DE102024203938A1

DE102024203938A1 - Method for performing nucleic acid amplification using a microfluidic device, in particular for the detection of pathogens

Info

Publication number: DE102024203938A1
Application number: DE102024203938.1A
Authority: DE
Inventors: Stefan Kulick; Anna-Lina Hahn; Katharina Frenzel; Viktoria Oelkrug
Original assignee: Robert Bosch GmbH
Current assignee: Robert Bosch GmbH
Priority date: 2024-04-26
Filing date: 2024-04-26
Publication date: 2025-10-30
Also published as: WO2025223951A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren (500) zur Durchführung einer Nukleinsäureamplifikation, insbesondere einer isothermalen Nukleinsäureamplifikation, mit einer mikrofluidischen Vorrichtung (100), insbesondere unter Ausnutzung einer PCR-Architektur (101, 102).The invention relates to a method (500) for carrying out nucleic acid amplification, in particular isothermal nucleic acid amplification, with a microfluidic device (100), in particular utilizing a PCR architecture (101, 102).

Description

Stand der TechnikState of the art

Der Nachweis von Krankheitserregern in einer biologischen Probe kann über einen Nachweis von Teilen der Nukleinsäuren dieser Krankheitserreger in der Probe geführt werden, wobei über eine Nukleinsäureamplifikation, bei welcher Nukleinsäuren abschnittsweise vervielfältigt werden, gezielt nach diesen Teilen gesucht wird. Der Einsatz solcher Verfahren am Point-of-Care und als patientennahe Sofortdiagnostik kann mit mikrofluidischen Systemen umgesetzt werden, wobei eine Patientenprobe in eine mikrofluidische Kartusche eingegeben und die Kartusche in einem Analysegerät für die Durchführung der Nukleinsäureamplifikation im Inneren der Kartusche angesteuert wird.The detection of pathogens in a biological sample can be achieved by identifying fragments of the pathogens' nucleic acids within the sample. This is done using nucleic acid amplification, a process in which nucleic acids are amplified section by section, to specifically search for these fragments. Such methods can be implemented at the point of care and as immediate, near-patient diagnostics using microfluidic systems. In this process, a patient sample is introduced into a microfluidic cartridge, which is then activated within an analyzer to perform nucleic acid amplification inside the cartridge.

Als Methoden zur Nukleinsäureamplifikation kommen dabei insbesondere die Polymerase-Kettenreaktion mit ihrer zwei- oder dreistufigen Temperaturzyklierung oder isothermale Amplifikationsreaktionen mit einer Nukleinsäureamplifikation auf nur einem Temperaturniveau zum Einsatz. Die Übertragung der Arbeitsabläufe (workflows) von solch grundsätzlich bekannten Methoden aus dem makroskopischen Labor in ein integriertes mikrofluidisches System erfordert dabei eine innovative Implementierung.Methods used for nucleic acid amplification include, in particular, the polymerase chain reaction with its two- or three-stage temperature cycling, or isothermal amplification reactions with nucleic acid amplification at only one temperature level. Transferring the workflows of such fundamentally well-known methods from the macroscopic laboratory to an integrated microfluidic system requires an innovative implementation.

Offenbarung der ErfindungDisclosure of the invention

Vorteile der ErfindungAdvantages of the invention

Vor diesem Hintergrund betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Durchführung einer Nukleinsäureamplifikation mit einer mikrofluidischen Vorrichtung sowie eine für das Verfahren eingerichtete Vorrichtung. Solch eine Vorrichtung kann insbesondere als mikrofluidische Kartusche ausgebildet sein, welche mit einem Analysegerät prozessiert werden kann, beispielsweise basierend auf einer Kartusche und einem Analysegerät wie in den Dokumenten DE 10 2016 222 075 A1 und DE 10 2016 222 072 A1 beschrieben. Gegenstand der Erfindung ist somit auch ein mikrofluidisches System mit einer solchen Kartusche und einem solchen Analysegerät.Against this background, the invention relates to a method for carrying out nucleic acid amplification with a microfluidic device and a device configured for the method. Such a device can in particular be configured as a microfluidic cartridge which can be processed with an analyzer, for example based on a cartridge and an analyzer as described in the documents. DE 10 2016 222 075 A1 and DE 10 2016 222 072 A1 described. The invention therefore also relates to a microfluidic system with such a cartridge and such an analysis device.

Unter einer Nukleinsäureamplifikation ist ein Verfahren zur Vervielfältigung von Abschnitten von Nukleinsäuren zu verstehen, insbesondere eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) oder eine isothermale Amplifikation.Nucleic acid amplification is a method for multiplying sections of nucleic acids, in particular a polymerase chain reaction (PCR) or isothermal amplification.

Bei dem vorgestellten Verfahren wird zunächst eine Probe in die mikrofluidische Vorrichtung aufgenommen, beispielsweise durch Eingabe der Probe in eine Eingabekammer der Vorrichtung.In the presented method, a sample is first taken into the microfluidic device, for example by introducing the sample into an input chamber of the device.

Bei der Probe handelt es sich insbesondere um eine biologische Probe mit darin enthaltenen Nukleinsäuren, also eine Probe von einem Lebewesen, insbesondere umfassend eine Körperflüssigkeit oder ein Teil eines Körpergewebes, beispielsweise Blut, Sputum, Urin oder einen Abstrich. Vorzugsweise wird das Verfahren eingesetzt, um einen Mikroorganismus, insbesondere einen Krankheitserreger, wie Bakterien, Viren oder Pilze, in der Probe nachzuweisen. Die Probe ist nach der Abnahme in ein Medium zum Transport vom Lebewesen bis zur Analyse, also bis zur mikrofluidischen Vorrichtung, aufgenommen. Dieses Transportmedium, beispielsweise Copan eNAT™, kann lysierende Substanzen enthalten, welche die in der Probe enthaltenen biologischen Zellen lysieren und dabei die in den Zellen befindlichen Nukleinsäuren freisetzen.The sample is, in particular, a biological sample containing nucleic acids, i.e., a sample from a living organism, especially comprising a body fluid or a part of body tissue, for example, blood, sputum, urine, or a swab. The method is preferably used to detect a microorganism, especially a pathogen such as bacteria, viruses, or fungi, in the sample. After collection, the sample is placed in a medium for transport from the living organism to the analysis, i.e., to the microfluidic device. This transport medium, for example, Copan eNAT™, may contain lyses that lyse the biological cells contained in the sample, thereby releasing the nucleic acids within the cells.

Nach der Aufnahme kann die Probe vorzugsweise zunächst aufgereinigt werden, wobei die Aufreinigung insbesondere eine Aufreinigung der in der Probe enthaltenen und für die Amplifikation vorgesehenen Nukleinsäuren umfasst, vorzugsweise eine Aufreinigung der Nukleinsäure über eine Festphase der Vorrichtung. Dabei werden die Nukleinsäuren aus der Probe durch Bindung an die Festphase, insbesondere an einen Filter, vom Rest der Probe abgesondert und anschließend, vorzugsweise nach einer Entfernung von Probenresten mit einem Waschmedium, wieder von der Festphase gelöst, um insbesondere mit einem für das Lösen verwendeten Elutionspuffer einen Teil der aufgereinigten Probe zu bilden.After sampling, the sample can preferably first be purified, wherein the purification particularly comprises the purification of the nucleic acids contained in the sample and intended for amplification, preferably the purification of the nucleic acid via a solid phase of the apparatus. In this process, the nucleic acids are separated from the rest of the sample by binding to the solid phase, in particular to a filter, and subsequently, preferably after removal of sample residues with a washing medium, dissolved again from the solid phase to form a portion of the purified sample, particularly with an elution buffer used for dissolution.

Es erfolgt dann ein Vermischen mit für die Nukleinsäureamplifikation spezifischen Reagenzien, wobei das daraus entstehende Gemisch im Folgenden als erste vermischte Probe bezeichnet wird. Bei den spezifischen Reagenzien handelt es sich insbesondere um Reagenzien, welche für die Vervielfältigung der ein oder mehreren zu vervielfältigenden Abschnitte der Nukleinsäuren spezifisch sind, beispielsweise Primer oder Hilfsprimer. Je nach zu vervielfältigendem Nukleinsäureabschnitt können sich diese Reagenzien, insbesondere die Primer, unterscheiden. Die spezifischen Reagenzien sind vorzugsweise in der mikrofluidischen Vorrichtung vorgelagert und können vor dem Vermischen in getrockneter, insbesondere lyophilisierter Form vorliegen, insbesondere als Teil eines insbesondere lyophilisierten Beads, welches im Weiteren als nachweisspezifisches Bead oder Primer-Bead bezeichnet wird. Unter einem Bead ist dabei insbesondere ein in der Mikrofluidik üblicherweise verwendeter getrockneter, insbesondere gefriergetrockneter, Feststoff in Kugelform zu verstehen. Alternativ können die spezifischen Reagenzien auch in flüssiger Form vorgelagert sein, beispielsweise in wässriger Lösung. Die spezifischen Reagenzien können insbesondere in einer Kammer vorgelagert sein, im Weiteren als erste Beadkammer bezeichnet. Das Primer-Bead kann je nach Anwendungsfall zusätzlich auch weitere unspezifische Reagenzien umfassen. Die Rehydrierung der getrockneten spezifischen Reagenzien erfolgt dabei bevorzugt durch das Vermischen mit der Probe. Für eine Verdünnung der Reagenzien oder der Probe, vor oder nach dem Rehydrieren der Reagenzien, oder auch alternativ zur Rehydrierung durch die Probe kann weitere Flüssigkeit, insbesondere ein Puffer wie beispielsweise in der Vorrichtung vorgelagerter Elutionspuffer, hinzugegeben werden.The sample is then mixed with reagents specific for nucleic acid amplification, and the resulting mixture is hereinafter referred to as the first mixed sample. The specific reagents are, in particular, reagents that are specific for amplifying the one or more nucleic acid segments to be amplified, for example, primers or auxiliary primers. Depending on the nucleic acid segment to be amplified, these reagents, especially the primers, may differ. The specific reagents are preferably placed upstream in the microfluidic apparatus and may be present in dried, in particular lyophilized, form before mixing, especially as part of a bead, which is hereinafter referred to as the detection-specific bead or primer bead. A bead is understood to be, in particular, a dried, in particular freeze-dried, solid in spherical form commonly used in microfluidics. Alternatively, the specific reagents may also be placed upstream in liquid form, for example, in aqueous solution. The specific reagents can be located in a chamber upstream, in the This is further referred to as the first bead chamber. Depending on the application, the primer bead may also include other non-specific reagents. The rehydration of the dried specific reagents is preferably carried out by mixing them with the sample. To dilute the reagents or the sample, before or after rehydration of the reagents, or alternatively to rehydration by the sample, additional liquid, in particular a buffer such as an elution buffer placed upstream in the apparatus, can be added.

In der ersten vermischte Probe enthaltene Nukleinsäuren werden anschließend denaturiert, wobei es sich bei diesen Nukleinsäuren insbesondere um in den zugegebenen spezifischen Reagenzien enthaltene Oligonukleotide, insbesondere Primer, und/oder um Nukleinsäuren aus der aufgenommenen Probe, also Nukleinsäuren von dem Lebewesen handeln kann. Das Denaturieren kann dabei über eine Erwärmung zumindest eines Teils der ersten vermischten Probe auf eine Temperatur höher als 90 °C, bevorzugt höher als 92 °C, ganz bevorzugt höher als 95 °C, beispielsweise 98 °C erfolgen. Aufgrund der Denaturierung werden vorzugsweise nur solche Reagenzien im nachweisspezifischen Bead untergebracht, welche durch die Denaturierung, insbesondere über eine Erwärmung, nicht substantiell beeinträchtigt oder beschädigt werden oder bei welchen ein teilweiser Verlust hinnehmbar ist. Die Denaturierung erfolgt dabei in einem Denaturierungsbereich der mikrofluidischen Vorrichtung, vorzugsweise umfassend ein oder mehrere Denaturierungskammern.The nucleic acids contained in the first mixed sample are subsequently denatured. These nucleic acids can be, in particular, oligonucleotides contained in the added specific reagents, especially primers, and/or nucleic acids from the sample itself, i.e., nucleic acids from the organism. Denaturation can be achieved by heating at least a portion of the first mixed sample to a temperature higher than 90 °C, preferably higher than 92 °C, and most preferably higher than 95 °C, for example, 98 °C. Due to the denaturation process, preferably only those reagents are included in the detection-specific bead that are not substantially affected or damaged by the denaturation, particularly by heating, or for which partial loss is acceptable. The denaturation takes place in a denaturation zone of the microfluidic device, preferably comprising one or more denaturation chambers.

Gemäß besonderer Ausgestaltung bildet der Denaturierungsbereich einen Teil eines ersten PCR-Bereichs der Vorrichtung, also einen Bereich, insbesondere umfassend Kammern, zur Durchführung einer PCR. Dadurch können vorteilhafterweise ein oder mehrere Kammern des PCR-Bereichs für die Denaturierung gemäß dem Verfahren eingesetzt werden, also als Denaturierungskammern. Im Falle einer isothermalen Amplifikation kann somit vorteilhafterweise eine PCR-Architektur der mikrofluidischen Vorrichtung, insbesondere ein PCR-Strang, teilweise für die Denaturierung von in der ersten vermischten Probe enthaltenen Nukleinsäuren, quasi zweckentfremdet, verwendet werden. Unter einem PCR-Strang sind dabei insbesondere zwei oder drei fluidisch in Serie geschaltete Kammern zur Durchführung einer Shuttle-PCR zu verstehen, also einer PCR, bei welcher die zu amplifizierende Probe zwischen den zwei bzw. drei Kammern, welche sich gemäß einem PCR-Zyklus auf unterschiedlichen Temperaturen befinden, wiederholt hin- und herbewegt werden. Das Denaturieren kann dabei insbesondere in einer oder mehreren Kammern eines ersten PCR-Strangs der mikrofluidischen Vorrichtung erfolgen, wobei eine dieser Kammern vorzugsweise für eine Denaturierung bei einer PCR vorgesehen ist, beispielsweise durch eine Anordnung eines Heizers im Analysegerät zur Erwärmung dieser Kammer auf eine Denaturierungstemperatur von zum Beispiel 99 °C. Die oben beschriebene erste Beadkammer kann gemäß bevorzugter Ausgestaltung im ersten PCR-Bereich angeordnet sein und vorzugsweise mit zumindest einer der Kammern des PCR-Strangs des ersten PCR-Bereichs über einen Kanal fluidisch direkt verbunden sein, beispielsweise abtrennbar über ein Ventil.According to a particular embodiment, the denaturation section forms part of a first PCR section of the device, i.e., a section, in particular comprising chambers, for carrying out a PCR. This advantageously allows one or more chambers of the PCR section to be used for denaturation according to the method, i.e., as denaturation chambers. In the case of isothermal amplification, a PCR architecture of the microfluidic device, in particular a PCR strand, can thus be advantageously used, in a sense, for the denaturation of nucleic acids contained in the first mixed sample. A PCR strand is understood to mean, in particular, two or three fluidically connected chambers for carrying out a shuttle PCR, i.e., a PCR in which the sample to be amplified is repeatedly moved back and forth between the two or three chambers, which are located at different temperatures according to a PCR cycle. The denaturation can take place, in particular, in one or more chambers of a first PCR strand of the microfluidic device, wherein one of these chambers is preferably provided for denaturation during PCR, for example by an arrangement of a heater in the analyzer to heat this chamber to a denaturation temperature of, for example, 99 °C. According to a preferred embodiment, the first bead chamber described above can be arranged in the first PCR region and is preferably directly fluidically connected to at least one of the chambers of the PCR strand of the first PCR region via a channel, for example, separable via a valve.

Nach der Denaturierung erfolgt eine Vermischung der denaturierten Probe mit für die Art der Nukleinsäureamplifikation relevanten Reagenzien, welche im Weiteren als verfahrensspezifische Reagenzien bezeichnet werden, wobei das daraus entstehende Gemisch im Weiteren als zweite vermischte Probe bezeichnet wird. Bei den verfahrensspezifischen Reagenzien handelt es sich insbesondere um für die Nukleinsäureamplifikation benötigte Reagenzien, welche bevorzugt unabhängig von der Wahl der zu vervielfältigenden Nukleinsäureabschnitten sind und sich insbesondere abhängig von der Art oder dem Typ der Nukleinsäureamplifikation unterscheiden können. Beispielsweise kann es sich bei den verfahrensspezifischen Reagenzien um für die jeweilige Reaktionsart oder Amplifikationsart übliche Reagenzien wie Polymerasen, Desoxyribonukleosidtriphosphate (dNTPs), Sonden, Reaktionspuffer, weitere Enzyme oder Zusatzstoffe handeln. Umfasst das Verfahren eine isothermale Amplifikation, so kann sich unter den verfahrensspezifischen Reagenzien beispielsweise eine strangverdrängende Polymerase, Hilfsenzyme wie zum Beispiel reverse Transkriptasen, Endonukleasen wie Restriktions- oder Nicking Enzyme, Helicasen, Rekombinasen, Einzelstrang-bindende Proteine, Ligasen oder weitere Stoffe befinden. Wird hingegen ein klassische PCR durchgeführt, kann stattdessen beispielsweise eine Taq-Polymerase als verfahrensspezifisches Reagenz vorliegen, wobei die Taq-Polymerase oder andere thermostabile Polymerasen aufgrund Ihrer Hitzebeständigkeit alternativ als Teil der oben beschriebenen spezifischen Reagenzien und insbesondere im nachweisspezifischen Bead vorliegen können.Following denaturation, the denatured sample is mixed with reagents relevant to the specific type of nucleic acid amplification. These reagents are hereinafter referred to as process-specific reagents, and the resulting mixture is referred to as the second mixed sample. The process-specific reagents are primarily those required for nucleic acid amplification. These reagents are preferably independent of the choice of nucleic acid segments to be amplified and may differ depending on the type of nucleic acid amplification. For example, the process-specific reagents may include reagents commonly used for the respective reaction or amplification method, such as polymerases, deoxyribonucleoside triphosphates (dNTPs), probes, reaction buffers, other enzymes, or additives. If the method involves isothermal amplification, the method-specific reagents may include, for example, a strand-displacing polymerase, auxiliary enzymes such as reverse transcriptases, endonucleases such as restriction or nicking enzymes, helicases, recombinases, single-strand binding proteins, ligases, or other substances. If, on the other hand, a classical PCR is performed, a Taq polymerase, for example, may be used as the method-specific reagent. Due to their heat resistance, Taq polymerase or other thermostable polymerases may alternatively be included as part of the specific reagents described above, and particularly in the detection-specific bead.

Die verfahrensspezifischen Reagenzien können vor dem Vermischen in getrockneter, insbesondere lyophilisierter Form vorliegen, insbesondere als Teil eines insbesondere lyophilisierten Beads, welches im Weiteren als verfahrensspezifisches Bead oder Enzym-Bead bezeichnet wird. Alternativ können die verfahrensspezifischen Reagenzien auch in flüssiger Form vorgelagert sein, beispielsweise in wässriger Lösung. Die verfahrensspezifischen Reagenzien können insbesondere in einer Kammer vorgelagert sein, im Weiteren als zweite Beadkammer bezeichnet. Gemäß bevorzugter Ausgestaltung sind die verfahrensspezifischen Reagenzien in einem zweiten PCR-Bereich der Vorrichtung angeordnet. Insbesondere kann die zweite Beadkammer in dem zweiten PCR-Bereich angeordnet sein. Die zweite Beadkammer kann vorzugsweise mit zumindest einer der Kammern eines PCR-Strangs des zweiten PCR-Bereichs über einen Kanal fluidisch direkt verbunden sein, beispielsweise abtrennbar über ein Ventil. Die spezifischen Reagenzien und die verfahrensspezifischen Reagenzien sind somit separat in der mikrofluidischen Vorrichtung angeordnet oder vorgelagert, insbesondere die spezifischen Reagenzien als Primer-Bead in der ersten Beadkammer und die verfahrensspezifischen Reagenzien als Enzym-Bead in der zweiten Beadkammer. Das Enzym-Bead kann je nach Anwendungsfall zusätzlich auch weitere Reagenzien umfassen. Die Rehydrierung der getrockneten verfahrensspezifischen Reagenzien erfolgt dabei bevorzugt durch das Vermischen mit der denaturierten Probe. Für eine Verdünnung der Reagenzien oder der Probe, vor oder nach dem Rehydrieren der Reagenzien, oder auch alternativ zur Rehydrierung durch die Probe kann weitere Flüssigkeit, insbesondere ein Puffer wie beispielsweise in der Vorrichtung vorgelagerter Elutionspuffer, hinzugegeben werden.The process-specific reagents can be present in dried, particularly lyophilized, form prior to mixing, especially as part of a lyophilized bead, which is hereinafter referred to as a process-specific bead or enzyme bead. Alternatively, the process-specific reagents can also be present in liquid form, for example, in an aqueous solution. The process-specific reagents can be present in a separate chamber, hereinafter referred to as a second bead chamber. In a preferred embodiment, the process-specific reagents are arranged in a second PCR compartment of the device. In particular, the second bead chamber can be located in this second PCR compartment. The second bead chamber can preferably be directly connected fluidically to at least one of the chambers of a PCR strand of the second PCR compartment via a channel, for example, via a valve. The specific reagents and the process-specific reagents are thus arranged separately in or upstream of the microfluidic device, in particular the specific reagents as primer beads in the first bead chamber and the process-specific reagents as enzyme beads in the second bead chamber. Depending on the application, the enzyme bead can also include additional reagents. The rehydration of the dried process-specific reagents is preferably carried out by mixing them with the denatured sample. To dilute the reagents or the sample, before or after rehydrating the reagents, or alternatively to rehydration by the sample, additional liquid, in particular a buffer such as an elution buffer placed upstream in the apparatus, can be added.

Die die lokale Trennung der spezifischen Reagenzien und der verfahrensspezifischen Reagenzien unterstützt vorteilhafterweise auch eine thermische Trennung der Orte ihrer Vorlagerung. Somit kann auch die jeweilige Prozessierung dieser Reagenzien, also die Denaturierung bzw. die Amplifikationsreaktion, insbesondere nach einer Rehydrierung der Reagenzien, direkt am oder nahe, insbesondere benachbart zum Ort der jeweiligen Vorlagerung erfolgen, so dass vorteilhafterweise Transportzeiten und Transportverluste zwischen Vermischung mit den Reagenzien und Prozessierung reduziert oder ganz vermieden werden können. Gemäß bevorzugter Ausgestaltung sind dazu der Denaturierungsbereich, insbesondere die Denaturierungskammer, und die verfahrensspezifischen Reagenzien, insbesondere die zweite Beadkammer, in der Vorrichtung zueinander so angeordnet sind, dass eine Erwärmung des Denaturierungsbereichs von einer ersten Ausgangstemperatur auf eine Denaturierungstemperatur während einer Denaturierungszeit die verfahrensspezifischen Reagenzien, insbesondere die zweite Beadkammer ausgehend von einer zweiten Ausgangstemperatur nicht höher als eine Maximaltemperatur erhöht. Dies hat den Vorteil, dass die verfahrensspezifischen Reagenzien durch die Erwärmung bei der Denaturierung nicht oder nur unwesentlich tangiert werden. Die Denaturierungstemperatur beträgt dabei insbesondere 92 °C, bevorzugt 95° °C, ganz bevorzugt 99 °C, wobei die Denaturierungszeit 2 Minuten, bevorzugt 5 Minuten, ganz bevorzugt 10 Minuten beträgt. Die Maximaltemperatur kann beispielsweise 70 °C, bevorzugt 60 °C, ganz bevorzugt 50 °C sein, während die erste und/oder die zweite Ausgangstemperatur zum Beispiel 20 °C, bevorzugt 30 °C, ganz bevorzugt 40 °C betragen können.The local separation of the specific reagents and the process-specific reagents advantageously also supports thermal separation of their upstream storage locations. Thus, the respective processing of these reagents, i.e., the denaturation or amplification reaction, particularly after rehydration of the reagents, can take place directly at or near, and especially adjacent to, the respective upstream storage location. This advantageously reduces or completely eliminates transport times and losses between mixing with the reagents and processing. According to a preferred embodiment, the denaturation area, particularly the denaturation chamber, and the process-specific reagents, particularly the second bead chamber, are arranged in the apparatus such that heating the denaturation area from a first initial temperature to a denaturation temperature during a denaturation period does not raise the process-specific reagents, particularly the second bead chamber, from a second initial temperature above a maximum temperature. This has the advantage that the process-specific reagents are not affected, or only minimally affected, by the heating during denaturation. The denaturation temperature is particularly 92 °C, preferably 95 °C, and most preferably 99 °C, with a denaturation time of 2 minutes, preferably 5 minutes, and most preferably 10 minutes. The maximum temperature can be, for example, 70 °C, preferably 60 °C, and most preferably 50 °C, while the first and/or second initial temperature can be, for example, 20 °C, preferably 30 °C, and most preferably 40 °C.

Die zweite vermischte Probe oder ein Teil davon kann dann für das Durchführen der Nukleinsäureamplifikation in einem Amplifikationsbereich, insbesondere in mindestens einer Amplifikationskammer, der mikrofluidischen Vorrichtung verwendet werden.The second mixed sample, or a part thereof, can then be used to carry out nucleic acid amplification in an amplification area, in particular in at least one amplification chamber, of the microfluidic device.

Die Nukleinsäureamplifikation kann insbesondere eine isothermale Amplifikation von in der zweiten vermischten Proben enthaltenen Nukleinsäureabschnitten umfassen. Gemäß bevorzugter Ausgestaltung kann vorteilhafterweise eine bereits vorhandene PCR-Architektur der mikrofluidischen Vorrichtung, quasi zweckentfremdet, für die isothermale Amplifikation verwendet werden. Insbesondere eine oder mehrere Kammern eines PCR-Strang können dabei als Amplifikationskammern dienen, insbesondere eine Architektur für, insbesondere quantitative, Echtzeit-PCR mit einer Echtzeit-Auslese einer der PCR-Kammern, beispielsweise über Fluoreszenzstrahlung. Bei Verwendung mehrere Amplifikationskammern kann zumindest ein Teil der zweiten vermischten Probe zwischen einer ersten Amplifikationskammer und einer zweiten Amplifikationskammer der Vorrichtung wiederholt hin und her bewegt werden, insbesondere um während der Amplifikation eine optische Auslese des Teils aus der zweiten Amplifikationskammer zu ermöglichen oder durchzuführen. Dies ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn die erste Kammer von mehreren Seiten, insbesondere von zwei gegenüberliegenden Seiten, beheizt werden kann, während die zweite Kammer zumindest von einer Seite für die Auslese optisch einsehbar ist, insbesondere durch eine transparente Wand der Kammer.Nucleic acid amplification can, in particular, comprise isothermal amplification of nucleic acid fragments contained in the second mixed sample. According to a preferred embodiment, an existing PCR architecture of the microfluidic device can advantageously be repurposed for isothermal amplification. In particular, one or more chambers of a PCR strand can serve as amplification chambers, especially an architecture for, in particular quantitative, real-time PCR with real-time readout of one of the PCR chambers, for example, via fluorescence radiation. When using multiple amplification chambers, at least a portion of the second mixed sample can be repeatedly moved back and forth between a first amplification chamber and a second amplification chamber of the device, in particular to enable or perform optical readout of the portion from the second amplification chamber during amplification. This is particularly advantageous if the first chamber can be heated from several sides, especially from two opposite sides, while the second chamber is at least visible from one side for selection, especially through a transparent wall of the chamber.

Kurze Beschreibung der ZeichnungenShort description of the drawings

Ausführungsbeispiele der Erfindung sind in den Zeichnungen schematisch dargestellt und in der nachfolgenden Beschreibung näher erläutert. Für die in den verschiedenen Figuren dargestellten und ähnlich wirkenden Elemente werden gleiche Bezugszeichen verwendet, wobei auf eine wiederholte Beschreibung der Elemente verzichtet wird.Exemplary embodiments of the invention are shown schematically in the drawings and explained in more detail in the following description. The same reference numerals are used for the elements shown in the various figures that have a similar effect, thus omitting a repeated description of the elements.

Es zeigen

1 ein Flussdiagramm eines Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Verfahrens,
2 ein Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen mikrofluidischen Vorrichtung und
3a-c schematische Momentaufnahmen der in 2 gezeigten mikrofluidischen Vorrichtung zu drei Zeitpunkten während der Durchführung des Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Verfahrens.

They show

1 a flowchart of an embodiment of the method according to the invention,
2 an embodiment of the microfluidic device according to the invention and
3a -c schematic snapshots of the in 2 shown microfluidic device at three points in time during the execution of the exemplary embodiment of the method according to the invention.

Ausführungsformen der ErfindungEmbodiments of the invention

1 zeigt ein Flussdiagramm zu einem nachfolgende beschriebenen Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens 500, welche insbesondere mit einem in 2 schematisch gezeigten Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen mikrofluidischen Vorrichtung 100 durchgeführt werden kann. 1 shows a flowchart for a subsequently described embodiment of the inventive method 500, which in particular is equipped with a 2 The schematically shown embodiment of the microfluidic device 100 according to the invention can be carried out.

Bei der mikrofluidischen Vorrichtung 100 handelt es sich insbesondere um eine mikrofluidische Kartusche 100, welche mit einem (nicht dargestellten) Analysegerät prozessiert werden kann, wie beispielsweise in den Dokumenten DE 10 2016 222 075 A1 und DE 10 2016 222 072 A1 beschrieben, ohne die Erfindung darauf grundsätzlich einzuschränken. Die schematische Darstellung der mikrofluidischen Vorrichtung 100 zeigt insbesondere und nicht erschöpfend einige beispielhafte Kammern der Vorrichtung, wobei diese Kammern durch fluidische Kanäle teilweise miteinander verbunden sind und durch (nicht dargestellte) Ventile, beispielsweise Membranventile, auch zeitweise voneinander getrennt werden können. Die Kartusche kann einen Schichtaufbau mit mehreren Schichten oder Lagen aufweisen, beispielsweise aus Polycarbonat, insbesondere eine fluidische Schicht, in welcher sich die Kammern und Kanäle für die Prozessierung der Probe befinden, und eine pneumatische Schicht mit Kanälen und Kammern sowie pneumatischen Anschlüssen zum Analysegerät. Durch Anliegen von Unterdruck oder Überdrück an die pneumatischen Anschlüsse kann eine zwischen der pneumatischen und der fluidischen Schicht befindliche Membran, beispielsweise umfassend thermoplastisches Polyurethan (TPU), teilweise in Ausnehmungen, insbesondere Kammern oder Kanäle, der fluidischen und pneumatischen Schicht bewegt werden, um die Funktionen von Pumpkammern und Membranventilen zu realisieren.The microfluidic device 100 is in particular a microfluidic cartridge 100 which can be processed with an (not shown) analytical device, as described in the documents. DE 10 2016 222 075 A1 and DE 10 2016 222 072 A1 The invention is described without fundamentally limiting it thereto. The schematic representation of the microfluidic device 100 shows, in particular but not exhaustively, some exemplary chambers of the device, wherein these chambers are partially interconnected by fluidic channels and can also be temporarily separated from one another by valves (not shown), for example, diaphragm valves. The cartridge can have a layered structure with several layers, for example, made of polycarbonate, in particular a fluidic layer in which the chambers and channels for processing the sample are located, and a pneumatic layer with channels and chambers as well as pneumatic connections to the analyzer. By applying negative or positive pressure to the pneumatic connections, a diaphragm located between the pneumatic and the fluidic layer, for example comprising thermoplastic polyurethane (TPU), can be moved partially in recesses, in particular chambers or channels, of the fluidic and pneumatic layers in order to realize the functions of pump chambers and diaphragm valves.

In einem ersten Schritt 501 wird die Probe, beispielsweise umfassend 300 Mikroliter (µl), in eine Eingabekammer 105 der Kartusche 100 aufgenommen. Bei der Probe handelt es sich um eine biologische Probe mit darin enthaltenen Nukleinsäuren, beispielsweise ein Abstrich oder eine Körperflüssigkeit wie Blut oder Sputum eines Säugetiers, insbesondere eines Menschen. Die Probe ist beispielsweise bereits mit einem lysierenden Transportmedium, zum Beispiel COPAN eNAT™, vermischt, welche die Zellen in der Probe lysieren und dabei die in den Zellen befindlichen Nukleinsäuren freisetzen.In a first step 501, the sample, for example comprising 300 microliters (µl), is drawn into an input chamber 105 of the cartridge 100. The sample is a biological sample containing nucleic acids, for example a swab or body fluid such as blood or sputum from a mammal, particularly a human. The sample is already mixed with a lyse medium, for example COPAN eNAT™, which lyses the cells in the sample and thereby releases the nucleic acids contained within the cells.

In einem zweiten Schritt 502 erfolgt eine Aufreinigung der Probe. Dabei kann die Probe für eine noch gründlichere Lyse zunächst einem weiteren Lyseschritt unterzogen werden, beispielsweise über Ultraschall. Dazu weist das Analysegerät vorzugsweise eine Ultraschallquelle auf, welche nahe der Eingabekammer 105 der im Analysegerät aufgenommenen Kartusche angeordnet ist. Im Zuge der Aufreinigung, beispielsweise gemäß dem bekannten Bind-Wash-Elute-Verfahren, kann die Probe mit einem Bindepuffer vermischt werden, welcher vorzugsweise auf der Kartusche vorgelagert ist, beispielsweise in einem Reagenzienriegel in einer ersten Reagenzienkammer 131, um bei nachfolgender Spülung der Probe über einen Filter (nicht dargestellt) in einer Filterkammer 106 die Nukleinsäuren an den Filter zu binden. Nach einem Waschen der gebundenen Nukleinsäuren, beispielsweise mit einem in einer zweiten Reagenzienkammer 132 vorgelagerten Waschpuffer, werden die Nukleinsäuren mit einem vorzugsweise in einer dritten Reagenzienkammer 133 vorgelagerten Elutionspuffer wieder vom Filter gelöst, wobei dieses Eluat, welches beispielsweise 60 µl umfassen kann, im Weiteren auch als aufgereinigte Probe bezeichnet wird. Ein erster Teil dieses Eluats, welcher als erster über den Filter geführt wurde, beispielsweise 20 µl, kann dabei verworfen werden, also für das Verfahren unberücksichtigt bleiben, da dieser erste Teil noch den größten Anteil von vom Filter zurückgehaltenen Waschpuffer enthalten kann.In a second step 502, the sample is purified. For even more thorough lysis, the sample can first undergo a further lysis step, for example, using ultrasound. For this purpose, the analyzer preferably has an ultrasound source located near the input chamber 105 of the cartridge housed in the analyzer. During the purification process, for example according to the known bind-wash-elute method, the sample can be mixed with a binding buffer, which is preferably located upstream of the cartridge, for example in a reagent bar in a first reagent chamber 131, so that during subsequent rinsing of the sample through a filter (not shown) in a filter chamber 106, the nucleic acids bind to the filter. After washing the bound nucleic acids, for example with a washing buffer placed upstream in a second reagent chamber 132, the nucleic acids are released from the filter again with an elution buffer preferably placed upstream in a third reagent chamber 133. This eluate, which may comprise, for example, 60 µl, is hereinafter also referred to as the purified sample. A first portion of this eluate, which was the first to pass through the filter, for example 20 µl, can be discarded and thus disregarded for the process, since this first portion may still contain the largest proportion of washing buffer retained by the filter.

Die Kartusche kann zwei PCR-Stränge in zwei PCR-Bereichen 101, 102 aufweisen, wobei jeder PCR-Stränge mehrere fluidisch in Serie angeordnete Kammern umfassen kann. Wie in 2 dargestellt, kann jeder PCR-Strang jeweils drei in Serie geschaltete Kammern 111, 112, 113, 121, 122, 123 aufweisen, um insbesondere zwei unabhängige PCR-Reaktionen mit jeweils drei Temperaturbereichen durchführen zu können. Beispielsweise haben diese Kammern 111, 112, 113, 121, 122, 123 jeweils eine Volumen von 20 µl. Das Verfahren ist jedoch nicht auf eine solche Architektur beschränkt, insbesondere nicht bei Durchführung einer isothermalen Amplifikation. Hingegen kann bei Durchführung einer isothermalen Amplifikation eine PCR-Architektur der mikrofluidischen Kartusche zweckfremd genutzt werden. Insbesondere können zwei voneinander beabstandete PCR-Bereiche 101, 102 vorteilhaft für das Verfahren genutzt werden, insbesondere, wie nachfolgend beispielhaft beschrieben, der erste PCR-Bereich 101 für die Vorlagerung der spezifischen Reagenzien 141 und für die Denaturierung sowie der zweite PCR-Bereich 102 für die Vorlagerung der verfahrensspezifischen Reagenzien 142 und für die Amplifikationsreaktion als Amplifikationsbereich.The cartridge can contain two PCR strands in two PCR areas 101, 102, each PCR strand potentially comprising multiple fluidically arranged chambers. As shown in 2 As shown, each PCR strand can have three chambers 111, 112, 113, 121, 122, 123 connected in series, in order to perform two independent PCR reactions, each with three temperature ranges. For example, these chambers 111, 112, 113, 121, 122, 123 each have a volume of 20 µl. However, the method is not limited to such an architecture, especially when performing isothermal amplification. Conversely, when performing isothermal amplification, a PCR architecture of the microfluidic cartridge can be used for a different purpose. In particular, two PCR areas 101, 102 separated from each other can be advantageously used for the procedure, especially, as described below by way of example, the first PCR area 101 for the pre-storage of the specific reagents 141 and for the denaturation, and the second PCR area 102 for the pre-storage of the procedure-specific reagents 142 and for the amplification reaction as an amplification area.

In einem dritten Schritt 503 des Verfahrens 500 werden beispielsweise 40 µl der aufgereinigten Probe zunächst jeweils zur Hälfte auf zwei der Kammern 112, 113 des ersten PCR-Strangs aufgeteilt, um anschließend zum Beispiel 30 µl des 40 µl umfassenden Eluats in eine mit dem ersten PCR-Strang verbundene erste Beadkammer 114 zu befördern, wobei sich in der ersten Beadkammer 114 Primer als spezifische Reagenzien 141 für die Nukleinsäureamplifikation befinden. Diese Primer 141 liegen in diesem Beispiel als lyophilisiertes Bead 141 in der ersten Beadkammer 114 vor, so dass das Bead, auch als Primer-Bead bezeichnet, durch die aufgereinigte Probe rehydriert, aufgelöst und dabei die Primer mit der aufgereinigten Probe vermischt werden, wobei das resultierende Gemisch im Weiteren als erste vermischte Probe bezeichnet wird. Wie in 2 dargestellt, ist die erste Beadkammer 114 im ersten PCR-Bereich 101 angeordnet und direkt mit dem ersten PCR-Strang 111, 112, 113 verbunden, so dass Beförderungszeiten, Beförderungsstrecken und Fluidverluste bei einer Beförderung von Fluid zwischen der ersten Beadkammer 114 und dem ersten PCR-Strang möglichst gering gehalten werden. Alternativ könnte die erste Beadkammer 114 auch an anderer Stelle in der Vorrichtung 100 angeordnet sein.In a third step 503 of the procedure 500, for example, 40 µl of the purified sample are first divided equally between two of the chambers 112 and 113 of the first PCR strand. Subsequently, for example, 30 µl of the 40 µl eluate is transferred to a first bead chamber 114 connected to the first PCR strand. This first bead chamber 114 contains primers as specific reagents 141 for nucleic acid amplification. In this example, these primers 141 are present in the first bead chamber 114 as a lyophilized bead 141. The bead, also referred to as the primer bead, is rehydrated and dissolved by the purified sample, thereby mixing the primers with the purified sample. The resulting mixture is subsequently referred to as the first mixed sample. As in 2 As shown, the first bead chamber 114 is arranged in the first PCR area 101 and directly connected to the first PCR strand 111, 112, 113, so that transport times, transport distances and fluid losses during fluid transport between the first bead chamber 114 and the first PCR strand are kept to a minimum. Alternatively, the first bead chamber 114 could also be arranged at another location in the device 100.

Zumindest ein Teil der ersten vermischten Probe, beispielsweise 20 µl, werden in ein oder zwei Kammern 112, 113 des ersten PCR-Strangs zurückbefördert, um dort im vierten Schritt 504 des Verfahrens 500 die darin enthaltenen Nukleinsäuren und vorzugsweise auch die Primer über Erwärmung auf über 90 °C, beispielsweise auf 98 °C während einer Dauer von zum Beispiel 60 Sekunden, zu denaturieren. Dieser Teil der ersten vermischten Probe kann vor oder nach der Denaturierung mit beispielsweise weiteren 20 µl Elutionspuffer aus der dritten Reagenzienkammer 133 vermischt werden, insbesondere um bei Bedarf genug Volumen für das weiter unten im fünften Schritt 505 beschriebene Lösen der verfahrensspezifischen Reagenzien 142 bereitzustellen. Im vorliegenden Beispiel erfolgt diese Verdünnung des Teils vor der Denaturierung, so dass der verdünnte Teil auf zwei Kammern 111, 112 des ersten PCR-Strangs verteilt und dort denaturiert wird. 3a zeigt schematisch eine Momentaufnahme der Denaturierung der in 2 gezeigten Vorrichtung 100. Das Innere der beiden Kammern 111, 112 ist mit einem schrägen Strichmuster ausgefüllt, um die Befüllung dieser Kammern 111, 112 mit dem Teil der ersten vermischten Probe zu illustrieren. Beide Kammern 111, 112 befinden sich jeweils in einem Heizbereich 151, 152, beispielsweise durch Kontaktierung der Außenseite der Vorrichtung 100 in diesen Heizbereichen 151, 152 mit Heizern des Analysegeräts. Die Vorrichtung kann dabei noch weitere, nicht dargestellte Heizbereiche aufweisen. Beispielsweise ist der erste Heizbereich 151, welcher die erste Kammer 111 des ersten PCR-Strangs umfasst, für den Denaturierungsschritt während des PCR-Zykluses vorgesehen und eingerichtet, beispielsweise für eine Erwärmung auf 99 °C. Beispielsweise ist der zweite Heizbereich 152, welcher die zweite, also hier mittlere Kammer 112 des ersten PCR-Strangs umfasst, für den Elongationsschritt während des PCR-Zykluses vorgesehen und eingerichtet, beispielsweise für eine Erwärmung auf 70 °C, wobei auch dieser Heizbereich 152, insbesondere der entsprechende Heizer des Analysegeräts, vorzugsweise in der Lage ist, eine Erwärmung auf eine Denaturierungstemperatur wie beispielsweise 99 °C zu leisten. Alternativ könnte der erste PCR-Strang für die Verwendung von nur zwei statt drei Kammern zur Abbildung des PCR-Zykluses ausgestaltet sein, so dass beispielsweise die zweite Kammer 112 für die Denaturierung und die dritte Kammer 113 sowohl für das Annealing als auch für die Elongation vorgesehen ist und damit die zweite Kammer 112 ebenfalls geeignet wäre, die Denaturierung 504 für das vorgestellte Verfahren 500 zu leisten. Die beiden Heizbereiche 151, 152 können somit auch als der oben beschriebene Denaturierungsbereich aufgefasst werden. Wenn die Verdünnung erst nach der Denaturierung erfolgt, kann die Denaturierung und damit die Erwärmung auch nur in einer der Kammern 111, 112 erfolgen, insbesondere in der ersten Kammer 111 des ersten PCR-Strangs im ersten Heizbereich 151.At least a portion of the first mixed sample, for example 20 µl, is returned to one or two chambers 112, 113 of the first PCR strand to denature the nucleic acids and preferably also the primers contained therein in the fourth step 504 of the process 500 by heating to above 90 °C, for example to 98 °C for a duration of, for example, 60 seconds. This portion of the first mixed sample can be mixed before or after denaturation with, for example, another 20 µl of elution buffer from the third reagent chamber 133, in particular to provide sufficient volume, if necessary, for dissolving the process-specific reagents 142 as described below in the fifth step 505. In the present example, this dilution of the part takes place before denaturation, so that the diluted part is distributed onto two chambers 111, 112 of the first PCR strand and denatured there. 3a schematically shows a snapshot of the denaturation of the in 2 The apparatus 100 shown. The interior of the two chambers 111, 112 is filled with a slanted line pattern to illustrate the filling of these chambers 111, 112 with the portion of the first mixed sample. Both chambers 111, 112 are each located in a heating zone 151, 152, for example, by contacting the outer surface of the apparatus 100 in these heating zones 151, 152 with heaters of the analyzer. The apparatus may also have further heating zones not shown. For example, the first heating zone 151, which comprises the first chamber 111 of the first PCR strand, is intended and configured for the denaturation step during the PCR cycle, for example, for heating to 99 °C. For example, the second heating zone 152, which comprises the second, i.e., middle, chamber 112 of the first PCR strand, is intended and configured for the elongation step during the PCR cycle, for example, for heating to 70 °C. This heating zone 152, and in particular the corresponding heater of the analyzer, is preferably also capable of heating to a denaturation temperature such as 99 °C. Alternatively, the first PCR strand could be designed to use only two instead of three chambers to perform the PCR cycle, so that, for example, the second chamber 112 is intended for denaturation and the third chamber 113 for both annealing and elongation. Thus, the second chamber 112 would also be suitable for performing the denaturation 504 for the presented method 500. The two heating zones 151 and 152 can therefore also be considered the denaturation zone described above. If the dilution only takes place after the denaturation, the denaturation and thus the heating can only take place in one of the chambers 111, 112, in particular in the first chamber 111 of the first PCR strand in the first heating area 151.

Der denaturierte Teil, welcher im Weiteren als denaturierte Probe bezeichnet wird, oder zumindest ein Teil davon, beispielsweise 20 µl, werden im fünften Schritt 505 in eine zweite Beadkammer 124 befördert, wobei sich in der zweiten Beadkammer 124 Enzyme und andere Reagenzien als verfahrensspezifische Reagenzien 142 für die Nukleinsäureamplifikation befinden, insbesondere eine Polymerase, Desoxyribonukleosidtriphosphate (dNTPs) und/oder HilfsEnyzme für eine isothermale Amplifikation. Diese Substanzen 142 liegen in diesem Beispiel als lyophilisiertes zweites Bead 142 in der zweiten Beadkammer 124 vor, so dass das Bead, auch als Enzym-Bead bezeichnet, durch die aufgereinigte Probe rehydriert, aufgelöst und dabei die Enzyme mit zumindest dem Teil der denaturierten Probe vermischt werden, wobei das resultierende Gemisch im Weiteren als zweite vermischte Probe bezeichnet wird. 3b zeigt hierzu schematisch eine Momentaufnahme, wobei das Innere der Beadkammer 124 mit einem schrägen Strichmuster ausgefüllt ist, um anzuzeigen, dass die Beadkammer mit dem Teil der denaturierten Probe bereits befüllt wurde. The denatured portion, hereinafter referred to as the denatured sample, or at least a portion thereof, for example 20 µl, is transferred in the fifth step 505 to a second bead chamber 124. This second bead chamber 124 contains enzymes and other reagents, specifically process-specific reagents 142 for nucleic acid amplification, in particular a polymerase, deoxyribonucleoside triphosphates (dNTPs), and/or auxiliary enzymes for isothermal amplification. In this example, these substances 142 are present in the second bead chamber 124 as a lyophilized second bead 142. The bead, also referred to as the enzyme bead, is rehydrated and dissolved by the purified sample, thereby mixing the enzymes with at least the portion of the denatured sample. The resulting mixture is hereinafter referred to as the second mixed sample. 3b Figure 1 schematically shows a snapshot in which the interior of bead chamber 124 is filled with a slanted line pattern to indicate that the bead chamber has already been filled with the part of the denatured sample.

Während das Primer-Bead ja schon aufgelöst und daher in 3b nicht mehr gezeigt ist, wird das Enzym-Bead 142 noch dargestellt, um zu illustrieren, dass die Auflösung des Enzym-Beads 142 hier gerade erst beginnt. Das Enzym-Bead kann auch Sonden für eine optische Auslese während oder nach der Nukleinsäureamplifikation enthalten. Alternativ können solche Sonden auch im Primer-Bead enthalten sein, wenn die hohe Temperatur während der Denaturierung für diese Sonden unproblematisch ist. Die zweite Beadkammer 124 kann, wie in den 2 und 3b gezeigt, im zweiten PCR-Bereich 102 angeordnet und direkt mit den Kammern 121, 122, 123 des zweiten PCR-Strangs verbunden sein, so dass zunächst eine größere Menge, beispielsweise 30 µl, der denaturierten Probe zunächst in Richtung des zweiten PCR-Strangs befördert werden können und davon ein Teil, beispielsweise die bereits beschriebenen 20 µl, in die zweite Beadkammer 124, und der Rest, beispielsweise für eine spätere erneute Vermischung, in eine Kammer 123 des zweiten PCR-Strangs geleitet und dort geparkt werden können. Alternativ könnte die zweite Beadkammer 124 auch im ersten PCR-Bereich 101 oder an anderer Stelle in der Vorrichtung 100 angeordnet sein. Die Anordnung des Enzym-Beads 142 in einer Kammer 124 mit Abstand zu den Kammern 112, 113 aus dem ersten PCR-Bereich 102, in welchen die Denaturierung durchgeführt wird, hat den Vorteil, dass das Enzym-Bead möglichst von einer Wärmeeinwirkung der Denaturierung verschont bleibt. Unter Berücksichtigung der Wärmeleitfähigkeit des betreffenden Materials der Kartusche, beispielsweise Polycarbonat, und der geometrischen Form des Bereichs der Kartusche zwischen den Kammern 112, 113 für die Denaturierung und der zweiten Beadkammer 124, kann der Abstand zwischen den Kammern 112, 113, 124 bei der Auslegung der Kartusche so gewählt werden, dass eine Erwärmung von zum Beispiel 40° C auf eine Mindestdenaturierungstemperatur auf beispielsweise 92 °C im Bereich der Kammern 112, 113 für die Denaturierung über eine Mindestzeit von beispielsweise einer oder zwei Minuten die zweite Beadkammer 124 ausgehend von beispielsweise 40 °C nicht auf mehr als 50 °C erwärmt.While the primer bead has already dissolved and is therefore in 3b Although the enzyme bead 142 is no longer shown, it is still depicted to illustrate that its dissolution is just beginning. The enzyme bead can The second bead chamber 124 can also contain probes for optical readout during or after nucleic acid amplification. Alternatively, such probes can also be included in the primer bead if the high temperature during denaturation is not a problem for these probes. The second bead chamber 124 can, as in the 2 and 3b The second bead chamber 124 is shown to be arranged in the second PCR area 102 and directly connected to chambers 121, 122, and 123 of the second PCR strand, so that a larger quantity, for example, 30 µl, of the denatured sample can initially be conveyed towards the second PCR strand. A portion of this sample, for example, the previously described 20 µl, can then be directed into the second bead chamber 124, and the remainder, for example, for later remixing, can be directed into chamber 123 of the second PCR strand and stored there. Alternatively, the second bead chamber 124 could also be arranged in the first PCR area 101 or at another location in the device 100. The arrangement of the enzyme bead 142 in a chamber 124 at a distance from the chambers 112, 113 of the first PCR area 102, in which the denaturation is carried out, has the advantage that the enzyme bead is spared as much as possible from the heat effect of the denaturation. Taking into account the thermal conductivity of the cartridge material, for example polycarbonate, and the geometric shape of the cartridge area between the denaturation chambers 112, 113 and the second bead chamber 124, the distance between the chambers 112, 113, 124 can be chosen in the cartridge design such that a heating from, for example, 40°C to a minimum denaturation temperature of, for example, 92°C in the area of the denaturation chambers 112, 113 for a minimum time of, for example, one or two minutes does not heat the second bead chamber 124 from, for example, 40°C to more than 50°C.

In einem sechsten Schritt 506 des Verfahrens 500 kann die zweite vermischte Probe dann amplifiziert werden, insbesondere können die in der zweiten vermischten Probe enthaltenen aufgereinigten Nukleinsäuren mit den ebenfalls darin befindlichen denaturierten Primern und aus dem zweiten Bead 142 gelösten Enzymen amplifiziert werden. Beispielsweise kann die zweite vermischte Probe für eine isothermale Amplifikation in eine Kammer 123 des zweiten PCR-Strangs als Amplifikationskammer 123 befördert und dort auf das gewünschte Temperaturniveau, beispielsweise auf 63 °C, für die Dauer der Amplifikation erwärmt werden. Dies ist als Momentaufnahme in 3c schematisch wieder mit einem schrägen Strichmuster illustriert, diesmal die mit der zweiten vermischten Probe befüllte Amplifikationskammer 123. Die Amplifikationskammer 123, welche wie dargestellt die dritte, hier unterste, Kammer 123 des zweiten PCR-Strangs bildet, befindet sich vorzugsweise in einem dritten Heizbereich 153 der mikrofluidischen Vorrichtung 100. Beispielsweise ist diese dritte Kammer 123 für den Primer-Hybridisierungsschritt, auch Primer-Annealing-Schritt genannt, während des PCR-Zykluses vorgesehen und eingerichtet, auf eine Temperatur zwischen 60 und 65 °C erwärmt zu werden, zum Beispiel durch ein die Vorrichtung im dritten Heizbereich 153 kontaktierenden Heizer des Analysegeräts. Da sich sowohl die zweite Beadkammer 124 also auch die Amplifikationskammer 123 im zweiten PCR-Bereich befinden, können auch hier Beförderungszeiten, Beförderungsstrecken und Fluidverluste bei der Beförderung der zweiten fluidischen Probe möglichst gering gehalten werden. Alternativ oder zusätzlich kann auch eine andere Kammer zur Amplifikation verwendet werden, insbesondere die mittlere, beispielsweise für die Elongation oder alternativ Denaturierung vorgesehene Kammer 122 des zweiten PCR-Strangs. Während der isothermalen Amplifikation kann die zu amplifizierende zweite vermischte Probe auch zwischen zwei Kammern 122, 123 als erste und zweite Amplifikationskammer 122, 123 hin- und herbewegt werden, beispielsweise wenn eine die erste Amplifikationskammer 122 von zwei Seiten beheizt werden kann, während die zweite Amplifikationskammer 123 nur von einer Seite beheizt werden kann, um eine optische Auslese der zweiten Amplifikationskammer 123 von der anderen Seite aus zu ermöglichen. Im Falle der isothermalen Amplifikation kann die Reaktion in regelmäßen Abständen, beispielsweise alle 30 Sekunden, über Fluoreszenzsignale ausgelesen und bei Überschreiten eines vorgegebenen Schwellwerts an Fluoreszenzstrahlung in einem bestimmten Wellenlängenbereich abgebrochen werden.In a sixth step 506 of the procedure 500, the second mixed sample can then be amplified. In particular, the purified nucleic acids contained in the second mixed sample can be amplified together with the denatured primers also contained therein and enzymes dissolved from the second bead 142. For example, the second mixed sample can be transferred to a chamber 123 of the second PCR strand as amplification chamber 123 for isothermal amplification and heated there to the desired temperature level, for example to 63 °C, for the duration of the amplification. This is described as a snapshot in 3c The diagram schematically illustrates, again with a slanted line pattern, this time the amplification chamber 123 filled with the second mixed sample. The amplification chamber 123, which, as shown, forms the third (here, lowest) chamber 123 of the second PCR strand, is preferably located in a third heating zone 153 of the microfluidic device 100. For example, this third chamber 123 is intended for the primer hybridization step, also called the primer annealing step, during the PCR cycle and is configured to be heated to a temperature between 60 and 65 °C, for example, by a heater of the analyzer that contacts the device in the third heating zone 153. Since both the second bead chamber 124 and the amplification chamber 123 are located in the second PCR zone, transport times, distances, and fluid losses during the transport of the second fluidic sample can be minimized. Alternatively or additionally, another chamber can be used for amplification, in particular the middle chamber 122 of the second PCR strand, for example, which is intended for elongation or alternatively denaturation. During isothermal amplification, the second mixed sample to be amplified can also be moved back and forth between two chambers 122, 123 as the first and second amplification chambers 122, 123, for example, if the first amplification chamber 122 can be heated from two sides, while the second amplification chamber 123 can only be heated from one side, in order to allow optical readout of the second amplification chamber 123 from the other side. In the case of isothermal amplification, the reaction can be read out at regular intervals, for example every 30 seconds, via fluorescence signals and terminated if a predetermined threshold of fluorescence radiation in a specific wavelength range is exceeded.

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Zitierte PatentliteraturCited patent literature

DE 10 2016 222 075 A1 [0003, 0019]
DE 10 2016 222 072 A1 [0003, 0019]

Claims

A method (500) for performing nucleic acid amplification, in particular isothermal nucleic acid amplification, using a microfluidic device (100), comprising the steps of: • Receiving (501) a sample into the microfluidic device (100) • Mixing (503) the preferably purified sample with reagents (141) specific for nucleic acid amplification, in particular primers, to obtain a first mixed sample, wherein the specific reagents (141) are preferably located upstream in the microfluidic device (100). • Denaturing (504) nucleic acids contained in the first mixed sample in a denaturation area (151, 152) of the device (100), in particular in a denaturation chamber, to obtain a denatured sample • Mixing (505) at least a portion of the denatured sample with process-specific reagents (142) for the type of nucleic acid amplification, in particular enzymes for nucleic acid amplification, to obtain a second mixed sample, wherein the process-specific reagents (142) are preferably located upstream in the microfluidic device (100) • Performing (506) nucleic acid amplification with at least a portion of the second mixed sample in an amplification area, in particular at least one amplification chamber, of the device (100), in particular as isothermal nucleic acid amplification

Procedure (500) according to Claim 1 , wherein the specific reagents (141) are located in a first bead chamber (114) and the process-specific reagents (142) are located in a second bead chamber (124), preferably in dried form, in particular each as part of a bead (141, 142).

Method (500) according to one of the preceding claims, wherein the denaturing (504) comprises denaturing specific reagents (141), in particular primers, contained in the first mixed sample.

Method (500) according to one of the preceding claims, wherein the denaturation (504) is carried out by heating at least a part of the first mixed sample to a temperature higher than 90 °C, preferably higher than 92 °C, most preferably higher than 95 °C, for example 98 °C.

Method (500) according to one of the preceding claims, wherein the denaturation (504) takes place in one or more chambers (112, 113) of a first PCR area (101), in particular a first PCR strand, of the microfluidic device (100).

Method (500) according to one of the preceding claims, wherein the mixing (505) with the method-specific reagents (142) and/or the carrying out (506) of nucleic acid amplification takes place in chambers (124, 123) of a second PCR area (102) of the microfluidic device (100).

Method (500) according to one of the preceding claims, wherein nucleic acids contained in the sample are purified prior to mixing with the specific reagents to obtain a purified sample.

Procedure (500) according to Claim 7 , wherein the purification (502) is carried out by separating the nucleic acids from the sample by binding the nucleic acids to a solid phase, in particular to a filter, wherein the nucleic acids are detached from the solid phase, preferably after removal of sample residues with a washing medium, to form a part of the purified sample.

Method (500) according to any of the preceding claims, wherein nucleic acid contained in the sample is released by lysis of cells in the sample.

Method (500) according to one of the preceding claims, wherein carrying out (506) the nucleic acid amplification as isothermal amplification comprises, in particular, repeated movement of at least a part of the second mixed sample subjected to amplification between a first amplification chamber (122) and a second amplification chamber (123), in particular to perform an optical selection of the part from the second amplification chamber (123) during the amplification.

Microfluidic device (100) for carrying out nucleic acid amplification, in particular according to a method (500) of the preceding claims, comprising reagents (141) specific for nucleic acid amplification, in particular upstream primers, a denaturation area (151, 152), in particular with a denaturation chamber (112, 113), for denaturing nucleic acids contained in the sample mixed with the specific reagents (141), and reagents (141) specific for the type of nucleic acid amplification, in particular comprising enzymes, in particular a polymerase, and at least one amplification chamber (123) for carrying out nucleic acid amplification.

Device (100) according to Claim 11 , wherein the specific reagents (141) are placed upstream in a first PCR area (101), in particular in a first bead chamber (114), in particular as a detection-specific bead (141), and wherein the process-specific reagents (142) are placed upstream in a second PCR area (102) spaced apart from the first PCR area (101), in particular in a second bead chamber (124), in particular as a process-specific bead (142),

Device (100) according to Claim 11 or 12 , wherein the denaturation area (151, 152), in particular the denaturation chamber (111, 112), and the second PCR area (102), in particular the second bead chamber (124), are arranged in the device (100) relative to each other such that a heating of the denaturation area (151, 152) from a first initial temperature to a denaturation temperature during a denaturation time does not raise the temperature of the second PCR area (102) from a second initial temperature higher than a maximum temperature.

Device (100) according to Claim 13 ; wherein the denaturation temperature is 92 °C, preferably 95 °C, most preferably 99 °C, wherein the denaturation time is 2 minutes, preferably 5 minutes, most preferably 10 minutes, wherein the maximum temperature is 70 °C, preferably 60 °C, most preferably 50 °C and/or wherein the first and/or the second initial temperature is 20 °C, preferably 30 °C, most preferably 40 °C.