DE10211540A1

DE10211540A1 - Electrode for enzyme immunoassays has a flat polymElectrode for enzyme immunoassays has a flat polymer substrate, covered with a thin electrode elemener substrate, covered with a thin electrode element layer in a low cost unit with a long life t layer in a low cost unit with a long life

Info

Publication number: DE10211540A1
Application number: DE2002111540
Authority: DE
Inventors: Jae-Chul Pyun; Sang-Doo Kim; Ji-Won Chung
Original assignee: Korea Institute of Science and Technology Europe Forschungs GmbH
Current assignee: Korea Institute of Science and Technology Europe Forschungs GmbH
Priority date: 2002-03-15
Filing date: 2002-03-15
Publication date: 2003-10-16

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Enzymimmunoassayelektrode, eine Vorrichtung sowie ein Verfahren zur Durchführung eines Enzymimmunoassays. Die Enzymimmunoassayelektrode weist ein flächiges Polymersubstrat auf, auf dessen einer Oberfläche unmittelbar mindestens eine dünne Schicht als aktives Elektrodenelement aufgebracht ist, wobei die dünne Schicht aus Gold besteht.The present invention relates to an enzyme immunoassay electrode, a device and a method for carrying out an enzyme immunoassay. The enzyme immunoassay electrode has a flat polymer substrate, on the surface of which at least one thin layer is applied directly as an active electrode element, the thin layer consisting of gold.

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Enzymimmunoassay, beispielsweise ein EIA oder ELISA (enzymgekoppelter Immunoassay). Derartige Enzymimmunoassays werden in der medizinischen Diagnostik und zahlreichen anderen Bereichen der biomedizinischen Erforschung, in der Mikrobiologie und zur wissenschaftlichen Analytik eingesetzt. Sie dienen im wesentlichen der Bestimmung und Quantifizierung von jeglicher Art von Antigenen, Haptenen oder Antikörpern. The present invention relates to a Enzyme immunoassay, for example an EIA or ELISA (enzyme-linked immunoassay). such Enzyme immunoassays are used in medical diagnostics and numerous other areas of biomedical Research, in microbiology and for scientific analytics. They essentially serve the determination and quantification of any kind of antigens, haptens or antibodies.

Herkömmliche Enzymimmunoassays beruhen auf der Verwendung von Enzymen, z. B. Peroxidase, alkalische Phosphatase oder Galaktosidase etc. und den entsprechenden Substraten als Detektionssysteme. Dabei wird das Enzym an einen der Reaktionspartner, beispielsweise einen Antikörper gekoppelt und damit die Spezifität von immunologischen Reaktionen mit einer enzymatischen Reaktion kombiniert. Der enzymgekoppelte Reaktionspartner bindet beispielsweise spezifisch dicht oder über weitere Mediatoren, beispielsweise Antikörper, an das zu erfassende Antigen, Hapten oder den zu erfassenden Antikörper und wird dadurch immobilisiert. Nach Auswaschen der nichtimmobilierten Reaktionspartner wird Substrat zugegeben, so daß die enzymatische Reaktion gestartet wird, wobei in herkömmlicher Weise aus dem Substrat mittels der enzymatischen Reaktion ein photometrisch oder fluorometrisch nachzuweisendes Reaktionsprodukt erzeugt wird. Conventional enzyme immunoassays are based on the Use of enzymes, e.g. B. peroxidase, alkaline Phosphatase or galactosidase etc. and the corresponding substrates as detection systems. Doing so the enzyme to one of the reactants, for example coupled an antibody and thus the Specificity of immunological reactions with a combined enzymatic reaction. The enzyme-linked Reactant binds specifically, for example close or via other mediators, for example Antibodies to the antigen, hapten or the antibody to be detected and is thereby immobilized. After washing the non-immobilized Reactant is added to the substrate so that the enzymatic reaction is started, wherein in conventionally from the substrate by means of enzymatic reaction a photometric or reaction product to be detected fluorometrically.

Als Reaktionspartner werden dabei häufig monoklonale Antikörper eingesetzt, die hochspezifisch für die nachzuweisende Substanz oder den nachzuweisenden Organismus sind. Enzymimmunoassays können dabei als kompetitive und nichtkompetitive Tests in den verschiedensten Kombinationen durchgeführt werden. Monoclonals are often used as reaction partners Antibodies used that are highly specific for the substance to be detected or the substance to be detected Organism. Enzyme immunoassays can be used as competitive and non-competitive tests in the various combinations can be carried out.

Üblich ist es heutzutage, Enzymimmunoassays als Festphasen-Immunotests durchzuführen, beispielsweise als ELISA. It is common nowadays to use enzyme immunoassays Perform solid phase immunoassays, for example as ELISA.

Fig. 1 zeigt ein Beispiel für den Aufbau und die Durchführung eines derartigen EIA. Als erstes wird ein Antigen Ag an einer Mikrotiterplatte 1 immobilisiert, das spezifisch einen gesuchten Antikörper Ab binden kann. Daraufhin wird auf die Mikrotiterplatte 1 eine zu untersuchende Probe gegeben, die gegebenenfalls Antikörper Ab als Analyt enthält. Dieser bindet dann an das immobilisierte Antigen Ag und wird dadurch selbst immobilisiert. Die Probe wird daraufhin ausgewaschen, so daß nur die immobilisierten Antigene Ag und Antikörper Ab auf der Mikrotiterplatte verbleiben. In einem dritten Schritt wird ein weiterer Antikörper Ab-Enz auf die Mikrotiterplatte gegeben, der seinerseits spezifisch an den Antikörper Ab bindet und an den ein Enzym gekoppelt ist. Dieses Enzym ist dabei so gewählt, daß es bei Zugabe eines bestimmten Substrates eine Farbreaktion auslöst. Die Intensität der Farbreaktion hängt dabei proportional von der Menge an immobilisiertem Enzym ab, die wiederum der Menge an Antikörper Ab entspricht. Als Enzyme kommen dabei beispielsweise herkömmlicherweise alkalische Phosphatase oder Wasserstoffperoxidase zum Einsatz. Für diese Enzyme sind aus der Literatur verschiedenste Substrate bekannt. Fig. 1 shows an example of the structure and implementation of such an EIA. First, an antigen Ag is immobilized on a microtiter plate 1 , which can specifically bind a desired antibody Ab. Thereupon a sample to be examined is placed on the microtiter plate 1 , which possibly contains antibody Ab as analyte. This then binds to the immobilized antigen Ag and is thereby immobilized itself. The sample is then washed out so that only the immobilized antigens Ag and antibodies Ab remain on the microtiter plate. In a third step, another antibody Ab-Enz is added to the microtiter plate, which in turn binds specifically to the antibody Ab and to which an enzyme is coupled. This enzyme is chosen so that it triggers a color reaction when a certain substrate is added. The intensity of the color reaction depends proportionally on the amount of immobilized enzyme, which in turn corresponds to the amount of antibody Ab. Alkaline phosphatase or hydrogen peroxidase, for example, are conventionally used as enzymes. A wide variety of substrates for these enzymes are known from the literature.

Um die Farbreaktion der Enzyme zu stoppen, wird gewöhnlich nach einer gewissen Reaktionszeit nach der Zugabe von Substrat die Farbreaktion mittels einer stark sauren oder basischen Lösung gestoppt. Daraufhin kann die optische Dichte bei bestimmten Wellenlängen, die Absorptionsbanden des Substrates bzw. des Produktes entsprechen, gemessen werden und so die Menge an Antikörper Ab bestimmt werden. To stop the color reaction of the enzymes usually after a certain reaction time after the Adding the color reaction using a substrate strongly acidic or basic solution stopped. The optical density can then be determined at certain Wavelengths, the absorption bands of the substrate or Product, be measured and so the Amount of antibody Ab can be determined.

Aus der DE 199 50 785 A1 ist ein Immunoassay bekannt, bei dem Elektroden in die Probe eingebracht werden und die Probe elektrochemisch vermessen wird. Grundlage für diese Möglichkeit ist dabei die Erkenntnis, daß der Schritt, mit dem die Enzymtätigkeit beendet wird (Zugabe einer sauren oder basischen Lösung) lediglich die Enzyme deaktiviert, jedoch die bereits eingefärbten Substrate (reduziert bzw. oxidiert) nicht zerstört. Dadurch kann deren Redox-Zustand zur Messung verwendet werden. Die Offenbarung der DE 199 50 785 A1 wird hiermit ausdrücklich in die vorliegende Offenbarung vollständig aufgenommen. An immunoassay is known from DE 199 50 785 A1, where electrodes are introduced into the sample and the sample is measured electrochemically. The basis for this possibility is the knowledge that the step that ends enzyme activity (adding an acidic or basic solution) only the enzymes are deactivated, but they are already colored substrates (reduced or oxidized) not destroyed. This can lead to their redox state Measurement can be used. The disclosure of DE 199 50 785 A1 is hereby expressly incorporated into the present disclosure fully incorporated.

Die quantitative Farbentwicklung erfolgt aufgrund eines Elektronentransfers zwischen den Substraten. Dies bedeutet, daß die Farbreaktion durch das Enzym mittels Oxidations- und Reduktionsreaktionen der Substrate erfolgen. Abweichend von herkömmlichen Enzymimmunoassays kann nunmehr jedoch die Menge an oxidiertem und reduziertem Substrat elektrochemisch bestimmt werden. Diese Menge an oxidiertem und reduziertem Substrat ist proportional der optischen Dichte bei der entwickelten Farbe der Enzymreaktion. Es ist daher bei herkömmlichen Farb-Enzymimmunoassays nicht nur möglich, die Farbreaktion des Enzyms optisch zu erfassen sondern auch durch ein elektrochemisches Verfahren den Analyten zu erfassen und quantitativ zu bestimmen. The quantitative color development is based on electron transfer between the substrates. This means that the color reaction by the enzyme by means of oxidation and reduction reactions Substrates. Different from conventional ones Enzyme immunoassays can now measure the amount of Oxidized and reduced substrate electrochemically be determined. This amount of oxidized and reduced substrate is proportional to the optical Density in the developed color of the enzyme reaction. It is therefore in conventional color enzyme immunoassays not only possible the color reaction of the enzyme optically to grasp but also by a electrochemical method to detect the analyte and to be determined quantitatively.

Vorteilhaft ist dabei insbesondere, daß die herkömmlichen, bereits zur Verfügung stehenden optischen Enzymimmunoassays eingesetzt werden können, jedoch die Vermessung und Auswertung nicht optisch sondern elektrochemisch erfolgt. So können sämtliche bereits erhältlichen Enzymimmunoassays (EIA und ELISA) problemlos eingesetzt werden. Insbesondere profitiert das elektrochemische Verfahren von der bereits weitgehenden Automatisierung" (z. B. Mikrotiterplatten) herkömmlicher optischer Enzymimmunoassays. It is particularly advantageous that the conventional, already available optical Enzyme immunoassays can be used, however Measurement and evaluation not optically but done electrochemically. So everyone can already available enzyme immunoassays (EIA and ELISA) can be used without any problems. This benefits in particular electrochemical process from the already extensive automation "(e.g. microtiter plates) conventional optical enzyme immunoassays.

Eine Vorrichtung, die sich zur Durchführung des Verfahrens eignet, ist beispielsweise in Fig. 2 dargestellt und weist mindestens eine Elektrodeneinheit mit mindestens einer Arbeitselektrode und mindestens einer Referenzelektrode auf, die in ein Näpfchen einer Mikrotiterplatte paßt sowie einen Potentiostaten 3 zur Konstanthaltung des elektrischen Potentiales zwischen der Arbeitselektrode und der Referenzelektrode und zur Erzeugung eines elektrischen Ausgangssignales. Weiterhin weist diese Vorrichtung eine Spannungsversorgung 4 für den Potentiostaten 3 und die Elektrodeneinheit 2 auf. Mit 5 ist ein Analog/Digitalwandler und mit 6 ein Mikroprozessor zur Steuerung und Datenverarbeitung bezeichnet. A device which is suitable for carrying out the method is shown, for example, in FIG. 2 and has at least one electrode unit with at least one working electrode and at least one reference electrode, which fits into a well of a microtiter plate and a potentiostat 3 for keeping the electrical potential constant between the working electrode and the reference electrode and for generating an electrical output signal. Furthermore, this device has a voltage supply 4 for the potentiostat 3 and the electrode unit 2 . 5 denotes an analog / digital converter and 6 denotes a microprocessor for control and data processing.

Im Falle eines Enzymimmunotestes, der auf einer Mikrotiterplatte durchgeführt wird, können entweder die Elektrodeneinheiten 2 oder auch die Mikrotiterplatte selbst verschiebbar sein, um jeweils die Arbeitselektroden in die einzelnen Näpfchen der Mikrotiterplatte einzubringen und die Messung durchzuführen. Alternativ können auch für jedes einzelne Näpfchen eine eigene Arbeitselektrode und eine Referenzelektrode in der Näpfchenanordnung einer Mikrotiterplatte entsprechenden Abständen zur Verfügung gestellt werden. In the case of an enzyme immunoassay which is carried out on a microtiter plate, either the electrode units 2 or the microtiter plate itself can be displaceable in order to insert the working electrodes into the individual wells of the microtiter plate and to carry out the measurement. Alternatively, a separate working electrode and a reference electrode in the well arrangement of a microtiter plate can also be provided at appropriate distances for each individual well.

Die Auswertung der Signale des Potentiostaten 3 erfolgt, nach Wandlung in digitale Signale, vorzugsweise mittels des Mikroprozessors 6. The signals of the potentiostat 3 are evaluated after conversion into digital signals, preferably by means of the microprocessor 6 .

Zur Messung werden nun die Elektroden der Elektrodeneinheit in ein Näpfchen einer Mikrotiterplatte eingeführt und der bei einem konstanten Reduktions/Oxidations-Potential erzeugte Strom gemessen. Dieser ist proportional zu der Menge an oxidiertem bzw. reduziertem Farb-Substrat und damit proportional zu der Menge an zu erfassendem Analyten. Diese amperometrische Analyse wird ebenfalls, wie bei der optischen Erfassung, unmittelbar nach der Beendigung der enzymatischen Reaktion mittels einer sauren bzw. alkalischen Lösung durchgeführt. The electrodes of the Electrode unit in a well of a microtiter plate introduced and that at a constant Reduction / oxidation potential generated current measured. This is proportional to the amount of oxidized or reduced color substrate and therefore proportional to the Amount of analyte to be recorded. This amperometric analysis is also used, as with optical Capture immediately after the completion of the enzymatic reaction using an acid or performed alkaline solution.

Der Potentiostat 3 erzeugt analoge Signale und gibt diese an den Analog/Digital-Wandler 5 aus, der die analogen Signale in digitale Signale wandelt und diese an den Mikroprozessor 6 ausgibt, wo eine Auswertung und Darstellung der Daten erfolgt. The potentiostat 3 generates analog signals and outputs them to the analog / digital converter 5 , which converts the analog signals into digital signals and outputs them to the microprocessor 6 , where the data is evaluated and displayed.

Enzymimmunoassays (insbesondere ELISA) werden vielfältig für die Diagnose von Krankheiten wie beispielsweise Hepatitis, Aids und dergleichen, verwendet. Der oben beschriebene elektrochemische Enzymimmunoassay weist jedoch noch einige Schwierigkeiten auf bei der Anwendung auf den herkömmlichen ELISA. Dies betrifft insbesondere die Herstellungskosten für die Elektrode, deren Lebensdauer sowie Schwankungen in der Empfindlichkeit zwischen verschiedenen Elektroden. Weiterhin ist eine Verkürzung der Analysedauer anzustreben. Enzyme immunoassays (especially ELISA) diverse for the diagnosis of diseases such as for example hepatitis, AIDS and the like, used. The electrochemical described above However, enzyme immunoassay still has some difficulties on when using the conventional ELISA. This applies in particular to the manufacturing costs for the electrode, its service life and fluctuations in sensitivity between different Electrodes. Furthermore, a shortening of the To strive for analysis duration.

Hier setzt nun die vorliegende Erfindung ein, die es sich zur Aufgabe gemacht hat, eine Vorrichtung und ein Verfahren und hierzu verwendete Elektroden zur Verfügung zu stellen, mit denen bei geringen Kosten, einer großen Lebensdauer und geringen Empfindlichkeitsschwankungen die Analyse eines elektrochemischen Enzymimmunoassays beschleunigt und verbessert werden kann. This is where the present invention comes in has set itself the task of a device and a method and electrodes used for this To provide with which at low cost, a long life and low Sensitivity fluctuations the analysis of an electrochemical Enzyme immunoassays can be accelerated and improved can.

Diese Aufgabe wird durch die Enzymimmunoassayelektrode nach Anspruch 1, die Vorrichtung nach Anspruch 14 sowie das Verfahren nach Anspruch 20 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen der Enzymimmunoassayelektrode, der Vorrichtung und des Verfahrens werden in den jeweiligen abhängigen Ansprüchen gegeben. This task is accomplished by the Enzyme immunoassay electrode according to claim 1, the device according to claim 14 and the method according to claim 20 solved. Advantageous further developments of the enzyme immunoassay electrode, the device and the method are in the given respective dependent claims.

Bei der vorliegenden Erfindung wird eine dünne Schicht aus Gold als Elektrode auf einem Substrat angeordnet. Eine derartige Elektrode ersetzt dann die bisher üblichen Platindrähte als Elektrode. Diese Goldfilmelektrode besteht aus einer dünnen Gold schicht mit einer Dicke von beispielsweise 100 nm aus einem tragenden Kunststoffmaterial als Substrat. In the present invention, a thin one Layer of gold as an electrode on a substrate arranged. Such an electrode then replaces the previously common platinum wires as electrodes. This Gold film electrode consists of a thin gold layer with a thickness of, for example, 100 nm a load-bearing plastic material as a substrate.

Eine derartige Goldfilmelektrode ist erheblich kostengünstiger, etwa um den Faktor 12, als die herkömmlichen Elektroden für elektrochemische Enzymimmunoassays. Mit den erfindungsgemäßen Goldfilmelektroden ist es weiterhin erstmals möglich, eine Goldschicht auf einem Substratmaterial, insbesondere Polyetherimide (PEI) ohne haftvermittelnde Zwischenschicht aufzubringen. Eine derartige haftvermittelnde Schicht war bisher beim Aufbringen eine Goldschicht auf ein Trägermaterial wie beispielsweise Silizium oder Glas erforderlich und bestand aus Chrom oder Titan. Dadurch daß es erstmalig möglich ist, auf diese haftvermittelnde Schicht zu verzichten, können die Kosten für eine derartige Elektrode weitergesenkt werden. Such a gold film electrode is significant cheaper, about a factor of 12 than that conventional electrodes for electrochemical Enzyme immunoassays. With the invention Gold film electrodes are still possible for the first time Gold layer on a substrate material, in particular Polyetherimide (PEI) without adhesion-promoting Apply intermediate layer. Such an adhesive Up to now, the layer was a gold layer when applied on a carrier material such as silicon or glass and was made of chrome or Titanium. Because it is possible for the first time on this to dispense with the adhesive layer can Costs for such an electrode reduced further become.

Fig. 3 zeigt die Anwendung einer derartigen Goldfilmelektrode zur Quantifizierung von oxidiertem TMB, (Tetramethylborat). Fig. 3 zeigt dabei das amperometrische Signal in Korrelation zu einer am selben Assay gemessenen optischen Dichte. Für das amperometrische Signal wurde das Potential bei 200 mV gegen eine Silber/Silberchlorid-Referenzelektrode fixiert und das Signal ca. 4,5 s, nachdem die Elektrode in die Probenlösung eingetaucht wurde, gemessen. Fig. 3 shows the use of such a gold film electrode for the quantification of oxidized TMB, (tetramethyl borate). Fig. 3 shows the amperometric signal in correlation to a measured in the same assay the optical density. For the amperometric signal, the potential was fixed at 200 mV against a silver / silver chloride reference electrode and the signal was measured approx. 4.5 s after the electrode was immersed in the sample solution.

Dieses Ergebnis zeigt, daß das elektrochemische Enzymimmunoassayverfahren eine lineare Beziehung zwischen der optischen Dichte (OD) des herkömmlichen optischen Enzymimmunoassays und dem gemessenen elektrochemischen Signal ermöglicht. This result shows that the electrochemical Enzyme immunoassay method has a linear relationship between the optical density (OD) of the conventional optical Enzyme immunoassays and the measured enables electrochemical signal.

Da die mit der Probenlösung in Kontakt stehende Oberfläche der Elektrode zwischen verschiedenen Messungen variieren kann, wird die erfindungsgemäße Elektrode derart weitergebildet, daß sie lediglich mit einem vorbestimmten Bereich in Kontakt mit der Probenlösung gerät. Dies wird vorteilhafterweise dadurch erzielt, daß die Breite und die Höhe der der Probenlösung ausgesetzten Goldfilmelektrodenschicht in der Lösung festgelegt wird. Die Breite kann beispielsweise dadurch bestimmt werden, daß bei der Herstellung von Elektroden auf einem Wafer, dieser Wafer mit einer vorbestimmten Breite in einzelne Elektrodenstreifen geschnitten wird. Eine reproduzierbare Höhe des freien Goldbereiches wird dadurch erzielt, daß die äußere Oberfläche der Goldfilmelektrode mittels eines wasserfesten oder wasserabweisend und elektrisch isolierenden Beschichtungsmateriales passiviert wird, in den Bereichen, in denen die Goldfilmelektrode nicht mit der Probe in Kontakt kommen soll. Dies kann vorteilhafterweise durch Aufsprühen einer Acelatlösung erfolgen. Because the one in contact with the sample solution Surface of the electrode between different measurements can vary, the electrode according to the invention trained in such a way that they only have one predetermined area in contact with the sample solution device. This is advantageously achieved by that the width and height of the sample solution exposed gold film electrode layer in the solution is set. The width can be, for example be determined by the fact that in the production of Electrodes on a wafer, this wafer with a predetermined width in individual electrode strips is cut. A reproducible amount of free gold area is achieved in that the outer Surface of the gold film electrode by means of a waterproof or water-repellent and electric insulating coating material is passivated, in the areas where the gold film electrode is not should come into contact with the sample. This can advantageously by spraying on an acelate solution respectively.

Fig. 4 zeigt hierzu das gemessene elektrochemische Signal bei einzelnen Elektroden mit unterschiedlichen freien, nicht abgedeckten Elektrodenoberflächen. Die Messung erfolgte dabei genauso wie in Fig. 3. Es zeigt sich, daß die freie Elektrodenfläche und die Größe des amperometrischen Signals einer TMB-Probe miteinander proportional korrelieren. Fig. 4 this shows the measured electrochemical signal at individual electrodes with different free, non-covered electrode surfaces. The measurement was carried out in exactly the same way as in FIG. 3. It can be seen that the free electrode area and the size of the amperometric signal of a TMB sample correlate proportionally with one another.

Diese Passivierung der Goldfilmelektroden-Oberfläche führt auch dazu, daß die Messergebnisse einzelner Elektroden vereinheitlicht werden und deren Empfindlichkeit sich nicht mehr nennenswert unterscheidet. This passivation of the gold film electrode surface also leads to individual measurement results Electrodes are standardized and their Sensitivity no longer differs significantly.

Fig. 5 zeigt hierzu Ergebnisse der Korrelation des amperometrischen Signals und des herkömmlichen optische Signals (OD) für eine TMB-Probe, wobei jeweils die Signale von insgesamt 8 Elektroden, die als Array auf einem einzigen Träger angeordnet sind, gemessen wurden. Jeder Datenpunkt in Fig. 5 stellt einen Durchschnittswert der acht Kanäle bei einer vorbestimmten optischen Dichte dar. Die eingezeichneten Fehlerbalken bezeichnen die Standardabweichung der Ergebnisse der insgesamt acht Kanäle. Der Linearitätsfaktor R beträgt in Fig. 5 0,9998 und die Empfindlichkeit wurde zu 31,64 nA/OD bestimmt. Fig. 5 shows results of this correlation of the amperometric signal and the conventional optical signal (OD) of a TMB sample, wherein in each case the signals of a total of 8 electrodes, which are arranged as an array on a single substrate, were measured. Each data point in FIG. 5 represents an average value of the eight channels at a predetermined optical density. The error bars shown indicate the standard deviation of the results of the total of eight channels. The linearity factor R in FIG. 5 is 0.9998 and the sensitivity was determined to be 31.64 nA / OD.

Diese Messung zeigt, daß eine erfindungsgemäße Elektrode unmittelbar in einem herkömmlichen ELISA-Test unter Verwendung von TMB als Chromophore eingesetzt werden kann. This measurement shows that an inventive Electrode immediately in a conventional ELISA test used as a chromophore using TMB can be.

Weiterhin ist vorteilhaft, daß die erfindungsgemäßen Elektroden eine sehr hohe Lebensdauer aufweisen. Versuche mit derartigen Elektroden in ELISATests ergaben, daß die Goldfilmelektroden für mindestens 5000 aufeinanderfolgenden Messungen verwendet werden können. Dies bedeutet, daß die erfindungsgemäßen Goldfilmelektroden wenigstens drei Monate kontinuierlich ohne Austausch in einem automatisierten ELISAAnalyser mit mittlerem Durchsatz (600-800 Proben pro Tag) verwendet werden können. Damit sinken die Analysekosten für die einzelne Messung erheblich. It is also advantageous that the invention Electrodes have a very long service life. Experiments with such electrodes in ELISA tests showed that the gold film electrodes for at least 5000 successive measurements can be used can. This means that the invention Gold film electrodes continuously for at least three months without replacement in an automated ELISA analyzer with medium throughput (600-800 samples per day) can be used. This reduces the analysis costs considerable for the individual measurement.

Fig. 6 zeigt eine Messung der Signalamplitude im Verlauf über insgesamt 500 Messungen. Es ist zu erkennen, daß die mit den erfindungsgemäßen Goldelektroden gemessenen amperometrischen Signale sich über sämtliche 500 Messungen proportional zu den optischen Signalen verhalten. Fig. 6 shows a measurement of the signal amplitude in the course of a total of 500 measurements. It can be seen that the amperometric signals measured with the gold electrodes according to the invention are proportional to the optical signals over all 500 measurements.

Weiterhin ist vorteilhaft an den erfindungsgemäßen Elektroden, der erfindungsgemäßen Vorrichtung und dem erfindungsgemäßen Verfahren, daß auf eine Reinigung der Goldelektroden zwischen einzelnen Messungen verzichtet werden kann. Bei herkömmlichen Vorrichtungen ist es erforderlich, die Elektroden zwischen den einzelnen Messungen zu reinigen, um einen Übertrag von Proben zwischen den einzelnen Messungen zu verhindern. Hierzu wurden sehr aufwendige Regerations- und Reinigungstechniken für die Elektroden entwickelt (siehe beispielsweise J. Wang, Solid elektrodes. In: Wang, J. (Ed.) Analytical electrochemistry. VCH Publishers, Inc., New York. (1994) pp. 80. Nachteilig ist hier dann auch weiterhin, daß dieser Reinigungsschritt zu einer Verzögerung im Meßablauf führt. It is also advantageous to the invention Electrodes, the device according to the invention and the inventive method that on a cleaning the gold electrodes between individual measurements can be dispensed with. With conventional devices it is necessary to place the electrodes between the to clean individual measurements to ensure a carryover of Samples between measurements prevent. For this purpose, very complex regeneration and Cleaning techniques developed for the electrodes (see for example J. Wang, Solid elektrodes. In: Wang, J. (Ed.) Analytical electrochemistry. VCH Publishers, Inc., New York. (1994) pp. 80. Disadvantageous then here is still that Cleaning step leads to a delay in the measurement process.

Bei der erfindungsgemäßen Goldfilmelektrode ist es nun möglich auf den Reinigungsschritt zu verzichten. Dies liegt u. a. daran, daß die Elektrode lediglich zur Messung der Substratlösung am Ende des ELISA- Tests in die Lösung eingetaucht wird. Da zuvor bereits Serum und Plasma der Probe aus dem Probenbehälter entfernt wurde, kann kein Übertrag von Material stattfinden. It is with the gold film electrode according to the invention now possible to do without the cleaning step. This is u. a. remember that the electrode only for measuring the substrate solution at the end of the ELISA Tests are immersed in the solution. Since before already serum and plasma from the sample Sample container has been removed, no transfer of material occur.

Die folglich relevante Verschleppung betrifft das Substrat TMB, wobei hier im schlimmsten Falle eine Verschleppung von dem Näpfchen mit der höchsten Konzentration an oxidiertem TMB (beispielsweise mit einer optischen Dichte von 3,0 bei 450 nm) zu dem Näpfchen mit der geringsten Konzentration an oxidiertem TMB, (beispielsweise mit einer optischen Dichte von 0 bei einer Wellenlänge von 450 nm, d. h. kein TMB) erfolgen kann. The consequent procrastination concerns this Substrate TMB, in the worst case one Carryover from the well with the highest Concentration of oxidized TMB (e.g. with an optical density of 3.0 at 450 nm) to that Cell with the lowest concentration of oxidized TMB, (for example with an optical density of 0 at a wavelength of 450 nm, i.e. H. no TMB) can be done.

Hierzu wurde ein Versuch durchgeführt mit einem Probenvolumen von 200 µl. Dazu wurde zuerst eine erfindungsgemäße Elektrode in eine Probenlösung mit einer optischen Dichte von OD = 3,0 eingetaucht und anschließend die Elektrode in eine Probe mit einer optischen Dichte OD = 0 überführt. Daraufhin wurde aus den Messungen abgeschätzt, welche Menge an Probe von der ersten zur zweiten Probe durch die Elektrode überführt wurde. Diese betrug ca. 0,25 ± 0,11 µl (N = 7). Dieses Ergebnis zeigt, daß mit der erfindungsgemäß beschichteten Elektrode kein wesentlicher Übertrag von Substanzen aus einer Probe in die nächste Probe erfolgt. For this purpose, an experiment was carried out with a Sample volume of 200 µl. This was first a electrode according to the invention in a sample solution with a optical density of OD = 3.0 immersed and then the electrode in a sample with a transferred optical density OD = 0. Thereupon was out the measurements estimated the amount of sample of the first to the second sample through the electrode was transferred. This was approx. 0.25 ± 0.11 µl (N = 7). This result shows that with the Electrode coated according to the invention is not essential Transfer of substances from one sample to the next Rehearsal is done.

Da der Reinigungsschritt nun weggelassen werden kann, wird eine Gesamtmeßdauer von ca. 60 s für die Messung einer Mikrotiterplatte erzielt. Since the cleaning step can now be omitted, a total measuring time of approx. 60 s for the measurement a microtiter plate.

Die Analysedauer kann weiter verringert werden, wenn erfindungsgemäß bei der Datenaufnahme wie folgt vorgegangen wird. The analysis time can be further reduced if according to the invention in data acquisition as follows is proceeded.

Die Elektrode wird in die Probe eingetaucht und das Signal wird zu einem vorbestimmten Zeitpunkt gemessen, nachdem die Elektrode eingetaucht wurde. Alternativ kann auch eine Signaländerung von einer vorbestimmten Größe erfaßt werden, die beispielsweise mit dem Eintauchen der Elektrode in die Probe zusammenhängt. In einem vorbestimmten Zeitabstand von dieser erfaßten Signaländerung wird dann das eigentliche Datensignal aufgezeichnet. The electrode is immersed in the sample and that Signal will be at a predetermined time measured after the electrode was immersed. Alternatively, a signal change from one predetermined size can be detected, for example with immersing the electrode in the sample related. At a predetermined interval from this detected signal change then becomes the real one Data signal recorded.

Dies ist beispielsweise in Fig. 8 dargestellt. Dabei bezeichnet 1 den Offsetwert der Messung, 2 den Startpunkt einer Messung, wobei der Startpunkt definiert ist als ein Punkt, bei dem das Signal um eine bestimmte Spannung niedriger ist als der Offsetwert, 3 den Endpunkt der Messung, bei dem Signalverfolgungsverfahren, wobei dieser Endpunkt als derjenige Punkt definiert ist, bei dem die erste Ableitung des Signals bezüglich der Zeit ansteigt, 4 den Signalwert, der im Falle des Signalverfolgungsverfahren drei Datenpunkte vor dem Endpunkt 3 der Messung angeordnet ist. Im Falle des Verfahrens mit einem bestimmten Zeitabstand nach Eintauchen der Elektrode ist dieser Punkt eine vorbestimmte Anzahl von Sekunden vor dem Endpunkt 3 der Messung angeordnet. Die jeweiligen Zeit- und Signalwerte, die als Start- oder Endwerte für die Messung definiert sind, können entsprechend den Meßbedingungen angepaßt und geändert werden. In dem in Fig. 8 dargestellten Versuch betrug der Offsetwert 1 2,4 V, der Startpunkt 2 lag um 0,1 V unterhalb des Offsetwerts und der Signalwert 4 wurde 0,5 s vor dem Endpunkt 3 gemessen. This is shown, for example, in FIG. 8. 1 denotes the offset value of the measurement, 2 the start point of a measurement, the start point being defined as a point at which the signal is lower than the offset value by a certain voltage, 3 the end point of the measurement in the signal tracking method, this end point is defined as the point at which the first derivative of the signal increases in time, 4 the signal value which, in the case of the signal tracking method, is arranged three data points before the end point 3 of the measurement. In the case of the method with a certain time interval after immersing the electrode, this point is arranged a predetermined number of seconds before the end point 3 of the measurement. The respective time and signal values, which are defined as start or end values for the measurement, can be adapted and changed in accordance with the measurement conditions. In the experiment shown in FIG. 8, the offset value 1 was 2.4 V, the start point 2 was 0.1 V below the offset value and the signal value 4 was measured 0.5 s before the end point 3 .

Mit diesen beiden erfindungsgemäßen Verfahren wurden jeweils Meßdauern von 5 s realisiert. Wenn nun ein Array aus insgesamt acht Elektroden verwendet wird, um eine Mikrotiterplatte von 96 Proben Näpfchen zu vermessen, dauert die gesamte Messung ca. 60 s. Verglichen mit der Gesaffitauswertedauer eines Leitertests von 2 bis 3 Stunden fällt diese reine elektrochemische Meßdauer nicht ins Gewicht. With these two methods according to the invention measurement times of 5 s each. If so now Array of eight electrodes in total is used around a microtiter plate of 96 samples measured, the entire measurement takes approx. 60 s. Compared to the Gesaffitauswertungszeit one Conductor tests of 2 to 3 hours fall this pure electrochemical measurement duration is not important.

Im folgenden werden einige Beispiele für die Herstellung und Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung und Elektroden gegeben. The following are some examples of that Production and use of the device according to the invention and given electrodes.

Auf eine Polyetherimid(PEI)-Schicht (Good Fellow GmbH, Bad Nauheim, Deutschland) mit einer Dicke von 3 mm wurde eine Goldschicht mit einer Dicke von 100 nm aufgesputtert. Die Substratschicht hatte eine Oberfläche von 100 × 100 mm im Quadrat. Anschließend wurde die PEI-Schicht in Elektrodenstreifen mit einer Fläche von 1,0 × 10 mm unter Verwendung eines Sägesystems für Wafer geschnitten. Auf die Goldschicht wurde anschließend eine Acrylatschicht aufgesprüht. Diese Acrylatschicht ist wasserdicht und wasserabweisend, so daß auf dieser Schicht keine elektrochemische Reaktion erfolgen kann. Als Acrylat wurde Ethylacetat und N-Buthylacetat in 1-Methoxy-2-propanol als Lösungsmittel verwendet. Die jeweiligen Enden der Elektrode wurden während des Sprühverfahrens mit einer Silicongummidichtung abgedeckt, so daß dort keine Acrylatbeschichtung aufgetragen wurde. Das eine Ende des Elektrodenstreifens diente anschließend als Elektrodenoberfläche für die elektrochemische Nachweisreaktion und das andere Ende wurde als elektrischer Kontakt zu der Auswerteschaltung verwendet. On a polyetherimide (PEI) layer (Good Fellow GmbH, Bad Nauheim, Germany) with a thickness of 3 mm was a gold layer with a thickness of 100 nm sputtered. The substrate layer had one 100 × 100 mm square surface. Then was the PEI layer in electrode strips with a 1.0 × 10 mm area using a sawing system cut for wafers. Was on the gold layer then sprayed on an acrylate layer. This Acrylate layer is waterproof and water-repellent, so that no electrochemical on this layer Reaction can take place. Ethyl acetate was used as the acrylate and N-butyl acetate in 1-methoxy-2-propanol as Solvent used. The respective ends of the Electrode was sprayed with a Silicone rubber seal covered, so there is no Acrylate coating was applied. One end of the electrode strip then served as Electrode surface for the electrochemical Detection reaction and the other end was considered electrical Contact used for the evaluation circuit.

Fig. 7 zeigt eine so hergestellte Anordnung 10 von paarweisen Elektroden 11, 12 bzw. 11', 12'. Die Elektroden 11, 12 sind strukturiert auf das Substrat 10 aufgesputtert, so daß diese paarweise vorliegen. Sie besitzen verdickte Ende 11b, 11c, die über verdünnte Bereiche 11b miteinander verbunden sind. Die Enden 11a, 12a dienen dabei als Elektroden für die elektrochemische Nachweisreaktion. Die verdickten Enden 11c bzw. 12c dienen als Kontaktierung zu der elektrischen Auswerteschaltung. FIG. 7 shows an arrangement 10 of electrodes 11 , 12 and 11 ′, 12 ′ produced in pairs in this way. The electrodes 11 , 12 are structured sputtered onto the substrate 10 so that they are present in pairs. They have thickened ends 11 b, 11 c, which are connected to one another via thinned regions 11 b. The ends 11 a, 12 a serve as electrodes for the electrochemical detection reaction. The thickened ends 11 c and 12 c serve as contacts to the electrical evaluation circuit.

Fig. 7a stellt dabei die Oberfläche des Substrats 10 dar, auf dem die Arbeitselektroden angeordnet sind. Fig. 7b zeigt demgegenüber die Rückseite 10b des Substrates auf der Ag/AgCl-Referenzelektroden 13, 13' aufgebracht sind. Fig. 7a thereby represents the surface of the substrate 10 on which the working electrodes are arranged. Fig. 7b shows, in contrast, the rear side 10 b of the substrate on the Ag / AgCl reference electrodes 13, 13 are applied '.

Die Flächen der Kontaktbereiche 11a, 12a, 13a betrugen 3,0 × 10 mm² und die Fläche der aktiven Elektrodenoberflächen, 11c, 12c und 13c 1,5 × 10 mm². The areas of the contact areas 11 a, 12 a, 13 a were 3.0 × 10 mm ² and the area of the active electrode surfaces, 11 c, 12 c and 13 c 1.5 × 10 mm ² .

Der in Fig. 7 dargestellte Elektrodenarray ist geeignet, um jeweils eine Spalte einer 36-Well Mikrotiterplatte gleichzeitig zu vermessen. Daher sind die Abstände der Elektrodenpaare entsprechend den Abständen der einzelnen Näpfchen der Mikrotiterplatte gewählt. The electrode array shown in FIG. 7 is suitable for measuring one column of a 36-well microtiter plate at a time. The distances between the electrode pairs are therefore selected in accordance with the distances between the individual wells of the microtiter plate.

Die Ag-AgCl-Referenzelektrode 13 wurde hergestellt, indem ein Silberdraht mit einem lektrisch leitfähigen Klebstoff (Elekolit 336, Pankol-Elosol GmbH, Oberursel, Deutschland) in 0,1 NHCl(Aqua)-Lösung für 10 s mit einer Spannung von 1 V anodisiert wurde. Eine derartige Ag/AgCl-Elektrode kann jedoch auch vorab getrennt hergestellt und anschließend auf das Substrat 10 aufgebracht werden. The Ag-AgCl reference electrode 13 was produced by using a silver wire with an electrically conductive adhesive (Elekolit 336, Pankol-Elosol GmbH, Oberursel, Germany) in 0.1 NHCl (Aqua) solution for 10 s with a voltage of 1 V was anodized. Such an Ag / AgCl electrode can, however, also be produced separately beforehand and then applied to the substrate 10 .

Für die amperometrische Messung wurde ein XYZ-Roboterarm (carrier arm, Hamilton Bonadutz AG, Schweiz) verwendet. Dieser Roboterarm wurde derartig programmiert, daß er die Goldschichtelektrode bzw. den Array von Goldschichtelektroden in die Näpfchen einer Mikrotiterplatte positioniert. Die amperometrische Messung wurde anschließend durchgeführt mittels eines herkömmlichen Potentiotates. Das Signal wurde aufgenommen mit einem 10 Bit-A/D-Wandler (ADC11, Picotech, GB), der mit einem PC verbunden war. Für die Messung wurden die TMB-Proben durch eine POD-Reaktion in einer Mikrotiterplatte vorbereitet und erzeugt, wie es beispielsweise in der Druckschrift J. C. Pyun, H. H. Lee, Application of an amperometric detector to the conventional enzyme-immunoassay (EIA), Sensors and Actuators B 78 (2001) 232-236 beschrieben wurde. A was used for the amperometric measurement XYZ robot arm (carrier arm, Hamilton Bonadutz AG, Switzerland) used. This robot arm became like this programmed that he the gold layer electrode or the array of gold-layer electrodes in the wells of one Microtiter plate positioned. The amperometric Measurement was then carried out using a conventional potentiotates. The signal was recorded with a 10 bit A / D converter (ADC11, Picotech, GB) connected to a PC. For the measurement the TMB samples were analyzed by a POD reaction a microtiter plate prepared and generated as it for example in J.C. Pyun, H.H. Lee, Application of an amperometric detector to the conventional enzyme immunoassay (EIA), Sensors and Actuators B 78 (2001) 232-236.

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Claims

1. Enzyme immunoassay electrode with a flat Polymer substrate on one surface immediately at least a thin layer as active Electrode element is applied, the thin layer of gold.

2. Electrode according to one of the previous ones Claims, characterized in that on the substrate separated from each other with at least two areas a thin layer of gold is applied.

3. Electrode according to one of the previous ones Claims, characterized in that on the substrate an arrangement of several, separate from each other Areas with a thin layer each Gold are applied.

4. Electrode according to one of the previous ones Claims, characterized in that the at least two areas on the same surface of the flat polymer substrates are arranged.

5. Electrode according to one of the previous ones Claims, characterized in that on the thin layers opposite surface of the flat polymer substrate Reference electrode is arranged.

6. Electrode according to one of the previous ones Claims, characterized in that the substrate Polyetherimide exists.

7. Electrode according to one of the preceding Claims, characterized in that they as printed circuit or printed circuit board is formed.

8. electrode according to the preceding claim, characterized in that on the printed Circuit or PCB an array of one A plurality of areas, each with a thin one Layer of gold is arranged.

9. Electrode according to one of the preceding Claims, characterized in that the thin Layer in the form of a strip on the substrate is applied.

10. Electrode according to one of the preceding Claims, characterized in that the at least using a thin layer on the substrate Vacuum process (PCD, CVD, sputtering) is applied.

11. Electrode according to one of the preceding Claims, characterized in that the at least a thin layer with an area waterproof or water-repellent electrical insulating layer is covered such that a further predetermined area of the thin layer not from the electrically insulating layer is covered.

12. Electrode according to one of the preceding Claims, characterized in that the electrical insulating layer consists of an acrylate.

13. Electrode according to one of the preceding Claims, characterized in that the electrical insulating layer sprayed onto the substrate is.

14. Device with a receptacle for sample containers for an enzyme immunoassay,
at least one electrode unit with at least one working electrode that can be inserted into the sample container and at least one reference electrode,
at least one potentiostat for keeping the electrical potential constant between the at least one working electrode and the at least one reference electrode and for generating an electrical output signal of the electrode unit, and
a voltage supply for the at least one electrode unit
characterized in that
the electrode unit has at least one electrode according to one of the preceding claims.

15. The device according to the preceding claim, characterized by an analog-to-digital converter for converting the output signal into a digital output signal.

16. The device according to the preceding claim, characterized by a microprocessor for Evaluation of the digital output signal.

17. The device according to one of claims 14 to 16, characterized in that the inclusion for the Sample container a receptacle for a Microtiter plate with a variety of wells for Recording of one sample at a time.

18. Device according to the preceding claim, characterized in that the electrode unit for each of the wells of the microtiter plate has at least one working electrode which in the associated cell can be inserted.

19. Device according to one of the two preceding Claims, characterized in that the at least one electrode unit at least one Working electrode has to the individual Cup of the microtiter plate is movable and / or the sample holder can be moved in this way is that the at least one working electrode Electrode unit successively in each of the The microplate well can be inserted.

20. Procedure for carrying out a Enzyme immunoassays (EIA, ELISA) with a sample, one Reactant is added to the sample to which an enzyme is coupled which, when a Substrate a redox reaction and color reaction triggers the substrate, and being unbound Reaction partner removed and then Substrate added to the sample, electrodes in the Sample introduced and the sample electrochemically is measured characterized in that for electrochemical measurement at least one Electrode according to one of claims 1 to 13 in the sample is introduced.

21. The method according to the preceding claim, characterized in that the sample is measured amperometrically.

22. Procedure according to one of the two previous Claims, characterized in that the Concentration of oxidized substrate and / or reduced substrate is determined.

23. Procedure according to one of the three preceding Claims, characterized in that as an enzyme alkaline phosphatase or hydrogen peroxidase is used.

24. The method according to any one of claims 20 to 23, characterized in that the method as Solid phase immunoassay is performed.

25. The method according to any one of claims 20 to 24, characterized in that one or more samples be arranged on a microtiter plate.

26. The method according to the preceding claim, characterized in that for simultaneous Measurement of several samples on a microtiter plate an electrode according to any one of claims to is used.

27. The method according to any one of claims 20 to 26, characterized in that the method as Two-sided binding test or competition test is carried out.

28. The method according to any one of claims 20 to 27, characterized in that the electrochemical Measurement with a predetermined time Distance after detection of a voltage change a predetermined value occurs.

29. The method according to any one of claims 20 to 28, characterized in that the electrochemical Measurement at a predetermined time after the The electrode is inserted into the sample.