DE10202713A1 - Biomolekularer Erkennungstest - Google Patents

Abstract

Es werden Verfahren zur Detektion mindestens einer gesuchten Targetsubstanz beschrieben, die in einer Probe enthalten ist, mit den Schritten: Einführung der Probe in eine Sensorsuspension (10), die in einem kräftefreien, homogenen Zustand gleichmäßig verteilt fluoreszenzmarkierte Antikörpermoleküle und unmarkierte, frei suspendierte Trägerpartikel enthält, die unmarkierte Antikörpermoleküle tragen, wobei die markierten und unmarkierten Antikörpermoleküle substanzspezifische Bindungsstellen für die Targetsubstanz besitzen, Fluoreszenzmessung im homogenen Zustand zur Erfassung eines ersten Fluoreszenzsignals (F1) der Sensorsuspension in mindestens einem vorbestimmten Detektorbereich (40), Ausübung von Kräften, unter deren Wirkung die Sensorsuspension (10) in einen inhomogenen Zustand überführt wird, in dem die Konzentration der Trägerpartikel im Detektorbereich (40) verändert ist, Fluoreszenzmessung im inhomogenen Zustand zur Erfassung eines zweiten Fluoreszenzsignals (F2) der Sensorsuspension (10), und Erfassung der Targetsubstanz in der Sensorsuspension (10), falls sich die ersten und zweiten Fluoreszenzsignale im homogenen und im inhomogenen Zustand (F1, F2) unterscheiden.

Description

• Die Erfindung betrifft Verfahren zur Substanzdetektion, insbesondere durch Detektion von Biomolekülen, und Vorrichtungen zur Durchführung derartiger Verfahren.
• Aus der Gentechnik und Pharmakologie sind verschiedene biomolekulare Erkennungstests bekannt, die auf dem Nachweis einer Komplexbildung zwischen einem Antikörper und einem korrespondierenden Antigen basieren. Ein klassisches Immunoassay ist beispielsweise der ELIZA-Test. Beim ELIZA-Test wird ein Festphasentestformat realisiert, bei dem eine Aggregatbildung zwischen Antikörper und Antigen (oder: zwischen Rezeptor und Substrat) und die Markierung dieses Aggregates an der Oberfläche einer Festphase erfolgt. Vor dem Nachweis des an die Festphase gebundenen Komplexes muss zunächst der ungebundene Anteil der zur Markierung eingesetzten Antikörper entfernt werden (siehe F. Lottspeich et al. in "Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin, 1998, Seite 92). Obwohl die Abtrennung durch das Festphasen-Testformat erleichtert wird, besteht ein Nachteil darin, dass der ELIZA-Test relativ aufwendig und umständlich ist.
• Es werden zunehmend auch Testformate realisiert, bei denen eine Komplexbildung zwischen Antigenen und antikörperbeladenen Partikeln erfolgt, die in einer Suspension beweglich sind. Auch bei diesem Testformat muss eine Abtrennung störender Komponenten in Form von fluoreszenzmarkierten Antikörpern, die jedoch nicht an Antigene gebunden sind, erfolgen. Diese Abtrennung kann lediglich umgangen werden, wenn sich bei der Assoziation zwischen Antikörper und Antigen die Eigenschaften des Aggregats so verändern, dass eine Unterscheidung zwischen dem Aggregat und seinen einzelnen Bestandteilen möglich ist. Dies wird beispielsweise bei der Resonanz-Energietransfer-Methode realisiert. Zwei mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markierte Antikörper werden an ein gemeinsames Antigen gekoppelt. Durch eine Überlappung der Absorptionsspektren beider Fluoreszenzfarbstoffe kommt es zu einem Energietransfer zwischen den Farbstoffmolekülen, der als Wellenlängenverschiebung in den Fluoreszenzspektren registriert werden kann. Ein Nachteil der Resonanz-Energietransfer- Methode besteht jedoch darin, dass beide Farbstoffe im Antigen- Antikörper-Aggregat räumlich so dicht beieinander lokalisiert sein müssen, dass ein effektiver Energietransfer möglich ist. Diese Bedingung ist nur bei relativ kleinen Antigenen erfüllt, da der sogenannte Försterabstand zur Charakterisierung des Energietransfers bei rd. 7 nm liegt. Durch die Beschränkung auf kleine Antigene und die häufig geringen Quantenausbeuten ist die Anwendbarkeit der Resonanz-Energietransfer-Methode begrenzt.
• Ein weiteres bekanntes Verfahren, das ohne die Abtrennung der ungebundenen fluoreszenzmarkierten Komplemente auskommt, ist die Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (siehe z. B. G. Gradl et al. in "BioMethods", Bd. 10, 1999, Seite 331-351). Bei diesem Verfahren wird die Fluoreszenz in einem relativ kleinen Beobachtungsvolumen registriert. Das Beobachtungsvolumen ist so gewählt, dass das Signal einzelner Moleküle registriert und analysiert werden kann. Aus dem Zeitverhalten eines im Beobachtungsvolumen detektierten Moleküls kann seine Größe abgeschätzt und damit zwischen Aggregaten und ungebundenen Komplementen unterschieden werden. Dieses Verfahren ermöglicht zwar eine extrem hohe Empfindlichkeit. Es besitzt jedoch den Nachteil, dass das Beobachtungsvolumen notwendig im µm³-Bereich liegen und die Moleküldichte in der Suspension gering gehalten werden muss.
• Die Aufgabe der Erfindung ist es, verbesserte Detektionsverfahren bereitzustellen, mit denen die Nachteile herkömmlicher biomolekularer Erkennungstests überwunden werden und die insbesondere eine hohe Nachweisempfindlichkeit und einen erweiterten Anwendungsbereich besitzen. Erfindungsgemäße Verfahren sollen ferner einen vereinfachten und schnellen Testablauf ermöglichen. Die Aufgabe der Erfindung ist es auch, Detektorvorrichtungen zur Umsetzung der Verfahren bereitzustellen.
• Diese Aufgaben werden durch Verfahren und Vorrichtungen mit den Merkmalen gemäß den Patentansprüchen 1 und 9 gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen.
• Die Grundidee der Erfindung ist es, eine Probe in eine Sensorsuspension einzuführen, die sowohl fluoreszenzmarkierte Antikörper als auch frei suspendierte, unmarkierte Trägerpartikel enthält, die unmarkierte Antikörper tragen, wobei sowohl die fluoreszenzmarkierten als auch die unmarkierten Antikörper substanzspezifische Bindungsstellen für mindestens eine Targetsubstanz bilden, die in der Probe nachgewiesen werden soll. Der Nachweis der Targetsubstanz erfolgt, indem durch eine Fluoreszenzmessung erfasst wird, ob sich durch Verknüpfen der gesuchten Targetsubstanz mit den fluoreszenzmarkierten Antikörpern und den unmarkierten Antikörpern fluoreszenzmarkierte Aggregate bilden. Diese Aggregate enthalten entsprechend mindestens einen Trägerpartikel, der unmarkierte Antikörper trägt.
• Die Fluoreszenz der fluoreszenzmarkierten Aggregate wird detektiert, indem in der Sensorsuspension unter der Einwirkung äußerer Kräfte, die selektiv auf die Trägerpartikel wirken, eine ein- oder mehrmalige Umverteilung der fluoreszierenden Aggregate in mindestens einem Detektorbereich erfolgt und entsprechend eine ein- oder mehrmalige lokal selektive Fluoreszenzmessung in dem mindestens einen Detektorbereich erfolgt. Die erfindungsgemäße Kombination der Bildung von Aggregaten aus fluoreszenzmarkierten Antikörpern, unmarkierten Antikörpern und der Targetsubstanz (z. B. Antigene) mit der Sammlung und Detektion der Aggregate in bestimmten Detektorbereichen wird vorteilhafterweise mit erheblich reduzierten technologischen Aufwand eine erhöhte Nachweisempfindlichkeit der Detektion erreicht. Die Nachweisempfindlichkeit ist mit der Empfindlichkeit der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie vergleichbar, ohne jedoch wie diese auf kleine Beobachtungsvolumen oder geringe Dichten beschränkt zu sein. Ein weiterer wichtiger Vorteil besteht in der Zeitersparnis. Beim erfindungsgemäßen Verfahren kann auf eine Abtrennung des ungebundenen Komplements verzichtet werden. Der schnelle Verfahrensablauf ist insbesondere für biochemische und klinische Tests von Bedeutung. Gemäß bevorzugten Ausführungsformen werden zur Sammlung der Aggregate in den vorbestimmten Detektorbereichen dielektrophoretische, optische oder magnetische Kräfte verwendet. Vorteilhafterweise besitzen diese Kräfte eine hohe Selektivität, so dass ausschließlich Aggregate, die mindestens einen dielektrischen Partikel enthalten, in die Detektorbereiche verschoben werden, während fluoreszenzmarkierte Antikörper, die nicht an der Aggregatbildung beteiligt sind, unverändert homogen in der Sensorsuspension verteilt bleiben.
• Gemäß weiteren vorteilhaften Ausführungsformen der Erfindung ist vorgesehen, dass die lokal selektive Fluoreszenzmessung in den Detektorbereichen durch Anwendung optischer Blenden oder elektronischer Ortsfilter (Bildverarbeitung) erfolgt. Vorteilhafterweise kann mit einer an sich bekannten Gerätetechnik (Abschattung, Maskenbildung) eine hochempfindliche Fluoreszenzmessung abwechselnd in mindestens einem homogenen Zustand, in dem sich die Sensorsuspension mit der Probe in einem kräftefreien Zustand befindet, und in mindestens einem inhomogenen Zustand realisiert werden, in dem die Trägerpartikel oder fluoreszierenden Aggregate unter der Wirkung der genannten Kräfte in dem mindestens einen Detektorbereich gesammelt oder aus diesem verdrängt sind.
• Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Detektionsverfahrens erfolgt eine wiederholte Fluoreszenzmessung in dem Detektorbereich, wobei abwechselnd eine Sammlung oder Konzentration der Aggregate im Detektorbereich und eine Rückverteilung oder Homogenisierung erfolgen. Die Rückverteilung wird durch eine aktive Suspensionsbewegung (Umrühren) und/oder eine thermische Rückverteilung realisiert. Um im letzteren Fall möglichst kurze Messzeiten zu erhalten, besitzt der mindestens eine Detektorbereich vorzugsweise in mindestens einer Richtung eine Querdimension im sub-mm- oder µm-Bereich, so dass nach Abschalten der sammelnden Kräfte die Aggregate durch thermische Stöße schnell wieder die übrige Sensorsuspension verteilt werden.
• Das erfindungsgemäße Verfahren liefert vorteilhafterweise zusätzliche Informationen aus der Kinetik des Fluoreszenzsignals beim Umschalten zwischen den verschiedenen Suspensionszuständen oder Messphasen. Wenn sich große Aggregate bilden, wird die Sammlung und/oder die Rückverteilung in den homogenen Zustand langsamer ablaufen, als wenn kleinere Aggregate gebildet werden.
• Ein Gegenstand der Erfindung ist auch eine Vorrichtung zur Detektion von Substanzen, die eine Suspensionskammer zur Aufnahme der genannten Sensorsuspension, eine Felderzeugungseinrichtung zur Sammlung insbesondere von Aggregaten aus fluoreszenzmarkierten und unmarkierten Antikörpern, Partikeln und mindestens einer Targetsubstanz in mindestens einem vorbestimmten Detektorbereich der Suspensionskammer und eine Fluoreszenzdetektoreinrichtung zur lokal selektiven Fluoreszenzmessung in dem mindestens einen Detektorbereich umfasst. Die erfindungsgemäße Detektorvorrichtung besitzt den besonderen Vorteil eines einfachen Aufbaus aus Komponenten, die an sich aus der Fluidik und insbesondere der fluidischen Mikrosystemtechnik bekannt sind. Die Detektorvorrichtung kann insbesondere als fluidisches Mikrosystem miniaturisiert aufgebaut sein.
• Gemäß bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung umfassen die Felderzeugungseinrichtungen Elektroden, die in der Sensorkammer mit einer vorbestimmten geometrischen Ausrichtung angeordnet sind, oder eine Magneteinrichtung.
• Die Erfindung besitzt die folgenden weiteren Vorteile. Die dielektrophoretischen Erkennungstests werden erfindungsgemäß in Größenbereiche der Targetsubstanzen erweitert, die bisher nicht erfassbar waren. Es können sehr kleine Targetsubstanzteilchen (z. B. Makromoleküle) im Aggregatverbund dielektrisch manipuliert werden. Das Detektionsverfahren bildet eine neue Spektroskopiemethode, die sich durch ein verbessertes Signal-Rausch- Verhältnis auszeichnet. Die Detektion ist nicht auf bestimmte Targetsubstanzen festgelegt. Es ergeben sich extrem hohe Detektionsgeschwindigkeiten im Sekundenbereich.
• Weitere Vorteile und Einzelheiten der Erfindung werden aus der Beschreibung der beigefügten Zeichnungen ersichtlich. Es zeigen:
• Fig. 1 und 2 schematische Illustrationen von Ausführungsfomen des erfindungsgemäßen Verfahrens, und
• Fig. 3 bis 9 verschiedene Ausführungsformen erfindungsgemäßer Detektorvorrichtungen.
• Bei der Beschreibung wird auf die Anwendung der Erfindung bei biomolekularen Erkennungstests beispielhaft Bezug genommen. Diese sind auf die Detektion von Biomolekülen gerichtet. Unter Biomolekülen werden hier allgemein Stoffe, Verbindungen, Makromoleküle oder Aggregate biologischen Ursprungs oder entsprechende komplexere Materialien, wie z. B. lebende oder tote biologische Zellen, Zellgruppen oder Zellbestandteile verstanden. Die Biomoleküle, die als Targetsubstanz in einer Probe erfasst werden sollen, umfassen beispielsweise Antigene. Als signalgebendes Material werden Antikörper verwendet, die substanzspezifische Bindungsstellen für die Biomoleküle bilden. Es werden einerseits markierte Antikörper und andererseits unmarkierte Antikörper verwendet, wobei letztere an Trägerpartikel gebunden sind. Die Markierung ermöglicht einen Nachweis mit einer an sich bekannten Fluoreszenzmessung. Die Trägerpartikel sind allgemein dielektrische oder magnetische Teilchen synthetischen oder natürlichen Ursprungs, wie z. B. kommerziell verfügbare Beads oder lebende oder tote Zellen. Die Erfindung ist jedoch auf die Detektion von Biomolekülen auf der Grundlage von Ligand-Rezeptor-Systemen, nicht beschränkt, sondern allgemein zur Detektion chemischer Stoffe anwendbar, die selektiv an bestimmte Substratmoleküle anbinden.
• Das Wirkprinzip des erfindungsgemäßen Verfahrens wird im Folgenden unter Bezug auf die Fig. 1 und 2 erläutert. Fig. 1 illustriert schematisch eine erfindungsgemäße Detektorvorrichtung 100 mit einer Sensorkammer 20, die eine Sensorsuspension 10 enthält, einer Felderzeugungseinrichtung 30, Detektorbereichen 40 und einem Fluoreszenzdetektor 50.
• Die Sensorsuspension 10 wird beispielsweise durch eine Salz-, Elektrolyt- oder Nährstofflösung gebildet. Sie enthält als signalgebendes Material fluoreszenzmarkierte Antikörper (z. B. Antikörper gegen Viren), die frei und ungebunden in der Sensorsuspension enthalten sind, und Trägerpartikel, die ebenfalls frei suspendiert sind und Antikörper tragen. Im Unterschied zu den freien Antikörpern sind die Trägerpartikel und die auf diesen angekoppelten Antikörper unmarkiert. Sie zeigen bei Bestrahlung mit Anregungslicht, das bei den fluoreszenzmarkierten Antikörpern eine Fluoreszenzemission auslöst, keine oder eine vernachlässigbar geringe Fluoreszenz. Als Trägerpartikel werden beispielsweise Beads mit einem Durchmesser im Bereich von 20 nm bis einige µm verwendet. Die unmarkierten Antikörper sind an die Beads z. B. mit Streptavidin gekoppelt. Auf einem Trägerpartikel können mehrere Antikörper angekoppelt sein, die für eine oder verschiedene Targetsubstanzen spezifisch bindend sind. In der Sensorsuspension können auch verschiedene Gruppen von Targetpartikeln mit verschiedenen Antikörpern enthalten sein.
• Zur Durchführung des Detektionsverfahrens wird der Sensorsuspension 10 eine Probe zugesetzt, die in Bezug auf eine oder mehrere Targetsubstanzen getestet werden soll. Alternativ ist es auch möglich, dass die Sensorsuspension selbst durch die Probe gebildet wird und dieser die Antikörper zugesetzt werden, die zum Teil fluoreszenzmarkiert, ungebunden und zum anderen Teil unmarkiert und an Trägerpartikel gebunden sind. In einem kräftefreien oder homogenen Zustand sind die Bestandteile der Sensorsuspension zunächst gleichförmig verteilt.
• Wenn die Probe eine oder mehrere der gesuchten Targetsubstanzen enthält, kommt es zur Aggregatbildung zwischen trägerpartikelgekoppelten, unmarkierten Antikörpern, der Targetsubstanz und fluoreszenzmarkierten Antikörpern. Die Aggregate bilden eine Stapel- oder sog. Sandwichform. Wenn die Targetsubstanz in der Sensorsuspension enthalten ist, sind fluoreszenzmarkierte Antikörper über die Targetsubstanz und die unmarkierten Antikörper an Trägerpartikel gebunden. Im homogenen Zustand liefert die Sensorsuspension bei Anregung der Fluoreszenzmarker ein homogenes, über die gesamte Sensorsuspension gleich verteiltes Fluoreszenzsignal, das sich aus einem Grundsignal von noch ungebundenen, fluoreszenzmarkierten Antikörpern und einem Aggregatsignal von fluoreszenzmarkierten Antikörpern zusammensetzt, die über die Aggregatbildung an Trägerpartikel gebunden sind. Da sich die Zahl der fluoreszierenden Moleküle vom targetsubstanzfreien Zustand der Sensorsuspension nicht unterscheidet, ist dem Fluoreszenzsignal noch nicht zu entnehmen, ob eine Targetsubstanz in der Probe ist oder nicht. Dies wird erst bei Überführung der Sensorsuspension in einen inhomogenen Zustand durch die selektive Ausübung von Feldkräften auf die Trägerpartikel und deren Sammlung in oder Verdrängung aus den Detektorbereichen 40 möglich.
• Allgemein beruht die erfindungsgemäße Detektion der bei Anwesenheit der Targetsubstanz gebildeten Aggregate auf der Erfassung einer Änderung des von dem mindestens einen Detektorbereich ausgehenden Fluoreszenzsignals. Je nach Anwendungsfall erfolgt eine ggf. mehrfache Auswertung der Fluoreszenzerhöhung oder -verminderung und/oder des Zeitverlaufs des Fluoreszenzsignals beim Übergang zwischen dem feldfreien (homogenen) und dem feldbeaufschlagten (inhomogenen) Zustand der Sensorsuspension.
• Um zwischen den Grund- und Aggregatsignalen zu unterscheiden, wird beispielsweise an die Felderzeugungseinrichtung 30 in Form von Elektroden ein elektrisches Feld angelegt (siehe unten), unter dessen Wirkung die Trägerpartikel auf Grund ihrer dielektrischen Eigenschaften von den Elektroden weggedrängt und in die Detektorbereiche 40 zwischen den Elektroden verschoben werden. Die ungebundenen fluoreszenzmarkierten Antikörper bleiben unbeeinflusst, sie werden nicht verschoben. Dies ist schematisch überhöht im rechten Teil von Fig. 1 illustriert. In den Detektorbereichen 40 ergibt sich eine erhöhte Konzentration von Trägerpartikeln relativ zu der vorher homogenen Verteilung im feldfreien Zustand (linkes Teilbild). Wenn in der Probe eine Targetsubstanz enthalten ist, wird die Zahl der fluoreszierenden Antikörper in den Detektorbereichen 40 erhöht, da mit den gesammelten Trägerpartikeln auch eine Anreicherung der gebundenen, markierten Antikörper erfolgt. In diesem Zustand ist der Beitrag des Aggregatsignals höher als im feldfreien Zustand, während das Grundsignal gleich bleibt. Insgesamt ergibt sich eine Erhöhung des Fluoreszenzsignals, die detektierbar ist. Das erläuterte Prinzip lässt sich auch umkehren, indem unter der Wirkung der äußeren Feldkräfte eine Abreicherung oder Entleerung der Detektorbereiche 40 von Trägerpartikeln erfolgt. In diesem Fall verringert sich das Fluoreszenzsignal.
• Fig. 2 illustriert die Zeitabhängigkeit der Fluoreszenz F(t) (willkürliche Einheiten) in einem Detektorbereich 40. Zum Zeitpunkt t = 1 befindet sich die Sensorsuspension im feldfreien, homogenen Zustand. Die im Detektorbereich 40 vorhandenen, gebundenen oder ungebundenen, fluoreszierenden Antikörper liefern ein Fluoreszenzsignal F1. Zum Zeitpunkt t = 2 wird die Felderzeugungseinrichtung 30 betätigt. Innerhalb einer extrem kurzen Ansprechzeit sammeln sich die Trägerpartikel in den Detektorbereichen 40. Sind die genannten Aggregate gebildet, erhöht sich die Fluoreszenz auf den Wert F2.
• Erfindungsgemäß erfolgt eine Erfassung der Targetsubstanz in der Sensorsuspension 10, falls sich die ersten und zweiten Fluoreszenzsignale im homogenen und im inhomogenen Zustand unterscheiden. Das Differenzsignal F2 - F1 ist charakteristisch für die Menge der an Trägerpartikel angekoppelte, fluoreszierende Antikörper und damit für die Konzentration der gesuchten Trägersubstanz in der Sensorsuspension.
• Anschließend ist die Sensorsuspension im inhomogenen Zustand, bis zum Zeitpunkt t = 3 die Feldwirkung abgeschaltet wird. Durch thermische Fluktuationen in der Sensorsuspension erfolgt eine Rückverteilung in den homogenen Zustand. Dieser Prozess verläuft langsamer als die Aggregatsammlung mit einer bestimmten Zeitcharakteristik bis zum Zeitpunkt t = 4. Die Geschwindigkeit des Fluoreszenzabfalls, der mit einer Halbwertszeit τ beschrieben werden kann, hängt insbesondere von der Größe der Aggregate und der detektierten Targetsubstanzteilchen ab.
• Je nach Anwendung und Aufgabe des Detektors wird das Auftreten der Fluoreszenzänderung (Schwellwertvergleich), die Stärke der Fluoreszenzänderung F2 - F1 und/oder die Zeitkonstante der Relaxationskinetik gemessen. Dies kann mit einem einmaligen Einschalten des inhomogenen Zustands oder vorzugsweise durch ein wiederholtes Umschalten zwischen dem homogenen und dem inhomogenen Zustand erfolgen. Dieses Umschalten kann mit einer relativ hohen Wiederholfrequenz erfolgen. Die Frequenz hängt von der Diffusionsgeschwindigkeit und damit von der Größe der Partikel ab und liegt beispielsweise im Hz-Bereich. Die Detektion des Fluoreszenzsignals F mit einem auf die Wiederholfrequenz abgestimmten Log-In-Verstärker ermöglicht eine hochempfindliche Erfassung der Targetsubstanz.
• Gemäß einer Abwandlung des erfindungsgemäßen Verfahrens können in der Sensorsuspension Gruppen mit verschieden großen Trägerpartikeln enthalten sein. Verschiedene Antikörper sind an die verschieden großen Trägerpartikel angekoppelt (unmarkiert) oder frei gelöst in der Suspension enthalten (fluoreszenzmarkiert). Wenn eine Probe mit verschiedenen Targetsubstanzen getestet wird, die an die verschiedenen Antikörper anbinden, kann die Fluoreszenzdetektion für die einzelnen Targetsubstanzen separat durchgeführt werden. Hierzu werden in wiederholten Versuchen zunächst relativ kleine Feldkräfte ausgeübt, die auf die kleineren Trägerpartikel wirken und auf die größeren Trägerpartikel keinen oder einen vernachlässigbar kleinen Einfluss ausüben. Anschließend wird die Aggregatsammlung mit stärkeren Feldkräften wiederholt, die auf alle Trägerpartikel wirken, um so auch die an größere Trägerpartikel gebundenen Targetsubstanzen zu detektieren.
• Alternativ ist es auch möglich, dass die Feldkräfte so schwach gebildet sind, dass nicht eine Sammlung der Trägerpartikel, sondern eine Sammlung oder Abreicherung der frei gelösten, fluoreszenzmarkierten Antikörper in den Detektorbereichen erfolgt.
• Die Umverteilung der Trägerpartikel oder der Antikörper beim Übergang zwischen dem homogenen und dem inhomogenen Zustand kann mit verschiedenartigen physikalischen oder chemischen Feldkräften bewirkt werden, wie im Folgenden unter Bezug auf Ausführungsformen erfindungsgemäßer Detektorvorrichtungen erläutert wird.
• In Fig. 3 sind Komponenten der Detektorvorrichtung 100 gemäß Fig. 1 in schematischer Perspektivansicht gezeigt. Die Suspensionskammer 20 wird durch einen Spalt 21 gebildet, der durch plattenförmige Boden- und Deckflächen 22, 23 begrenzt wird. In den anderen Raumrichtungen sind als Begrenzungen ebenfalls plattenförmige Wände mit einem Zu- und/oder Ablauf vorgesehen, die aus Klarheitsgründen nicht dargestellt sind. Des Weiteren können zwischen den Boden- und Deckflächen 22, 23 auch Abstandshalter vorgesehen sein, mit denen die Spaltbreite eingestellt ist. Die Boden- und Deckflächen 22, 23 bestehen beispielsweise aus Kunststoff, Glas oder Halbleitermaterial. Mindestens die Deckfläche 23 ist transparent.
• Auf den Innenseiten der Boden- und Deckflächen 22, 23 sind streifenförmige Elektroden 31 angeordnet, die mit einem Hochfrequenzgenerator (nicht dargestellt) verbunden sind. Die Elektroden 31 bestehen allgemein aus einem leitfähigen, inerten Material. z. B. Platin oder Gold. Sie sind einander gegenüberliegend, übereinander angeordnet, so dass an den Boden- und Deckflächen 22, 23 jeweils ausgerichtete Streifen 41 frei bleiben, die die Begrenzungen der Detektorbereiche 40 bilden.
• Der Fluoreszenzdetektor wird beispielsweise durch ein Fluoreszenz-Auflichtmikroskop 51 gebildet, das über der transparenten Deckfläche 23 angeordnet ist. Das Fluoreszenz-Auflichtmikroskop 51 ist zur Anregung von Fluoreszenz und zur Messung der emittierten Fluoreszenz in den Detektorbereichen 40 eingerichtet (siehe Doppelpfeil). Die oberen Elektroden 31 bilden eine Maskierungseinrichtung 60, mit der die Teilbereiche der Suspensionskammer 20 zwischen den gegenüberliegenden Elektroden abgeschattet und die Detektorbereiche 40 zwischen lateral benachbarten Elektroden freigelassen werden.
• Die Breite des Spaltes zwischen den Boden- und Deckflächen 22, 23 wird je nach Größe der verwendeten Partikel gewählt und entspricht bspw. dem 5- bis 10-fachen Partikeldurchmesser. Die Ausdehnung der Boden- und Deckflächen 22, 23 liegt bspw. im cm- bis mm-Bereich. Die Breite und Anordnung der Elektrodenstreifen wird anwendungsabhängig ausgewählt. Die Breite und Abstände betragen bspw. 100 µm.
• Die Einstellung einer geeigneten Breite der Detektorbereiche 40 stellt ein wichtiges Merkmal der Erfindung dar. Um eine genügend schnelle Umverteilung der Trägerpartikel in den homogenen Zustand nach Abschalten der Feldwirkung zu erhalten, muss die Breite der Detektorbereiche 40 genügend gering sein. Für eine Umverteilung innerhalb von ungefähr 1 min liegt die Breite der Detektorbereiche 40 für Trägerpartikel mit einer Diffusionskonstante von rd. D = 10^-12 m²/s im µm-Bereich.
• Die Beschickung der Suspensionskammer 20 erfolgt mit einer der aus der Fluidik an sich bekannten Methoden durch Einspülen der Sensorsuspension oder durch Einsaugen in den Spalt 21 unter Wirkung von Kapillarkräften. Die zu untersuchende Probe kann bereits vor Beschickung der Sensorkammer 20 in der Sensorsuspension enthalten oder gesondert in die Sensorkammer 20 eingeführt werden. Die Boden- und Deckflächen 22, 23 werden beispielsweise durch Glasplatten mit der Gestalt von Deckgläsern gebildet, wie sie in der Mikroskopie verwendet werden.
• Die Fig. 4 und 5 zeigen abgewandelte Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Detektorvorrichtung. Die Unterschiede beziehen sich auf die Geometrie des Strahlengangs und die Gestaltung der Maskierungseinrichtung. Gemäß Fig. 4 sind lediglich auf der Bodenfläche 22 der Suspensionskammer 20 Elektroden 31 vorgesehen. Die Elektroden 31 werden so mit elektrischen Hochfrequenzfeldern beaufschlagt, dass sich die Konzentrationsverhältnisse zwischen freien und gebundenen fluoreszierenden Antikörpern in der Suspensionskammer 20 temporär verschieben. Die Deckfläche 23 besteht aus einem transparenten Material. Die Maskierungseinrichtung 40 (schematisch illustriert) ist im Strahlengang des Auflichtmikroskops 51 beispielsweise oberhalb des Objektivs 52 angeordnet. Die Maskierungseinrichtung ist vorzugsweise als Blende am Ort der Feldblende vor dem lichtempfindlichen Element 53 (z. B. Photomultiplier) angeordnet. Die Größe der Blendenstrukturen der Maskierungseinrichtung 40 sind so gewählt, dass die in der Abbildung der Suspensionskammer 20 freigelassenen Bildstrukturen entsprechend den Detektionsbereichen 40 eine Größe von wenigen µm aufweisen. Die Ausführungsform gemäß Fig. 5 zeichnet sich durch eine seitlich angeordnete Lichtquelle 54 aus. Das in den Detektorbereichen 40 emittierte Fluoreszenzlicht wird mit dem lichtempfindlichen Element 53 erfasst.
• Die Suspensionskammer 20 einer erfindungsgemäßen Detektorvorrichtung kann alternativ auch als Durchflusskammer gebildet sein, wie dies in Fig. 6 in schematischer Draufsicht illustriert ist. Im oberen Teilbild von Fig. 6 ist die Bodenfläche 22 mit einer mäanderförmigen Kanalstruktur 24 gezeigt, die die Suspensionskammer bildet und durch die die Sensorsuspension während der Detektion hindurchströmt (siehe gestrichelte Linie). Auf der Bodenfläche 22 ist des Weiteren eine Anordnung von zwei kammförmigen Elektroden 32, 33 vorgesehen, die seitlich als Elektrodenfinger in die mäanderförmige Kanalstruktur 24 greifen.
• Die Elektroden 33, 34 werden je nach Betriebsart der Detektorvorrichtung und Zusammensetzung der Sensorsuspension mit einer hochfrequenten Wechselspannung oder einer Gleichspannung beaufschlagt. Die hochfrequente Wechselspannung dient der dielektrophoretischen Verschiebung der Konzentrationsverhältnisse in der Suspensionskammer, insbesondere quer zur Strömungsrichtung. Analog können mit einer Anode und einer Kathode Partikel mit bspw. pH-Wert-abhängigen Nettoladung Strömungsrichtung beschleunigt oder gebremst und damit in bestimmten Teilbereichen gesammelt werden.
• Die im unteren Teilbild von Fig. 6 illustrierte Deckfläche 23 der Sensorkammer 20 ist gleichzeitig eine Maskierungseinrichtung 60. Sie enthält Blenden 61, die insbesondere in den längeren, lateralen Abschnitten der Mäanderstruktur vorbestimmte Teilbereiche verdunkeln und benachbarte Teilbereiche 62 freilassen. Unter der Wirkung der elektrischen Felder werden die ursprünglich homogen verteilten verteilten Komponenten der Sensorsuspension ausgelenkt und elektrophoretisch in die abgedunkelten oder freigelassenen Teilbereiche überführt. Die Fluoreszenzmessung erfolgt nach den oben genannten Prinzipien.
• In Fig. 7 ist eine weitere Gestaltung der Sensorkammer 20 einer erfindungsgemäßen Detektorvorrichtung illustriert. Aus Übersichtlichkeitsgründen ist lediglich die strukturierte Bodenfläche 22 der Sensorkammer 20 gezeigt. Die Bodenfläche 22 weist Vertiefungen oder Durchbrüche 25 auf, die vertikal in die Tiefe gerichtet sind. Auf der Unterseite der Bodenfläche 22 verlaufen Gräben 26, in denen Elektroden (nicht dargestellt) angeordnet sind. Die Gräben 26 können mit den Durchbrüchen 25 verbunden sein.
• Zu den Seiten ist die Suspensionskammer durch Wände (nicht dargestellt) begrenzt, von denen mindestens eine Wand zur Fluoreszenzmessung transparent ist. Die Anregung und Messung der Fluoreszenz erfolgt mit einem horizontalen Strahlengang 55, d. h. parallel zur ebenen Bodenfläche 22. Nach oben kann die Suspensionskammer offen sein.
• Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine Probe, wie z. B. ein Tropfen der zu testenden Lösung in die Suspensionskammer 20 über der Bodenfläche 22 gebracht. Beispielsweise in Pfeilrichtung 55 erfolgt eine Beleuchtung der Sensorsuspension mit der Probe. Entsprechend erfolgt auch eine laterale Fluoreszenzmessung. Zum Übergang vom homogenen zum inhomogenen Zustand der Sensorsuspension werden die Elektroden in den Gräben 26 mit Spannungen beaufschlagt, so dass die Trägerpartikel in die Vertiefungen oder Durchbrüche 25 überführt werden. Die fluoreszierenden Antikörper, die bei Anwesenheit der Targetsubstanz in der Probe mit Trägerpartikeln verbunden sind, werden der Fluoreszenzanregung entzogen. Unter der Wirkung der Feldkräfte verringert sich die Fluoreszenz. Nach Abschalten der Feldkräfte erfolgt die thermische Rückführung in den homogenen Zustand. Aus der Differenz der Fluoreszenzsignale kann die Zahl der gebildeten Aggregate ermittelt werden. Bei dieser Ausführungsform wird die Funktion einer Maskierungseinrichtung durch die Gestalt der Bodenfläche 22 erfüllt.
• Die Umverteilung der Trägerpartikel zwischen ausgeblendeten und nicht ausgeblendeten Teilbereichen unter der Wirkung von magnetischen Feldkräften ist in Fig. 8 illustriert. Von der Suspensionskammer 20 ist die Bodenfläche 22 mit kanalförmigen Vertiefungen 27 gezeigt, die analog zu dem in Fig. 7 illustrierten Prinzip ein Schattengebiet für seitliche Fluoreszenzanregung 55 bilden. Auf der Unterseite der Bodenfläche 22 ist eine schaltbare Magneteinrichtung 35, z. B. eine Spule, vorgesehen.
• Bei dieser Gestaltung enthält die Sensorsuspension als Trägerpartikel magnetische Teilchen (Magnetbeads). Bei Betätigung der Magneteinrichtung 35 werden die Trägerpartikel mit oder ohne angebundenen fluoreszierenden Antikörpern in die Kanäle, 27 gezogen. In diesen erfolgt keine Fluoreszenzanregung, so dass das Fluoreszenzsignal bei Bildung der genannten Aggregate entsprechend vermindert wird. Die Fluoreszenzmessung kann vertikal über der Bodenfläche 22 mit einem Fluoreszenz-Auflichtmikroskop 51 erfolgen. Eine gesonderte Maskierungseinrichtung ist bei dieser Gestaltung nicht erforderlich.
• Die Kanäle besitzen typischerweise eine Tiefe von wenigen µm, damit die magnetischen Trägerpartikel nach Abschalten des Magnetfeldes genügend schnell rückdiffundieren können. Zur Beschleunigung des Übergangs in die homogene Phase ist auf der Unterseite der Sensorkammer eine Rühreinrichtung 70 vorgesehen. Die Rühreinrichtung umfasst beispielsweise ein Ultraschallelement in Form einer schwingenden Plattform. Bei Betätigung des Ultraschallelements wird die Suspension verwirbelt, und dabei werden die Trägerpartikel aus den Kanälen 27 in die übrige Suspensionskammer überführt.
• Ein weiteres Beispiel mit einer Durchfluss-Sensorkammer ist in Fig. 9 gezeigt. Die Bodenfläche 22 der Sensorkammer enthält mindestens einen Kanal 28, dessen eine Hälfte 28a mit der Sensorsuspension, die insbesondere Trägerpartikel und die die Probe enthält, und dessen andere Hälfte 28b von einer Referenzlösung durchströmt wird, die keine Antikörper und keine Probe enthält. Mit Hilfe der Elektroden 36 werden Trägerpartikel in die Referenzströmung überführt, in der die Fluoreszenz lokal selektiv gemessen wird. Hierzu ist eine Maskierungseinrichtung in Form einer Blende (nicht dargestellt) vorgesehen.
• Die Erfindung kann mit den folgenden Modifikationen umgesetzt werden. Es ist möglich, die Überführung der Sensorsuspension vom inhomogenen zum homogenen Zustand unter Verwendung der Felderzeugungseinrichtung zu unterstützen, beispielsweise indem Feldwirkungen umgekehrt werden. Des Weiteren ist es möglich, anstelle einer optischen Maskierungseinrichtung eine elektronische Maskierungseinrichtung vorzusehen. Wenn als lichtempfindliches Element für die Fluoreszenzmessung eine CCD-Kamera verwendet wird, kann eine elektronische Maskierung von bestimmten Ausschnitten des CCD-Elements entsprechend den abgebildeten Detektorbereichen erfolgen. Alternativ zu den elektrischen oder magnetischen Feldwirkungen können auch hydrodynamische, optische oder chemische Kräfte wirken. Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausführung der Erfindung werden die temporären Konzentrationsverschiebungen nach einem Kühlschritt im eingefrorenen Zustand der Sensorsuspension untersucht.
• Die Erfindung kann alternativ zur Fluoreszenzmessung für ein anderes Messverfahren ausgelegt sein, wobei dann Antikörper verwendet werden, die zur Erfassung mit dem jeweiligen Messverfahren angepasst, insbesondere markiert sind.
• Die in der vorstehenden Beschreibung, den Zeichnungen und den Ansprüchen offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausgestaltungen von Bedeutung sein.

Claims (16)

1. Verfahren zur Detektion mindestens einer gesuchten Targetsubstanz, die in einer Probe enthalten ist, mit den Schritten:

- Einführung der Probe in eine Sensorsuspension (10), die in einem kräftefreien, homogenen Zustand gleichmäßig verteilt fluoreszenzmarkierte Antikörpermoleküle und unmarkierte, frei suspendierte Trägerpartikel enthält, die unmarkierte Antikörpermoleküle tragen, wobei die markierten und unmarkierten Antikörpermoleküle substanzspezifische Bindungsstellen für die Targetsubstanz besitzen,

- Fluoreszenzmessung im homogenen Zustand zur Erfassung eines ersten Fluoreszenzsignals (F1) der Sensorsuspension in mindestens einem vorbestimmten Detektorbereich (40),

- Ausübung von Kräften, unter deren Wirkung die Sensorsuspension (10) in einen inhomogenen Zustand überführt wird, in dem die Konzentration der Trägerpartikel im Detektorbereich (40) verändert ist,

- Fluoreszenzmessung im inhomogenen Zustand zur Erfassung eines zweiten Fluoreszenzsignals (F2) der Sensorsuspension (10), und

- Erfassung der Targetsubstanz in der Sensorsuspension (10), falls sich die ersten und zweiten Fluoreszenzsignale im homogenen und im inhomogenen Zustand (F1, F2) unterscheiden.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem die Trägerpartikel dielektrische oder magnetische Partikel sind und zur Veränderung der Konzentration der Trägerpartikel elektrische, optische oder magnetische Kräfte ausgeübt werden.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, bei dem die Fluoreszenzmessungen im homogenen und im inhomogenen Zustand abwechselnd mit einer vorbestimmten Wiederholfrequenz mehrfach durchgeführt werden.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, bei dem eine frequenzsensitive Fluoreszenzmessung erfolgt, deren Frequenz auf die Wiederholfrequenz der Fluoreszenzmessungen abgestimmt ist.

5. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem im Falle des Auftretens der Targetsubstanz der Zeitverlauf des Fluoreszenzsignals zwischen den Fluoreszenzsignalen (F1, F2) beim Übergang zwischen dem homogenen und dem inhomogenen Zustand erfasst wird.

6. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem in der Sensorsuspension verschiedene Arten von Trägerpartikeln enthalten sind, die selektiv durch verschiedene oder verschieden starke Feldkräfte beeinflusst werden.

7. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem zur Fluoreszenzmessung eine Maskierungseinrichtung (60) verwendet wird, die eine optische Blende oder einen elektronischen Ortsfilter umfasst.

8. Verfahren gemäß einer der vorhergehenden Ansprüche, bei dem beim Übergang vom inhomogenen zum homogenen Zustand die Sensorsuspension vermischt wird, um die Trägerpartikel gleichmäßig zu verteilen.

9. Detektorvorrichtung (100), insbesondere zur Durchführung eines Verfahrens gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, mit einer Suspensionskammer (20) zur Aufnahme einer Sensorsuspension (10), einer Felderzeugungseinrichtung (30) zur Anreicherung oder Abreicherung von Trägerpartikeln in mindestens einem vorbestimmten Detektorbereich (40) der Suspensionskammer (20) und einer Fluoreszenzdetektoreinrichtung (50) zur lokal selektiven Fluoreszenzmessung in dem mindestens einen Detektorbereich (40).

10. Detektorvorrichtung gemäß Anspruch 9, bei der die Felderzeugungseinrichtung (30) Elektroden (31, 32, 33) oder eine Magneteinrichtung (35) umfasst.

11. Detektorvorrichtung gemäß Anspruch 9 oder 10, bei der eine Maskierungseinrichtung (60) vorgesehen ist, die mit der Fluoreszenzdetektoreinrichtung (50) zur lokal selektiven Fluoreszenzmessung zusammenwirkt.

12. Detektorvorrichtung gemäß Anspruch 11, bei der die Maskierungseinrichtung (60) durch die Elektroden der Felderzeugungseinrichtung (30) gebildet wird.

13. Detektorvorrichtung gemäß Anspruch 12, bei der die Maskierungseinrichtung durch eine Blende in der Fluoreszenzdetektoreinrichtung (50) gebildet wird.

14. Detektorvorrichtung gemäß Anspruch 13, bei der die Maskierungseinrichtung (60) durch einen elektronischen Ortsfilter gebildet wird, der mit der Fluoreszenzdetektoreinrichtung (50) zusammenwirkt.

15. Detektorvorrichtung gemäß Anspruch 9, bei der die Suspensionskammer eine Durchflusskammer mit mindestens einem Kanal (28) bildet, wobei der mindestens eine Detektorbereich (40) in Teilbereichen des Kanals vorgesehen ist.

16. Detektorvorrichtung gemäß Anspruch 9, bei der die Suspensionskammer (20) eine Bodenfläche (22) mit einer Strukturierung aufweist, die Funktion der Maskierungseinrichtung erfüllt.