DE102011117520A1

DE102011117520A1 - Sensor system for non-intrusive pressure measurements in biological system, has linker that is immobilized at surface of donor and acceptor combination portion to provide frequency response energy transfer signal with donor excitation

Info

Publication number: DE102011117520A1
Application number: DE102011117520A
Authority: DE
Inventors: Frank Schleifenbaum
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2011-11-03
Filing date: 2011-11-03
Publication date: 2013-05-08

Abstract

The sensor system a combination portion from a donor and an acceptor, which provides a frequency response energy transfer (FRET) signal with excitation of the donor. An end of a linker between the donor and acceptor is immobilized at a surface of the combination portion. An independent claim is included for method for measuring dynamic or static pressure changes.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Sensorsystem für nicht intrusive Druckmessungen.The present invention relates to a sensor system for non-intrusive pressure measurements.

Die Bestimmung von Daten zu Druckveränderungen durch optische und nicht-intrusive Verfahren ist insbesondere in den Bereichen der Aerodynamik, der Fluidik und der Strömungsmechanik von großem Interesse. Auch die Messung von Drucken in biologischen Systemen, beispielsweise zur Bestimmung intrazellulärer Strömungen und Veränderungen ist ein weiteres Gebiet, für welches entsprechende Sensoren von Interesse wären.The determination of data on pressure changes by optical and non-intrusive methods is of particular interest in the fields of aerodynamics, fluidics and fluid mechanics. The measurement of pressures in biological systems, for example, to determine intracellular flows and changes is another area for which corresponding sensors would be of interest.

In derzeit kommerziell angebotenen Systemen wird häufig der Flächendruck optisch über den Sauerstoffpartialdruck bestimmt. Hierbei muss sich jedoch zunächst ein Gleichgewicht einstellen und es sind keine dynamischen Druckveränderungen bestimmbar. Zudem sind derartige Systeme aufgrund der Sauerstoffabhängigkeit nur in sauerstoffhaltiger Atmosphäre einsetzbar und Messungen in Flüssigkeiten sind überhaupt nicht möglich.In currently commercially available systems, the surface pressure is often determined optically via the oxygen partial pressure. Here, however, an equilibrium must first be established and no dynamic pressure changes can be determined. In addition, such systems are only usable in an oxygen-containing atmosphere due to the oxygen dependence and measurements in liquids are not possible at all.

In der WO 2004/044865 wird ein polymeres Material auf Polyurethanbasis zur Druckmessung beschrieben, welches ein photochemisches System enthält, das als kettenverlängerndes Diol gestaltet ist. Das photochemische System kann ein Exciplex sein oder ein System, welches auf Fluoreszenzresonanz-Energietransfer (Fluorescence Resonance Energy Transfer, nachstehend mit FRET bezeichnet), beruht, Im Fall eines Exciplex wird ausgenutzt, dass ein angeregter Ladungstransferkomplex (Charge tansfer Komplex) seinen Anregungszustand in Abhängigkeit vom Druck verändert und dessen Luminiszenz als optisch sichtbares Ergebnis damit druckabhängig ist. Nutzt das System FRET als Meßgrösse, wird ausgenutzt, dass das Fluoreszenzspektrum einer Donor-Akzeptor-Kombination sich in Abhängigkeit vom Abstand von Donor und Akzeptor verändert.In the WO 2004/044865 there is described a polyurethane-based polymeric material for pressure measurement which contains a photochemical system designed as a chain-extending diol. The photochemical system may be an exciplex or a system based on Fluorescence Resonance Energy Transfer (hereinafter referred to as FRET). In the case of an exciplex, an excited charge-transfer complex (charge transfer complex) is used as a function of its excited state changed by the pressure and the luminescence as an optically visible result is thus pressure-dependent. If the system uses FRET as the measured variable, it is exploited that the fluorescence spectrum of a donor-acceptor combination changes as a function of the distance between donor and acceptor.

Bedingt durch die Art der Herstellung (die Sensoren werden im Verlauf der Polymerisation eingebaut) ist die Druckabhängigkeit eines Sensors kaum je vergleichbar mit einem auf die gleiche Weise hergestellten zweiten Sensor, da die Abstände von Donor und Akzeptor nicht definiert festgelegt werden können und man stets eine Verteilung verschiedener Abstände erhält. Daher muss bei Verwendung solcher Sensoren vor einer Messung stets zunächst eine Kalibrierung durchgeführt werden und die Ergebnisse zweier Sensoren können nicht direkt verglichen werden.Due to the nature of the preparation (the sensors are incorporated in the course of the polymerization), the pressure dependence of a sensor is hardly ever comparable to a second sensor prepared in the same way, since the distances between donor and acceptor can not be defined defined and one always Distribution of different distances receives. Therefore, when using such sensors before a measurement, always a calibration must first be performed and the results of two sensors can not be compared directly.

Ebenfalls bereits kommerziell erhältlich sind sogenannte drucksensitive Beschichtungen (pressure sensitive coatings) die einen in einer Matrix eingebetteten Chromophor enthalten. Die Funktionalität dieser drucksensitiven Beschichtungen beruht in der Regel auf der dynamischen Löschung bzw. Dämpfung (Quenching) der Lumineszenz eines Chromophoren durch Sauerstoff. Die Funktionsfähigkeit solcher Systeme erfordert die Diffusion des Sauerstoffs durch die Beschichtung zum Chromophoren. Zudem weisen derartige Systeme in der Regel ein immer schlechter werdendes Signal/Rausch-Verhältnis mit steigendem Druck auf, d. h. maximale Signalqualität wird im Vakuum oder bei sehr niedrigen Drucken erreicht. Jegliche Störung der Sauerstoffdurchlässigkeit der Beschichtung (z. B. als Folge von Feuchtigkeits- oder Temperaturveränderungen führt zudem zu kaum reproduzierbaren Meßwertveränderungen.Also commercially available are so-called pressure-sensitive coatings containing a chromophore embedded in a matrix. The functionality of these pressure-sensitive coatings is generally based on the dynamic quenching or quenching of the luminescence of a chromophore by oxygen. The operability of such systems requires the diffusion of oxygen through the coating to the chromophore. In addition, such systems generally have a deteriorating signal-to-noise ratio with increasing pressure, i. H. maximum signal quality is achieved in vacuum or at very low pressures. Any disturbance of the oxygen permeability of the coating (eg as a consequence of changes in humidity or temperature also leads to hardly reproducible changes in measured values.

Meng und Sachs (J. Cell Sci. 124(2), 261ff (2011) beschreiben die Visualisierung dynamischer cytoplasmatischer Kräfte in vivo mit Hilfe von FRET-Sensoren. Einzelstrang-DNA-Segmente werden kovalent an zwei voneinander entfernten Positionen des Sensors gebunden. Durch Zugabe von komplementärer DNA wird die Persistenzlänge verändert (d. h. der die Fluorophore verbindende Linker verkürzt oder verlängert) und damit der Abstand der Fluorophore des Sensors, was zu einer Veränderung des FRET-Signals führt. Dadurch wird es möglich, Änderungen in der Tertiärstruktur von biologischen Verbindungen oder cytoplasmatische Kräfte zu verfolgen. Meng and Sachs (J. Cell Sci. 124 (2), 261ff (2011) describe the visualization of dynamic cytoplasmic forces in vivo using FRET sensors. Single-stranded DNA segments are covalently bound to two spaced apart positions of the sensor. Addition of complementary DNA alters the persistence length (ie, shortens or lengthens the linker connecting the fluorophores) and thus the distance of the fluorophores of the sensor, resulting in a change in the FRET signal. This makes it possible to follow changes in the tertiary structure of biological compounds or cytoplasmic forces.

Die vorstehend beschriebenen oder kommerziell erhältlichen Systeme zur Druckmessung erfüllen die Anforderungen an nicht-intrusive Druckmesseinrichtungen zur Messung von Drucken auf (ausgedehnten) Oberflächen nicht in voll zufriedenstellendem Umfang, insbesondere bei der Messung von dynamischen Druckveränderungen und Strömungen oder der Messung von Drucken und Strömungen in fluiden Systemen. Der vorliegenden Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, Sensorsysteme für nicht-intrusive Druckmessungen zur Verfügung zu stellen, die die vorstehend beschriebenen Nachteile nicht oder nur in geringerem Umfang aufweisen und die insbesondere auch die Verfolgung dynamischer Druckveränderungen in fluiden Systemen ermöglichen. Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Sensorsysteme gemäß Anspruch 1 gelöst.The above-described or commercially available pressure measurement systems do not fully meet the requirements of non-intrusive pressure gauges for measuring pressures on (extended) surfaces, particularly in the measurement of dynamic pressure changes and flows or the measurement of pressures and flows in fluids systems. The present invention therefore an object of the invention to provide sensor systems for non-intrusive pressure measurements available that do not have the disadvantages described above, or only to a lesser extent and in particular allow the tracking of dynamic pressure changes in fluid systems. This object is achieved by the sensor systems according to claim 1.

Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind den Unteransprüchen und der nachfolgenden detaillierten Beschreibung zu entnehmen.Preferred embodiments of the invention can be found in the subclaims and the following detailed description.

Des weiteren betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Verfolgung dynamischer Druckveränderungen und Strömungen sowie die Verwendung von Kombinationen eines Donors und eines Akzeptors zur Messung von Drucken. Nachfolgend ist der Begriff Druck oder dynamischer Druck dahingehend zu verstehen, dass damit auch Strömungen erfasst werden.Furthermore, the invention relates to a method for tracking dynamic pressure changes and flows as well as the use of combinations of a donor and an acceptor for measuring prints. In the following, the term pressure or dynamic pressure is to be understood as meaning that flows are also detected.

Die erfindungsgemäßen Sensorsysteme weisen als Bestandteil a) eine Kombination aus einem Donor und einem Akzeptor auf, die bei Anregung des Donors ein FRET-Signal liefert. The sensor systems according to the invention have as component a) a combination of a donor and an acceptor, which supplies a FRET signal upon excitation of the donor.

FRET bedeutet, dass die Singulett-Singulett-Übergänge eines Donors und eines Akzeptors miteinander in Wechselwirkung stehen. Absorptions-Übergangs-Dipolmomente des Donors sind mit Emissions-Übergangsdipolmomenten des Akzeptors gekoppelt. Die Anregungsenergie wird strahlungslos vom Donor auf den Akzeptor übertragen. Wird ein Donor gewählt, der die Anregungsenergie in Abwesenheit des Akzeptors über Strahlung abgibt (z. B. ein Fluoreszenzfarbstoff), wird dieses Signal des Donors im Vergleich zur Anregung in Abwesenheit des Akzeptors geschwächt, wenn Energieübertrag zu einem Akzeptor stattfindet, wobei die Schwächung (Löschung oder Quenching) umso ausgeprägter ist, je besser der strahlungslose Energietransfer vom Donor auf den Akzeptor ist. Wie vorstehend erwähnt, ist die strahlungslose Energieübertragung stark von dem Abstand zwischen Donor und Akzeptor abhängig, so dass die Veränderung des Abstandes über die Schwächung des Signals verfolgt werden kann.FRET means that the singlet-singlet transitions of a donor and an acceptor interact with each other. Absorbance-transition dipole moments of the donor are coupled to emission transition dipole moments of the acceptor. The excitation energy is transmitted without radiation from the donor to the acceptor. When a donor is selected that releases the excitation energy in the absence of the acceptor via radiation (eg, a fluorescent dye), this signal from the donor is weakened compared to the excitation in the absence of the acceptor when energy transfer to an acceptor occurs, with the attenuation ( Erasure or quenching), the more pronounced the better the non-radiative energy transfer from the donor to the acceptor. As mentioned above, the non-radiative energy transfer is strongly dependent on the distance between donor and acceptor, so that the change in the distance can be tracked via the attenuation of the signal.

Die auf den Akzeptor übertragene Energie führt zu einer Anregung desselben. Auch der Akzeptor kann die übertragene Energie prinzipiell auf verschiedenen Wegen abgeben. Erfolgt dies strahlungsfrei, entsteht kein eigenes Signal bei diesem Vorgang; wird jedoch ein Akzeptor verwendet, der seinerseits die Anregungsenergie durch Strahlung abgibt (z. B. ein Fluoreszenzfarbstoff) wird ein Signal des Akzeptors erhalten.The energy transferred to the acceptor causes it to excite. Also, the acceptor can deliver the transmitted energy in principle in different ways. If this is radiation-free, no signal of its own arises during this process; however, if an acceptor is used which in turn emits the excitation energy by radiation (eg, a fluorescent dye), a signal of the acceptor is obtained.

Die vorstehenden Ausführungen zeigen, dass grundsätzlich Donor/Akzeptorkombinationen beliebiger Art möglich sind. Erforderlich ist lediglich, dass entweder Donor oder Akzeptor bei der Abgabe der Anregungsenergie, ein messbares Signal bzw. eine Signalveränderung liefern, welches bzw. welche verfolgt werden kann und welches bzw. welche sich in Abhängigkeit vom Abstand zwischen Donor und Akzeptor verändert.The above statements show that in principle donor / acceptor combinations of any kind are possible. All that is required is that either donor or acceptor deliver a measurable signal or signal change upon delivery of the excitation energy, which or which can be tracked, and which or which change as a function of the distance between donor and acceptor.

Als Donor oder Akzeptor eignen sich daher beispielsweise Metalle, Metalllegierungen und Stoffe, die zugeführte Anregungsenergie in Form von elektromagnetischer Strahlung abgeben, wie beispielsweise Fluoreszenzfarbstoffe, Nanopartikel (halbleitend und metallisch) sowie Kohlenstoffnanostrukturen.As donor or acceptor, therefore, metals, metal alloys and substances, for example, which deliver supplied excitation energy in the form of electromagnetic radiation, such as, for example, fluorescent dyes, nanoparticles (semiconducting and metallic) and carbon nanostructures, are suitable.

Die Kombination von Donor und Akzeptor wird so gewählt, dass für einen strahlungslosen Übergang das Absorptionsspektrum des Akzeptors mit dem Emissionsspektrum des Donors überlappt, um eine strahlungslose Energieübertragung zu ermöglichen. Diese Energieübertragung verändert das Signal der Strahlung von Donor oder Akzeptor oder von beiden. Diese Veränderung kann verfolgt werden und ist ein Maß für die Veränderung des Abstands zwischen Donor und Akzeptor.The combination of donor and acceptor is chosen so that for a nonradiative transition, the absorption spectrum of the acceptor overlaps with the emission spectrum of the donor to allow nonradiative energy transfer. This energy transfer alters the signal of the donor or acceptor radiation or both. This change can be tracked and is a measure of the change in the distance between donor and acceptor.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist der Donor und/oder der Akzeptor ein Fluoreszenzfarbstoff, der in Abwesenheit des Akzeptors oder Donors Anregungsenergie in Form von Fluoreszenzstrahlung abgibt. Werden nun Donor und Akzeptor in einem solchen Abstand voneinander angeordnet, dass eine strahlungslose Energieübertragung zwischen beiden möglich ist, wird das Fluoreszenzsignal des Donors geschwächt oder es entsteht ein neues Fluoreszenzsignal des Akzeptors oder eine Kombination beider Effekte ist zu beobachten, wenn sowohl Donor als auch Akzeptor Fluoreszenzfarbstoffe sind. Die Fluoreszenz des Akzeptors erfolgt bei einer anderen, längeren Wellenlänge als die Fluoreszenz des Donors. Durch eine geeignete Detektionsvorrichtung können die beiden Fluoreszenzsignale verfolgt werden. Falls die Fluoreszenz im sichtbaren Bereich erfolgt, was eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung darstellt, können zur Detektion z. B. farbempfindliche Kamerasysteme eingesetzt werden.According to a preferred embodiment, the donor and / or the acceptor is a fluorescent dye which emits excitation energy in the form of fluorescent radiation in the absence of the acceptor or donor. If the donor and acceptor are arranged at such a distance from each other that a nonradiative energy transfer between the two is possible, the fluorescence signal of the donor is weakened or a new fluorescence signal of the acceptor arises or a combination of both effects can be observed if both donor and acceptor Fluorescent dyes are. The fluorescence of the acceptor occurs at a different, longer wavelength than the fluorescence of the donor. By a suitable detection device, the two fluorescence signals can be followed. If the fluorescence is in the visible range, which represents a preferred embodiment of the invention, for detection z. B. color-sensitive camera systems are used.

FRET basiert auf dem strahlungslosen Energieübertrag zwischen Donor und Akzeptor über eine Dipol-Dipol-Kopplung nach Förster (weshalb die Technologie manchmal auch als Förster Resonanz-Energietransfer bezeichnet wird).FRET is based on the nonradiative energy transfer between donor and acceptor via a Förster dipole-dipole coupling (which is why the technology is sometimes referred to as Förster's resonance energy transfer).

Nachstehend werden die erfindungsgemäßen Sensorsysteme beispielhaft unter Bezugnahme auf die bevorzugte Ausführungsform, bei der sowohl Donor als auch Akzeptor Fluoreszenzfarbstoffe sind, näher beschrieben. Grundsätzlich gelten jedoch die Ausführungen auch für andere Donor/Akzeptor-Kombinationen.Hereinafter, the sensor systems of the present invention will be further described by way of example with reference to the preferred embodiment in which both donor and acceptor are fluorescent dyes. In principle, however, the statements also apply to other donor / acceptor combinations.

Insbesondere seien an dieser Stelle Exciplexe oder Excimere als weiteres Beispiel erwähnt, wovon Exciplexe bevorzugt sind. Ein Exciplex ist ein Aggregat (metastabiler Komplex) aus zwei unterschiedlichen Atomen oder Molekülen, von denen eines (z. B. durch Strahlung) angeregt ist, während man von Excimeren spricht, wenn Donor- und Akzeptormolekül gleich sind. Exciplexe und Excimere sind das Ergebnis chemischer Interaktionen bei einer Kollision der Elektronenwolken der beteiligten Moleküle nach Anregung eines der Partner. Während der räumlichen Überlappung können Elektronen des Akzeptors und des Donors simultan ausgetauscht werden, der Austausch kann aber auch schrittweise unter Bildung ionischer Radikale erfolgen. Ist zwischen den beteiligten Molekülen die Ausbildung einer chemischen Bindung möglich, so existiert ein Minimum der Energie in Abhängigkeit vom Ort und vom Abstand der beteiligten Moleküle, d. h. der Abstand der beiden Moleküle hat Auswirkungen auf die Energie. Das Minimum liegt beim sogenannten Gleichgewichtsabstand der beiden Teilchen, die miteinander verbunden sind.In particular, at this point exciplexes or excimers are mentioned as a further example, of which exciplexes are preferred. An exciplex is an aggregate (metastable complex) of two different atoms or molecules, one of which is excited (eg, by radiation), while excimer is called when the donor and acceptor molecules are the same. Exciplexes and excimers are the result of chemical interactions in a collision of the electron clouds of the molecules involved after excitation of one of the partners. During the spatial overlap, electrons of the acceptor and the donor can be exchanged simultaneously, but the exchange can also be carried out stepwise to form ionic radicals. If it is possible to form a chemical bond between the participating molecules, then a minimum of the energy exists as a function of the location and distance of the molecules involved, ie the distance of the two molecules has an effect on the energy. The Minimum is the so-called equilibrium distance between the two particles, which are interconnected.

Wird die in den erfindungsgemäßen Sensorsystemen enthaltene Kombination von Fluoreszenzfarbstoffen mit Licht der Absorptionswellenlänge eines der Farbstoffe angeregt, so ist die Entfernung von Donor und Akzeptor entscheidend dafür, ob und wenn ja, in welcher Intensität FRET und ein entsprechendes Signal gemessen werden können. Ist die Entfernung zwischen Donor und Akzeptor zu groß, wird keine FRET beobachtet und es kann nur die Fluoreszenz des Donors beobachtet werden. Wird der Abstand zwischen Donor und Akzeptor so weit verringert, dass ein strahlungsloser Energieübertrag nach Förster möglich ist, wird die Fluoreszenz des Donors geschwächt und die des Akzeptors ist zu beobachten. Die Intensität der strahlungslosen Energieübertragung nach Förster ist umgekehrt proportional der 6. Potenz des Abstands zwischen Donor und Akzeptor, d. h. dieser Effekt ist nur bei sehr geringen Abständen zwischen Donor und Akzeptor zu beobachten. Üblicherweise wird FRET nur bei Entfernungen von weniger als 50 nm beobachtet, wobei im Bereich von 1 bis 10 nm in der Regel ein für eine Auswertung geeignetes Signal-Rausch-Verhältnis gegeben ist, weshalb in den bevorzugten Systemen der Abstand zwischen Donor und Akzeptor im Bereich von 1 bis 10 nm, vorzugsweise im Bereich von 2 bis 8 nm liegt. Grundsätzlich eignet sich als Kombination von Fluoreszenzfarbstoffen in den Sensorsystemen gemäß der Erfindung jede Kombination, bei der der vorstehend beschriebene strahlungslose Energieübertrag möglich ist.If the combination of fluorescent dyes contained in the sensor systems according to the invention is excited with light of the absorption wavelength of one of the dyes, the removal of donor and acceptor is decisive for determining whether and, if so, in what intensity FRET and a corresponding signal can be measured. If the distance between donor and acceptor is too large, no FRET is observed and only the fluorescence of the donor can be observed. If the distance between donor and acceptor is reduced so much that a radiationless transfer of energy by Förster is possible, the fluorescence of the donor is weakened and that of the acceptor is observed. The intensity of the radiationless energy transfer according to Förster is inversely proportional to the 6th power of the distance between donor and acceptor, d. H. this effect can be observed only at very small distances between donor and acceptor. Usually, FRET is observed only at distances of less than 50 nm, wherein in the range of 1 to 10 nm is usually suitable for an evaluation signal-to-noise ratio, which is why in the preferred systems, the distance between donor and acceptor in the range from 1 to 10 nm, preferably in the range of 2 to 8 nm. In principle, a combination of fluorescent dyes in the sensor systems according to the invention is suitable for any combination in which the radiationless energy transfer described above is possible.

Bevorzugt sind Systeme bei der die Fluoreszenz des Donors und die Fluoreszenz des Akzeptors bei Wellenlängen liegen, die sich um mindestens 5 nm, besonders bevorzugt mindestens 10 und insbesondere bevorzugt mindestens 20 nm unterscheiden (Maxima der Emission), da dies die Verfolgung des FRET-Signals erleichtert.Preferred are systems in which the fluorescence of the donor and the fluorescence of the acceptor are at wavelengths that differ by at least 5 nm, more preferably at least 10 and especially preferably at least 20 nm (maxima of the emission), as this is the tracking of the FRET signal facilitated.

Es ist ebenfalls von Vorteil, wenn die Donoranregung bei einer Wellenlänge möglich ist, bei der eine möglichst geringe direkte Anregung des Akzeptors erfolgt, da dies das erzielbare Signal zu Rausch Verhältnis beeinflusst. Starke direkte Anregung des Akzeptors bei Anregung des Donors verschlechtert das Signal/Rausch-Verhältnis. Bevorzugt werden weiterhin Fluoreszenzfarbstoffe, deren Emission im Grün- bzw. Rotfenster typischer RGB-Digitalkameras, d. h. im Bereich von etwa 480 bis 800 nm, vorzugsweise im Bereich von 500 bis 700 nm liegt. Dies ermöglicht die einfache Erfassung des zu messenden Signals und die Auswertung über handelsübliche Grafikprogramme.It is also advantageous if the donor excitation is possible at a wavelength at which the lowest possible direct excitation of the acceptor takes place, since this influences the achievable signal-to-noise ratio. Strong direct excitation of the acceptor upon excitation of the donor degrades the signal-to-noise ratio. Fluorescent dyes whose emission in the green or red window of typical RGB digital cameras, ie. H. in the range of about 480 to 800 nm, preferably in the range of 500 to 700 nm. This enables the simple acquisition of the signal to be measured and the evaluation via commercially available graphics programs.

Entsprechende Fluoreszenzfarbstoffe sind dem Fachmann bekannt und in der Literatur beschrieben, so dass sich hier nähere Ausführungen erübrigen.Corresponding fluorescent dyes are known to the person skilled in the art and described in the literature, so that further details are unnecessary here.

Geeignete Detektionsverfahren (sowohl frequenz- oder intensitäts- als auch zeitaufgelöst) bzw. Detektoren zur Detektion bzw. Verfolgung von Fluoreszenzsignalen sind an sich bekannt und vielfach in der Literatur beschrieben, so dass sich hier detaillierte Ausführungen erübrigen. Der Fachmann wird das Detektionsverfahren je nach Anwendung geeignet auswählen.Suitable detection methods (both frequency or intensity as well as time resolved) or detectors for detecting or tracking fluorescence signals are known per se and have been described many times in the literature, so that detailed explanations are unnecessary here. The person skilled in the art will suitably select the detection method according to the application.

Ein wesentliches Merkmal der vorliegenden Erfindung ist weiterhin, dass der Linker, der Donor und Akzeptor miteinander verbindet, an einem Ende an einer Oberfläche immobilisiert ist, vorzugsweise über eine kovalente Anbindung des Linkers an die Oberfläche. Dadurch wird es möglich, entsprechende Sensoren mit definiertem Abstand zwischen Donor und Akzeptor reproduzierbar herzustellen und zur quantitativen Messung von Drucken oder Druckveränderungen zu verwenden.An essential feature of the present invention is further that the linker linking donor and acceptor is immobilized at one end to a surface, preferably via a covalent attachment of the linker to the surface. This makes it possible to produce corresponding sensors with a defined distance between donor and acceptor reproducible and to use for the quantitative measurement of pressure or pressure changes.

Von Bedeutung ist weiterhin, dass der Linker präzise in der Länge einstellbar ist, da damit ein definierter Abstand zwischen Donor und Akzeptor erreicht werden kann, was für die Reproduzierbarkeit und die Vergleichbarkeit der Ergebnisse zwischen Sensoren aus verschiedenen Herstellungschargen von Bedeutung ist. Zudem sollte der Linker eine einstellbare Steifigkeit aufweisen und biegsam sein, um bei Druckbeanspruchung eine Abstandsveränderung zwischen Donor und Akzeptor und damit eine Veränderung des FRET-Signals zu bewirken. Das gemessene Signal erlaubt unmittelbar eine Aussage über den Abstand zwischen Donor und Akzeptor und damit, unter Heranziehung einer vorher erstellten geeigneten Kalibrierungskurve für das jeweilige Sensorsystem, auch unmittelbar eine Aussage über den Druck, der am freien Ende des Linkers und dem dort befindlichen Fluoreszenzfarbstoff wirkt. Da die Längenveränderung des Linkers unter Druckeinwirkung reversibel ist und zudem eine Relaxation sehr schnell erfolgt, eignen sich die Sensorsysteme gemäß der Erfindung insbesondere auch zur Messung dynamischer Drucke bzw. kontinuierlicher Druckveränderungen.Of importance is also that the linker is precisely adjustable in length, as it allows a defined distance between donor and acceptor can be achieved, which is for the reproducibility and comparability of the results between sensors from different manufacturing batches of importance. In addition, the linker should have an adjustable stiffness and be flexible to cause a change in pressure between donor and acceptor and thus a change in the FRET signal under compressive stress. The measured signal allows immediate information about the distance between donor and acceptor and thus, using a previously created suitable calibration curve for the respective sensor system, also directly a statement about the pressure acting at the free end of the linker and the fluorescent dye located there. Since the change in length of the linker is reversible under the action of pressure and, in addition, relaxation takes place very rapidly, the sensor systems according to the invention are also particularly suitable for measuring dynamic pressures or continuous pressure changes.

Die Linkergeometrie erlaubt somit eine Verbiegung bei Druckänderungen parallel oder in stumpfen Anstellwinkeln zur Oberfläche. Dadurch wird die Messung von dynamischen Drucken ermöglicht.The linker geometry thus allows a bend in pressure changes parallel or at obtuse angles of attack to the surface. This allows the measurement of dynamic printing.

Um den strahlungslosen Energieübertrag möglichst wenig oder nicht zu beeinflussen, sollte der Linker nicht elektronenleitend sein und kein delokalisiertes Elektronensystem aufweisen.In order to influence the non-radiative energy transfer as little as possible or not, the linker should not be electron-conducting and have no delocalized electron system.

Vorzugsweise ist der Linker weiterhin linear.Preferably, the linker is still linear.

Von Vorteil ist auch, wenn der Linker mit guter Ausbeute und ohne aufwendige Aufreinigungsschritte synthetisierbar ist, da dies wirtschaftlich von Vorteil ist und die Reproduzierbarkeit der Messergebnisse positiv beeinflusst. It is also advantageous if the linker can be synthesized with good yield and without expensive purification steps, since this is economically advantageous and positively influences the reproducibility of the measurement results.

Weiterhin ist eine zuverlässige und gezielte asymmetrische Substitutionsmöglichkeit der Linkergrundstruktur von Vorteil und bevorzugt.Furthermore, a reliable and targeted asymmetric substitution possibility of the linker base structure is advantageous and preferred.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform werden als Linker kurzkettige, doppelsträngige DNA Segmente verwendet.According to a preferred embodiment, short-chain, double-stranded DNA segments are used as linkers.

Aus dem Vorstehenden wird ohne weiteres ersichtlich, dass über Länge und Art der DNA der Arbeitsbereich des Sensorsystems eingestellt werden kann.It will be readily apparent from the foregoing that the working range of the sensor system can be adjusted by the length and type of DNA.

Die Steifigkeit solcher kurzkettiger DNA-Segmente und damit die Empfindlichkeit des Sensors kann mit Hilfe geeigneter Interkalationssubstanzen wie z. B. Acridiniumsalzen, die selektiv in die DNA-Grooves (Furchen) interkalieren oder durch Variation der Länge nicht doppelsträngiger Bereiche, gesteuert und eingestellt werden. Die DNA-Stränge können beliebig verlängert und modifiziert werden, ohne das FRET-Sensorsystem als solches zu beeinflussen. Auf diese Weise lässt sich die Strömungsangriffsfläche auf molekularer Ebene einstellen und so die Empfindlichkeit und damit der Einsatzbereich des Sensors anpassen. Kurzkettige doppelsträngige DNA-Segmente haben den Vorteil, dass sie mit praktisch quantitativer Ausbeute selektiv synthetisiert werden können und es keiner aufwendigen Aufreinigung bedarf.The rigidity of such short-chain DNA segments and thus the sensitivity of the sensor can be determined by means of suitable intercalation substances such. , Acridinium salts that selectively intercalate into the DNA grooves (grooves) or are controlled and adjusted by varying the length of non-double-stranded regions. The DNA strands can be extended and modified as desired without affecting the FRET sensor system as such. In this way, the flow attack surface can be set at the molecular level and thus adjust the sensitivity and thus the application of the sensor. Short-chain double-stranded DNA segments have the advantage that they can be synthesized selectively with practically quantitative yield and that no elaborate purification is required.

Nach einem bevorzugten Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Sensorsysteme wird von einer einsträngigen DNA mit einer bestimmten und vorher festgelegten Kettenlänge, d. h. einer bestimmten Anzahl von Basen ausgegangen. In der Regel weisen die einsträngigen Segmente 10 bis 50, vorzugsweise 15 bis 40 und insbesondere 20 bis 30 Basen auf. An einem Ende dieser einsträngigen DNA, vorzugsweise am 3'-Ende wird dann der als Akzeptor fungierende Fluoreszenzfarbstoff durch kovalente Verknüpfung angebracht. Das 5'-Ende wird an einer Oberfläche immobilisiert, wobei diese Immobilisierung vorzugsweise über eine kovalente Anbindung des betreffenden Endes des Einzelstrangs an eine Oberfläche erfolgt. Grundsätzlich sind jedoch auch andere Arten der Immobilisierung denkbar (z. B. nicht-kovalente Wechselwirkungen zwischen Einzelstrang und Oberfläche), doch sind diese Varianten in der Regel weniger stabil als die Varianten mit kovalenter Anbindung, was beim praktischen Einsatz von Nachteil sein kann.According to a preferred method for the preparation of the sensor systems according to the invention is of a single-stranded DNA with a certain and predetermined chain length, d. H. a certain number of bases. As a rule, the single-stranded segments have 10 to 50, preferably 15 to 40 and in particular 20 to 30 bases. At one end of this single-stranded DNA, preferably at the 3 'end, the fluorescent dye functioning as acceptor is then attached by covalent linkage. The 5 'end is immobilized on a surface, this immobilization preferably taking place via a covalent attachment of the relevant end of the single strand to a surface. In principle, however, other types of immobilization are conceivable (eg non-covalent interactions between single strand and surface), but these variants are generally less stable than the variants with covalent attachment, which can be disadvantageous in practical use.

Die kovalente Anknüpfung z. B. an eine Glasoberfläche kann gemäß einer bevorzugten Verfahrensweise wie folgt erreicht werden:
Zunächst werden an der Glasoberfläche durch Behandlung mit einem entsprechenden Agens wie Peroxoschwefelsäure freie Hydroxygruppen erzeugt, an die ein funktionalisiertes Silan (z. B. ein aminofunktionalisiertes Silan) kovalent gebunden wird. Dieses aminofunktionalisierte Silan kann dann mit Hilfe eines Imids, z. B. N-Succinimid (um nur ein Beispiel stellvertretend zu benennen) in einen Aktivester überführt werden, der im Folgeschritt dann selektiv an die Aminofunktion am Ende des DNA-Einzelstrangs bindet. Damit ist der Linker an der Oberfläche immobilisiert und einer der Fluoreszenzfarbstoffe des erfindungsgemäßen Sensorsystems Donor oder Akzeptor befindet sich in einem definierten Abstand von der Oberfläche.The covalent attachment z. B. to a glass surface can be achieved according to a preferred procedure as follows:
First, free hydroxyl groups are generated on the glass surface by treatment with an appropriate agent, such as peroxosulfuric acid, to which a functionalized silane (eg, an amino-functionalized silane) is covalently bound. This amino-functionalized silane can then with the aid of an imide, z. For example, N-succinimide (to name just one example) are converted into an active ester, which then selectively binds to the amino function at the end of the DNA single strand in the subsequent step. Thus, the linker is immobilized on the surface and one of the fluorescent dyes of the sensor system according to the invention donor or acceptor is located at a defined distance from the surface.

Im abschließenden Schritt muss jetzt noch der zweite Fluoreszenzfarbstoff so eingebracht werden, dass ein reproduzierbar einstellbarer Abstand zum ersten Fluoreszenzfarbstoff erreicht wird.In the final step, the second fluorescent dye must now be introduced so that a reproducibly adjustable distance to the first fluorescent dye is achieved.

Dies wird am besten dadurch erzielt, dass man einen zum immobilisierten Einzelstrang komplementären DNA-Strang mit einem vorher festgelegten Hybridisierungsbereich und einem am Ende gebundenen zweiten Fluoreszenzfarbstoff (der dann mit dem ersten Fluoreszenzfarbstoff das Donor/Akzeptor Paar liefert) mit dem ersten Strang hybridisiert.This is best achieved by hybridizing a DNA strand complementary to the immobilized single strand with a predetermined hybridization region and a final second fluorescent dye (which then provides the donor / acceptor pair with the first fluorescent dye) to the first strand.

Das Ergebnis ist ein erfindungsgemäßes Sensorsystem mit einem klar und eindeutig definierten und reproduzierbar einstellbaren Abstand zwischen den beiden Fluoreszenzfarbstoffen.The result is an inventive sensor system with a clear and clearly defined and reproducibly adjustable distance between the two fluorescent dyes.

Bevorzugt wird der Abstand zwischen Donor und Akzeptor so eingestellt, dass bei Abwesenheit eines zu bestimmenden Drucks bzw. einer Druckveränderung oder im ”Nullzustand” eine FRET-Effizienz im Bereich von 2–20, vorzugsweise 5–15% erhalten wird. Dadurch kann die Sensitivität und der Meßbereich des Sensors gezielt auf den Druckbereich eingestellt werden, in dem später die Messungen erfolgen.Preferably, the distance between donor and acceptor is adjusted so that in the absence of a pressure to be determined or a pressure change or in the "zero state" a FRET efficiency in the range of 2-20, preferably 5-15% is obtained. As a result, the sensitivity and the measuring range of the sensor can be adjusted specifically to the pressure range in which measurements are taken later.

Da die Hybridisierung in einer klar definierten Weise erfolgt, ist bei Verwendung gleicher Ausgangsmaterialien davon auszugehen, dass ein Produkt mit einem stets gleichen Abstand der beiden Fluoreszenzfarbstoffe erhalten wird. Damit lassen sich die Messergebnisse von derartigen Sensoren unmittelbar vergleichen, ohne dass es jedes mal einer aufwendigen Kalibrierung bedarf.Since the hybridization takes place in a clearly defined manner, when using the same starting materials, it can be assumed that a product is obtained with a constant distance between the two fluorescent dyes. Thus, the measurement results of such sensors can be compared directly, without the need for an elaborate calibration every time.

Statt einer Glasoberfläche kann die Immobilisierung auch an beliebige andere Oberflächen erfolgen, insbesondere z. B. an Polymeroberflächen wie z. B. Folien. Damit können erfindungsgemäße Sensorsysteme erhalten werden, die sehr flexibel auf andere Oberflächen oder Werkstücke aufgebracht werden können, die Druckveränderungen unterliegen, die verfolgt werden sollen.Instead of a glass surface, the immobilization can also take place on any other surfaces, in particular z. B. on polymer surfaces such. B. slides. Thus, inventive Sensor systems are obtained, which can be very flexibly applied to other surfaces or workpieces that are subject to pressure changes to be tracked.

Statt DNA-Strängen können auch andere Linker verwendet werden, solange die Einstellbarkeit und Reproduzierbarkeit der Herstellung gegeben ist. Hier seien beispielsweise Oligomere oder Polymere definierter Kettenlänge genannt. Sind derartige Produkte weitgehend unpolar, werden damit Druckmessungen mit den erfindungsgemäßen Sensorsystemen auch in unpolaren Flüssigkeiten wie Ölen möglich. Mögliche molekulare Systeme sind z. B. auch Steroidgerüste oder substituierte Zuckerketten.Instead of DNA strands, other linkers can be used as long as the adjustability and reproducibility of the preparation is given. For example, oligomers or polymers of defined chain length may be mentioned here. If such products are largely nonpolar, pressure measurements with the sensor systems according to the invention are also possible in nonpolar liquids such as oils. Possible molecular systems are z. B. also steroid scaffolds or substituted sugar chains.

Am 3' Ende des immobilisierten DNA-Stranges kann ein weiterer funktionalisierter DNA-Einzelstrang gebunden (hybridisiert) werden, um so eine Modifikation des Sensors zu erreichen. Dieser Schritt kann prinzipiell beliebig oft wiederholt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Funktionalisierung so gewählt, dass sie eine größere Strömungsangriffsfläche zur Einstellung der Sensorempfindlichkeit bietet. Auch zur Verwendung von Druck- und Strömungsmessungen in vivo können die erfindungsgemäßen Sensorsysteme eingesetzt werden. Beispielsweise kann man für derartige Messungen autofluoreszierende Proteine verwenden und als Linker geeignete Helixpolypeptide, Aus den vorstehenden Ausführungen wird deutlich, dass die erfindungsgemäßen Sensorsysteme mit einem reproduzierbar einstellbaren definierten Abstand zwischen den beiden Fluoreszenzfarbstoffen in einer Vielzahl von Anwendungsbereichen zur statischen und dynamischen Druckmessung eingesetzt werden können. Hier seien exemplarisch nur die Avionik, Druckmessungen in fluiden Systemen, insbesondere Flüssigkeiten und Gasen oder in der Strömungsmechanik genannt.At the 3 'end of the immobilized DNA strand, another functionalized DNA single strand can be bound (hybridized) so as to achieve a modification of the sensor. In principle, this step can be repeated as often as desired. In a preferred embodiment, the functionalization is chosen to provide a larger flow attack surface for adjusting the sensor sensitivity. The sensor systems according to the invention can also be used for the use of pressure and flow measurements in vivo. For example, it is possible to use autofluorescent proteins for such measurements and helix polypeptides suitable as linkers. It will be clear from the foregoing that the sensor systems according to the invention can be used with a reproducibly settable defined distance between the two fluorescent dyes in a variety of applications for static and dynamic pressure measurement. By way of example only avionics, pressure measurements in fluid systems, in particular liquids and gases or in fluid mechanics are mentioned here.

Die erfindungsgemäßen Sensorsysteme sind sauerstoffunabhängig, was gegenüber den drucksensitiven Beschichtungsmassen einen signifikanten Vorteil darstellt, da die Abhängigkeit der Meßergebnisse von Luftfeuchtigkeit, Temperatur oder Sauerstoffgehalt weitestgehend reduziert ist.The sensor systems according to the invention are oxygen-independent, which represents a significant advantage over the pressure-sensitive coating compositions, since the dependence of the measurement results of air humidity, temperature or oxygen content is largely reduced.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden Metallnanopartikel zur Verstärkung der Fluoreszenz der Farbstoffsysteme (particle enhanced fluorescence) eingesetzt. Hierdurch wird eine Steigerung des optischen Signal-zu-Rausch Verhältnisses erreicht. Weiterhin können die Nanopartikel ihrerseits als Akzeptorsysteme eingesetzt werden. Hierbei löschen oder schwächen sie die Donorfluoreszenz und können gegebenenfalls ihrerseits lumineszieren. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Messung dynamischer oder statischer Druckveränderungen, wobei ein Sensorsystem mit einer Kombination von aus einem Donor und einem Akzeptor, die bei Anregung ein FRET-Signal liefert und einem Linker zwischen Donor und Akzeptor, wobei ein Ende des Linkers auf einer Oberfläche immobilisiert ist, eingesetzt wird, dieses Sensorsystem der zu bestimmenden Druckveränderung ausgesetzt wird und der Donor mit elektromagnetischen Wellen einer Wellenlänge, die zur Anregung des Donors geeignet ist, angeregt und ein FRET-Signal über eine geeignete Erfassungseinrichtung erfasst wird.According to a further preferred embodiment, metal nanoparticles are used to enhance the fluorescence of the particle systems (particle enhanced fluorescence). This achieves an increase in the optical signal-to-noise ratio. Furthermore, the nanoparticles themselves can be used as acceptor systems. In so doing, they either erase or weaken the donor fluorescence and, if appropriate, can themselves luminesce. Another object of the present invention is a method for measuring dynamic or static pressure changes, wherein a sensor system having a combination of a donor and an acceptor which upon stimulation provides a FRET signal and a linker between donor and acceptor, one end of the Linkers is immobilized on a surface is used, this sensor system of the pressure change to be determined is excited and the donor with electromagnetic waves of a wavelength which is suitable for exciting the donor, and a FRET signal is detected by a suitable detection means.

Wegen näherer Details zu den Donoren und Akzeptoren und der Immobilisierung des Linkers an einer Oberfläche sowie geeigneter Erfassungseinrichtungen sei auf die vorstehenden Ausführungen zu den Sensorsystemen gemäß der Erfindung verwiesen.For more details about the donors and acceptors and the immobilization of the linker on a surface as well as suitable detection means, reference is made to the above statements on the sensor systems according to the invention.

Schließlich betrifft eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die Verwendung einer Kombination eines Donors und eines Akzeptors, die bei Anregung ein FRET-Signal liefert, wobei Donor und Akzeptor über einen Linker verbunden sind, dessen eines Ende an einer Oberfläche immobilisiert ist, zur Messung von Drucken.Finally, another embodiment of the present invention relates to the use of a combination of a donor and an acceptor which upon stimulation provides a FRET signal, wherein donor and acceptor are linked via a linker whose one end is immobilized on a surface for measuring pressures ,

Der Einsatz von FRET-Systemen bietet den Vorteil, insbesondere bei der Verwendung zweier Farbstoffe als Donor und Akzeptor, einen internen Standard aufzuweisen. Hierdurch kann die Effizienz des Energieübertrags über die antikorrelierten Intensitätsänderungen von Donor und Akzeptor ermittelt werden. Diese bevorzugte Ausführungsform beinhaltet daher eine interne Referenz und ist gegen Intensitätsschwankungen unanfällig. Daher ist im Gegensatz zu vielen bisher beschriebenen optischen Sensoren eine Fluoreszenzlöschung, die druckunabhängige Ursachen hat (z. B. Temperatur, Luftfeuchtigkeit) für die Messung unproblematisch.The use of FRET systems offers the advantage of having an internal standard, especially when using two dyes as donor and acceptor. In this way, the efficiency of the energy transfer can be determined via the anticorrelated intensity changes of donor and acceptor. This preferred embodiment therefore includes an internal reference and is immune to intensity fluctuations. Therefore, in contrast to many optical sensors described hitherto, fluorescence quenching, which has pressure-independent causes (eg temperature, air humidity), is unproblematic for the measurement.

Ausführungsbeispiel:Embodiment:

Zum Aufbau eines erfindungsgemäßen Sensors auf einer Glasoberfläche wurde diese zunächst gründlich gereinigt. Anschliessend wurden mit Hilfe einer stark sauren, oxidierenden Mischung aus 3 Teilen konz. H₂SO₄ und 2 Teilen 30%gen H₂O₂ nach Inkubation im Ultraschall für 30 Min Silanol-Gruppen auf der SiO₂- Oberfläche erzeugt. Die so chemisch aktivierten Oberflächen waren stark hydrophil und wurden direkt mit Aminopropyltriethoxysilan (APTES) umgesetzt. Hierzu wurde 10–15 μl 5%tige APTES/Ethanol (EtOH) Lösung aufpipettiert und das Substrat für 1 h in einer EtOH-Dampf gefüllten Kammer aufbewahrt. Wichtig ist bei der Silanisierung das wasserfreie Arbeiten, da durch größere Mengen H₂O die Silan-Gruppen miteinander kondensieren können und sich somit keine homogene Oberfläche ausbilden kann. Anschließend wurden die Proben mit EtOH gereinigt und für 15 mm bei 110°C im Ofen gebacken. Anschließend wurden die Amino-Gruppen in Carboxy-Gruppen umfunktionalisiert. Dazu wurden pro Sandwich 10 μl Glutarsäureanhydrid(GA)-Lösung (2 mg GA in 1 μl trockenem Dimethylformamid (DMF)) zugegeben und für 6 h in eine DMF-Dampf gesättigte Kammer gegeben.To construct a sensor according to the invention on a glass surface, it was first thoroughly cleaned. Subsequently, with the aid of a strongly acidic, oxidizing mixture of 3 parts of conc. H ₂ SO ₄ and 2 parts 30% gen H ₂ O ₂ after incubation in the ultrasound for 30 min silanol groups on the SiO ₂ surface generated. The thus chemically activated surfaces were highly hydrophilic and were directly reacted with aminopropyltriethoxysilane (APTES). To this was pipetted 10-15 μl of 5% APTES / ethanol (EtOH) solution and the substrate stored for 1 h in a EtOH vapor-filled chamber. An important factor in silanization is anhydrous work, since larger amounts of H ₂ O allow the silane groups to condense with each other and thus not form a homogeneous surface. The samples were then cleaned with EtOH and oven-baked for 15 mm at 110 ° C baked. Subsequently, the amino groups were converted to carboxy groups. For this purpose, 10 μl of glutaric anhydride (GA) solution (2 mg GA in 1 μl of dry dimethylformamide (DMF)) were added per sandwich and added to a chamber saturated with DMF vapor for 6 h.

Danach wurde abwechselnd mit DMF und doppelt destilliertem Wasser gespült. Zur Immobilisierung des aminofunktionalisierten DNA-Einzelstrangs wurden die carboxyfunktionalisierten Oberflächen mit N-Hydroxysuccinimid (NHS)/Diisopropyl-carbodiimid (DIC) aktiviert. Dabei wurden sogenannte Aktiv-Ester-Gruppen erzeugt, welche sehr hydrolyseempfindlich sind. Deshalb ist es bei diesem Schritt der Synthese wichtig wasserfrei und zügig zu arbeiten. Die Aktivierlösung bestand aus einer 1 molaren NHS und 1,5 molaren DIC-DMF Lösung 37,5 mg NHS in 250 μl. Daraus werden 76,7 μl entnommen und zu 23,23 DIC gegeben). Nach einer Inkubationszeit von 4 h in einer DMF-Dampf gesättigten Kammer, wurden die Oberflächen mit wasserfreiem Aceton gereinigt und es konnten nun die aminofunktionalisierten Oligonukleotide an die Glasoberfläche gebunden, d. h. immobilisiert werden.Thereafter, it was rinsed alternately with DMF and double distilled water. To immobilize the amino-functionalized DNA single strand, the carboxy-functionalized surfaces were activated with N-hydroxysuccinimide (NHS) / diisopropylcarbodiimide (DIC). In this case, so-called active ester groups were generated, which are very sensitive to hydrolysis. Therefore, it is important in this step of the synthesis to work anhydrously and quickly. The activating solution consisted of a 1 molar NHS and 1.5 molar DIC-DMF solution 37.5 mg NHS in 250 μl. From this, 76.7 μl are removed and added to 23.23 DIC). After an incubation period of 4 h in a DMF vapor saturated chamber, the surfaces were cleaned with anhydrous acetone and the amino-functionalized oligonucleotides could now be bound to the glass surface, i. H. be immobilized.

Die verwendete Einzelstrang-DNA hat in diesem Ausführungsbeispiel folgenden Aufbau:
Atto590-CAA CAG CGA CTA CAT CAA CAT GAG GTC GA-NH₂.The single-stranded DNA used in this embodiment has the following structure:
Atto590-CAA CAG CGA CTA CAT CAA CAT GAG GTC GA-NH ₂ .

Diese wurde in einer 0,1 μM Lösung zu 40 μl auf die NHS/DIC – aktivierte Oberfläche pipettiert und in einer mit dem Dampf, einer phosphatgepufferten Salzlösung (PBS) gefüllten Kammer für 6 h gelagert. Um die überschüssigen Aktivester-Gruppen zu binden wurde anschließend Hydroxylamin verwendet, welches in großer Konzentration auf die Oberflächen gegeben und für 1 h auf den Proben gelassen wurde. Anschliessend wurde die DNA-funktionalisierte Oberfläche mit einem komplementären Teilstrang, der am 3' Ende Atto488 als Donorfarbstoff trägt, bei 50°C hybridisiert. Dieser Teilstrang hat den Aufbau Atto488-ACC TCA TGT TGA. Das resultierende Sensorsystem ist in 1 dargestellt, aus der auch die Strukturen der als Donor bzw. Akzeptor eingesetzten Fluoreszenzfarbstoffe Atto 590 und Atto 488 zu entnehmen sind.This was pipetted onto the NHS / DIC activated surface in a 0.1 μM solution of 40 μl and stored in a chamber filled with the vapor, a phosphate buffered saline (PBS) for 6 h. To bind the excess active ester groups, hydroxylamine was then used, which was added to the surfaces in high concentration and left on the samples for 1 h. Subsequently, the DNA-functionalized surface was hybridized with a complementary partial strand, which carries Atto488 as donor dye at the 3 'end, at 50 ° C. This sub-string has the construction Atto488-ACC TCA TGT TGA. The resulting sensor system is in 1 which also shows the structures of the fluorescent dyes Atto 590 and Atto 488 used as donor or acceptor.

Die Funktionsfähigkeit des Sensors ist in 2a dargestellt für unterschiedlich starke Luftströmungen unter verschiedenen Anstellwinkeln. Man erkennt, dass die Energieübertragseffizienz, errechnet aus dem Intensitätsverhältnis von Donor und Akzeptor, in Abhängigkeit des Drucks steigt. Für flache Anstellwinkel zwischen 0° und 20° beobachtet man zunächst eine Abnahme der Energieübertragseffizienz. Diese Beobachtung erklärt sich durch einen Unterdruck, der bei flachen Anstellwinkeln auftritt und demonstriert, dass der Sensor reversibel arbeitet. 2b) zeigt eine Druckmessung unter einem Anstellwinkel von 0° bei der die Luft durch eine Halb-Röhre über die Probe geleitet wurde. Auf diese Weise wurden Verwirbelungen vermieden und der Sensor zeigte die Abhängigkeit der FRET-Effizienz vom angelegten dynamischen Druck.The functionality of the sensor is in 2a shown for different strong air flows at different angles of attack. It can be seen that the energy transfer efficiency, calculated from the intensity ratio of donor and acceptor, increases as a function of the pressure. For shallow angles of attack between 0 ° and 20 °, a decrease of the energy transfer efficiency is first observed. This observation is explained by a negative pressure that occurs at shallow angles of attack and demonstrates that the sensor works reversibly. 2 B ) shows a pressure measurement at an angle of attack of 0 ° at which the air was passed through a half-tube over the sample. In this way, turbulence was avoided and the sensor showed the dependence of the FRET efficiency on the applied dynamic pressure.

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Zitierte PatentliteraturCited patent literature

WO 2004/044865 [0004]

Zitierte Nicht-PatentliteraturCited non-patent literature

Meng and Sachs (J. Cell Sci. 124 (2), 261 ff (2011) [0007]

Claims

Sensor system for non-intrusive pressure measurements with a) a combination of a donor and an acceptor that provides a FRET signal upon excitation of the donor, and b) a linker between donor and acceptor wherein one end of the linker is immobilized on a surface.

Sensor system according to claim 1, characterized in that the immobilization of the linker takes place via a covalent bond.

Sensor system according to one of claims 1 or 2, characterized in that the linker is selected so that the distance between the donor and acceptor is without the action of a pressure to be determined in the range of 1 to 10 nm.

Sensor system according to one of claims 1 to 3, characterized in that short-chain double-stranded DNA segments are used as linkers.

Sensor system according to one of claims 1 to 4, characterized in that the donor or the acceptor or donor and acceptor are fluorescent dyes.

A method of measuring dynamic or static pressure changes, characterized in that a sensor system comprising a combination of a donor and an acceptor which upon stimulation provides a FRET signal and a linker between donor and acceptor, wherein one end of the linker is immobilized on a surface is used, this sensor system is exposed to the pressure change to be determined and the donor is excited with electromagnetic waves of a wavelength which is suitable for exciting the donor, and a FRET signal is detected by a suitable detection means.

Use of a combination of a donor and an acceptor which upon stimulation provides a FRET signal, wherein donor and acceptor are linked via a linker whose one end is immobilized on a surface for measuring pressures.