DE102011109063B3

DE102011109063B3 - Verfahren zum Nachweis von Biomolekülen

Info

Publication number: DE102011109063B3
Application number: DE102011109063A
Authority: DE
Inventors: Dr. Templin Markus; Fridolin Treindl; Anette Doetinger; Oliver Pötz
Original assignee: NMI Naturwissenschaftliches und Medizinisches Institut
Current assignee: NMI Naturwissenschaftliches und Medizinisches Institut
Priority date: 2011-07-28
Filing date: 2011-07-28
Publication date: 2012-12-20
Anticipated expiration: 2031-07-29
Also published as: US20140248715A1; CN103917873B; EP2737319B1; US10274485B2; CA2842995A1; WO2013013922A1; CA2842995C; EP2737319A1; CN103917873A

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von in einer komplexen biologischen Probe enthaltenen Biomolekülen, mit den Schritten: Auftrennen der biologischen Probe entsprechend zumindest einer physikalischen Eigenschaft der Biomoleküle in unterschiedliche Fraktionen; und spezifischer Nachweis von in den Fraktionen vorhandenen Biomolekülen mittels zumindest eines festphasenbasierten, immunologischen Nachweisverfahrens.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren, mit dem Biomoleküle, insbesondere Proteine und/oder Peptide bzw. zu Peptiden verdauten Proteinen in biologischem Material nachgewiesen werden können.
Derartige Verfahren sind aus dem Stand der Technik vielfach bekannt.
Der spezifische Nachweis von Biomolekülen, insbesondere von Proteinen und/oder Peptiden aus geringen Mengen biologischen Materials ist eine wichtige Voraussetzung für Forschung und medizinische Diagnostik.
Neue Entwicklungen zielen daher darauf ab, die Sensitivität von bekannten Nachweismethoden, insbesondere von Proteinnachweismethoden zu erhöhen. Insbesondere soll dabei eine größere Anzahl verschiedener Proteine oder Proteinvarianten gleichzeitig in einer Probe detektiert und quantifiziert werden können.
Technologische Entwicklungen, die signifikante Fortschritte bei der Detektion von Proteinen gebracht haben sind insbesondere die Massenspektrometrie und Mikroarray basierte Ansätze.
Massenspektometrische Methoden sind in der Lage, eine große Zahl verschiedener Proteinen eindeutig aus einer komplexen Probe nachzuweisen. Die Empfindlichkeit stellt dabei trotz großer Fortschnitte bei Separations- und Detektionstechniken einen kritischen Punkt dieser Technologie dar, denn systembedingt ist der sensitive Nachweis von Proteinen aus kleinen Probenmengen häufig nicht möglich.
Ein zweiter kritischer Punkt sind die Kosten, die mit der massenspektrometrischen Analyse verbunden sind. Um einen spezifischen Proteinnachweis zu ermöglichen, sind aufwändige und kostenintensive Probenvorbereitungs- und Proteinseparationstechniken erforderlich, wobei die Kosten für die dazu erforderliche apparative Ausstattung, d. h. das eigentliche Massenspektrometer, sehr hoch sind.
Dies hat dazu geführt, dass massenspektrometrische Analysen in wenigen spezialisierten Labors durchführt werden und nur ein geringer Anteil der verfügbaren diagnostischen Nachweisverfahren auf dieser Technik beruht.
Immunoassays, wie die Immunohistochemie, der direkte Immunoassay, und der Sandwich-Immunoassay, sind in Forschungslabors und auch bei klinischen Analysen deshalb die weitaus wichtigeren Analysemethoden. Sie erlauben in der Regel den spezifischen Nachweis von Proteinen in komplexen Proben ohne aufwändige Probenvorbereitung.
Die erreichbare Sensitivität kann bis in den femtomolaren Konzentrationsbereich reichen, wobei die Spezifität des Messsignals sehr hoch sein kann.
In den letzten Jahren wurden große Anstrengungen unternommen, um den Immunoassay von der Bestimmung einzelner Parameter in ein multiplexes Format zu bringen, um so eine größere Zahl verschiedener Proteine gleichzeitig nachweisen zu können.
So sind zum Beispiel Proteinmikroarrays, die als Festphasenassays auf planaren Trägern oder auf Mikrosphären eine signifikante Miniaturisierung der Immunoassays darstellen, entwickelt worden, die es erlauben, Duzende bis Hunderte von verschiedenen Proteinen aus wenigen Mikrolitern Probevolumen zu detektieren und zu quantifizieren.
Problematisch ist bei diesen, auf Antikörpern basierten Ansätzen zum einen das Fehlen von affinen Bindemolekülen, also von Antikörpern, die die Vorrausetzung für einen sensitiven und spezifischen Immunoassay sind. Zum anderen sind die Kreuzreaktivität der eingesetzten Antikörper untereinander und die Kreuzreaktivität mit verschiedenen Analytproteinen problematisch.
Diese Limitierungen führen beim gleichzeitigen Nachweis von mehr als etwas 20 Proteinen häufig dazu, dass die Sensitivität des Nachweisverfahrens deutlich absinkt.
Bekannt ist es auch, in einem Immunoblot, dem sogenannten Western-Blot, Proteine zunächst mit Hilfe einer Gel-Elektrophorese in einer Trägermatrix entsprechend ihrer Größe, Ladung oder anderen physikalischen Eigenschaften in Banden aufzutrennen und die Banden dann auf eine Membran zu übertragen, wo die Proteine dann für Antikörper-Bindungen zugänglich sind.
Dieses Verfahren ist mit denselben Nachteilen behaftet, wie die oben beschrieben Immunoassays.
Die DE 603 17 315 T2 beschreibt ein Verfahren zum Nachweis von DNA-bindenden Proteinen aus einer Protein-Probe. Dazu wird eine Probe mit markierten Proteinen bereitgestellt, wobei die Proteine dann an Mikrosphären über einen Detektionskomplex gebunden werden, der an die Mikrosphären gekoppelt ist. So an die Mikrosphären gebundene Proteine können mittels Antikörpern detektiert werden.
Meehan et al.,: Proteomics and the Search for Biomarkers of Female Reproductive Diseases, Reproduction (2010) 140 (4), Seiten 509–519 beschreiben die präparative Auftrennung von Zellextrakten in einzelne Fraktionen durch 2-D-Elektrophorese mit anschließender Elution von Protein-Untergruppen.
Die WO 2004/074452 A2 beschreibt die Multiplexanalyse von Proteinen mit Hilfe von einzelnen Sätzen von Mikrosphären-Populationen mit individueller Fluoreszenzsignatur, wobei die Mikrosphären individuelle Liganden tragen.
Aus dem Dynabeads^® Streptavidin Trial Kit ist es bekannt, Streptavidin-Mikrosphären zur Bindung biotinylierter Proteine, Antikörper oder Nukleinsäuren zu verwenden.
Vor diesem Hintergrund liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein einfaches und preiswert durchzuführendes Verfahren der eingangs genannten Art zu schaffen, mit dem eine Vielzahl von Biomolekülen, insbesondere Proteinen oder Peptiden, bzw. zu Peptiden verdauten Proteinen aus geringen Mengen von biologischem Material spezifisch und sensitiv nachgewiesen werden kann.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe gelöst durch ein Verfahren der eingangs genannten Art, mit den Schritten:

a) Auftrennen der biologischen Probe entsprechend zumindest einer physikalischen Eigenschaft der Biomoleküle in unterschiedliche Fraktionen; und
b) spezifischer Nachweis von in den Fraktionen vorhandenen Biomolekülen mittels zumindest eines festphasenbasierten, immunologischen Nachweisverfahrens, wozu die Biomoleküle aus den einzelnen Fraktionen an für jede Fraktion spezifische, voneinander unterscheidbare Mikrosphärenpopulationen immobilisiert werden, wobei die auf die Matrix übertragenen Biomoleküle/Proteine zur Bindung an ein Trägermoleküle wie Avidin oder Streptavidin modifiziert, vorzugsweise biotinyliert werden.

Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird auf diese Weise vollkommen gelöst.
Unter einer „komplexen biologischen Probe” wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Probe verstanden, die ein Gemisch aus unterschiedlichen Biomolekülen enthält, die natürlichen Ursprungs sein können oder synthetisch/gentechnologisch hergestellt wurden. Die Probe kann dabei auch aus einer kleinen Menge an Gewebe, beispielsweise Biopsiematerial, oder aus kultivierten Zellen bestehen.
Unter Biomolekülen werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung solche Moleküle verstanden, die aus einer biologischen Probe im obigen Sinne stammen, und dem erfindungsgemäßen Verfahren zugänglich sind. Insbesondere Proteine, Peptide und Polysaccharide zählen zu den so definierten Biomolekülen.
Die Auftrennung in Schritt a) erfolgt dabei beispielsweise über Säulenchromatographie und der spezifische Nachweis im Schritt b) mittels Mikrosphären.
Erfindungsgemäß wird also nach Fraktionierung der komplexen biologischen Probe ein Mikrosphären basierter Immunoassay, also ein multiplexes, miniaturisiertes System, genutzt, um aus geringer Probenmenge Hunderte von Proteinen in einem Immunoassay nachzuweisen.
Die im Schritt a) erhaltene Auftrennung der Biomoleküle nach der physikalischen Eigenschaft, also die Ansammlung der Biomoleküle in den verschiedene Werte der physikalischen Eigenschaft repräsentierenden Fraktionen, wird durch die Bindung der Biomoleküle an die Mikrosphären sozusagen eingefroren. Die Zuordnung der einzelnen Biomoleküle zu den Fraktionen kann auch nach dem Mischen der Mikrosphären aus einigen oder allen Fraktionen nachträglich wieder abgerufen und/oder zur weiteren Auswertung verwendet werden, weil die für verschiedene Fraktionen verwendeten Mikrosphären – beispielsweise über ihre Färbung – voneinander unterscheidbar sind.
Erfindungsgemäß wird also zunächst ein physikalisches Verfahren zur Auftrennung der Biomoleküle eingesetzt, wobei die erhaltenen Fraktionen dann auf verschiedenen Populationen von Mikrosphären erneut immobilisiert werden.
Unerwartet an dem neuen Verfahren ist, dass nach dem Beladen der Mikrosphären mit unbekannten Biomolekülen, insbesondere Proteinen/Peptiden, eine immunologische Auswertung möglich ist, so dass keine massenspektroskopische Auswertung erforderlich ist.
Der Nachweis der dann angereichert auf den Mikrosphären (Beads) vorliegenden Biomoleküle erfolgt beispielsweise nach Mischen der Mikrosphären in einem multiplexen Immunoassay. Für diesen Assay können alle Beadpopulationen (d. h. alle Fraktionen) gemischt und gleichzeitig mit einem Antikörper inkubiert werden.
Als Mikrosphärenpopulationen können dabei beispielsweise solche aus der xMAP^® Technologie der Firma Luminex Corp., Austin, Texas eingesetzt werden. Diese Technologie verwendet bis zu 500 unterschiedlich farbkodierte Mikrosphärenpopulationen oder -sätze, die in einem entsprechenden Lesegerät einzeln erkannt werden können.
Für jeden Satz von identisch kodierten Mikrosphären können optische Signale der an die Mikrosphären gebundenen Substanzen gemessen und als Summensignal ausgegeben werden.
Werden verschieden farbkodierte Sätze von Mikrosphären mit unterschiedlichen Substanzen beladen, so können in einem Auswertegang für die verschiedenen Sätze von identisch farbkodierten Mikrosphären die optischen Signale erfasst und in Zuordnung zu dem jeweiligen Satz von Mikrosphären dargestellt werden.
Erfindungsgemäß wird also das Auftrennvermögen von physikalischen Verfahren wie der ein-dimensionalen oder zwei-dimensionalen Gelelektrophorese oder der isoelektrischen Fokussierung mit der Flexibilität und der Nachweisempfindlichkeit von Bead-basierten Assaysystem kombiniert.
In einer Ausführung des neuen Verfahrens werden alle in der Probe vorhandenen Proteine denaturiert, mit Hilfe ein-dimensionaler SDS-Gelelektrophorese aufgetrennt und mit Hilfe des Western-Blot Verfahrens auf eine Trägermembran übertragen und darauf immobilisiert.
Nach Biotinylierung der immobilisierten Proteine wird diese Matrix wird dann in Spalten von ca. 1 cm Breite und 5–10 cm Länge zerschnitten, die alle Proteine der Probe enthalten. Danach werden die Spalten in 0.5 mm breite Streifen zerschnitten. Aus jedem einzelnen Streifen wird dann das Protein eluiert und jeweils an unterscheidbare Beadpopulationen gebunden. Von jedem Streifen wird genügend Protein elutiert, um mehrere Tausend Mikrosphären zu belegen. Das Signal wird dann in einem direkten Bead-basierten Immunoassay generiert, wozu ca. 100 Mikrosparen pro Assay notwendig sind. Damit können mehrere hundert Assays mit den aus einer Fraktion generierten Mikrosphären durchgeführt werden.
Vor diesem Hintergrund ist es bevorzugt, wenn in Schritt a) die biologische Probe gelelektrophoretisch aufgetrennt und das entstehende Bandenmuster vorzugsweise auf eine Matrix übertragen wird, und weiter vorzugsweise in Schritt a) die Matrix mechanisch in kleine Abschnitte zerteilt und danach aus den einzelnen Abschnitten die Biomoleküle in jeweilige Fraktionen eluiert werden, wobei vorzugsweise die Matrix in zumindest eine Spalte und die zumindest eine Spalte in mehrere Streifen zerschnitten wird, wobei die zumindest eine Spalte in zumindest 10, vorzugsweise 20 bis 200 Streifen zerschnitten wird.
Diese gelelektrophoretische Auftrennung hat gegenüber einem säulenbasierten Verfahren den Vorteil, dass viele Proben gleichzeitig parallel aufgetrennt werden können. Weiter ist die einfache und kostengünstige Durchführung der gelbasierten Verfahren von Vorteil. Ferner lassen sich die an die Matrix gebundenen Biomoleküle besser biotinylieren als die in Fraktionen nach einer Säulenauftrennung enthaltenen Biomoleküle.
Während es auch möglich ist, das Gel selbst mechanisch zu zerteilen, also in Spalten und Streifen zu zerschneiden, ist diese mechanische Manipulation bei einer Matrix, insbesondere bei einer in einem Western Blot verwendeten Matrix, leichter und reproduzierbarer durchzuführen.
Durch das mechanische Zerteilen von Gel oder Matrix werden die in den Banden nach der physikalischen Eigenschaft getrennten Biomoleküle/Proteine/Peptide auf die Abschnitte/Streifen verteilt und räumlich voneinander getrennt.
Dabei ist es nicht erforderlich, das Gel nach der Auftrennung anzufärben, denn die entstehenden Banden müssen für den weiteren Ablauf des neuen Verfahrens nicht sichtbar sein. Die Kontrolle, ob die Auftrennung erfolgreich war, kann auf der Ebene der Mikrosphären erfolgen.
Die Erfindung schafft somit ein Verfahren, das in der Lage ist, verschiedene Biomoleküle, die in einer komplexen Probe vorhanden sind, mit Hilfe eines multiplexen Immunoassays nachzuweisen.
Dabei ist es bevorzugt, wenn in Schritt b) die mit den Biomolekülen belegten Mikrosphären aus zumindest mehreren Fraktionen miteinander zu einer Mastermischung gemischt werden und vorzugsweise diese Mastermischung danach in Aliquots aufgeteilt wird, weiter vorzugsweise in Schritt b) zu zumindest einem Aliquot ein spezifisches Bindungsmolekül, vorzugsweise ein Antikörper gegeben wird, wobei das Bindungsmolekül zur Abgabe eines vorzugsweise optisch detektierbaren Signals ausgelegt ist, wobei ferner vorzugsweise in Schritt b) für die Biomoleküle aus einem Aliquot nach den Mikrosphärenpopulationen auftrennt die Intensität des detektierbaren Signals bestimmt wird.
Aus der Mastermischung können dabei viele Aliquots entnommen werden, die jeweils gegen einen Antikörper getestet werden.
Die Proteine können dabei in Schritt a) vor der elektrophoretischen Auftrennung denaturiert werden, wobei die biologische Probe in Schritt a) vor der elektrophoretischen Auftrennung vorbehandelt werden kann, um die Proteine zu Peptidfragmenten abzubauen, so dass in Schritt b) die Peptidfragmente nachgewiesen werden.
Durch diese Kombination von Schritten ergeben sich verschiedene Vorteile.
Als überraschend hat sich ergeben, dass das für die verschiedenen Werte der physikalischen Eigenschaften, also für die einzelnen Fraktionen jeweils erhaltene Fluoreszenzsignal um so höher ist, je schmaler der Streifen aus der Matrix ausgeschnitten wurde. Durch die Auflösung der mechanischen Zerteilung wird somit die Sensitivität des neuen Verfahrens beeinflusst.
Mit einer geringen Menge an Probenmaterial kann eine große Anzahl von Messungen durchgeführt werden. Mit 10 μg Protein, wie es üblicherweise für den Nachweis von einem Protein in Western Blot genutzt wird, kann eine Mastermischung erstellt werden, mit der Hunderte von Messungen durchgeführt werden können.
Aus 20.000 bis 50.000 Zellen oder 5 bis 20 μg zellulären Proteins lassen sich nach ersten Versuchen der Erfinder einige Dutzend bis mehrere Hundert verschieden Proteine nachweisen.
An das Material aus einer Western-Blot-Spur lassen sich nach Aliquotierung beispielsweise bis zu 96 verschiedene Antikörper binden, so dass bis zu Tausend Messungen möglich sind. Dies erlaubt eine umfassende Charakterisierung des untersuchten Materials, so dass sogar die Untersuchung zellulärer Signalübertragung wie die Phosphorylierungskaskaden möglich ist.
Das neue Verfahren zeigt auch eine sehr gute Auflösung. Eine Western-Blot Spur kann beispielsweise in bis zu 96 Fraktionen aufgeteilt werden. Damit können Proteine, die in verschiedenen Isoformen mit unterschiedlichem Molekulargewicht vorliegen, prozessierte Proteine und modifizierte Proteine unterschieden und mit einem Antikörper detektiert werden.
Wegen der Fraktionierung der Proteine mit Hilfe der Gelelektrophorese lassen sich jetzt vermehrt auch unspezifische Antikörper einsetzen, so dass die eingangs erwähnten Probleme vermeiden werden können.
Darüber hinaus ergibt sich eine gute Dynamik des Systems, weil spezifische Signale aus positiven Fraktionen aufsummiert werden. Versuche mit verschiedenen Antikörpern haben ergeben, dass eine Dynamik von über 10.000 bei guter Linearität möglich ist.
Spike-in Experimente mit rekombinanten Fusionsproteinen haben gezeigt, dass die Quantifizierung eines intrinsischen Proteins mit diesen internen Standards möglich ist.
Durch Mischen von Proben, die auf verschiedenen Beadpopulation immobilisiert wurden, und Vermessen der gemischten Proben in einer Reaktion, ist eine vergleichende Messung verschiedener Proben und eine interne Standardisierung möglich. Dies ist insbesondere relevant, weil so Tumor- und Normalgewebe oder Tumorgewebe vor und nach einer Behandlung in einer einzigen Messung verglichen werden können.
Die Anwendung des neuen Verfahrens ist insbesondere interessant bei limitierenden Probenmengen, wie beispielsweise bei klinischem Tumormaterial oder bei nach Laser Capture Mikrodissektion erhaltenen Tumorzellpopulationen. Auf diese Weise lassen sich Tumormarker nachweisen und eine Analyse der Signalübertragung durchführen.
Ferner lässt sich das neue Verfahren anwenden in der Analyse von modifizierten Proteinen. So kann beispielsweise im Rahmen der Phosphoproteomics der Nachweis der Phosphorylierung erfolgen. Ferner können epigentische Veränderungen wie Histonmodifikationen nachgewiesen werden.
Überraschend an dieser Kombination von zwei Nachweisverfahren ist insbesondere, dass das Signal-Rausch-Verhältnis bei der Auswertung der beladenen Mikrosphären um so besser wird, je schmaler die ausgeschnittenen Banden sind, denn je schmaler die ausgeschnittene Bande ist, um so ”reiner” ist das eluierte Protein.
Die Biotinylierung der auf der Membran gebundenen Proteine erlaubt es dabei, auch geringe Mengen Protein auf den Mikrosphären zu immobilisieren. Die extrem hohe Affinität der Biotin-Streptavidin Interaktion führt dazu, dass Streptavidin-Beads auch mit wenig Material beladen werden können und eine gute Belegungsdichte erreicht wird.
Weitere Vorteile ergeben sich aus der Beschreibung und der beigefügten Zeichnung.
Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Die Erfindung wird nachstehend anhand von Beispielen beschrieben, die anhand der Figuren erläutert werden, in denen
1A bis H die einzelnen Verfahrensschritte des neuen Verfahrens zeigen;
2A und B zwei Balkendiagramme zu dem Nachweis von ERK1/ERK2 aus einer humanen Leberzelllinie zeigen;
3A und B zwei Balkendiagramme und eine Regressionskurve zu der Quantifizierung von ERK1 in humanen Leberzelllinie zeigen;
4A und B zwei Balkendiagramme zu dem Nachweis von ERK1/ERK2 in Tumorgewebe zeigen; und
5A und B je zwei Balkendiagramme zu dem Nachweis der Aktivierung eines Regulators in zwei verschiedenen Tumorgeweben zeigen.
Beispiel 1: Nachweis von Proteinen aus geringem Mengen biologischen Materials
In 1A bis H sind bei A beginnend die wesentlichen Schritte des neuen Verfahrens vereinfachend dargestellt.
Zunächst werden die in einer komplexen biologischen Probe vorliegenden Proteine nach einem gängigen Protokoll denaturiert.
Danach erfolgt mittels Gelelektrophorese auf einem SDS-Gel eine Auftrennung der Proteine nach dem Molekulargewicht (1A). Dieses Bandenmuster wird dann – wie bei einem Western-Blot – auf eine Protein-bindende Membran übertragen (1B).
Die jetzt auf der Membran gebundenen Proteine werden durch Einführung von Biotin modifiziert (1C). Die Proteinbanden liegen jetzt in mehreren Spalten nebeneinander vor. Eine dieser Spalten wird jetzt mechanisch aus der Membran ausgeschnitten und in viele schmale Streifen geschnitten (1D).
Dabei sind die Streifen in Längsrichtung der Spalten so kurz, dass sich eine Proteinbande auf mehrere benachbarte Streifen aufteilten kann.
Aus jedem Streifen wird das Protein jetzt in wässrige Lösung eluiert, so dass aus einem Membranstreifen 20 bis 200 Fraktionen generiert werden (1E).
Zu jeder Fraktion wird jetzt eine unterscheidbar farbkodierte Mikrosphärenpopulation gegeben, wobei jede Mikrosphäre mit Streptavidin belegt ist, so dass das Protein auf den Mikrosphären immobilisiert wird (1F). Auf diese Weise werden 20 bis 200 mit Protein aus verschiedenen Streifen beladene, über ihre Farbkodierung unterscheidbare Mikrosphärenpopulationen erzeugt.
Diese Mikrosphärenpopulationen werden dann zunächst miteinander vermischt, woraufhin die Mischung dann in bis zu 500 Aliquots aufgeteilt wird. Jedes Aliquot enthält dabei mindestens 100 Mikrosphären aus jeder Fraktion. Zu jedem Aliquot wird jetzt ein spezifischer Antikörper gegeben, der spezifisch an eines der in der komplexen Probe nachzuweisenden Proteine bindet (1G).
Diese Antikörper sind beispielsweise fluoreszenzmarkiert, so dass über die Kombination der Messwerte für das Farbsignal (Identifizierung des Streifens) und das Fluoreszenzsignal (Protein erkannt) und die Aufsummierung der Fluoreszenzsignale für jedes Mikrosphärenpopulation ein bestimmtes Protein identifiziert und quantifiziert werden kann.
Wird das Fluoreszenzsummensignal über den über die Mikrosphärenpopulationen identifizierten Fraktionen, also dem Molekulargewicht dargestellt, so lassen sich spezifische (schraffiert in 1H) von unspezifischen (Hell in 1H) unterscheiden und quantifizieren.
Beispiele 2: Nachweis von ERK1 und ERK2 in humanen Leberzelllinien
15 μg Proteinextrakt aus einer humanen Leberzelllinie (HepG2) wurden nach SDS-Gelelektrophorese im Western-Blot auf Anwesenheit der Proteine ERK1 und ERK2 mit dem in 1 gezeigten Verfahren untersucht.
Ein erster Antikörper, der die Proteine ERK1 und ERK2 erkennt, wurde in einer ersten Analyse (A) eingesetzt. Ein zweiter Antikörper, der phosphoryliertes ERK1 und ERK2 erkennt, wurde in einer zweiten Analyse (B) eingesetzt.
Gemessen wurden die Fluoreszenzsummensignale für 96 Beadpopulationen, die jeweils mit den von den Membranstreifen eluierten Proteinen belegt wurden. Zur Messung wurden alle 96 Beadpopulationen gemischt und 100.000 Beads, also etwa 1000 Beads pro Population, mit Antikörpern inkubiert.
Gezeigt sind in 2 zwei Balkendiagramme mit den gemessenen Signalintensitäten und die Aufnahme eines Blotstreifens der in einem Standard Western-Blot entwickelt wurde.
Die beiden Proteine lassen sich unterscheiden und quantifizieren.
Beispiel 3: Quantifizierung von ERK1 in humanen Leberzelllinien
Auf ein SDS-Polyacrylamid Gel wurde in 4 Spuren jeweils 20 μg Zelllysat der humanen Leberzelllinie HepG2 aufgetragen.
Zur ersten Probe wurden 20 ng gereinigtes GST-ERK1 Fusionsprotein zugefügt, zur nächsten 4 ng, dann 0.8 ng, dann 0.16 ng. Nach elektrophoretischer Auftrennung wurden die Proteine auf eine Membran übertragen und mit Biotin modifiziert.
Die vier einzelnen Spuren wurden anschließend in jeweils 60 Streifen geschnitten und die Proteine wieder von der Oberfläche der Streifen gelöst; die generierten Eluate der einzelnen Streifen wurden auf 60 unterschiedbare Mikrosphärenpopulationen immobilisiert und zu einem Mastermix vereinigt.
Somit lagen in diesem Experiment 4 Ansätze vor, bei denen gleiche Mengen an HepG2 Zell-Lysat vorhanden waren (und damit auch gleiche Mengen intrinsisches ERK1 und ERK2 vorlagen) aber unterschiedliche, definierte Mengen an GST-ERK1 Fusionsprotein.
Durch Inkubation der 4 Proben mit einem spezifischen anti-ERK Antikörper konnten Meßsignale (relative Fluoreszenzintensität) für ERK1, ERK2 und das GST-ERK1 Fusionsprotein generiert werden. Zur Messung wurden 100.000 Beads – entspricht etwa 1000 Beads pro Population – mit dem ERK1/2 spezifischen Antikörper inkubiert. Aus den Signalen für die bekannten Mengen des Fusionsproteins wurde eine Standardkurve erstellt und Mithilfe dieser Kurve die absolute Menge an ERK1 berechnet.
In dem Balkendiagramm in 3A sind Signale für die HepG2 Probe mit 4 ng GST-ERK1 Fusionsprotein gezeigt; Peaks mit dem Molekulargewicht 65 kDa, 42 kDa und 39 kDa korrespondieren mit GST-ERK1, ERK2 und ERK1.
In 3B rechts ist die relative Fluoreszenzintensität des intrinsischen ERK1 in den 4 Spuren gezeigt.
Beispiel 4: Analyse von in limitierter Menge vorliegendem Tumormaterial
Gefrorenes Tumorgewebe wurde geschnitten und histologisch beurteilt. In den untersuchten Schnitten konnten zwei histologisch unterscheidbare Tumorbereiche identifiziert werden.
Mittels lasergestützter Mikrodissektion wurden aus beiden Bereichen ungefähr 20.000 Zellen entnommen. Die enthaltenen Proteine wurden in detergenzhaltigem Lysepuffer solubilisiert.
Für beide Tumorbereiche wurden gemäß dem Verfahren nach 1 die Proteine durch Geleelektrophorese nach Größe getrennt und jeweils 96 Proteinfraktionen generiert. Die Immobilisierung der Fraktionen für die beiden Tumorbereiche erfolgte auf 192 unterscheidbaren Beadpopulationen. Diese wurden zur Messung kombiniert. So konnten beide Proben vergleichend in einem Assay auf Unterschiede in der Proteinexpression untersucht werden.
Der große Vorteil des neuen Verfahrens liegt in der Anzahl der nun möglichen Analysen. Mit den verfügbaren 20.000 Zellen lassen sich bis zu 200 Assays durchführen. Mit einem üblichen Western-Blot können mit diesem Material nur 1–8 Assays durchgeführt werden.
In einer vergleichenden Analyse wurde die Expression von 54 Proteinen untersucht. Für den größten Teil der untersuchten Analyten (45/54) wurden keine auffälligen Änderungen der Expression zwischen den Proben detektiert; siehe 4, wo wieder die Fluoreszenzsummensignale über dem Molekulargewicht gezeigt sind.
Aus 4 ist zu erkennen, dass mit Hilfe eines ERK1/2 spezifischen Antikörpers die Expression der Gesamtmenge an ERK1 (schraffierte Balken) und ERK2 (graue Balken) detektiert werden können. Beide Proteine sind detektierbar, Unterschiede in der Expression der Kinasen wurde nicht gefunden.
Signifikante Änderungen wurden für einen kleinen Anteil der Analyten detektiert. Vor besonderer Signifikanz ist dabei der Nachweis der Aktivierung eines zentralen Regulators des zellulären Wachstums.
Mit Hilfe eines spezifischen Antikörpers wurde die Expression der Gesamtmenge des Regulators aus Tumor A und Tumor B bestimmt; siehe 5A.
Mit Hilfe eines aktivierungsspezifischen Antikörpers wurde ferner die Menge an aktiviertem Regulators bestimmt, sieh 5B. Dabei ergab sich ein Verhältnis von 83:1 für Tumor B:Tumor A.

Claims

Verfahren zum Nachweis von in einer komplexen biologischen Probe enthaltenen Biomolekülen, mit den Schritten a) Auftrennen der biologischen Probe entsprechend zumindest einer physikalischen Eigenschaft der Biomoleküle in unterschiedliche Fraktionen; und b) spezifischer Nachweis von in den Fraktionen vorhandenen Biomolekülen mittels zumindest eines festphasenbasierten, immunologischen Nachweisverfahrens, wozu die Biomoleküle aus den einzelnen Fraktionen an für jede Fraktion spezifische, voneinander unterscheidbare Mikrosphärenpopulationen immobilisiert werden, wobei die aufgetrennten Biomoleküle zur Bindung an ein Trägermoleküle wie beispielsweise Avidin oder Streptavidin modifiziert, vorzugsweise biotinyliert werden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt a) die biologische Probe gelelektrophoretisch aufgetrennt wird.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt a) das entstehende Bandenmuster auf eine Matrix übertragen wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–3, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt a) die Matrix mechanisch in kleine Abschnitte zerteilt und danach aus den einzelnen Abschnitten die Biomoleküle in jeweilige Fraktionen eluiert werden.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Matrix in zumindest eine Spalte und die zumindest eine Spalte in mehrere Streifen zerschnitten und danach aus den einzelnen Streifen die Biomoleküle in jeweilige Fraktionen eluiert werden.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die zumindest eine Spalte in zumindest 10, vorzugsweise 20 bis 200 Streifen zerschnitten wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt b) die mit den Biomolekülen belegten Mikrosphären aus zumindest mehreren Fraktionen miteinander zu einer Mastermischung gemischt werden
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt b) die Mastermischung in Aliquots aufgeteilt wird.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt b) zu zumindest einem Aliquot ein spezifisches Bindungsmolekül wie beispielsweise ein Antikörper gegeben wird, wobei das Bindungsmolekül zur Abgabe eines vorzugsweise optisch detektierbaren Signals ausgelegt ist.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt b) für die Biomoleküle aus einem Aliquot nach den Mikrosphärenpopulationen getrennt die Intensität des detektierbaren Signals bestimmt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Biomoleküle in Schritt a) vor der elektrophoretischen Auftrennung denaturiert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Biomoleküle Proteine sind.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die biologische Probe in Schritt a) vor der Auftrennung vorbehandelt wird, um die Proteine zu Peptidfragmenten abzubauen, und dass in Schritt b) die Peptidfragmente nachgewiesen werden.