DE10219545A1

DE10219545A1 - Regulation der Apoptose

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Publication number: DE10219545A1
Application number: DE10219545A
Authority: DE
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Current assignee: Individual
Priority date: 2002-04-26
Filing date: 2002-04-26
Publication date: 2003-11-06
Also published as: EP1530473A2; AU2003232212A1; WO2003090665A3; AU2003232212A8; WO2003090665A2

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer Substanz zum Nachweis von Kationenkanälen sowie die Verwendung eines Wirkstoffes zur Beeinflussung von Kationenkanälen zur Vorbeugung oder Behandlung von Erkrankungen, die mit einer gestörten Regulation der Apoptose in Zusammenhang stehen.

Description

Unter Apoptose wird der sogenannte programmierte Zelltod verstanden. Im weiteren Sinne faßt man darunter auch den Zelluntergang zusammen, der durch genetische Informationen der betroffenen Zelle selbst reguliert wird. Die Apoptose ist die Grundlage einer geregelten Embryogenese (Absterben überflüssiger Organanlagen), Gewebehomöostase (Schutz vor Neubildungen) und Funktion des Immunsystems (Auslösung von Apoptose bei Zielzellen durch zytotoxische T-Lymphozyten und natürliche Killerzellen) und wird durch verschiedene Faktoren (z. B. Rezeptorbindungen, Proteasenwirkung) ausgelöst. Ferner spielt die Apoptose auch eine Rolle bei der Zytostastikawirkung, Strahlentherapie und anderen therapeutischen Prinzipien.

Wissenschaftliche Untersuchungen zeigen, daß oxidativer und osmotischer Streß, wohlbekannte Auslöser von apoptotischem Tod kernhaltiger Zellen [Gulbins et al. 2000, Michea et al. 2000, Rosette and Karin 1996] auch erythrozytäre Apoptose hervorrufen. Obgleich Erythrozyten weder Kerne noch Mitochondrien enthalten, sind sie doch fähig, morphologische Änderungen zu durchlaufen, wie sie für apoptotische kernhaltige Zellen typisch sind [Daugas et al. 2001], obwohl die Erythrozyten gegenüber manchen apoptotischen Stimuli resistent sind, wie z. B. gegen Serum-Entzug oder den Proteinkinase C-Hemmer Staurosporin [Daugas et al. 2001].

Obwohl Apoptose eine wichtige Rolle in vielen Krankheitsverläufen spielt, sind die molekularen Mechanismen, welche die Apoptose vermitteln, und deren Bedeutung für den Krankheitslauf freilich bisher weitgehend unklar.

Dementsprechend stellt sich die Erfindung die Aufgabe, unter Aufklärung der molekularen Mechanismen neue Diagnose- und Behandlungsansätze aufzufinden sowie Wirkstoffe bereitzustellen, die für die therapeutische und die diagnostische Anwendung bei Störungen der Apoptoseregulation genutzt werden können.

Überraschenderweise konnte am Beispiel von Erythrozyten ein Mechanismus aufgezeigt werden, über den diese kernlosen Zelten in den programmierten Zelltod getrieben bzw. gegen wohlbekannte Auslöser von apoptotischem Tod resistent gemacht werden können.

Demzufolge wird die erfindungsgemäße Aufgabe durch den Gegenstand der unabhängigen Ansprüche 1 bis 4, 16, 22 und 26 gelöst. Bevorzugte Ausführungen sind in den abhängigen Ansprüchen 5 bis 15, 17 bis 21, 23 bis 25 und 27 genannt. Der Inhalt aller dieser Ansprüche wird hiermit durch Bezugnahme zum Inhalt der Beschreibung gemacht.

Erfindungsgemäß kann mindestens eine Substanz zum Nachweis der Expression und/oder Funktion von Kationenkanälen in Zellen verwendet werden. Dabei wird diese Substanz zur Diagnose von Erkrankungen, die mit einer gestörten Regulation der Apoptose im Zusammenhang stehen, genutzt. Hierbei kann es sich z. B. um die Erkennung von genetischen Dispositionen für bestimmte Erkrankungen infolge von Mutationen, z. B. am Kationenkanal, handeln. Es kann so unter Umständen eine Anfälligkeit gegenüber bestimmten Erkrankungen diagnostiziert werden, so daß bei entsprechenden Symptomen schnell auf eine gestörte Regulation der Apoptose, mit den damit einhergehenden klinischen Symptomen, geschlossen werden kann. Bei der Substanz, die zum Nachweis der Expression und/oder Funktion von Kationenkanälen eingesetzt wird, kann es sich z. B. um einen Antikörper handeln, der gegen den Kationenkanal gerichtet ist, und in einem dem Fachmann bekannten Nachweisverfahren, wie z. B. ELISA (enzyme linked immuno sorbent assay) eingesetzt wird. Weiterhin kann z. B. mit Hilfe der sogenannten PCR-Technik (polymerase chain reaction) dieser Nachweis erbracht werden. Bei diesem molekulargenetischen Verfahren werden selektiv bestimmte DNA- Abschnitte amplifiziert. Dabei erfolgt eine Neusynthese von DNA- Sequenzen, die von zwei synthetischen Oligonukleotiden eingerahmt werden, mittels DNA-Polymerasen. Durch die exponentielle Anreicherung, ausgehend von geringen Mengen DNA (10^-9-10^-15 g) können nach mehrmaliger Wiederholung des Vorgangs (20-40 Zyklen) die DNA-Abschnitte nachweisbar gemacht werden. Zum Nachweis von RNA-Abschnitten muß die RNA mittels einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase in eine DNA umkopiert werden. Durch Auswahl von geeigneten DNA- Abschnitten am Zielprotein, dem Kationenkanal, kann so der erfindungsgemäße Nachweis erfolgen. Weitere Verfahren, wie ein bekanntes Zielprotein bzw. Domänen eines aus mehreren Untereinheiten zusammengesetzten Zielproteins quantitativ und/oder qualitativ nachgewiesen werden kann, sind dem Fachmann bekannt, und in diesem Zusammenhang wird auf die umfangreiche dementsprechende Fachliteratur verwiesen.

Weiterhin kann erfindungsgemäß mindestens ein Wirkstoff zur Vorbeugung oder Behandlung von Erkrankungen in Zellen verwendet werden. Dieser Wirkstoff beeinflußt nach Applikation die Expression und/oder die Funktion von Kationenkanälen, wobei es insbesondere zu einer Stimulierung oder Inhibierung des Kationenkanals kommt. Dies resultiert in einer Induktion, alternativ dazu einer zumindest partiellen Hemmung, der Apoptose, d. h. generell in einer Regulation der Apoptose in den betroffenen Zellen. Es kann sich bei diesem Wirkstoff zum einen um die schon beschriebenen Substanzen handeln, zum anderen kann der Wirkstoff z. B. eine gentechnisch veränderte Mutante des Kationenkanals, bzw. ein up-/downstream liegendes Mitglied der Signaltransduktionskaskade dieses Kationenkanals, sein. So ist es z. B. möglich, mit Hilfe der Gentechnologie Wirkstoffe herzustellen, die entweder a) eine höhere Aktivität als ihre physiologischen Äquivalente haben, oder b) keine Wechselwirkungen mit ihren physiologischen Inhibitoren eingehen können. Eine weitere Möglichkeit ist die Bereitstellung der natürlich vorkommenden Signalelemente. Auch könnten Inhibitoren der Signaltransduktionskaskade ihrerseits inhibiert werden, um so eine Aktivierung der entsprechenden Signaltransduktionskaskade des Kationkanales zu ermöglichen. Dieser Wirkstoff kann dann zur Herstellung eines Medikamentes oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung bereitgestellt werden, was in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform beansprucht wird.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird ein Verfahren zur Regulation der Apoptose beansprucht. Bei diesem Verfahren werden Zellen mit einem Wirkstoff in Kontakt gebracht, wobei der Wirkstoff die Expression und/oder Funktion von Kationenkanälen beeinflußt, insbesondere stimuliert oder inhibiert, und dadurch die Apoptose in diesen Zellen induziert (bei Stimulierung) bzw. inhibiert (bei Hemmung). Abhängig von der Erkrankung, die mit der Apoptose assoziiert ist, kann dabei durch gezielte Beeinflussung der Apoptose der Krankheitsverlauf positiv beeinflußt werden.

Erfindungsgemäß hat die Beeinflussung, insbesondere die Stimulierung oder Inhibierung, von Kationenkanälen eine Beeinflussung und/oder Kontrolle der intrazellulären Ca²⁺-Konzentration, d. h. des Einstroms von Ca²⁺-Ionen in die Zelle, zur Folge. Der Kationenkanal ist dabei Ca²⁺ durchlässig, wodurch ein Eintritt von Ca²⁺ in die Zelle gewährt wird. Bei dem Kanal selbst handelt es sich um einen unspezifischen Kationenkanal. Durch Steigerung der intrazellulären Ca²⁺-Konzentration wird die zelluläre Apoptose unter geeigneten Bedingungen stimuliert, durch Herabsetzung der intrazellulären Ca²⁺-Konzentration dementsprechend die zelluläre Apoptose inhibiert.

Generell sind erfindungsgemäß alle Zellen, d. h. sowohl kernhaltige als auch kernlose Zellen, beeinflußbar, wobei mittels Beeinflussung eines Kationenkanals die Apoptose reguliert werden kann. Unter Zellen werden erfindungsgemäß auch die Zellen umfaßt, die zwar kernlos sind, aber aus kernhaltigen Vorstufen hervorgegangen sind. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei diesen Zellen um Blutzellen, d. h. vom Knochenmark abstammenden Zellen, insbesondere um Erythrozyten. Diese kernlosen Zellen sind aus den kernhaltigen Vorstufen, den Erythroblasten, hervorgegangen. Während ihrer Entwicklung durch Reifung und Teilung (Erythropoese) wird der Kern aus der Zelle ausgestoßen, und im Zytoplasma findet gleichzeitig die Hämoglobinbildung statt. Die Zellvolumen-regulatorischen Kationeinkanäle werden, aber nicht nur in Erythrozyten, sondern auch in mehreren kernhaltigen Zellen exprimiert [Cabado et al. 1994, Chan & Nelson 1992, Gamper et al. 2000, Koch & Korbmacher 1999, Volk et al. 1995, Wehner et al. 1995, 2040]. Nachdem eine Zunahme von intrazellulärem Calcium auch in kernhaltigen Zellen Zelltod auslösen kann [Green & Reed 1998], kann die Aktivierung der Zellvolumen-empfindlichen Kationenkanäle gleichermaßen bei der Auslösung des apoptotischen Todes kernhaltiger Zellen eine Rolle spielen.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Wirkstoff oder die Substanz gegen die Kationenkanäle selbst gerichtet. Bei dem Wirkstoff oder der Substanz kann es sich, neben den schon beschriebenen, auch unter anderem um Antisensesequenzen, gentechnisch veränderte Mutanten der Mitglieder der Signaltransduktionskaskade des Kationenkanals, oder um sogenannte "small molecular compounds" handeln. Weiter zu nennen sind Polynukleotide, welche für ein Peptid kodieren, welches die Expression und/oder Funktion von Kationenkanälen beeinflußt, insbesondere stimuliert oder inhibiert, oder Polypeptide, welche vorzugsweise die Expression und/oder Funktion von Kationenkanälen beeinflussen, insbesondere stimulieren oder inhibieren. Weiterhin kann der Wirkstoff oder die Substanz gegen Aktivatoren, Inhibitoren, Regulatoren und/oder biologische Vorläufer von Kationenkanälen gerichtet sein. Diese Aktivatoren, Inhibitoren, Regulatoren und/oder biologische Vorläufer können z. B. Transkriptionsfaktoren, die für den Expressionslevel des entsprechenden Kationenkanals verantwortlich sind, und andere bekannte Aktivatoren, Inhibitoren, Regulatoren und/oder biologische Vorläufer von Kationenkanälen sein. Auch gegen diese Aktivatoren, Inhibitoren, Regulatoren und/oder biologische Vorläufer kann als Wirkstoff oder als Substanz z. B. ein Polynukleotid, welches ein Peptid kodiert, oder ein Polypeptid sowie ein "small molecular compound" eingesetzt werden. Auch der Einsatz mindestens einer oxidierenden Agens als Wirkstoff oder Substanz ist gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfaßt.

Bei der vorliegenden Erfindung ist es möglich, bekannte sowie noch unbekannte Wirkstoffe oder Substanzen zu verwenden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Wirkstoff oder die Substanz ein sogenannter "small molecular compound", insbesondere ein solcher mit einem Molekulargewicht (MG) < 2.000. Bei diesem "small molecular compound" handelt es sich vorzugsweise um Amilorid (MG 229,65), Ionomycin und/oder deren Analoga. Ein Beispiel für ein Analogon von Amilorid ist z. B. Ethylisopropylamilorid. Amilorid ist die internationale Kurzbezeichnung für das Kalium-retinierende Diuretikum N-Amidino-3,5- diamino-6-chlorpyrazin-2-carbamid. Diuretika sind allgemein Arzneimittel, die durch Hemmung der renalen Rückresorption vor allem von Na⁺- Ionen eine erhöhte Ausscheidung von Na⁺, Cl^- und HCO₃ ^--Ionen sowie (indirekt) von Wasser bewirken und dadurch das Plasmavolumen senken und Stauungssymptome verbessern. Kalium-retinierende bzw. kaliumsparende Diuretika wie Amilorid oder Triamteren hemmen die Natriumresorption im distalen Tubulus. Sie haben eine schwache diuretische Wirkung bei gleichzeitiger Kaliumretention. Ionomycin zählt zu den sogenannten Ionophoren. Diese von Pressmann 1967 eingeführte und aus "Ionen" und "phor" zusammengesetzte Bezeichnung faßt die meist makrozyklischen Verbindungen mit einem Molekulargewicht (MG) im allgemeinen < 2.000 zusammen, die reversibel Chelate oder auch Komplexe mit Ionen bilden. Aufgrund ihrer relativ hydrophoben Oberfläche können sie diese Ionen als Carrier durch sonst für Ionen undurchlässige biologische Membranen transportieren. Durch diese Carrierfunktion wird der Einstrom von Ca²⁺ ermöglicht, wodurch es zu einer Induzierung der Apoptose in den entsprechenden Zellen kommt.

Die Erfindung kann benutzt werden, um alle Formen von Erkrankungen, die mit einer gestörten Regulation, insbesondere einer gestörten Inhibierung oder Induzierung, der Apoptose im Zusammenhang stehen, zu erkennen oder zu behandeln. Bei den Erkrankungen, die mit einer gestörten Inhibierung im Zusammenhang stehen, handelt es sich dabei z. B. um neurodegenerative Erkrankungen, akutes Nierenversagen, Thalassämie, Sichelzellenanämie, Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase-Mangel, Eisenmangelanämie und/oder Immundefizienz. Eine längere Verweildauer von Erythrozyten im hochosmolaren Nierenmark während eines akuten Nierenversagens [Mason et al. 1986] kann über Aktivierung des Kanals Apoptose auslösen, eine Wirkung, welche zur Störung der Mikrozirkulation beiträgt. Darüber hinaus wird der Kationen-Kanal bei Störungen aktiviert, welche zur Schrumpfung von Erythrozyten führen, wie Sichelzellanämie [Joiner 1993, Lang et al. 1998], Thalassämie [Mach-Pascual et al. 1996] oder Eisenmangelanämie [Jolobe 2000, Mach-Pascual et al. 1996]. Das beschleunigte Absterben der Erythrozyten bei diesen Erkrankungen kann demnach durch Hemmung des Kationenkanals zumindest partiell abgeschwächt werden. Alternativ dazu handelt es sich bei den Erkrankungen, die mit einer gestörten Induzierung der Apoptose in Zusammenhang stehen, um Tumorerkrankungen und/oder Infektionen, wohlbekannte Erkrankungen, bei denen eine gestörte Inhibierung der Apoptose vorliegt. Durch die Erfindung sind auch alle anderen Erkrankungen, die durch Induktion bzw. Inhibierung der Apoptose über einen Kationenkanal behandelbar sind, erfaßt.

Erfindungsgemäß kann der Wirkstoff oder die Substanz vor allem oral, intravenös, topisch und/oder durch Inhalation verabreicht werden. Die Verabreichungsform sowie die Dosis kann frei gewählt werden. Dabei spielen bekanntermaßen insbesondere Alter, Geschlecht, sowie andere Faktoren des Patienten eine Rolle. Auch das Krankheitsbild, sowie Art und Grad der Erkrankung müssen bei der Auswahl der Applikationsart sowie der Dosis des Wirkstoffes oder Substanz berücksichtigt werden.

Die Erfindung umfaßt ferner eine pharmazeutische Zusammensetzung, die mindestens einen Wirkstoff enthält, der die Expression und/oder Funktion von Kationenkanälen beeinflußt, insbesondere stimuliert oder inhibiert, und gegebenenfalls einen pharmazeutischen Träger. Dabei kann es sich bei dem Wirkstoff um ein Polynukleotid handeln, welches ein Peptid, insbesondere ein Polypeptid, kodiert, wobei vorzugsweise dieses Peptid die Expression und/oder Funktion von Kationenkanälen beeinflußt, insbesondere stimuliert oder inhibiert. Alternativ dazu kann der Wirkstoff ein Peptid sein, vorzugsweise ein Polypeptid, wobei dieses Peptid bzw. Polypeptid vorzugsweise die Expression und/oder Funktion von Kationenkanälen beeinflußt, insbesondere stimuliert oder hemmt. Der Wirkstoff kann ferner ein "small molecular compound", vorzugsweise ein "small molecular compound" mit einem Molekulargewicht (MG) < 2.000, sein. So kann es sich z. B. bei dem Wirkstoff um eine sogenannte Antisensesequenz handeln, d. h. eine Sequenz, die in der Lage ist, mit der mRNA eine Doppelstrangduplex auszubilden, und dadurch die Translation in ein Polypeptid zu verhindern. Auch kann z. B. die Gensequenz selbst genutzt werden, um eine Über-/Unterexpression des Kationenkanals zu erzielen, z. B. durch Einbau in geeignete Vektoren mit starken Promotoren oder durch Konstruktion von geeigneten Mutanten. Weiterhin kann es sich bei dem Wirkstoff um die schon beschriebenen Stoffe Amilorid, Ionomycin und/oder deren Analoga, so z. B. Ethylisopropylamilorid, sowie einer oxidierenden Agens handeln. Zu weiteren Merkmalen einer solchen Zusammensetzung wird auf den entsprechenden bisherigen Text der Beschreibung Bezug genommen.

Die Erfindung umfaßt ferner eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine wirksame Menge mindestens eines Wirkstoffes aufweist, der die Expression und/oder Funktion von Aktivatoren, Inhibitoren, Regulatoren und/oder biologischen Vorläufern von Kationkanälen beeinflußt, vorzugsweise stimuliert oder inhibiert. Diese pharmazeutische Zusammensetzung kann gegebenenfalls auch einen pharmazeutischen Träger enthalten. Die Aktivatoren, Inhibitoren, Regulatoren und/oder biologischen Vorläufer von Kationenkanälen können z. B. die weiter oben schon erwähnten Transkriptionsfaktoren, sowie weitere bekannte oder bis jetzt unbekannte Mitglieder der Signaltransduktionskaskade des Kationenkanals sein. Auch Polynukleotide, die ein Polypeptid kodieren, welches die Expression und/oder Funktion von Aktivatoren, Inhibitoren, Regulatoren und/oder biologischen Vorläufern von Kationenkanälen beeinflussen, vorzugsweise stimulieren oder inhibieren, können in solchen Zusammensetzungen enthalten sein. Weiterhin sind sogenannte "small molecular compounds", die vorzugsweise ein Molekulargewicht (MG) von < 2.000 haben, und die gegen Aktivatoren, Inhibitoren, Regulatoren und/oder biologischen Vorläufern von Kationenkanälen gerichtet sind, und dabei die Expression bzw. Funktion dieses Kanals stimulieren oder inhibieren, erfindungsgemäß einsetzbar. Schließlich kann es sich bei dem Wirkstoff um ein Peptid handeln, vorzugsweise ein Polypeptid, wobei vorzugsweise dieses Peptid die Expression und/oder Funktion von Aktivatoren, Inhibitoren, Regulatoren und/oder biologischen Vorläufern von Kationenkanälen beeinflußt, insbesondere stimuliert oder hemmt. Zu den weiteren Merkmalen einer solchen Zusammensetzung wird auf den bisherigen entsprechenden Text der Beschreibung Bezug genommen.

Schließlich umfaßt die Erfindung ein Diagnosekit. In diesem Kit ist mindestens eine Substanz enthalten, die zum Nachweis der Expression und/oder Funktion von Kationenkanälen genutzt wird. Das Diagnosekit dient vorzugsweise zur Erkennung von Anfälligkeiten gegenüber Erkrankungen, die mit einer gestörten Regulation der Apoptose in Zusammenhang stehen. Gezielt können solche Diagnosekits in einem Diagnoseverfahren eingesetzt werden, welches zur Erkennung von Anfälligkeiten gegenüber neurodegenerativen Erkrankungen, akutem Nierenversagen, Thalassämie, Sichelzellenanämie, Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase-Mangel, Eisenmangelanämie, Immundefizienz, Tumorerkrankung und/oder Infektionen benutzt wird.

Die genannten Merkmale und weitere Merkmale der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen in Verbindung mit den Unteransprüchen und Figuren. Hierbei können die Einzelmerkmale jeweils für sich oder zu mehreren in Kombination miteinander verwirklicht sein.

In den Abbildungen zeigen:

Abb. 1 Ionomycin-induzierte Erythrozyten-Apoptose;

Abb. 2 Osmotisch ausgelöste erythrozytäre Apoptose;

Abb. 3 Oxidativ ausgelöste erythrozytäre Apoptose;

Abb. 4 Durch Glucosemangel ausgelöste erythrozytäre Apoptose.

Methoden

Erythrozyten wurden gesunden Freiwilligen entnommen. Die Experimente wurden bei 37°C in Ringer-Lösung folgender Zusammensetzung vorgenommen: 125 mM NaCl, 5mM KCl, 1 mM MgSO₄, 32 mM N-2- Hydroxyethylpiperazin-N-2-ethansulfonsäure (HEPES), 5 mM Glucose, 1 mM CaCl₂, pH = 7.4. Für die nominal Calcium-freie Lösung wurde CaCl₂ durch 1mM Ethylenglycol-bis(β-aminoethyläther)-N,N,N',N'-tetra-Essigsäure (EGTA) ersetzt. Die Osmolarität wurde durch Zugabe von Sucrose auf 850 mosmol/l gesteigert. Ionomycin wurde in einer Konzentration von 1 µM, Amilorid in einer Konzentration von 1 mM eingesetzt. Die Konzentration des Lösungsmittels Dimethylsulfoxid DMSO war jeweils 0.1%.

Die FACS-Analyse (flow cytometric analysis) wurde nach Standardmethoden durchgeführt [Andree et al., 1990]. Nach Inkubation wurden die Zellen in Annexin-bindendem Puffer gewaschen, der 125 mM NaCl, 10 mM HEPES; pH = 7.4) und 5 mM CaCl₂ enthielt. Die Erythrozyten wurden mit Annexin-Flous (Böhringer Mannheim, Germany) 1 : 100 verdünnt. Nach 15 min. wurden die Proben 1 : 5 verdünnt und durch FACS analysiert (FACS-Calibur from Becton Dickinson). Von den Zellen wurden Vorwärtsstreuung (forward scatter), Seitwärtsstreuung (sideward scatter) und Annexin-Fluoreszenz (FL-1) gemessen.

Die Werte werden als arithmetische Mittelwerte ± SEM angegeben, die statistische Analyse wurde mit Hilfe des gepaarten oder ungepaarten t- Tests durchgeführt.

Es wurden Untersuchungen durchgeführt, um der Frage nachzugehen, ob osmotischer Schock oder oxidativer Streß, gut bekannte Auslöser von apoptotischem Zelltod in kernhaltigen Zellen [Bortner & Cidlowski 1998, 1999, Lang et al. 1998, Maeno et al. 2000, Michea et al. 2000, Roger et al. 1999, Rosette &, Karin 1996] auch Erythrozyten in die Apoptose treiben. Es konnte gezeigt werden, daß beide Maßnahmen sowie Glucosemangel Apoptose auslösen. Überraschenderweise wurde die Apoptose durch Entfernen des extrazellulären Ca²⁺ unterbunden. In weiteren Experimenten konnte gezeigt werden, daß der Kationenkanal- Hemmstoff Amilorid die osmotisch, oxidativ oder metabolisch induzierte Apoptose unterbinden kann. Amilorid hemmt einen Kationenkanal, der durch osmotischen Schock [Huber et al. 2001] und oxidativen Streß [Duranton et al. 2001] aktiviert wird und Ca²⁺ in die Zelle einströmen läßt [Duranton et al. 2001]. Die Hemmung der erythrozytären Apoptose durch Amilorid zeigt daher, daß die Apoptose durch Aktivierung dieses Kanals zustande kommt. Befunde in kernhaltigen Zellen zeigen, daß auch diese Zellen durch Aktivierung des Amilorid-sensitiven Kationenkanales getötet werden können.

Experiment 1 Steigerung der cytosolischen Calcium-Konzentration durch das Ionophor Ionomycin löst erythrozytäre Apoptose aus

Änderungen des Zellvolumens (gemessen als forward scatter) nach einer 3-stündigen Inkubation von Erythrozyten mit 1 µM Ionomycin in Abwesenheit von Ca²⁺ (A) oder in Anwesenheit von Ca²⁺ (B). Phosphatidylserin-Assymmetrie (gemessen als Annexinbindung) nach 3-stündiger Inkubation mit Ionomycin in Abwesenheit von Ca²⁺ (C) oder Anwesenheit von Ca²⁺ (D). Arithmetische Mittelwerte (± SEM) von Annexinbindenden Zellen nach 3 Stunden Vorbehandlung mit 1 µM Ionomycin mit oder ohne Ca²⁺ in der extrazellulären Flüssigkeit (E).

Um die Bedeutung von Ca²⁺ für die erythrozytäre Apoptose zu überprüfen, wurde das Calciumionophor Ionomycin eingesetzt. Wie in Abb. 1 B gezeigt wird, führt die Verabreichung von 1 µM Ionomycin binnen 3 Stunden zu massiver, Ca²⁺-abhängiger Zeltschrumpfung, wie anhand der "Vorwärtsstreuung" (forward scatter FC) der Fluoreszenz-aktivierten Zell Sortierung (FACS) gezeigt werden kann. Die FC nimmt von einem Wert von 428 ± 13 (n = 3) auf einen Wert von 121 ± 2 (n = 4) ab. Darüber hinaus steigert 1 µM Ionomycin die Bindung von Annexin von 4.1 ± 0.4% (n = 3) auf 71.3 ± 3.2% (n = 4) (Fig. 1 D). Ionomycin induzierte Zellschrumpfung und Annexinbindung werden beide in Abwesenheit von extrazellulärem Ca²⁺ gehemmt. Die entsprechenden Werte betragen 337 ± 16 (n = 4) für die FC und 12.9 ± 3.1% (n = 4) für die Annexinbindung (Fig. 1 E). Die Behandlung von Erythrozyten mit Ionomycin löst somit zwei typische Merkmale der Apoptose aus, d. h. das Zusammenbrechen der Phosphatidylserin-Asymmetrie (welche zur Annexinbindung führt) und die Zellschrumpfung.

Experiment 2 Osmotischer Schock führt zu erythrozytärer Annexinbindung

Annexin-Bindung von Erythrozyten in isotonischem Medium (A) und in 850 mosmolarem Medium nach Zugabe von Sucrose für 24 Stunden (B). Die Zellen wurden der hyperosmolaren Lösung ferner in Abwesenheit von Ca²⁺ (C) oder in Anwesenheit von 1 mM Ca²⁺ aber Anwesenheit von 1 mM Amilorid (D) ausgesetzt. Arithmetische Mittelwerte (± SEM) von Annexin-bindenden Zellen bei verschiedenen Osmolaritäten nach 24 und 48 Stunden (E). Arithmetische Mittelwerte (± SEM) von Annexin- bindenden Zellen, die für 24 Stunden in 850 mosmol/l mit oder ohne Ca²⁺ bzw. mit oder ohne 1 mM Amilorid inkubiert wurden (F).

Osmotischer Schock ist als Auslöser von Apoptose in kernhaltigen Zellen bekannt [Bortner & Cidlowski 1998, 1999, Lang et al. 1998, Maeno et al. 2000, Michea et al. 2000, Roger et al. 1999, Rosette &, Karin 1996]. Wie überraschenderweise beobachtet wurde, steigert osmotischer Schock die Annexinbindung auch von kernlosen Erythrozyten (Abb. 2B, E). Werden Erythrozyten einer Osmolarität von 850 mosmol/l ausgesetzt (Zugabe von Sucrose), dann steigt die Zahl Annexin-bindender Zellen binnen 24 Stunden von 3.9 ± 0.3% (n = 4) auf 51.4 ± 3.8% (n = 9). Ein typisches Experiment ist in Abb. 2B dargestellt. Nominale Abwesenheit von Calcium mindert die Zahl Annexin-bindender Zellen nach osmotischem Schock signifikant auf 21.1 ± 7.2% (n = 4, siehe Abb. 2C für ein typisches Experiment und Abb. 2F für arithmetische Mittelwerte ± SEM). Darüber hinaus senkt der Kationenkanalblocker Amilorid (1 mM) die Zahl Annexin-bindender Zellen signifikant auf 29.8 ± 4.0% (n = 5, siehe Abb. 2D für ein typisches Experiment und Abb. 2F für arithmetische Mittelwerte ± SEM).

Experiment 3 Oxidativer Streß löst erythrozytäre Apoptose aus

Annexinbindung vor (A) und nach (B, C, D) 15-minütiger Oxidation von Erythrozyten mit 0.66 tert-butyl-hydroperoxid (tBOOH). Nach der Oxidation wurden die Zellen für 24 Stunden in Ringerlösung mit 1 mM Ca²⁺ (B) oder ohne Ca²⁺ (C) bzw. mit 1 mM Ca²⁺ und 1 mM Amilorid (D) inkubiert. Arithmetische Mittelwerte (± SEM) von Annexin-bindenden Zellen 24 Stunden nach einer 15-minütigen Behandlung mit 1 mM tBOOH oder 0.66 mM tBOOH, in der Anwesenheit oder Abwesenheit von 1 mM Ca²⁺ oder in der Anwesenheit von 1 mM Ca²⁺ und 1 mM Amilorid (E).

Oxidativer Streß, hervorgerufen durch die Verabreichung von 0.66 mM oder 1 mM tert-butyl-hydroperoxide (tBOOH) führte zu massiver Schrumpfung von Erythrozyten, wie durch die Änderung der Vorwärtsstreuung (forward scatter) in der FACS-Analyse von 370 ± 13 (n = 4) auf 314 ± 51 (n = 4) bzw. 167 ± 14 (n = 4) erkennbar wird. In einer ersten Serie von Experimenten konnte beobachtet werden, daß eine Behandlung der Zellen für 15 min mit 0.66 mM tBOOH signifikante Annexin-Bindung auslöst (Fig. 3B). Die Annexinbindung konnte durch Weglassen des extrazellulären Calciums (Abb. 3C) oder durch Verabreichung von 1 mM Amilorid (Abb. 3D) signifikant reduziert werden. Wie in Abb. 3E gezeigt wird, steigern 0.66 mM und 1 mM tBOOH die Zahl Annexin-bindender Zellen von 3.2 ± 0.5% (n = 4) auf 26 ± 7.5% (n = 4) und 68.5 ± 5.3 (n = 4). In der nominalen Abwesenheit extrazellulären Calciums sind sowohl die Oxidationsinduzierte Zellschrumpfung, als auch die Annexin- Bindung beide herabgesetzt. Die Werte für die Vorwärtsstreuung (forward scatter) in Calciumfreiem Incubationsmedium erreichten 339 ± 22 (n = 4) (0.66 mM tBOOH) und 307 ± 15 (n = 4) (1 mM tBOOH), im Vergleich zu 314 ± 51 (n = 4) und 167 ± 14 (n = 4) in der Anwesenheit von Calcium. Die Zahlen für Annexin-positive Zellen erreichten nur 11.0 ± 1.4% (n = 4) (0.66 mM tBOOH) und 34.1 ± 2.6% (n = 4) (1 mM tBOOH) in der Abwesenheit von Calcium (Fig. 3E). Entsprechend hemmte das Weglassen von extrazellulärem Calcium die tBOOH-induzierte Phosphatidylserin-Umlagerung um 66% bzw. 53%. Gleichermaßen minderte die Anwesenheit von 1 mM Amilorid die Wirkung von tBOOH selbst in der Anwesenheit von 1 mM Ca²⁺. Die jeweiligen Werte für die Vorwärtsstreuung (forward scatter) erreichten 356 ± 24.0 (n = 4) (0.66 mM tBOOH) und 291 ± 27 (n = 4) (1 mM tBOOH). In der Anwesenheit von 1 mM Amilorid wurde die Zahl Annexin-positiver Zellen auf 7.9 ± 3.2% (0.66 mM tBOOH) bzw. 37.7 ± 4.4% (1 mM tBOOH) herabgesetzt, ein Befund, welcher die Hemmung der t-BOOH-induzierten Annexin-Bindung um 80 bzw. 48% reflektiert (Abb. 3E).

Experiment 4

Glucosemangel induziert Erythrozytenapoptose

Annexin-Bindung von Erythrozyten nach 48-stündiger Inkubation in der Anwesenheit (A) oder der Abwesenheit von Glucose (B). Die Zellen wurden ferner einer Glucose-freien Lösung ohne Ca²⁺ (C) oder mit 1 mM Ca²⁺ und 1 mM Amilorid (D) ausgesetzt. Arithmetische Mittelwerte (± SEM) von Annexin-bindenden Zellen, welche einem Glucoseentzug für 24 oder 48 Stunden mit oder ohne Anwesenheit von Ca²⁺ oder 1 mM Amilorid (E) ausgesetzt wurden.

Es wurde früher gezeigt, daß Glucosemangel die antioxidativen Mechanismen von Erythrozyten schwächt. Daher wurde die Wirkung von Glucosemangel untersucht (Abb. 4A-E). In der Anwesenheit von Glucose banden 3.1 ± 0.6% (n = 4) der Erythrozyten Annexin. Die Entfernung von Glucose aus dem extrazellulären Medium steigerte die Zahl Annexinbindender Zellen auf 11.2 ± 2.2% (n = 4) nach 24 Stunden und auf 49.4 ± 5.7% (n = 4) nach 48 Stunden. Die Zunahme Annexin-bindender Zellen war in der nominalen Abwesenheit von Calcium signifikant herabgesetzt. Die entsprechenden Werte waren 10.4 ± 2.5% (n = 4) nach 24 Stunden und 10.0 ± 1.9% (n = 4) nach 48 Stunden. In gleicher Weise wurde die Wirkung von Glucose-Entzug durch Amilorid (1 mM) abgeschwächt. Die jeweiligen Werte waren 5.7 ± 1.8% (n = 4) nach 24 Stunden und 11.7 ± 1.9% (n = 4) nach 48 Stunden (Abb. 4E).

Jüngste Befunde zeigten, daß der Ca²⁺-Ionophor Ionomycin erythrozytäre Zellschrumpfung und Annexinbindung von Erythrozyten auslöst, beides typische Hinweise auf Apoptose in kernhaltigen Zellen [Bratosin et al. 2001, Berg et al. 2001, Daugas et al. 2001]. Wie und unter welchen Bedingungen die Ca²⁺-Konzentration in Erythrozyten gesteigert wird, blieb bisher unklar. Mit den vorliegenden Ergebnissen ist zum ersten Mal die Bedeutung eines Amilorid-sensitiven, Zellvolumen-regulierten Kationenkanales für die Auslösung von apoptotischem Zelltod gezeigt worden. Die Kanäle wurden früher charakterisiert, ihre Hemmbarken durch Amilorid [Huber et al. 2001, Duranton et al. 2002], sowie ihre Empfindlichkeit gegenüber osmotischem [Huber et al. 2001] und oxidativem [Duranton et al. 2002] Streß gezeigt.

Die durch oxidativen Streß induzierte erythrozytäre Zellschrumpfung resultiert aus einer Aktivierung von Ca²⁺-sensitiven K⁺-Kanälen in der erythrozytären Zellmembran, die über eine Hyperpolarisation der Zellmembran zu erythrozytärem Verlust von KCl führt [Bookchin et al. 1987, Brugnara et al. 1993].

Die gezeigten Mechanismen spielen eine Rolle in der Begrenzung der Erythrozytenlebensdauer. Die Präsentation von Phosphatidylserin auf der Zelloberfläche stimuliert die Aufnahme der Erythrozyten durch Makrophagen [Boas et al. 1998, Romero & Romero 1999]. Daher fördert eine Zunahme der intrazellulären Calcium-Konzentration, wie sie in alternden Erythrozyten auftritt [Kiefer & Snyder 2000, Romero & Romero 1999], die Entfernung der betroffenen Erythrozyten aus der Blutbahn.

Oxidativer Streß oder herabgesetzte Wirksamkeit von antioxidativen Mechanismen [Damonte et al. 1992] beschleunigt zumindest z. T. über Aktivierung des Kationenkanales die Entfernung von Erythrozyten. Durch Hemmung der Kationenkanäle wird dieses Absterben verzögert. Ähnliche Befunde lassen sich auch in kernhaltigen Zellen nachweisen. Literatur Andree HA, Reutelingsperger CP, Hauptmann R, Hemker HC, Hermens WT and Willems GM (1990) Binding of vascular anticoagulant alpha (VAC alpha) to planar phospholipid bilayers. J Biol Chem. 265: 4923-8
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Claims

1. Verwendung mindestens einer Substanz zum Nachweis der Expression und/oder Funktion von Kationenkanälen in Zellen, zur Diagnose von Erkrankungen, die mit einer gestörten Regulation der Apoptose in Zusammenhang stehen.

2. Verwendung mindestens eines Wirkstoffes zur Beeinflussung, insbesondere zur Stimulierung oder Inhibierung der Expression und/oder Funktion von Kationenkanälen in Zellen, zur Vorbeugung oder Behandlung von Erkrankungen, die mit einer gestörten Regulation der Apoptose in Zusammenhang stehen.

3. Verwendung mindestens eines Wirkstoffes zur Beeinflussung, insbesondere zur Stimulierung oder Inhibierung der Expression und/oder Funktion von Kationenkanälen in Zellen, zur Herstellung eines Medikamentes oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Vorbeugung oder Behandlung von Erkrankungen, die mit einer gestörten Regulation der Apoptose in Zusammenhang stehen.

4. Verfahren zur Regulation der Apoptose, dadurch gekennzeichnet, daß Zellen mit einem Wirkstoff in Kontakt gebracht werden, der die Expression und/oder Funktion von Kationenkanälen beeinflußt, insbesondere stimuliert oder inhibiert, und dadurch die Apoptose in diesen Zellen induziert oder hemmt.

5. Verwendung oder Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Beeinflussung, insbesondere Stimulierurig oder Inhibierung, von Kationenkanälen eine Beeinflussung und/oder Kontrolle des Ca²⁺-Einstroms in die Zellen zur Folge hat.

6. Verwendung oder Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Zellen um Blutzellen, insbesondere um Erythrozyten, handelt.

7. Verwendung oder Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff oder die Substanz gegen Kationenkanäle gerichtet ist.

8. Verwendung oder Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff oder die Substanz gegen Aktivatoren, Inhibitoren, Regulatoren und/oder biologischen Vorläufer von Kationenkanälen gerichtet ist.

9. Verwendung oder Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff oder die Substanz ein Polynukleotid ist, welches ein Peptid, insbesondere ein Polypeptid, kodiert, wobei vorzugsweise dieses Peptid die Expression und/oder Funktion von Kationenkanälen beeinflußt, insbesondere stimuliert oder inhibiert.

10. Verwendung oder Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff oder die Substanz ein Peptid, vorzugsweise ein Polypeptid, ist, wobei vorzugsweise dieses Peptid die Expression und/oder Funktion von Kationenkanälen beeinflußt, insbesondere stimuliert oder inhibiert.

11. Verwendung oder Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff oder die Substanz ein "small molecular compound", vorzugsweise ein "small molecular compound" mit einem Molekulargewicht (MG) < 2.000 ist.

12. Verwendung oder Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff oder die Substanz Amilorid oder ein Analogon ist.

13. Verwendung oder Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff oder die Substanz eine oxidierende Agens ist.

14. Verwendung oder Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Erkrankungen, die mit einer gestörten Regulation, insbesondere einer gestörten Inhibierung, der Apoptose in Zusammenhang stehen, um neurodegenerative Erkrankungen, akutes Nierenversagen, Thalassämie, Sichelzellenanämie, Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase-Mangel, Eisenmangelanämie und/oder Immundefizienz handelt.

15. Verwendung oder Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Erkrankungen, die mit einer gestörten Regulation, insbesondere einer gestörten Induzierung, der Apoptose in Zusammenhang stehen, um Tumore und/oder Infektionen handelt.

16. Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend eine wirksame Menge mindestens eines Wirkstoffes, der die Expression und/oder Funktion von Kationenkanälen beeinflußt, insbesondere stimuliert oder inhibiert, und gegebenenfalls einen pharmazeutischen Träger.

17. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff ein Polynukleotid ist, welches ein Peptid, insbesondere ein Polypeptid, kodiert, wobei vorzugsweise dieses Peptid die Expression und/oder Funktion von Kationenkanälen beeinflußt, insbesondere stimuliert oder inhibiert.

18. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff ein Peptid, vorzugsweise ein Polypeptid, ist, wobei vorzugsweise dieses Peptid die Expression und/oder Funktion von Kationenkanälen beeinflußt, insbesondere stimuliert oder hemmt.

19. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 16 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff ein "small molecular compound", vorzugsweise ein "small molecular compound" mit einem Molekulargewicht (MG) < 2.000, ist.

20. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff Amilorid oder ein Analogon ist.

21. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 16 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff ein oxidierendes Agens ist.

22. Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend eine wirksame Menge mindestens eines Wirkstoffes, der die Expression und/oder Funktion von Aktivatoren, Inhibitoren, Regulatoren und/oder biologischen Vorläufern von Kationenkanälen beeinflußt, insbesondere stimuliert oder inhibiert, und gegebenenfalls einen pharmazeutischen Träger.

23. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff ein Polynukleotid ist, welches ein Peptid, insbesondere ein Polypeptid, kodiert, wobei vorzugsweise dieses Peptid die Expression und/oder Funktion von Aktivatoren, Inhibitoren, Regulatoren und/oder biologischen Vorläufern von Kationenkanälen beeinflußt, insbesondere stimuliert oder inhibiert.

24. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff ein Peptid, vorzugsweise ein Polypeptid, ist, wobei vorzugsweise dieses Peptid die Expression und/oder Funktion von Aktivatoren, Inhibitoren, Regulatoren und/oder biologischen Vorläufern von Kationenkanälen beeinflußt, insbesondere stimuliert oder hemmt.

25. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 22 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff ein "small molecular compound", vorzugsweise ein "small molecular compound" mit einem Molekulargewicht (MG) < 2.000, ist.

26. Diagnosekit, umfassend mindestens eine Substanz zum Nachweis von Expression und/oder Funktion von Kationenkanälen, zur Erkennung von Anfälligkeiten gegenüber Erkrankungen, die mit einer gestörten Regulation der Apoptose in Zusammenhang stehen.

27. Diagnosekit nach Anspruch 26 zur Erkennung von Anfälligkeiten gegenüber neurodegenerativen Erkrankungen, akuten Nierenversagen, Thalassämie, Sichelzellenanämie, Glucose-6-Phosphat- Dehydrogenase-Mangel, Eisenmangelanämie, Immundefizienz, Tumorerkrankungen und/oder Infektionen.