DE10215321A1

DE10215321A1 - Trp-p8 Splice Varianten und regulatorische RNA

Info

Publication number: DE10215321A1
Application number: DE10215321A
Authority: DE
Inventors: Simone Kaiser; Thomas Plath
Original assignee: Metagen Pharmaceuticals GmbH
Current assignee: HINZMANN, BERND, DR., 13127 BERLIN, DE; KAISER, SIMONE, DR.RER.NAT., 12163 BERLIN, DE; PILARSKY, CHRISTIAN, DR., 01309 DRESDEN, DE; PLATH, THOMAS, DR., 14163 BERLIN, DE; ROSENTHAL, ANDRE, PROF., 14482 POTSDAM, DE
Priority date: 2002-04-02
Filing date: 2002-04-02
Publication date: 2003-10-23
Also published as: EP1359158A2; EP1359158A3

Abstract

Die Erfindung betrifft neue Trpp8 Sequenzen sowie deren Verwendungen im Zusammenhang mit der Diagnose und/oder Behandlung von Prostatakrebs.

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft neue Trp-p8 (transient receptor potential protein 8, folgend kurz Trpp8) Splice Varianten und regulatorische RNA sowie hierdurch codierte Proteine bzw. Peptide, die Verwendung von aus Trpp8 abgeleiteten Substanzen zum Screenen nach daran bindenden Substanzen, sowie die Verwendung von an Trpp8 bindenden Substanzen zur Diagnose und/oder Behandlung von Krebserkrankungen.

Hintergrund der Erfindung und Stand der Technik

Die Kalzium Homeostase regelt wichtige Zellfunktionen, wie Proliferation, Differenzierung, Invasion, Migration, Angiogenese und Apoptose. Bei Prostatakrebs spielt Kalzium eine wichtige Rolle in der Tumorbildung. Es ist jedoch wenig über die Kalziumkanäle und membrangebundenen Plasma Rezeptoren bekannt, die den Eintritt und Austritt von Kalzium in und aus intrazellulären Kalziumreservoirs in Prostatatumorzellen regeln.

Trpp8 ist in der Literaturstelle Tsavaler et al., Cancer Res, 61: 3760-3769 (2001) als Prostata-spezifisches Gen beschrieben worden, welches vorwiegend in humanen Prostatatumoren exprimiert wird. Trpp8 wird signifikant hochreguliert. In Androgen-abhängigen Prostata Zelllinien wird gemäß dieser Literaturstelle Trpp8 gefunden, nicht jedoch in Androgen-unabhängigen Zelllinien, welche auch nicht PAP (prostate acid phosphatase) und PSA (prostate specific antigen) exprimieren. Es wird vermutet, daß Trpp8 als Kalzium Kanal Protein funktioniert. Nach neuer Nomenklatur der Trp-Superfamilie wird Trpp8 zukünftig auch als TRPM8 bezeichnet (Montell et al., Mol Cell, 9, 229-231, 2002).

Trp Proteine sollen zu den sogenannten store operated calcium channels (SOC) bzw. capacitative calcium entry channels (CCE) gehören. In LNCaP Zellen konnte eine Involvierung in der Apoptose gezeigt werden (Wertz et al., J Biol Chem, 275: 11470-11477 (2000)).

Die 5694 bp Trpp8 cDNA hat einen 3312 bp offenen Leserahmen, welcher für ein 1104 Aminosäuren Protein mit angeblich sieben transmembranen Domänen codiert mit einem Molekulargewicht von ca. 127.500 Da. Unveröffentlichte bioinformatische Analyse der Anmelderin legen jedoch nahe, daß Trpp8 lediglich 6 transmembrane Domänen aufweist.

Trpp8 Sequenzen sind in den Literaturstellen US-6,194,152, US-6,183,968, WO-99/46374, WO-99/09166, WO-01/25273, WO-01/25272, WO-01/34802, WO-01/46258, WO-01/42467 und WO-01/1633 beschrieben. Die Literaturstellen US-6,194,152 und WO-01/51633 offenbaren die Verwendung der darin genannten Sequenzen zur Detektion von Tumorzellen sowie verschiedener Substanzklassen in allgemeiner Weise zur Behandlung von Prostatakrebs.

Prostatakrebs ist eine mit zunehmendem Alter mit beachtlicher Inzidenz auftretende Erkrankung. Bislang wird Prostatakrebs im wesentlichen pathologisch diagnostiziert und meist durch Entfernung der Prostata behandelt. Die Entfernung der Prostata hat verschiedene nachteilige Effekte auf einen Patienten. Eine verbesserte Diagnose und Behandlung dieser Krebsart, insbesondere ohne das Erfordernis einer Entfernung der Prostata, ist daher in hohem Maße wünschenswert.

Technisches Problem der Erfindung

Der Erfindung liegt das technische Problem zugrunde, pharmazeutische Zusammensetzungen zur Diagnose und/oder zur Behandlung von Prostatakrebs-Erkrankungen anzugeben.

Grundzüge der Erfindung sowie bevorzugte Ausführungsbeispiele

Zur Lösung dieses technischen Problems lehrt die Erfindung zunächst eine Nukleinsäure codierend für eine Trpp8 Splice Variante oder regulatorische RNA enthaltend eine Nukleinsäuresequenz gemäß einer der Sequenzen Seq.-ID 1 bis 7, sowie ein Trpp8 Peptid oder Protein enthaltend eine Aminosäuresequenz codiert durch eine der Nukleinsäuresequenzen Seq.-ID 1 bis 7 oder 23 bis 30 oder gemäß Seq.-ID 8, wobei bekannte Sequenzen enthaltend diese Sequenzen ausgeschlossen sind. Die Nukleinsäure bzw. das Peptid oder Protein können insbesondere aus diesen Sequenzen bestehen. Erfindungsgemäße Nukleinsäuren oder Proteine bzw. Peptide lassen sich mit den üblichen molekularbiologischen Methoden herstellen.
Die Splice Variante (6b) gemäß Seq.-ID 1 enthält 6 Exons mit einer Länge von 985 Basenpaaren. Exons 1 bis 5 sind identisch mit bekanntem Vollängen Trpp8. Exon 6 is um 234 Basenpaare verlängert und geht in das poly-A-Signal über. Eine Teilsequenz ist in Seq.-ID 23 angegeben.
Die Splice Variante (16b) gemäß Seq.-ID 2 enthält zumindest 2 Exons mit einem unbekannten 5'-Ende. Exon 15 ist identisch mit bekanntem Trpp8. Das erfindungsgemäße Exon 16b schließt sich mit 104 Basenpaaren unmittelbar an Exon 16 an und geht in ein poly-A-Signal über. Eine Teilsequenz ist in Seq.-ID 24 angegeben.
Die Splice Variante (20b) gemäß Seq.-ID 3 enthält zumindest 8 Exons mit einem unbekannten 3'-Ende. Exons 19 bis 26 sind identisch mit bekanntem Trpp8. Exon 20b schließt sich mit 127 Basenpaaren unmittelbar an Exon an. Das poly- A-Signal beginnt bereits beim Basenpaar 1136. Eine Teilsequenz ist in Seq.-ID 25 angegeben.
Die Splice Variante (avant25) gemäß Seq.-ID 4 enthält zumindest 3 Exons mit einem unbekannten 5'-Ende. Avant25 weist 571 Basenpaare auf, deren Sequenz in bekanntem Trpp8 nicht gefunden wird. Die Sequenz befindet sich im Intron- Bereich zwischen Exon 24 und 25 von Trpp8. Die Sequenz geht weiter in Exon 25 und 26 von Trpp8. Exon 26 ist wie bei 20b abgebrochen. Das poly-A-Signal beginnt beim Basenpaar 1136. Eine Teilsequenz ist in Seq.-ID 26 angegeben.
Die Splice Variante (avant13) gemäß Seq.-ID 5 enthält zumindest 6 Exons mit einem unbekannten 5'-Ende. Avant13 weist ein Exon von 271 Basenpaaren im Intronbereich von Trpp8 zwischen dessen Exon 12 und 13 auf. Dieses Exon geht in Exon 21 über, wobei lediglich 20 Basenpaare des 3'-Endes Teil des Transkrips sind. Die Exons 22, 23, 24, und 26 sind identisch mit der Vollänge von Trpp8, weisen aber ein anderes Splice Muster auf. Exon 26 ist abgebrochen und enthält ein poly-A-Signal beginnend beim Basenpaar 347. Teilsequenzen sind Seq.-ID 27 und 31.
Die Splice Variante (4a_4b) gemäß Seq.-ID 6 enthält zumindest 5 Exons. Exon 2x ist ein separates Exon, welches sich im Intron-Bereich von Trpp8 zwischen Exon 2 und 3 befindet und aus mindestens 35 Basenpaaren besteht (das 5'-Ende von Exon 2x ist nicht komplett), und mehrere hundert Basen vor Exon 3 gemäß bekanntem Trpp8 angeordnet. Exon 3 wird wie in Trpp8 transkribiert, aber Exon 4 startet 46 Basen früher als in Trpp8. Die Sequenz setzt sich über Exon 5 zu 6a fort und endet mit 6b. Teilsequenzen sind in Seq.-ID 28-30 angegeben.
Im Einzelnen wird auch auf die graphische Darstellung der jeweiligen Lagen gemäß Abb. 1 hingewiesen.
Das neue regulatorische Trpp8 Gen gemäß der Sequenzen Seq.-ID 7 und 8 ist auf dem gegenüberliegenden Strang des bekannten Trpp8 Gens auf Chromosom 2 angeordnet. Exon 1 des regulatorischen Gens liegt im Intron zwischen Exon 12 und 11 des Trpp8. Exon 2 des neuen Gens umfaßt Exon 11 von Trpp8 vollständig. Exon 3 des neuen Gens ist zwischen Exon 8 und 7 des Trpp8 angeordnet. Erfindungsgemäße mRNA bindet möglicherweise bekanntes Trpp8 oder seine Splice Varianten und beeinflußt deshalb vermutlich die Expression dieser Gene. Diese Bindung könnte eine Stabilisierung und somit eine länger andauernde Translation induzieren, könnte aber auch eine Destabilisierung der mRNA durch Aktivierung der Abbaumechanismen bewirken. Insofern betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zur Modulation der Trpp8 Expression, insbesondere deren Destabilisierung, wobei einer Zielzelle, beispielsweise Prostatatumorzelle, eine Substanz enthaltend zumindest eine Teilsequenz aus oder die Vollsequenz gemäß Seq.-ID 7 oder 8 in einer physiologisch wirksamen Dosis zugeführt wird. Damit eignen sich solche Substanzen auch zur Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Behandlung von Krebs, insbesondere Prostatakrebs. Ansonsten geltend die zu den anderen Erfindungsgegenständen getroffenen Ausführungen analog. Die Lokalisierung der regulatorischen RNA ist in der Abb. 2 im Einzelnen dargestellt.
Die Erfindung betrifft weiterhin verschiedene Verwendungen der neuen Nukleinsäuren bzw. Peptide oder Protein, ebenso wie (gleiche) Verwendungen bereits bekannter Trpp8 Nukleinsäuren. Dies sind:

a) Die Verwendung einer für Trpp8 codierenden Nukleinsäure und/oder eines Trpp8 Peptids oder Proteins zur Detektion von Prostatakrebs oder zur Detektion eines Risikos der Erkrankung an Prostatakrebs, wobei eine Prostata-Gewebeprobe auf Übertranskription von Trpp8 RNA oder auf Überexpression eines Trpp8 Proteins untersucht wird, wobei vorzugsweise eine an für Trpp8 codierende Nukleinsäure oder eine an Trpp8 Protein oder Peptid bindende Detektorsubstanz, vorzugsweise enthaltend eine Reportergruppe, verwendet wird, wobei Bindung besagter Nukleinsäure und/oder besagten Proteins oder Peptids an die Detektorsubstanz halbquantitativ oder quantitativ detektiert wird,
b) die Verwendung einer Trpp8 RNA oder eines Trpp8 Proteins oder Peptids zum Screenen nach daran bindenden Substanzen, insbesondere prospektiven Wirkstoffen zur Inhibierung von besagter RNA oder besagtem Protein oder Peptid, oder prospektiven Detektorsubstanzen, wobei eine prospektive Substanz oder eine Mischung solcher prospektiver Substanzen mit besagter RNA oder besagtem Protein oder Peptid kontaktiert wird, wobei mit einem Bindungsassay Bindungsereignisse festgestellt werden, und wobei eine bindende prospektive Substanz, ggf. nach Dekonvolutierung, selektiert wird,
c) die Verwendung einer Trpp8 inhibierenden oder daran bindenden Substanz zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Prostatakrebs.

Die bindende Substanz kann ein Antikörper sein, welcher durch Immunisierung eines nicht-menschlichen Säugetiers mit einer Trpp8 cDNA oder mit einem Trpp8 Peptid oder Protein erhältlich ist. Die Substanz kann aber auch eine Mimikryverbindung eines Antikörpers gegen ein Trpp8 Peptid oder Protein, sein. Die Substanz kann schließlich ein Aptamer, eine antisense RNA oder ein Ribozym sein. Die Substanz kann zusätzlich eine zytotoxische und/oder immunstimulierende Komponente tragen bzw. daran gebunden sein. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann zur lokalen Applikation in Tumorzellen enthaltendem Tumoren hergerichtet sein.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Diagnose einer Krebserkrankung, wobei eine erfindungsgemäße Detektorsubstanz in der Ausführungsform mit einer Reportergruppe in zu untersuchendes Gewebe (welches im Organismus verblieben oder daraus entnommen sein kann) appliziert wird, wobei das zu untersuchende Gewebe dann einer Detektionsverfahrenstufe unterworfen wird, welche sensitiv für die Reportergruppe ist, und wobei im Fall der Detektion eines definierten Mindestwertes der Reportergruppe im Gewebe das Gewebe als Tumorzellen enthaltend qualifiziert wird, sowie ein Verfahren zur Behandlung einer Prostatakrebs-Erkrankung, wobei eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung in einer physiologisch wirksamen Dosis und üblicher galenischer Herrichtung einem Patienten dargereicht wird. Es versteht sich, daß ggf. zur Entfernung nicht gebundener Detektorsubstanz notwendige Waschverfahrensstufen zwischengeschaltet werden.
Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß Trpp8, insbesondere die erfindungsgemäßen Splice Varianten und regulatorische RNA differentiell in Prostatatumorgewebe exprimiert wird, i. e. in Prostatatumorgewebe ist die Expression höher, verglichen mit normalen Zellen gleichen Gewebes. Dies erlaubt es einerseits, insbesondere diese neuen Varianten als Marker zur Identifizierung von Tumorzellen in der Prostata zu nutzen. Auf der anderen Seite bietet die Inhibierung von Trpp8 bzw. der Varianten, insbesondere auch bei lokaler Applikation, die Möglichkeit, in die Prostatatumor-spezifischen Trpp8 Assoziationen mit anderen Prozessen in den Tumorzellen einzugreifen und somit letztendlich den Tumorzell-spezifisch veränderten Stoffwechsel zu stören und zu einem Absterben oder zumindest einer Wachstumshemmung der Prostatatumorzellen beizutragen.
Im Rahmen der Erfindung kann es sich empfehlen, im Vorfeld einer Behandlung mit einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung eine Probe aus einem Gewebe, welches als Tumorgewebe mit anderen Methoden identifiziert ist, zu entnehmen und die Gewebeprobe auf Expression bzw. Überexpression von Trpp8 bzw. der Varianten zu untersuchen. Alternativ kann mit einer erfindungsgemäßen Detektorsubstanz zur Diagnose in vivo auf Trpp8 Abhängigkeit getestet werden. Wird eine Expression bzw. Überexpression von Trpp8 gegenüber Normalgewebe gleichen Typs festgestellt, so ist die Anwendung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung indiziert.
Handelt es sich bei dem Tumor um einem Typus, bei welchem Tumorzellen Trpp8 bzw. eine der Varianten exprimieren, Normalzellen gleichen Gewebetyps jedoch nicht oder nur schwach, so ist es besonders bevorzugt, wenn die an Trpp8 bzw. die Variante bindende Substanz zusätzlich eine zytotoxische, radioaktive und/oder immunstimulierende Komponente trägt. Dies führt dann letztendlich dazu, dass praktisch ausschließlich Tumorzellen getötet, sei es durch die Zytotoxizitat, sei es durch Angriff durch das stimulierte Immunsystem, werden, während Normalzellen in dem Gewebe praktisch vollständig erhalten bleiben. In dieser Ausführungsform braucht die bindende Substanz selbst nicht inhibierend auf Trpp8 bzw. die Varianten zu wirken, da die bindende Substanz dann lediglich als Marker funktionieren muß, welcher die Komponenten zu Ziel-Tumorzellen trägt. Im Falle des Einsatzes einer zytotoxischen, radioaktiven und/oder immunstimulierenden Komponente kann es sich besonders empfehlen, wenn die pharmazeutische Zusammensetzung zur lokalen Applikation in Tumorzellen enthaltendem Gewebe hergerichtet ist, beispielsweise zur Injektion.

Definitionen

Im Rahmen dieser Beschreibung wird die Bezeichnung Trpp8 als Oberbegriff für alle humanen Isoformen, Splice Varianten und regulatorische RNA, bekannt oder neu, auf Nukleinsäuren- oder Aminosäurenbasis, verwendet. Mit diesen Begriffen mit umfaßt sind auch die ggf. im Rahmen dieser Beschreibung offenbarten kurzen Sequenzen, welche aus den verschiedenen Varianten stammen, beispielsweise Immunisierungssequenzen. Weiterhin mit umfaßt sind auch Homologe, wobei die Homologie zumindest 80%, vorzugsweise mehr als 90%, höchstvorzugsweise mehr als 95%, beträgt. Im Falle der Nukleinsäuresequenzen sind auch komplementäre oder allelische Varianten mit umfaßt. Weiterhin sind Sequenzen umfaßt, welche lediglich Teilsequenzen der explizit offenbarten Sequenzen, beispielsweise ein Exon oder mehrere Exons, oder komplementärer Sequenzen hierzu darstellen, mit der Maßgabe, daß diese Teilsequenzen im Falle der Nukleinsäuren eine für eine Hybridisierung mit einer erfinsungsgemäßen Nukleinsäure hinreichende Länge, zumindest 50 Basen, aufweisen und im Falle der Proteine bzw. Peptide, ggf. codiert durch eine Nukleinsäure, mit zumindest gleicher Affinität an ein protein- oder peptidspezifisches Zielmoleküle binden. Es versteht sich, daß die Erfindung auch Expressionskassetten umfaßt, i. e. eine oder mehrere der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen mit mindestens einer Kontroll- oder regulatorischen Sequenz. Eine solche Expressionskassette kann auch eine Sequenz für ein bekanntes Protein umfassen, wobei im Zuge der Translation ein Fusionsprotein aus einem bekannten Protein und einem erfindungsgemäßen Protein oder Peptid entsteht. Ebenso sind auch antisense Sequenzen zu den vorstehenden Nukleinsäuresequenzen umfaßt. Mit umfaßt sind auch Expressionsvektoren enthaltend erfindungsgemäße Nukleinsäuren sowie damit transformierte Wirtszellen. Schließlich sind RNA sowie damit korrelierende DNA und umgekehrt umfaßt, ebenso wie genomische DNA als auch korrelierte cDNA und umgekehrt.
Als Inhibitor ist eine Verbindung oder Substanz bezeichnet, welche entweder die Bildung von Trpp8 inhibiert oder gebildetes Trpp8 in der Aktivität reduziert, bezogen auf die Trpp8 in vitro oder in vivo Aktivität in Abwesenheit des Inhibitors. Insofern kann ein Inhibitor einerseits eine Substanz sein, welche in der Entstehungskaskade von Trpp8 inhibierend eingreift. Auf der anderen Seite kann ein Inhibitor eine Substanz sein, welche mit gebildetem Trpp8 eine Bindung eingeht, und zwar dergestalt, dass weitere physiologische Wechselwirkungen mit endogenen Substanzen zumindest reduziert sind.
Mimikry-Moleküle sind Verbindungen, die den variablen Bereich, insbesondere den Bindungsbereich eines Antikörpers nachbilden und an gleicher Stelle eines Zielmoleküls binden wie der zu Grunde liegende Antikörper.
Der Begriff der Antikörper umfaßt humane, humanisierte und nicht humanisierte polyklonale Antikörper, monoklonale Antikörper und Phage-Display-Antikörper, aber auch chimäre Antikörper sowie spezifische Fragmente der leichten und/oder der schweren Kette des variablen Bereiches zu Grunde liegender Antikörper vorstehender Art. Die Herstellung bzw. Gewinnung solcher Antikörper mit vorgegebenen Immunogenen ist dem Durchschnittsfachmann wohl vertraut und braucht nicht näher erläutert zu werden. Weiterhin umfaßt der Begriff der Antikörper bispezifische Antikörper. Bispezifische Antikörper kombinieren eine definierte Immunzellaktivität mit einer spezifischen Tumorzellerkennung, wodurch Tumorzellen getötet werden. Ein bispezifischer Antikörper bindet einerseits an Auslösemoleküle der Immun- Effektorzelle (z. B. CD3, CD16, CD64) und andererseits an Antigene der Tumorzielzelle.
Die galenische Herrichtung einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung kann in fachüblicher Weise erfolgen. Als Gegenionen für ionische Verbindungen kommen beispielsweise Na⁺, K⁺, Li⁺ oder Cyclohexylammonium in Frage. Geeignete feste oder flüssige galenische Zubereitungsformen sind beispielsweise Granulate, Pulver, Dragees, Tabletten, (Mikro-)Kapseln, Suppositorien, Sirupe, Säfte, Suspensionen, Emulsionen, Tropfen oder injizierbare Lösungen (i. v., i. p., i. m.) sowie Präparate mit protrahierter Wirkstoff-Freigabe, bei deren Herstellung übliche Hilfsmittel wie Trägerstoffe, Spreng-, Binde-, Überzugs-, Quellungs-, Gleit- oder Schmiermittel, Geschmacksstoffe, Süßungsmittel und Lösungsvermittler, Verwendung finden. Als Hilfsstoffe sei Magnesiumcarbonat, Titandioxid, Lactose, Mannit und andere Zucker, Talcum, Milcheiweiß, Gelatine, Stärke, Zellulose und ihre Derivate, tierische und pflanzliche Öle wie Lebertran, Sonnenblumen-, Erdnuss- oder Sesamöl, Polyethylenglycole und Lösungsmittel, wie etwa steriles Wasser und ein- oder mehrwertige Alkohole, beispielsweise Glycerin, genannt. Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung ist dadurch herstellbar, dass mindestens ein erfindungsgemäß verwendeter Trpp8-Inhibitor in definierter Dosis mit einem pharmazeutisch geeigneten und physiologisch verträglichen Träger und ggf. weiteren geeigneten Wirk-, Zusatz- oder Hilfsstoffen mit definierter Inhibitordosis gemischt und zu der gewünschten Darreichungsform hergerichtet ist.
Tumorzellen exprimieren Trpp8 differenziell, wenn Normalzellen des gleichen Gewebetyps dieses nicht exprimieren. Tumorzellen überexprimieren Trpp8 spezifisch bzw. differenziell, wenn Trpp8 im Vergleich zu Normalzellen des gleichen Gewebes zumindest in doppelter Menge exprimiert wird.
Zytotoxische Komponenten bzw. Gruppen sind Verbindungen, welche direkt oder indirekt Apoptose einleiten oder zumindest wachstumshemmend wirken. Solche Gruppen bzw. Verbindungen können neben Radioisotopen (z. B. 188Re, 213Bi, 99mTc, 90Y, 131J, 177Lu) insbesondere Zytostatika einschließlich sogenannter Prodrugs sein, welche in der Tumortherapie eingesetzt werden. Beispiele hierfür sind: Alkylantien (z. B. Mechlorethamin, Ifosfamid, Chlorambucil, Cyclophosphamid, Melphalan, Alkylsulfonate, Busulphan, Nitrosoharnstoffe, Carmustin, Lomustin, Semustin, Triazene, Dacarbazin), Antimetaboliten (z. B. Folsäure-Antagonisten, Methotrexat, Pyrimidin-Analoga, Fluoruracil, Fluordesoxyuridin, Cytarabin, Gemcitabin, Purin-Analoga, Mercaptopurin), Mitosehemmer (z. B. Vincaalkaloide, Vincristin, Vinblastin, Paclitaxal, Docetaxel, Protaxel), Epipodophyllotoxine (z. B. Etoposid, Teniposid), Antibiotika (z. B. Dactinomycin, Daunorubicin, Idarubicin, Anthracycline, Bleomycin, L-Asparaginase), Platinkomplexverbindungen (z. B. Cisplatin), Hormone und verwandte Verbindungen (z. B. Nebennierensindensteroide, Aminogluthetimid, Gestagene, Östrogene, Androgene, Antiöstrogene, Tamoxifen, Steriodanaloga, Flutamid). Bei Bindung einer solchen Verbindung mit einer an Trpp8 bindenden Substanz erfolgt die Kopplung dergestalt, daß die Affinität zu Trpp8 um nicht mehr als 90%, vorzugsweise 50%, bezogen auf die Substanz ohne zytostatische Gruppe, reduziert ist und die zytostatische Wirkung der Gruppe um nicht mehr als 90%, vorzugsweise 50%, bezogen auf die Verbindung ohne Substanz, reduziert ist.
Eine immunstimulierende Komponente ist meist ein Protein oder ein wirksamer Bestandteil hiervon, welches Zellen des Immunsystems stimuliert. Beispiele hierfür sind: Zytokine, wie M-CSF, GM-CSF, G-CSF, Interferone, wie IFN-alpha, beta, gamma, Interleukine wie IL-1 bis -16 (außer -8), human LIF, Chemokine wie Rantes, MCAF, MIP-1-alpha, -beta, NAP-1 und IL-8.
Eine Reportergruppe ist ein Atom, Molekül oder eine Verbindung, welche in Verbindung mit einem hierauf abgestellten Assay den Nachweis der Reportergruppe und der somit mit der Reportergruppe verbundenen Verbindung oder Substanz ermöglicht. Beispiele für Reportergruppen und hiermit assoziierte Detektionsmethoden sind: 32P-Labeling und Intensitätsmessung mittels Phosphoimager. Viele weitere Beispiele sind dem Durchschnittsfachmann bekannt und bedürfen nicht der detaillierten Aufzählung.
Eine an Trpp8 bindende Substanz kann eine Substanz sein, welche ein Trpp8-Protein oder Trpp8-RNA bindet.

Beispiele

Im Folgenden wird die Erfindung anhand von lediglich bevorzugte Ausführungsformen darstellenden Beispielen und Abbildungen näher erläutert. Es zeigen:
Abb. 1: Lokalisierung der erfindungsgemäßen Trpp8 Splice Varianten relativ zu Volllängen Trpp8,
Abb. 2: Lokalisierung der erfindungsgemäßen Trpp8 regulatorischen RNA auf dem Chromosom 2,
Abb. 3 bis 9: verschiedene Hammerhead Ribozyme gegen verschiedene Trpp8 Splice Varianten sowie regulatorischer RNA, einschließlich Schnittstellen.

Tab. 1

Ergebnisse zur vergleichenden Trpp8 Expression in Prostatatumor- und -normalgewebe

In der Abb. 1 ist oben bekanntes Trpp8 in Volllänge dargestellt. Darunter sind die verschiedenen Splice Varianten gemäß der Erfindung dargestellt, woraus sich die Lagen der jeweiligen Exons in den erfindungsgemäßen Varianten, bezogen auf die Volllänge, entnehmen lassen.
In der Abb. 2 ist die Lokalisierung der erfindungsgemäßen regulatorischen RNA bzw. der hierfür codierenden DNA auf dem Chromosom 2 dargestellt. Die Pfeile zeigen die Richtung der Transkription. Die erfindungsgemäße RNA entsteht durch Transkription der Exons nach links, Volllängen Trpp8 nach rechts.

Methoden

1: Mikrodissektion

Prostatatumor- und -normalgewebe aus jeweils einem Patienten wurde gefroren und in 10 µm Proben geschnitten. Nach einer Färbung mit Hematoxylin wurden die Proben wieder eingefroren. Aus jedem Patienten wurden zumindest 30 Proben gewonnen. Normal- und Tumorgewebe wurde von einen Pathologen mit Hilfe eines Mikroskopes identifiziert und markiert. Die jeweiligen Bereiche wurden unter dem Mikroskop resektiert unter Verwendung einer Nadel und jeweils in 100 µl 2% Mercaptoethanol enthaltenden GTC Puffer bei -80°C eingefroren.

2: Poly-A+-RNA Präparation

Die Poly-A+-RNA Präparation erfolgte unter Verwendung eines modifizierten Protokolls gemäß dem Poly-A-Tract 1000 Kit (Amersham, Freiburg, Deutschland). Gewebeproben aus 1 wurden langsam auf Eis aufgetaut, homogenisiert und mit 30µ1 Verdünnungspuffer, enthaltend 1% β-Mercaptoethanol, sowie biotinyliertem Oligo-dT Primer versetzt, und für 5 min. auf 70°C erhitzt. Die Proben wurden dann für 5 min. bei 20°C gehalten und anschließend bei 20000 g für 10 min. zentrifugiert. Dem Überstand wurden 120 µl gewaschener Streptavidin-gekoppelter paramagnetischer Partikel (SA- PMP) zugebenen und bei 20°C für 5 min. inkubiert. Die mRNA wurde dann durch magnetische Trennung isoliert. Nach drei Waschschritten mit 0,5 × SSC Lösung wurde die mRNA in Nuklease-freiem Wasser eluiert, eingedampft unter Vakuum und umgehend in cDNA prozessiert.

3: cDNA Synthese

Die mRNA aus 2 wurde in 10 µl Nuklease-freiem Wasser gelöst. 1 µl T7-dT24-(GGCCAG) Primer (100 pmol/µl) wurde zugegeben und es wurde bei 70°C für 10 min. inkubiert. Dann wurde die Probe auf Eis gelegt und 4 µl 5 × Erststrang Puffer (Invitrogen, Groningen, Niederlande), 2 µl DTT (0,1 M), 1 µl dNTP's (10 mM), und 14 U anti-RNAse (Ambion, Huntingdon, England) zugegeben, gefolgt von einer Inkubation für 2 min. bei 37°C. Dann wurden 1 µl Superscript II Reverse Transkriptase (Invitrogen) zugegeben, gefolgt von einer Inkubation für 1 h bei 37°C.

4: Zweitstrangsynthese und DNA Reinigung

Sofort nach der Synthese des ersten Stranges nach 3 wurden 91 µl Wasser, 30 µl 5 × Zweitstrang Puffer, 34 dNTP's (10 mM), 10 U E. coli DNA-ligase, 40 U DNA Polymerase I und 2 U RNAse H (alle von Invitrogen) zugegeben und die Mischung wurde für 2 h bei 16°C inkubiert. Dann wurden 10 U T4 DNA Polymerase (Invitrogen) zugegeben und weitere 5 min. inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 10 µl 0,5 mM EDTA gestoppt. Die Reinigung der DNA erfolgte gemäß den Vorschriften des GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kits (Amersham Biosciences, Buckinghampshire, England). Gereinigte DNA wurde unter Vakuum eingedampft und bei -20°C gelagert.

5: In vitro Transkription und cRNA Reinigung

Die in vitro Transskription wurde gemäß dem Herstellerprotokoll von Ambion durchgeführt. Das DNA Pellet wurde in 84 Wasser gelöst und 7,5 µl dNTP's (75 mM), 2 µl 10 × reaction buffer (Ambion), 2 µl 10 T7 Enzymmix (Ambion) und 14 U anti-RNAse (Ambion) wurden zugegeben, gefolgt von einer Inkubation von 6 h bei 37°C. Die Reinigung der erhaltenen cRNA erfolgte gemäß dem Herstellerprotokoll zum Rneasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland). Nach Elution von der Säule wurde die cRNA eingedampft unter Vakuum und auf -80°C eingefroren.

6: Zweite in vitro Transskriptionsrunde

Die zweite Amplifikationsrunde wurde mit nur geringen Abweichungen von der ersten Runde durchgeführt. Die Synthese des ersten Stranges erfolgte mit random hexamer primer (250 ng/µl). Nach Inkubation über 60 min. bei 37°C wurde das cRNA-cDNA Hybrid bei 37°C für 20 min. mit 2 U RNase H inkubiert, gefolgt von einem 2-minütigen Inaktivierungsschritt bei 95°C.

7: Quantitative PCR und Auswertung

Die Synthese des ersten Stranges erfolgte mit der cRNA aus 6. 1 ng cDNA wurden für die Amplifikation eingesetzt mit 2,5 µl 10x SYBR®Green PCR Puffer, 3 µl Magnesiumchlorid (25 mM), 2 µl dNTV's (mit dUTP; 12,5 mM) und 0,625 U Ampli Taq Gold in einem Reaktionsvolumen von 25 µl. Die Reaktion wurde in einem GeneAmp 5700 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Weiterstadt, Deutschland) durchgeführt. Die Bedingungen waren: 2 min. 50°C, 10 min. 95°C, 15 s 95°C, 1 min. 60°C, die letzten beiden Phasen in 40 Zyklen. Für 4a_4b wurden die Vorwärts- bzw. Rückwärtsprimer gemäß Seq.-ID 9 bzw. 10 verwendet, für 6b 11 bzw. 12, für 16b 13 bzw. 14, für 20b 15 bzw. 16, für avant25 17 bzw. 18, für avant13 19 bzw. 20, und für beta-Aktin 21 bzw. 22. Die Auswertung erfolgte nach der ΔΔCt Methode nach Herstellervorschrift. Der CT Wert des Kontrollgens beta- Aktin wurde bei einer Grenze von 0,1 gemessen. Zur Normalisierung wurde der CT Wert des beta-Aktin vom CT Wert des untersuchten Gens abgezogen. Dieser normalisierte CT Wert wurde im Falle der Tumorgewebe auf die Normalgewebe bezogen bzw. normalisiert, wodurch der ΔΔCt erhalten wird. Wird dieser Wert als Potenz zur Basis 2 eingesetzt, so wird eine relative Größe der Über- oder Unterexpression in Tumorgewebe gegenüber dem Normalgewebe des gleichen Patienten erhalten.

Beispiel 1

Vergleich der Expression erfindungsgemäßer Trpp8 Sequenzen in Tumorgewebe gegenüber Normalgewebe der jeweiligen Patienten

Für die Proben jedes Patienten wurden quantitative PCR Versuche gemäß dem Teil "Methoden" durchgeführt. Überexpression wurde für 4-fache und höher Werte im Tumorgewebe und Unterexpression für 0,25-fache und niedriger Werte definiert. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 zusammengefaßt. Zum Vergleich wurde die Expression von Volllängen Trpp8 aus demselben Patientenkollektiv unter identischen Bedingungen analysiert. Tabelle 1
Man erkennt, daß die erfindungsgemäßen Gene bzw. Splice Varianten oder regulatorische RNA mit hoher, teilweise sehr hoher Spezifität als Marker für Tumorgewebe fungieren. Entsprechend hoch ist die Anwendungsbreite der jeweiligen Inhibierung für therapeutische Zwecke mittels der beschriebenen bindenden Substanzen.

Beispiel 2

Herstellung von Antikörpern

Durch Immunisierung mit einem Trpp8 Antigen können in fachüblicher Weise polyklonale Antikörper und nach Selektion von Hybridomzellen monoklonale Antikörper hergestellt werden, welche sowohl im therapeutsichen als auch im diagnostischen Bereich Anwendung finden können. Als Immunogene kommen beispielsweise in Frage: i) Prostatatumorzelllinien, die Trpp8 Splice Varianten endogen exprimieren, beispielsweise LNCaP, ii) mit Trpp8 Splice Varianten transient bzw. stabil transfizierte Prostatatumorzelllinien, iii) mit Trpp8 Splice Varianten transient bzw. stabil transfizierte Zelllinien wie NIH3T3, COS7, oder HEK293, oder vi) cDNA der Trpp8 Splice Varianten zur Immunisierung nicht-menschlicher Säugetiere. Es ist auch die Immunisierung mittels Peptiden möglich, für welche eine Splicevariante oder ein Teil hiervon codiert. Schließlich ist eine Immunisierung mit rekombinant in Insektenzellen hergestellten Trpp8 Splice Varianten möglich.

Beispiel 3

Antisense Oligonukleotide

Ein Beispiel eines antisense Oligonukleotides gegen 6b ist tcc tgt ccc acc ggt acc tc. Ein Beispiel eines antisense Oligonukleotides gegen 16b ist tgt gcc ttg gtt tgt acc ta. Ein Beispiel eines antisense Oligonukleotides gegen 20b ist cca agt cag gct tac cat cc. Ein Beispiel eines antisense Oligonukleotides gegen avant13 ist gcg acc agc agg cag ctg tt. Ein Beispiel eines antisense Oligonukleotides gegen 4a_4b ist gga ttt cat tga gcg tgg cc. Ein Beispiel eines antisense Oligonukleotides gegen avant25 ist gaa atc aga tgg ctt act gg.

Beispiel 4

Ribozyme gegen Trpp8 Splice Varianten sowie regulatorische RNA

In den Abb. 3 bis 9 sind verschiedene Hammerhead Ribozyme dargestellt welche die in den Abbildungen angegebenen Trpp8 Splice Varianten bzw. die regulatorische RNA an den angegebenen Stellen schneiden.
Folgend sind Varianten der erfindungsgemäßen Seq.-ID 1 bis 6 angegeben ("vor" = "avant"). SEQUENCE LISTING

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Claims

1. Nukleinsäure codierend für eine Trpp8 Splice Variante oder regulatorische RNA enthaltend eine Nukleinsäuresequenz gemäß einer der Sequenzen Seq.-ID 1 bis 7 oder 23 bis 31.

2. Trpp8 Peptid oder Protein enthaltend eine Aminosäurensequenz codiert durch eine der Nukleinsäuresequenzen Seq.-ID 1 bis 7 oder 23 bis 31 oder gemäß Seq.-ID 8.

3. Verwendung einer für Trpp8 codierenden Nukleinsäure und/oder eines Trpp8 Peptids oder Proteins, insbesondere nach Anspruch 1 oder 2, zur Detektion von Prostatakrebs oder zur Detektion eines Risikos der Erkrankung an Prostatkrebs, wobei eine Prostata-Gewebeprobe auf Übertranskription von Trpp8 RNA oder auf Überexpression eines Trpp8 Proteins untersucht wird.

4. Verwendung nach Anspruch 3, wobei eine an für Trpp8 codierende Nukleinsäure oder eine an Trpp8 Protein oder Peptid bindende Detektorsubstanz, vorzugsweise enthaltend eine Reportergruppe, verwendet wird, wobei Bindung besagter Nukleinsäure und/oder besagten Proteins oder Peptids an die Detektorsubstanz halbquantitativ oder quantitativ detektiert wird.

5. Verwendung einer Trpp8 RNA oder eines Trpp8 Proteins oder Peptids, insbesondere nach Anspruch 1 oder 2, zum Screenen nach daran bindenden Substanzen, insbesondere prospektiven Wirkstoffen zur Inhibierung von besagter RNA oder besagtem Protein oder Peptid, oder prospektiven Detektorsubstanzen, wobei eine prospektive Substanz oder eine Mischung solcher prospektiver Substanzen mit besagter RNA oder besagtem Protein oder Peptid kontaktiert wird, wobei mit einem Bindungsassay Bindungsereignisse festgestellt werden, und wobei eine bindende prospektive Substanz, ggf. nach Dekonvolutierung, selektiert wird.

6. Verwendung einer Trpp8 inhibierenden oder daran bindenden Substanz zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Prostatakrebs.

7. Verwendung nach Anspruch 6, wobei die Substanz ein Antikörper ist, welcher durch Immunisierung eines nicht- menschlichen Säugetiers mit einer Trpp8 cDNA, einem Trpp8 Peptid oder Protein, insbesondere gemäß Anspruch 2, erhältlich ist oder ein Phage-Display Antikörper ist.

8. Verwendung nach Anspruch 7, wobei die Substanz eine Mimikryverbindung eines Antikörpers gegen ein Trpp8 Peptid oder Protein, insbes. gemäß Anspruch 2, ist.

9. Verwendung nach Anspruch 6, wobei die Substanz ein Aptamer, eine antisense RNA, eine inhibtorische RNA oder ein Ribozym ist.

10. Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 9, wobei die Substanz zusätzlich eine zytotoxische und/oder immunstimulierende Komponente trägt.

11. Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 10, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung zur lokalen Applikation in Tumorzellen enthaltendem Gewebe hergerichtet ist.

12. Verfahren zur Diagnose einer Krebserkrankung, wobei eine Detektorsubstanz nach Anspruch 4 in der Ausführungsform mit einer Reportergruppe in zu untersuchendes Gewebe appliziert wird, wobei das zu untersuchende Gewebe dann einer Detektionsverfahrenstufe unterworfen wird, welche sensitiv für die Reportergruppe ist, und wobei im Fall der Detektion eines definierten Mindestwertes der Reportergruppe im Gewebe das Gewebe als Tumorzellen enthaltend qualifiziert wird.

13. Verfahren zur Behandlung einer Prostatakrebs-Erkrankung bzw. Behandlungsplan, wobei eine pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 6 bis 11 in einer physiologisch wirksamen Dosis einem Patienten dargereicht wird.

14. Verfahren zur Behandlung einer Prostatakrebs-Erkrankung bzw. Behandlungsplan, wobei zunächst eine Detektorsubstanz nach Anspruch 4 in der Ausführungsform mit einer Reportergruppe in zu untersuchendes Gewebe appliziert wird, wobei das zu untersuchende Gewebe dann einer Detektionsverfahrenstufe unterworfen wird, welche sensitiv für die Reportergruppe ist, und wobei im Fall der Detektion eines definierten Mindestwertes der Reportergruppe im Gewebe das Gewebe als thermosensitive Tumorzellen enthaltend qualifiziert wird, und wobei dann eine Krebsthermotherapie, beispielsweise transurethrale Mikrowellen-Hyperthermie oder transrektale Ultraschall-Hyperthermie, durchgeführt wird.

15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei vor, zugleich oder nach der Krebsthermotherapie eine pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 6 bis 11 dargereicht wird.