DE10211617A1

DE10211617A1 - Neuer Promotor mit erhöhtem Expressionsprofil

Info

Publication number: DE10211617A1
Application number: DE2002111617
Authority: DE
Inventors: Martin Otto Giersberg; Isolde Saalbach; Helmut Baeumlein
Original assignee: Institut fuer Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung
Current assignee: Institut fuer Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung
Priority date: 2002-03-15
Filing date: 2002-03-15
Publication date: 2003-09-25

Abstract

Die Erfindung betrifft eine DNA-Sequenz, die fähig ist, als neuer Promotor mit erhöhtem Expressionsprofil zur Expression beliebiger Gene in Pflanzensamen zu wirken, welche eine Basensequenz A-B umfaßt, wobei DOLLAR A - A der USP-Promotor oder ein Fragment des USP-Promotors, das die gleichen Eigenschaften besitzt, ist und DOLLAR A - B die an dieses Fragment aus dikotylen Pflanzen anschließende DNA-Sequenz bis zur maximalen Länge von A + B von 1690 Basenpaaren darstellt, oder DOLLAR A - eine hiervon durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche Sequenz, wobei letztere Sequenz mit der ursprünglichen Sequenz A - B hybridisiert und Promotor-Aktivität aufweist.

Description

Die Erfindung betrifft eine DNA-Sequenz, die fähig ist, als neuer Promotor mit erhöhtem Expressionsprofil zur Expression beliebiger Gene in Pflanzensamen zu wirken, und seine Verwendung. Anwendungsgebiete sind die Landwirtschaft und die Produktion von chemisch und pharmazeutisch aktiven Stoffen.
Das "Unbekannte Samenprotein" (USP) aus Vicia faba wird von einem während der frühen Samenentwicklung aktiven Gen kodiert (Bassüner et al., 1988 - DE 39 20 034 C2). Es liegen detaillierte Kenntnisse über die Funktion des USP-Genpromotors vor. So sind die für seine hohe, samenspezifische Aktivität verantwortlichen Promotor-cis-Elemente sowie die damit interagierenden Transkriptionsfaktoren charakterisiert worden (Bäumlein, H., W. Boerjan, I. Nagy, R. Bassüner, M. Van Montagu, D. Inze and U. Wobus, 1991: A novel seed protein gene from Vicia faba is developmentally regulated in transgenic tobacco and Arabidopsis plants. Mol. Gen. Genet. 225, 459-467, Fiedler, U., R. Filistein, U. Wobus and H. Bäumlein, 1993: A complex ensemble of cis regulatory elements controls the expression of a Vicia faba non-storage seed protein gene. Plant Mol. Biol. 22, 669-679; Wohlfarth, Th., H. Braun, V. Kirik, K. Kölle, A. Czihal, A. Tewes, H. Luerssen, S. Miséra, A. Shutov and H. Bäumlein, 1998: Regulation and Evolution of seed globlulin genes. J. Plant Physiol. 152, 600-606). Von besonderer Bedeutung für die samenspezifische Funktion des USP-Promotors ist die Wechselwirkung zwischen einem RY-Promotorelement und den essentiellen Regulatorproteinen FUS3 und ABI3.
Weitere Befunde belegen eine interessante neue Anwendung des USP-Genpromotors für die Selektion von Embryogenese-kompetenten Zellen während der somatischen Embryogenese. Offensichtlich wird der USP-Genpromotor spezifisch in embryogenen Zellen aktiv. In Verbindung mit einem Reportergen (GFP) sowie durch Durchfluß-Zytometrie lassen sich diese Zellen bzw. Zellcluster isolieren.
Aufgrund seiner hohen samenspezifischen Aktivität wurde der USP-Genpromotor für die samenspezifische Expression einer ganzen Reihe von Transgenen für gene farming-Zwecke benutzt (Czihal, A., B. Conrad, P. Buchner, R. Brevis, A. A. Farouk, R. Manteuffel, K. Adler, U. Wobus, J. Hofemeister and H. Bäumlein, 1999: Gene farming in plants: Expression of a heatstable Bacillus amylase in transgenic legume seeds. J. Plant Physiol. 155, 183-189).
Für die Nutzung des USP-Promotors für gene farming in verschiedenen Samen, u. a. der Erbse, ist eine weitere Erhöhung der Expressionsrate wünschenswert. Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, eine DNA-Sequenz mit Promotoreigenschaften zu finden, durch welche eine Erhöhung der Promotoraktivität erreicht wird. Ein solcher Promotor soll vor allem in der Lage sein, die samenspezifische Fremdgenexpression deutlich zu erhöhen.
Die Aufgabe der Erfindung wird durch eine DNA-Sequenz mit verbesserten Promotoreigenschaften gemäß Anspruch 1 sowie den Ansprüchen 9, 10 und 12 gelöst, die Unteransprüche sind Vorzugsvarianten.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß die Aktivität des an sich bekannten USP- Promotors (vgl. z. B. DE 39 20 034 C2) durch eine erfindungsgemäße Verlängerung erhöht wird. Der erfindungsgemäße Promotor umfaßt den USP-Promotor bzw. ein Fragment mit den gleichen Eigenschaften und eine daran anschließende DNA-Sequenz. Dieser neue Promotor besitzt ein im Vergleich zum bekannten USP-Promotor erhöhtes Expressionsprofil zur Expression beliebiger Gene in Pflanzensamen und umfaßt eine Basensequenz A-B, wobei

- A den USP-Promotor oder ein Fragment des USP-Promotors, das die gleichen Eigenschaften besitzt, darstellt und
- B die an dieses Fragment aus dikotylen Pflanzen anschließende DNA-Sequenz bis zur maximalen Länge von A + B von 1690 Basenpaaren darstellt, oder
- eine hiervon durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche Sequenz, wobei letztere Sequenz mit der ursprünglichen Sequenz A-B hybridisiert und Promotor- Aktivität aufweist.

Der bevorzugte Promotor ist in Abb. 1 und mit seinen Sequenzen in Anlage 1 dargestellt, die ebenfalls Gegenstand der Erfindungsbeschreibung sind. Dieser Promotor wird im folgenden als "USP-plus" bezeichnet und besitzt die Gesamtlänge -1690/±0 (vgl. Sequenz Nr. 1). In einer weiteren bevorzugten Ausführungsvariante der Erfindung umfaßt der Promotor die Sequenz -1197/±0 (vgl. Seqenz Nr. 2) und Abb. 1. Die erfindungsgemäße DNA wird aus dikotylen Pflanzen isoliert, bevorzugt aus Leguminosen, besonders bevorzugt aus dem Vicia faba-Genom. Der bekannte USP-Promotor besitzt bevorzugt 685 bp (vgl. Seqenz Nr. 5). Die anschließende DNA-Sequenz hat bevorzugt eine Länge von 200-900 Basenpaaren, bevorzugt eine Länge von 500-600 bp. Insbesondere weist die DNA-Sequenz B eine Länge von 512 Basenpaaren auf (vgl. Sequenz Nr. 4). Gemäß der Erfindung ist auch eine weitere Verlängerung des Promotors um weitere ca. 480 bp bis 500 bp möglich, vorzugsweise 493 bp (vgl. Sequenz 3).
Die Erfindung unfaßt darüber hinaus auch Mutationen und Deletionen der beanspruchten Sequenzen, die die gleichen Eigenschaften aufweisen und bei denen ebenfalls eine stark verbesserte Expresionsaktivität gegeben ist.
Die Isolierung eines Promotors erfolgt fachgemäß unter Verwendung ein heterologen "transposon tagging"-Systems, wobei der spezifische Promotor bevorzugt aus Vicia faba isoliert wird. Gegenstand der Erfindung sind deshalb auch das Verfahren zur Herstellung des Promotors sowie seine Verwendung zur Expression beliebiger Gene in Pflanzensamen und entsprechend transformierte Pflanzenzellen.
Eine erfindungsgemäße Expressionskassette umfaßt

a) einen erfindungsgemäßen Promotor,
b) ein zu exprimierendes Genkonstrukt und
c) ggf. eine Terminatorsequenz,

Der Transfer in das Genom der gewünschten Pflanze wird fachgemäß initiiert, wobei die Expressionskassette stabil integriert wird und nach eventueller züchterischer Modulation nachfolgend die Pflanze aufgezogen und der Samen geerntet wird.
Bei den Pflanzenzellen, die mit einer erfindungsgemäßen Expressionskassette transformiert sind, handelt es sich vorzugsweise um mit einem hitzestabilen α-Amylase-Gen stabilisierte Tabakpflanzen. Wie am anliegenden Beispiel gezeigt, (Tabaklinien 61 und 62) kann eine einfache Basensubstitution innerhalb der Promotorsequenz vorgenommen werden, ohne Auswirkungen auf das Expressionsprofil des Promotors zu verursachen.
Aus der Verlängerung der Promotorsequenzen resultieren positive Eigenschaften. Versuche im heterologen System mit transgenen USP-Amylase Tabakpflanzen und USP-plus-Amylase Tabakpflanzen ergaben, daß unter der Verwendung des verlängerten USP-Promotors "USP- plus" eine höhere Akkumulation des Transgenprodukts im Samen stattfindet. Durchschnittlich kann von einer ca. einhundertprozentigen Steigerung zu vergleichbaren USP-Tabakpflanzen ausgegangen werden. Analoge Ergebnisse werden mit anderen Pflanzen, z. B. Erbsen erreicht.
Die erhebliche Steigerung des Genprodukts unter Anwendung des erfindungsgemäßen Promotors auf fast das Doppelte ist überraschend. Es lag nicht auf der Hand, daß mit einer Verlängerung des Promotors ("Vervollständigung des Fragments") überhaupt eine Steigerung des Genprodukts zu erreichen war. Normalerweise sucht man aktive Regionen in Promotoren und anderen aktiven Substanzen, arbeitet also eher in Richtung einer Verkürzung.
Ein weiteres Argument für das Vorliegen von Erfindungshöhe besteht darin, daß der USP- Promotor seit 1989 existiert und eine Veränderung/Verbesserung - obwohl für die Anwendung notwendig - niemals erreicht werden konnte.
Unter biotechnologischen Gesichtspunkten ist eine Verdopplung der samenspezifischen Fremdexpression von großer ökonomischer und wissenschaftlicher Bedeutung.
Im Frühjahr/Sommer 2000 wurde ein Freilandversuch mit transgenen Erbsen durchgeführt. Dabei wurde die samenspezifische Synthese einer hitzestabilen, bakteriellen α-Amylase durch den USP-Genpromotor kontrolliert. Die bisherige Auswertung erlaubt die Schlußfolgerung, daß sowohl der USP-Genpromotor als auch der USP-Plus-Promotor auch unter Freilandbedingungen effizient und stabil für gene farming-Zwecke geeignet ist.
Die Erfindung soll nachfolgend durch Ausführungsbeispiele näher erläutert werden.

Beispiel 1

Herstellung des Promotors USP plus

Grundlage für die Verlängerung des Promotors war ein aus einer genomischen Lambda Phagenbank aus Vicia faba gewonnenes DNA-Fragment (vgl. Abbildung A).
Dieses Fragment wurde subkloniert und befindet sich in dem resultierenden Vektor p471OCR Die zur Verlängerung des Promotors notwendigen Sequenzinformationen wurden durch Primerwalking in Richtung 5'Ende, ausgehend von der bekannten Gensequenz des USP- Promotors, von diesem Fragment gewonnen.
Zur Amplifikation des 5'Bereichs des Promotors wurde das Oligonukleotidpaar XbaI-USP und USP-up gewählt. (XbaI-USP CTAGTCTAGagtatatatttaaagtatttttacatgatataatg)
Der Primer XbaI-USP kodiert die notwendige XbaI Erkennungssequenz die zur Klonierung der kompletten Expressionskassette in den binären Vektor PZP200 benötigt wird.
Der Primer USP-up liegt auf der bekannten USP-Sequenz im 3'Bereich des Promotors, so daß nach Restriktion mit PstI ein Fragment entsteht, welches die Verlängerung des Promotors darstellt.
Die vorhandene Expressionskassette, USP-α-Amylase-Terminator, wurde mit XbaI aus dem Vektor p30T-Amylase isoliert und anschließend partiell mit PstI geschnitten.
Das zu verlängernde Fragment durch Gelelektrophorese getrennt und isoliert.
Die amplifizierte Verlängerung wurde mit PstI geschnitten und an die USP-α-Amylase- Terminator Expressionskassette ligiert. Anschließend erfolgte eine XbaI Restriktion und ein Aufreinigungsschritt durch Gelektrophorese.
Die so resultierende Expressionskassette USP-plus (entspricht: Verlängerung + USP) α- Amylase-Terminator wurde dann in den XbaI Ort des binären Vektors PZP200 kloniert.
Nach Transformation dieses Vektors in Agrobakterium tumefacies wurden Blattstücke von Nicotiana tabacum infiziert, transgene Pflanzen regeneriert und die Expressionshöhen der α-Amylase durch Enzymaktivitätsbestimmungen im Tabaksamen ermittelt.
Der Sequenzabschnitt zwischen dem Verlängerungsabschnitt und dem Sequenzbereich des Retrotransposons liefert nach Datenbanksuchen keine eindeutige Zuordnung zu bekannten Sequenzen. Es besteht die Möglichkeit, daß sich der vollständige Promotor bis zum ORF des Retrotransposons erstrecken könnte oder dieser Sequenzbereich andere regulatorische, auf den Promotor wirkende Eigenschaften beinhaltet.
Der Sequenzbereich vor dem Retrotransposon aus Vicia faba ([gi:5101862] partial RNAse H gene) ist für Pisum sativum in der Literatur beschrieben. (Sequenz in der Datenbank [gi:6855710]). Die Zuordnung als Teilsequenz eines RNAse H Gens sollte diesen Sequenzabschnitt als nicht promotorzugehörig gelten lassen. Abschnitt B Verlängerung des USP-Promotors durch 512 bp ohne eingeführte XbaI site umfassend die Sequenz (Sequenz Nr. 4)

Klonierungsstellen PstI site des ursprünglichen USP Promoters (5'Ende)
XbaI site (5'Ende der Verlängerung)

Beispiel 2

Zusammenhang zwischen Kopienzahl und α-Amylase Aktivität

Es wurden Tabakpflanzen mit kurzem (USP-Promotor) und verlängertem Promotorkonstrukt (USP-plus) hergestellt.
Als Reportengen wurde das α-Amylasegen aus Bacillus licheniformis verwendet.
Expressionskassette: Promotor-α-Amylase-Terminator
Nach Abreifen der Samen wurde die hitzestabile α-Amylase Aktivität der Samenextrakte gemessen. Tabelle 1 Auswertung der Meßergebnisse
Durch Spaltungsanalysen der Nachkommenschaften wurde die Kopienzahl des α- Amylasegens in 16 bzw. 10 unabhängigen USP bzw. USP-plus Linien bestimmt.
Hauptaugenmerk wurde hierbei auf die höher exprimierenden USP (kurz) Linien geworfen. Auffällig ist, daß alle untersuchten USP-Linien mit einer Aktivität über 2,5 CU/G mehr als eine Kopie (Ausnahme Linie Nr. 21/59 mit 2,5 CU/g) des Transgens enthalten. Die erhöhte α- Amylase-Aktivität im Samen dieser Linien scheint hier auf einen Gen-Dosis Effekt zurückzuführen zu sein.
Im Gegensatz hierzu stehen die Linien des USP-plus Konstruktes. Hochexprimierende Linien treten auch bei nur einer Kopie des Transgens gehäuft auf.
"Single copy" Linien des USP-plus Promotors übersteigen demnach die Expression der USP- Linien um ein Dreifaches (angenähert), vgl. Abb. 2 Vergleich der "single copy" Linien.

Auftragung aller Messwerte

In die Abb. 3 wurden alle erhaltenen Messwerte, ohne Berücksichtigung der Kopienanzahl, einbezogen. Es wurden 99 USP-plus Tabaklinien und 54 Tabaklinien des USP Konstruktes berücksichtigt. Aktivitätsbestimmung der vorhandenen USP-plus::Amylase und USP::Amylase Tabaklinien Unabhängige USP-plus Linien (Verlängerter Promotor)

Unabhängige USP-plus::α-Amylase Tabaklinien

Unabhängige USP::α-Amylase Tabaklinien (Kurzer Promotor)
Das Transformierte USP::Amylase Konstrukt der Transformationen 61 und 62 trägt eine stille Mutation in Form einer Basensubstitution (C ⇐ G) an der Promotorposition (5' ⇐ 3' Base Nr. 1054) Aktivitätsbestimmung der Samen der Nachkommenschaften von 6 USP::Amylase Linien

Bewertung

Die Expression ist auch in der nächsten Generation stabil und erhärtet die Messungen der ersten Generation. Die emittelten Aktivitätshöhen spiegeln das Aufspaltungsmuster des α- Amylase-Gens in der Nachfolgegeneration wieder.

Anlage 1

Sequenz 1

Gesamtsequenz, abgeleitet vom initialen genomischen Fragment (enthält hier nicht die eingeführte xbaI Restriktionsstelle)

USP-Promotor, Verlängerung (USP-Plus) und optionale weitere 5'Verlängerung

Sequenz 2

USP-plus ohne xbaI-Schnittstelle (1197)

Sequenz 3

Erweiterter Bereich (5'Ende USP-plus bis Retrotransposon ORF 493 bp)

Sequenz 4

Verlängerung des USP-Promotors durch 512 bp ohne eingeführte XbaI site

Sequenz 5

Bekannter USP-Promotor (685 bp)

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. DNA-Sequenz, die fähig ist, als neuer Promotor mit erhöhtem Expressionsprofil zur Expression beliebiger Gene in Pflanzensamen zu wirken, umfassend die Basensequenz A-B, wobei
A der USP-Promotor oder ein Fragment des USP-Promotors, das die gleichen Eigenschaften besitzt, ist und
B die an dieses Fragment aus dikotylen Pflanzen anschließende DNA-Sequenz bis zur maximalen Länge von A + B von 1690 Basenpaaren darstellt, oder
eine hiervon durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche Sequenz, wobei letztere Sequenz mit der ursprünglichen Sequenz A-B hybridisiert und Promotor- Aktivität aufweist.

2. Promotor nach Anspruch 1 gekennzeichnet durch die Gesamtsequenz A-B mit der Sequenz -1690/±0 bp (Seq. Nr. 1).

3. Promotor nach Anspruch 1 gekennzeichnet durch die Sequenz A-Fragment B mit der Sequenz -1197/±0 bp (Seq. Nr. 2).

4. Promotor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz A den USP-Promotor darstellt und eine Länge von 685 bp (Seq. Nr. 5) aufweist.

5. Promotor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz B eine Länge von 200-900, bevorzugt 500-600, Basenpaaren aufweist.

6. Promotor nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz B eine Länge von 512 Basenpaaren (Seq. Nr. 4) aufweist.

7. Promotor nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenzen aus Leguminosen, vorzugsweise aus Vicia faba stammen.

8. Promotor oder Fragment mit gleichen Eigenschaften, nach einem der Ansprüche 1 bis 7, die fähig sind, eine Transkription (ausschließlich) im Samen einer Pflanze zu steuern.

9. Verfahren zur Isolierung eines Promotors gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 unter Verwendung ein heterologen "transposon tagging"-Systems, wobei der entwicklungsspezifische Promotor bevorzugt aus Vicia faba isoliert wird.

10. Verwendung des Promotors gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Expression beliebiger Gene in Pflanzensamen funktionell gebunden in einer Expressionskassette, die

a) den Promotor,

b) ein zu exprimierendes Genkonstrukt und

c) ggf. eine Terminatorsequenz umfasst.

11. Verwendung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass ein Transfer in das Genom der gewünschten Pflanze initiiert wird, wobei die Expressionskassette stabil integriert wird und nach eventueller züchterischer Modulation nachfolgend die Pflanze aufgezogen und der Samen geerntet wird.

12. Pflanzenzelle, die mit einer Expressionskassette gemäß Anspruch 10 transformiert ist.

13. Pflanzenzelle nach Anspruch 12, die eine mit einem hitzestabilen α-Amylase-Gen stabilisierte Tabakpflanze ist.