausführungsbeispielen näher beschrieben. Soweit keine näheren Angaben gemacht werden, erfolgt die Enzym-Anreicherung mit Hilfe biochemischer Standardverfahren, wie z. B. beschrieben von T. G. Cooper in Biochemische Arbeitsmethoden, Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New York, (1981). Beispielsweise eignen sich Reinigungsverfahren, wie Fällung, z. B. mit Ammoniumsulfat, Ionenaustauschchromatographie, Gelchromatographie, Affinitätschromatographie, z. B. Immunoaffinitätschromatographie, und isoelektrische Fokussierung, sowie Kombinationen solcher Verfahren. The isolation of preferred enzymes is described in more detail in the exemplary embodiments. If no further details are given, the enzyme enrichment is carried out with the help standard biochemical methods, such as. B. described by T. G. Cooper in Biochemical Working methods, publisher Walter de Gruyter, Berlin, New York, (1981). For example, are suitable Cleaning processes such as precipitation, e.g. B. with ammonium sulfate, ion exchange chromatography, Gel chromatography, affinity chromatography, e.g. B. Immunoaffinity Chromatography, and isoelectric focusing, as well as combinations of such methods.

Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur vorzugsweise enantioselektiven Synthese von (R)-Mandelsäure unter Verwendung eines der neuartigen erfindungsgemäßen Proteine, wobei

a) das Protein oder ein dieses Protein exprimierender Mikroorganismus mit Benzaldehyd und HCN in Kontakt gebracht wird; und
b) das gebildete (R)-Mandelonitril (ein Cyanhydrin) gegebenenfalls isoliert und anschließend zu (R)-Mandelsäure umsetzt.

The invention further relates to a method for the preferably enantioselective synthesis of (R) -mandelic acid using one of the novel proteins according to the invention, wherein

a) the protein or a microorganism expressing this protein is brought into contact with benzaldehyde and HCN; and
b) the (R) -mandelonitrile (a cyanohydrin) optionally isolated and then converted to (R) -mandelic acid.

Die Umsetzung gemäß Schritt b) erfolgt vorzugsweise auf chemischem Weg. Geeignete Methoden dafür sind dem Fachmann bekannt. So beschreibt beispielseweise die EP-A-1 160 235, worauf hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird, einen chemischen Weg zur Herstellung von alpha-Hydroxycarbonsäuren durch Hydrolyse der entsprechenden Cyanhydrine. The reaction in step b) is preferably carried out chemically. suitable Methods for this are known to the person skilled in the art. For example, EP-A-1 160 235 describes which is hereby expressly referred to, a chemical route for the production of Alpha-hydroxycarboxylic acids by hydrolysis of the corresponding cyanohydrins.

Weiterhin ist Gegenstand der Erfindung die Verwendung eines erfindungsgemäßen Proteins, eines Polynukleotids, einer Expressionskassette, eines Vektors oder eines Mikroorganismus gemäß obiger Definition zur enantioselektiven Herstellung eines Mandelsäure- und/oder Mandelonitril-Isomers. The invention furthermore relates to the use of a protein according to the invention, a polynucleotide, an expression cassette, a vector or a microorganism as defined above for the enantioselective production of a mandelic acid and / or Mandelonitrile isomer.

Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele und unter Bezugnahme auf die beiliegenden Figuren näher erläutert. Dabei zeigt: The invention is illustrated by the following examples and with reference to the enclosed figures explained in more detail. It shows:

Fig. 1 (A) ein SDS-Gel der (R)-Hydroxynitril Lyase aus P. laurocerasus; Bahnen 1 und 4: Markerproteine (von oben: 106 kDa, 77 kDa, 50,8 kDa), Bahnen 2 und 3: Hydroxynitril Lyase; und (B) ein SDS-Gel der (R)-Hydroxynitril Lyase aus S. aucuparia; Bahnen 1 und 4: Markerproteine (von oben: 106 kDa, 77 kDa, 50,8 kDa), Bahnen 2 und 3: Hydroxynitril Lyase. Fig. 1 (A) is an SDS-gel of the (R) -hydroxynitrile lyase from P. laurocerasus; Lanes 1 and 4: marker proteins (from above: 106 kDa, 77 kDa, 50.8 kDa), lanes 2 and 3: hydroxynitrile lyase; and (B) an SDS gel of the (R) -hydroxynitrile lyase from S. aucuparia; Lanes 1 and 4: marker proteins (from above: 106 kDa, 77 kDa, 50.8 kDa), lanes 2 and 3: hydroxynitrile lyase.

Fig. 2 (A) ein Aminosäuresequenz-Alignment zwischen SEQ ID NO: 2 (P. laurocerasus), oben und (R)-Mandelonitril Lyase Isoform aus Mandel (Prunus dulcis), unten (Swiss-Prot Accession No: O 24243);
Smith-Waterman-Score: 93.333% Identität bei Overlap von 15 Aminosäuren (B) ein Aminosäuresequenz-Alignment zwischen SEQ ID NO: 4 (S. aucuparia), oben, und (R)-Mandelonitril Lyase aus Prunus serotina, unten (Swiss-Prot Accession No: P 52706);
Smith-Waterman-Score: 66.667% Identität bei Overlap von 24 Aminosäuren Fig. 2 (A) is an amino acid sequence alignment between SEQ ID NO: 2 (P. laurocerasus) above and (R) -mandelonitrile lyase isoform from almond (Prunus dulcis), from below (Swiss-Prot Accession No: 24243 O);
Smith-Waterman-Score: 93.333% identity with overlap of 15 amino acids (B) an amino acid sequence alignment between SEQ ID NO: 4 (S. aucuparia), top, and (R) -mandelonitrile lyase from Prunus serotina, bottom (Swiss- Prot Accession No: P 52706);
Smith-Waterman-Score: 66.667% identity with overlap of 24 amino acids

example 1 Measurement of the enzymatic activity a) ee test R / S-mandelonitrile to determine the specificity of hydroxynitrile lyases assay

- n µl sample (volume n depending on enzyme activity) (the enzyme serves as a positive control from almonds, it converts (R) -mandelonitrile)
- Dilute ad 600 µl with water
- 200 µl 1 mol / l Na citrate pH 5.0
- 200 µl 250 mmol / l R / S-mandelonitrile in 0.1 M Na citrate (+ 0.2% Triton X-100 red.) suspended.

Sample dilution for chiral HPLC

- Remove 200 µl batch and dilute 1/5 with 100 mmol / l HCl, pH should be below 3.0
- centrifuge
- Add the supernatant to HPLC (5 µl for ~ 10 mmol / l solutions) (HPLC: Agilent 1100; column: Nucleodex β-PM; Marchery &Nagel; T = 40 ° C; 0.8 ml / min; eluent A: 14 , 8 mM H 3 PO 4 ; eluent B: methanol)
Retention times: R-mandelic acid amide 4.7 min
S-Mandelic Acid 4.9
R-mandelic acid 10.0
S-mandelic acid 10.7
R-almondonitrile 24.5
S-almondonitrile 25.6
Benzaldehyde 26.8

b) Benzaldehyde determination (HPLC)

Testpuffer: Na-Citrat 1 M pH 5,0
Substrat: Mandelonitril (Aldrich 11,602-5) 40 mM in 0,1 M Na-Citrat-Puffer, frisch ansetzen
Proben: Verdünnung in Testpuffer, pH 5,0
Kontrollen: Positiv-Kontrolle
Reagenzien-Blank
Testansatz: (in 1,5 ml Eppendorffgefäß)
Max. 500 µl Probe (bei Blank 500 µl MES-Puffer) ad 600 µl mit H₂O
200 µl 1 M Na-Citrat
100 µl 40 mM Mandelonitril
in Thermoblock bei 25°C unter Schütteln inkubieren für 1-2 h
Stoppen mit 200 µl 2 M HCl (pH-Kontrolle!)
Abzentrifugieren, in HPLC-Probegläschen überführen
Gerät: Beckmann; Säule: Merck LiChrosorb RP18 (5 µm); Eluent A: H₂O/0,1% TFA; Eluent B: Acetonitril/0,1% TFA c) Test für die Mikrotiterplatte Testpuffer: Na-Citrat 0,1 M pH 5,0
Substrat: Mandelonitril (Aldrich 11,602-5) 8 mM in Testpuffer, frisch ansetzen
Proben: Verdünnung in Testpuffer, pH wichtig
Kontrollen: positiv: Enzym aus Mandeln
Neagtiv: Probe ohne Substrat
Reagenzienblank
Mikrotiterplatte: UV Star Fa. Greiner 655801
Messung: 10 Min. Kinetik Spectramax 280 nm (Values = Vmax = mOD/min.; U/ml = (Vmax/1000).2,643.Verdünnung d. Probe
Ansatz:
100 µl Probenverdünnung
100 µl Substratlösung
Messung bei 280 nm Test buffer: Na citrate 1 M pH 5.0
Substrate: Mandelonitrile (Aldrich 11.602-5) 40 mM in 0.1 M Na citrate buffer, freshly prepared
Samples: Dilution in test buffer, pH 5.0
Controls: positive control
Reagent Blank
Test batch: (in 1.5 ml Eppendorff tube)
Max. 500 µl sample (with blank 500 µl MES buffer) ad 600 µl with H ₂ O
200 µl 1 M Na citrate
100 µl 40 mM mandelonitrile
Incubate in a thermoblock at 25 ° C with shaking for 1-2 h
Stop with 200 µl 2 M HCl (pH control!)
Centrifuge, transfer to HPLC test tubes
Device: Beckmann; Column: Merck LiChrosorb RP18 (5 µm); Eluent A: H ₂ O / 0.1% TFA; Eluent B: acetonitrile / 0.1% TFA c) Test for the microtiter plate Test buffer: Na citrate 0.1 M pH 5.0
Substrate: Mandelonitrile (Aldrich 11.602-5) 8 mM in test buffer, freshly prepared
Samples: Dilution in test buffer, pH important
Controls: positive: enzyme from almonds
Negative: sample without substrate
reagent blank
Microtiter plate: UV Star from Greiner 655801
Measurement: 10 min. Kinetics Spectramax 280 nm (Values = Vmax = mOD / min .; U / ml = (Vmax / 1000) .2,643. Dilution of the sample
Approach:
100 µl sample dilution
100 µl substrate solution
Measurement at 280 nm

Example 2 Purification of the (R) -hydroxynitrile lyase from Prunus laurocerasus (cherry laurel) a) extraction

350 g Blätter (bei -20 Grad Celsius eingefroren) werden in einem Haushaltsmixer zusammen mit Trockeneis zu feinem Pulver zermahlen. Das Pulver wird dann bei 4 Grad Celsius in 20 mM Mes, 20 mM Ascorbinsäure, 100 mM Lysin, pH 6,5 resuspendiert und zwei Stunden gerührt. Grobteile werden über Gaze entfernt und die Lösung durch Zentrifugation geklärt. Der Überstand wird eine Woche gegen 5 mM Mes, pH 6,5 bei täglichem Pufferwechsel dialysiert. Dies entfernt die großen Mengen an Benzaldehyd, die sich in der Lösung befinden und den Test stören. Das Dialysat (750 ml) enthält ca 0,05 mg/ml Protein (38 mg gesamt). Diese Lösung wird an Q-Sepharose chromatographiert (Aktivität 7 U/mg vor Säulenauftrag). 350 g leaves (frozen at -20 degrees Celsius) are mixed in a household mixer Grind dry ice into fine powder. The powder is then measured at 4 degrees Celsius in 20 mM Mes, 20 mM ascorbic acid, 100 mM lysine, pH 6.5 resuspended and stirred for two hours. coarse particles are removed via gauze and the solution is clarified by centrifugation. The supernatant becomes one Dialysed weekly against 5 mM Mes, pH 6.5 with daily buffer change. This removes the big ones Amounts of benzaldehyde in the solution that interfere with the test. The dialysate (750 ml) contains approx. 0.05 mg / ml protein (38 mg total). This solution is called Q-Sepharose chromatographed (activity 7 U / mg before column application).

b) Q-Sepharose chromatography

Durchmesser der Säule 5 cm, Länge 5,5 cm, Volumen 108 ml. Die Säule war äquilibriert in 200 mM Natriumphosphat, pH 7,2. Nach dem Auftrag des Dialysats (pH nachgestellt ebenfalls auf 7,2) wurde die Säule mit gleichem Puffer bis zur Grundlinie der Absorption gewaschen und dann im linearen Gradienten nach 20 mM Natriumphosphat, 1 M Natriumchlorid, pH 7,2 eluiert. Die enzymatische Aktivität eluiert ab ca 600 mM Salz. In der Wertfraktion waren noch 0,96 mg Protein mit einer spezifischen Aktivität von 197 U/mg enthalten. Column diameter 5 cm, length 5.5 cm, volume 108 ml. The column was equilibrated in 200 mM Sodium phosphate, pH 7.2. After application of the dialysate (pH also adjusted to 7.2) the column was washed with the same buffer up to the baseline of the absorption and then in the linear gradient eluted after 20 mM sodium phosphate, 1 M sodium chloride, pH 7.2. The Enzymatic activity elutes from about 600 mM salt. The value fraction still contained 0.96 mg of protein contain a specific activity of 197 U / mg.

c) N-terminal sequence determination

Das so gereinigte Protein wurde durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese analysiert. Das Präparat besteht zu über 99% nur aus einer Proteinbande. Das Protein hat ein Molekulargewicht von ca 85 kDa (Fig. 1(A)). Das durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese getrennte Protein wurde auf eine PVDF-Membran geblottet und die N-terminale Sequenz bestimmt. Man erhielt drei verschieden N-terminale Sequenzen (SEQ ID NO: 1, 2 und 3) was auf das Vorkommen von Isoenzymen in der Präparation hindeutet. The protein purified in this way was analyzed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. The preparation consists of over 99% only one protein band. The protein has a molecular weight of approximately 85 kDa ( Fig. 1 (A)). The protein separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis was blotted onto a PVDF membrane and the N-terminal sequence was determined. Three different N-terminal sequences (SEQ ID NO: 1, 2 and 3) were obtained, which indicates the presence of isoenzymes in the preparation.

Die ermittelten Sequenzen zeigten signifikante Sequenzübereinstimmung mit O-Mandelonitril Lyase aus Mandel (Fig. 2(A)). The sequences determined showed significant sequence agreement with O-mandelonitrile lyase from almond ( FIG. 2 (A)).

Example 3 Purification of the (R) -hydroxynitrile lyase from Sorbus aucuparia (rowan berry) a) extraction

200 g Samen werden in einem Haushaltsmixer zusammen mit Trockeneis zu feinem Pulver zermahlen. Das Pulver wird dann bei 4 Grad Celsius in 20 mM Mes, 20 mM Ascorbinsäure, 100 mM Lysin, pH 6,5 resuspendiert und zwei Stunden gerührt. Bereits in dieser Stufe machen sich große Mengen HCN (> 20 ppm) sowie starker Benzaldehydgeruch bemerkbar. Grobteile werden über Gaze entfernt und die Lösung durch Zentrifugation geklärt. Der Überstand wurde mit 80%iger Ammoniumsulfat-Sättigung gefällt, in 100 ml 20 mM Mes, pH 6,5 resuspendiert und gegen den gleichen Puffer dialysiert. In a household mixer, 200 g of seeds are mixed with dry ice to form a fine powder ground. The powder is then at 4 degrees Celsius in 20mM Mes, 20mM ascorbic acid, 100mM Lysine, pH 6.5 resuspended and stirred for two hours. Already at this stage large amounts of HCN (> 20 ppm) and strong smell of benzaldehyde noticeable. Rough parts are over Gauze removed and the solution clarified by centrifugation. The supernatant was 80% Ammonium sulfate saturation, resuspended in 100 ml 20 mM Mes, pH 6.5 and against dialyzed the same buffer.

b) Superdex gel filtration

12 ml des Dialysats wurden auf einer Superdex Molekularsiebsäule getrennt (4 ml/min, 2Minuten Fraktionen, 2Stunden, Laufpuffer wie oben, Durchmesser der Säule 2,6 cm, Länge 50 cm, Volumen 320 ml). Aktive Fraktionen wurden gesammelt und vereinigt. In der Wertfraktion waren noch 5,8 mg Protein mit einer spezifischen Aktivität von 9 U/mg enthalten. 12 ml of the dialysate was separated on a Superdex molecular sieve column (4 ml / min, 2 minutes Fractions, 2 hours, running buffer as above, diameter of the column 2.6 cm, length 50 cm, Volume 320 ml). Active fractions were collected and pooled. In the value fraction were still Contain 5.8 mg protein with a specific activity of 9 U / mg.

c) Preparative Q-Sepharose

Die Wertfraktion der Superdex-Chromatographie wurde dann auf einer Q-Sepharose (Waters, Protein PAK (HRP, Volumen 8 ml) weiter gereinigt. Die Säule wurde in 20 mM Phosphatpuffer pH 7,2 äqulibriert und die Probe aufgetragen. Nach dem Waschen wurde im linearen Gradienten nach 20 mM Phosphat, pH 7,2, 1 M NaCl eluiert. Die Aktivität eluierte scharf in einem Peak. (94 U/mg spezifische Aktivität). The value fraction of the Superdex chromatography was then on a Q-Sepharose (Waters, Protein PAK (HRP, volume 8 ml) further purified. The column was pH in 20 mM phosphate buffer 7.2 equilibrated and the sample applied. After washing was done in a linear gradient after 20 mM phosphate, pH 7.2, 1 M NaCl eluted. The activity eluted sharply in a peak. (94 U / mg specific activity).

d) N-terminal sequence determination

Das so gereinigte Protein wurde durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese analysiert. Das Präparat besteht zu über 80% nur aus einer Proteinbande. Das Protein hat ein Molekulargewicht von ca 85 kDa (Fig. 1(B)). Das durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese getrennte Protein wurde auf eine PVDF-Membran geblottet und die N-terminale Sequenz bestimmt. Man erhielt eine N-terminale Sequenz gemäß SEQ ID NO: 4 welche eine ausgeprägte Sequenzübereinstimmung mit der Oxynitril Lyase aus Prunus serotina (Späte Traubenkirsche) zeigte (Fig. 2(B)). The protein purified in this way was analyzed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. The preparation consists of over 80% only one protein band. The protein has a molecular weight of approximately 85 kDa ( Fig. 1 (B)). The protein separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis was blotted onto a PVDF membrane and the N-terminal sequence was determined. An N-terminal sequence according to SEQ ID NO: 4 was obtained, which showed a pronounced sequence agreement with the oxynitrile lyase from Prunus serotina (late bird cherry) ( FIG. 2 (B)).

Example 4 Determination of SDS stability

Die erfindungsgemäßen Enzympräparate wurde auf ihre Stabilität gegenüber verschiedene SDS-Konzentrationen untersucht. Die absolute und relative Aktivitätsabnahme bei steigender SDS-Konzentration wurde jeweils bestimmt und mit den für das Mandel-Enzym ermittelten Werten verglichen. Die Ergebnisse sind in folgender Tabelle zusammengefasst:

The enzyme preparations according to the invention were examined for their stability with respect to different SDS concentrations. The absolute and relative decrease in activity with increasing SDS concentration was determined in each case and compared with the values determined for the almond enzyme. The results are summarized in the following table:

Überraschenderweise wurde festgestellt, dass die erfindungsgemäßen Enzyme weniger empfindlich auf SDS reagieren (geringerer prozentualer Aktivitätsverlust) und bei gleicher SDS- Konzentration eine höhere Restaktivität aufweisen als das Mandel-Enzym. SEQUENZPROTOKOLL

Surprisingly, it was found that the enzymes according to the invention are less sensitive to SDS (lower percentage loss in activity) and, at the same SDS concentration, have a higher residual activity than the almond enzyme. SEQUENCE LISTING

Claims

1. Protein with R-hydroxynitrile lyase activity (E.C.4.1.2.10) isolatable from leaves of Prunus laurocerasus or Sorbus aucuparia seeds.

2. Protein according to claim 1 isolatable from leaves of Prunus laurocerasus, characterized by an amino acid sequence comprising at least 10 successive amino acid residues according to SEQ ID NO: 1, 2, or 3 or functional equivalents thereof.

3. Protein according to claim 1 isolatable from seeds of Sorbus aucuparia, characterized by an amino acid sequence comprising at least 10 consecutive Amino acid residues according to SEQ ID NO: 4 or functional equivalents thereof.

4. Protein according to claim 2 or 3, wherein the functional equivalent is also at least one partial sequence of at least 10 consecutive Amino acid residues from an amino acid sequence according to SEQ ID NO: 1, 2, 3 or 4 includes.

5. Protein according to any one of the preceding claims, characterized by a Molecular weight of about 85 kDa, determined by SDS gel electrophoresis reducing conditions.

6. Protein according to any one of the preceding claims, characterized in that it the enzymatic conversion of benzaldehyde to R-mandelonitrile in the presence catalyzed by HCN or the reverse reaction.

7. Polynucleotide, which is for a protein according to any one of the preceding claims encodes, as well as its functional equivalents, complementary polynucleotides, and the nucleic acid sequences hybridizable therewith.

8. Expression cassette comprising at least one polynucleotide according to claim 7 operatively linked to at least one regulatory nucleic acid sequence.

9. Recombinant vector for transforming a eukaryotic or prokaryotic host comprising a polynucleotide according to claim 7, or one Expression cassette according to claim 8.

10. A method for producing a protein according to any one of claims 1 to 6, wherein a microorganism transformed with a vector according to claim 9 cultivated and the protein isolated from the culture.

11. A method for isolating a protein according to claim 2, characterized in that that crushing leaves of Prunus laurocerasus, an aqueous extract manufactures and purifies this by ion exchange chromatography.

12. A method for isolating a protein according to claim 3, characterized in that that you crush Sorbus aucuparia seeds, produce an aqueous extract and this by gel chromatography and ion exchange chromatography purifying.

13. Protein obtainable by a process according to any one of claims 10 to 12.

14. Microorganism, characterized in that it has a vector according to claim 9 wearing.

15. A method for the enantioselective synthesis of R-mandelic acid using a protein according to any one of claims 1 to 6, wherein

a) the protein or a microorganism expressing this protein is brought into contact with benzaldehyde and HCN according to claim 14; and

b) the R-mandelonitrile formed is optionally isolated and then converted to R-mandelic acid.

16. Use of a protein according to any one of claims 1 to 6, a polynucleotide according to claim 7, an expression cassette according to claim 8, a vector according to Claim 9 or a microorganism according to claim 14 for enantioselective Preparation of a Mandelic Acid and / or Mandelonitrile Isomer.