DE102011108346A1

DE102011108346A1 - Verwendung von Hemmstoffen der TMPRSS2 als Arzneimittel

Info

Publication number: DE102011108346A1
Application number: DE102011108346A
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Garten; Eva Friebertshäuser; Prof. Dr. Steinmetzer Torsten; Daniela Meyer; Maya Hammami; Frank Sielaff
Original assignee: Philipps Universitaet Marburg
Current assignee: Philipps Universitaet Marburg
Priority date: 2011-07-25
Filing date: 2011-07-25
Publication date: 2013-01-31
Also published as: EP2736500A1; WO2013014074A1

Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Hemmstoffen gemäß der allgemeinen Formel Izur Behandlung viraler Infektionen, speziell für die Behandlung von Influenzainfektionen, zur Therapie von inflammatorischen Atemwegserkrankungen oder zur Hemmung der Serinprotease TMPRSS2, wobei X ein CH oder N, R1 ein substituierter zyklischer Sulfonylrest, R2 eine unsubstituierte oder substituierte Amidinogruppe und R3 eine als Amid gekoppelte sekundäre Amingruppe ist.

Description

Die vorliegende Erfindung beschreibt die Verwendung von Hemmstoffen der Serinprotease TMPRSS2 zur Herstellung von Arzneimitteln, die zur Behandlung von Erkrankungen einsetzbar sind, bei denen diese Protease beteiligt ist. So sind Hemmstoffe der TMPRSS2 für die Behandlung virusbedingter Erkrankungen geeignet, beispielsweise von Influenzainfektionen. Die Inhibitoren sind auch für die Therapie inflammatorischer Atemwegserkrankungen einsetzbar.
Beschreibung und Stand der Technik
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Na-sulfonylierten sekundärer Amiden substituierter Phenylalanine oder Azaphenylalanine als Hemmstoffe der Serinprotease TMPRSS2 zur Herstellung von Arzneimitteln, die für die Therapie und/oder Prophylaxe von viralen Erkrankungen eingesetzt werden können. Ebenso ist eine Verwendung dieser Verbindungen zur Therapie und/oder Prophylaxe von inflammatorischen Atemwegserkrankungen möglich.
Das Gen für die Serinprotease TMPRSS2 wurde erstmals 1997 identifiziert (Paolini-Giacobino, Genomics 44, 309–320 (1997)). Für die TMPRSS2 wurde beschrieben, dass sie an viralen Erkrankungen beteiligt sein kann, beispielsweise an Influenza- oder Metapneumovirus-Infektionen (Böttcher et al., J. Virology 80, 9896–9898 (2006), Böttcher et al. Vaccine 27, 6324–6329 (2009); Böttcher et al. J Virol. 84, 5605–5614 (2010); Chaipan et al., J. Virology 83, 3200–3211 (2009), Shirogane et al., J. Virology 82, 8942–8946 (2008)), aber auch bei Infektionen mit dem SARS-Coronavirus (severe acute respiratory syndrome coronavirus, Matsuyama et al., J. Virol. 82 (2010) 12658–12664).
Erste substratanaloge synthetische Inhibitoren der TMPRSS2 wurden vor kurzem beschrieben, die TMPRSS2 mit K_i-Werten > 10 nM hemmen ( WO 2010/149459 ).
Diese Verbindungen besitzen jedoch eine geringe Selektivität und hemmen auch andere trypsinartige Serinproteasen. Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zu Grunde, für therapeutische Anwendungen geeignete, alternative Wirkstoffe bereitzustellen, die die Serinprotease TMPRSS2 mit hoher Aktivität inhibieren und daher für die Behandlung von Erkrankungen geeignet sind, bei denen diese Protease beteiligt ist.
Durch ein Screening bekannter Hemmstoffe trypsinartiger Serinproteasen, die beispielsweise bereits als Inhibitoren der Proteasen Matriptase, Urokinase (uPA) und Thrombin beschrieben wurden (für Urokinase: z. B. Stürzebecher et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 9, 3147-3152 (1999); für Matriptase: z. B. Steinmetzer et al., J. Med. Chem. 49, 4116-4126, (2006); Steinmetzer et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 19, 67–73, (2009); Schweinitz et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 19, 1960-1965, (2009), für Thrombin: Stürzebecher et al. J. Med. Chem. 40, 3091–3099, (1997)) haben wir überraschenderweise Verbindungen gefunden, die die TMPRSS2 wirksam hemmen und deshalb für die Behandlung von Erkrankungen einsetzbar sind, die durch die Protease TMPRSS2 vermittelt oder verstärkt werden.
Als geeignete Hemmstoffe der TMPRSS2 und damit zur Behandlung von viral bedingten Erkrankungen oder Atemwegserkrankungen, die mit der TMPRSS2 in Zusammenhang stehen, erwiesen sich Na-sulfonylierte sekundäre Amide substituierter Phenylalanine oder Azaphenylalanine der allgemeinen Formel (I),
wobei

• X CH oder N ist, und
• R₁ ein einfach oder mehrfach substituierter oder unsubstituierter zyklischer Aryl- oder Heteroarylrest ist, der ein bis drei Ringe enthalten kann, die entweder aneinander gebunden oder miteinander fusioniert sind, und
• R₂ eine Amidinogruppe der folgenden Struktur ist,
in der R₄ bevorzugt H ist, aber auch -OH, -OCH₃ und -O-CO(CH₂)_nCH₃ mit n gleich eine ganze Zahl von 0 bis 5 sein kann, und
• R₃ eine sekundäre Amingruppe ist, die über eine Amidbindung an das zentrale Phenylalanin- oder Azaphenylalanin-Derivat gebunden ist und mehrfach substituiert oder unsubstituiert sein kann.

Die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) sind im Sinne der Anmeldung als Prodrugs anzusehen, wenn der Rest R₄ an der Gruppe R₂ gleich -OH, -OCH₃ oder -O-CO(CH₂)_nCH₃ mit n gleich eine ganze Zahl von 0 bis 5, ist. Deren Umwandlung in eine unsubstituierte Amidinogruppe mit R₄ gleich H ist in der Literatur ausführlich beschrieben und führt im Organismus zum eigentlich wirksamen Inhibitor (Ettmayer et al., J. Med. Chem. 47, 2393–2404 (2004)).
Als sehr geeignet für die Verwendung als Hemmstoffe der TMPRSS2 und somit für die Behandlung von Erkrankungen, die mit der Aktivität der TMPRSS2 in Zusammenhang stehen, erwiesen sich Verbindungen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass die Inhibitoren eine Struktur gemäß Formel (II) besitzen
wobei

– X und R₂ wie zuvor definiert sind, und
– Y ein CH oder N ist, falls R₇ direkt an Y gebunden ist, oder Y ein CH₂ oder NH ist, falls R₇ nicht direkt an Y gebunden ist, und
– m gleich 0, 1 oder 2 ist, und
– R₅
– ein Aryl- oder Heteroarylrest ist, der auch teilweise hydriert sein kann, und der mit bis zu zwei Resten unabhängig voneinander substituiert sein kann, die ausgewählt werden aus H, Cl, Br, unverzweigtes oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, OH, Alkoxy mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, NH₂, Amidin, Guanidin, CF₃, CN oder
– ein Amid der Struktur R₆-CO-NH- ist, wobei R₆ ein unverzweigter oder verzweigter Alkylrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen ist, der substituiert sein kann mit NH₂, CH₃NH, (CH₃)₂N, CH₃)₃N⁺, Cl, Br, OH, Alkoxy mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, CF₃, CN, Amidin, Guanidin oder
– ein verzweigter oder unverzweigter Alkylrest mit 3–7 Kohlenstoffatomen ist, wobei der Alkylrest substituiert sein kann mit NH₂, CH₃NH, (CH₃)₂N, Cl, Br, OH, Alkoxy mit 1 bis 2 Kohlenstoffatomen, CN, Amidin oder Guanidin, und
– R₇
– NH₂, oder ein verzweigter oder unverzweigter NH-Alkyl- oder ein Alkylrest mit 1–6 Kohlenstoffatomen ist, wobei der Alkylrest substituiert sein kann mit NH₂, CO-NH₂, CH₃NH, (CH₃)₂N, Cl, Br, OH, Alkoxy mit 1 bis 2 Kohlenstoffatomen, CN, Amidin, Guanidin oder NH-CO-NH-R₈, und R₈ ein H, Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder Aryl, Aralkyl, Heteroaryl ist, oder
– ein -(CH₂)_p-CO-R₉ ist, mit p gleich 0, 1, 2 oder 3 und wobei R₉ OH, O-Alkyl mit 1–7 Kohlenstoffatomen, NH₂ oder NH-Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ist, oder
– ein -(CH₂)_p-NHCONH-R₁₀ ist, wobei R₁₀ H oder ein Alkyl, Cycloalkyl, Aralkyl, Aryl oder Heteroarylrest ist, der unsubstituiert oder substituiert sein kann, wobei der gegebenenfalls vorhandene Substituent Cl, Br, unverzweigtes oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, OH, Alkoxy mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, NH₂, Amidin, CF₃, oder CN sein kann,
– im Falle von X = N auch ein verzweigter oder unverzweigter aliphatischer oder aromatischer oder heteroaromatischer Acylrest mit 1–10 Kohlenstoffatomen ist, und der mit bis zu zwei Resten unabhängig voneinander substituiert sein kann, die ausgewählt werden aus H, Cl, Br, unverzweigtes oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, OH, Alkoxy mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, NH₂, Amidin, Guanidin, CF₃ oder CN ist.

Als ganz besonders geeignet für die Verwendung als Hemmstoffe der TMPRSS2 und somit für die Behandlung von Erkrankungen, die mit der Aktivität der TMPRSS2 in Zusammenhang stehen, erwiesen sich Verbindungen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass die Inhibitoren eine Struktur gemäß Formel (III) besitzen
worin

– X wie zuvor definiert ist, bevorzugt aber CH ist, und
– R₇ definiert ist wie zuvor, bevorzugt aber ein -(CH₂)_n-NH₂ oder -(CH₂)_n-Guanidin mit n = eine ganze Zahl von 4 bis 5 ist, oder ein -(CH₂)₃-CO-NHCH₃, und
– R₁₀ und R₁₁ unabhängig voneinander ausgewählt werden aus H, Cl, Br, unverzweigtes oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, OH, Alkoxy mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, NH₂, H₂N-CH₂, Amidin, Guanidin, CF₃ oder CN, wobei sie bevorzugt Cl sind.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen gemäß Formeln (I) bis (III) sowie deren Salze anorganischer und organischer Säuren sind Hemmstoffe der Serinprotease TMPRSS2 und können in Form ihrer pharmazeutisch akzeptablen Salze zur Herstellung von Arzneimitteln für Patienten zur Therapie und/oder Prophylaxe von viralen Erkrankungen, beispielsweise von Influenza-Infektionen sowie für die Behandlung von inflammatorischen Atemwegserkrankungen oder Erkrankungen, hervorgerufen durch den SARS-CoV, verwendet werden. Der Begriff „Patient” bezieht sich dabei gleichermaßen auf Menschen und Wirbeltiere. Damit können die Arzneimittel in der Human- und Veterinärmedizin verwendet werden.
Unter pharmazeutisch akzeptablen Salzen der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Verwendung als Hemmstoffe der Serinprotease TMPRSS2 gemäß Formel (I) bis (III) werden die entsprechenden Salze organischer und anorganischer Säuren verstanden, welche nach zuverlässiger medizinischer Beurteilung keine übermäßige Toxizität, Irritationen oder allergische Reaktionen am Patienten auslösen.
Diese pharmazeutisch akzeptablen Salze organischer und anorganischer Säuren sind aufgrund ihrer höheren Wasserlöslichkeit gegenüber den Ausgangs- bzw. Basisverbindungen besonders für die Herstellung von Arzneimitteln geeignet. Diese Salze müssen ein pharmazeutisch verträgliches Anion aufweisen. Geeignete pharmazeutisch verträgliche Säureadditionssalze der erfindungsgemäßen Verbindungen sind z. B. Salze anorganischer Säuren, wie Salzsäure, Bromwasserstoff-, Phosphor-, Metaphosphor-, Salpeter-, Sulfon- und Schwefelsäure oder Salze organischer Säuren wie z. B. Essigsäure, Benzolsulfonsäure, Benzoesäure, Zitronensäure, Ethansulfonsäure, Fumarsäure, Gluconsäure, Glykolsäure, Isethionsäure, Milchsäure, Lactobionsäure, Maleinsäure, Methansulfonsäure, Bernsteinsäure, p-Toluolsulfonsäure, Weinsäure, Trifluoressigsäure. Der im folgenden verwendete Begriff „physiologisch funktionelles Derivat” bezeichnet jedes physiologisch verträgliche Derivat einer erfindungsgemäßen Verbindung der Formel (I) is (III), z. B. einen Ester, der bei Verabreichung an einen Säuger, wie z. B. den Menschen, in der Lage ist, (direkt oder indirekt) eine Verbindung der Formel I oder einen aktiven Metaboliten hiervon zu bilden und für die Verwendung als Hemmstoffe der Serinprotease TMPRSS2 geeignet sind. Die Verbindungen gemäß der allgemeinen Formel I können des Weiteren in verschiedenen Formen verwendet werden, z. B. als amorphe und kristalline polymorphe Formen.
Nachfolgend beziehen sich alle Verweise auf die Verwendung von Verbindungen gemäß Formel (I) bis (III) wie vorstehend beschrieben sowie Salze, Solvate und physiologisch funktionellen Derivate wie hierin beschrieben.
Die Verwendung von Wirkstoffen im Sinne der vorliegenden Erfindung, die sowohl therapeutisch wirksam als auch pharmazeutisch akzeptabel sind, können dem Patienten als Teil einer pharmazeutisch akzeptablen Komposition verabreicht werden. Die Verabreichung kann peroral, parenteral, intravenös, intramuskulär, subkutan, intracisternal, intravaginal, intraperitoneal, intravasculär, intrathekal, intratracheal, intravesikal, topisch, lokal (Puder, Salbe oder Tropfen) oder in Sprayform (Aerosol) erfolgen. Die intravenöse, subkutane, intraperitoneale oder intrathekale Gabe kann dabei kontinuierlich mittels einer Pumpe oder Dosiereinheit erfolgen. Dosierungsformen für die örtliche Administration der erfindungsgemäßen Verbindungen schließen Salben, Puder, Zäpfchen, Sprays und Inhalationsmittel ein. Die aktive Komponente wird dabei unter sterilen Bedingungen mit einem physiologisch akzeptablen Trägerstoff und möglichen Konservierungsmitteln, Puffern, Verdünnungs- und Treibmitteln je nach Bedarf vermischt. Bei der aktiven Komponente kann es sich dabei um Verbindungen gemäß Formel (I) bis (III), deren pharmazeutisch akzeptable Salze oder um Gemische aus Verbindungen gemäß Formel (I) bis (III) und deren pharmazeutisch akzeptable Salze handeln.
Die Erfindung soll nachfolgend anhand der angegebenen Ausführungsbeispiele beschrieben werden.
Ausführungsbeispiele
Methoden zur Analyse und Reinigung der Verbindungen
Analytische HPLC
Zur analytischen reversed-phase-HPLC wurde eine HPLC-Anlage LC-10A der Firma Shimadzu, bestehend aus den Teilsystemen CTO-10A Säulenofen, LC-10ATvp Pumpen (2×), DGU-14A Degaser, SIL-10Axl Autoinjektor, SCL-10Avp Systemcontroller, SPD-M10Avp Photodiodenarraydetektor und einer Säule 250/4,6 Nucleodur 100-5 C18 ec der Firma Macherey-Nagel, Germany, unter Benutzung der zugehörigen Software Shimadzu CLASS-VP, Version 7.2.1, verwendet. Die Detektion erfolgte bei 220 nm. Als Elutionsmittel dienten Wasser mit 0,1% TFA (A) und Acetonitril mit 0,1% TFA (B), die Analyse erfolgte bei einer Flussrate von 1 ml/min mit einem linearen Gradienten (1% B/min) und 10% B als Startbedingung.
Präparative HPLC
Alle finalen Inhibitoren wurden mittels präparativer RP-HPLC gereinigt und liegen als TFA-Salze vor. Dazu wurde eine HPLC-Anlage der Firma Varian, bestehend aus den Teilsystemen Varian PrepStar Model 218 präparative Pumpen (2×), Varian ProStar Model 320 UV-Vis Detektor, Varian Fraktionssammler Model 701, und einer Säule VP 250/32 Nucleodur 100-5 C8 ec der Firma Macherey-Nagel (Dünen, Deutschland), unter Benutzung der zugehörigen Star-Software V. 6.0 verwendet. Die Detektion erfolgte bei 220 nm. Als Elutionsmittel dienten ebenfalls Wasser mit 0,1% TFA (A) und Acetonitril mit 0,1% TFA (B) bei einer Flussrate von 20 mL/min und einem geeigneten Gradienten.
Massenspektrometrie
Die Spektren wurden mit einem Gerät der Firma Applied Biosystems (QTrap 2000) aufgenommen.
Verwendete Abkürzungen

Boc

tert.-Butyloxycarbonyl

Cbz

Benzyloxycarbonyl

DIPEA

Diisopropylethylamin

DCM

Dichlormethan

DMF

N,N-Dimethylformamid

HPLC

Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie

i. V.

im Vakuum

LM

Lösungsmittel

MS

Massenspektroskopie

NMM

N-Methylmorpholin

PyBOP

Benzotriazol-1-yl-N-oxy-tris(pyrrolidino)phosphoniumhexafluorophosphat

RT

Raumtemperatur

TFA

Trifluoressigsäure

Alle eingesetzten Aminosäuren, Kupplungsreagentien und andere Reagentien für die Synthesen wurden von den Firmen Peptech, Senn, Aldrich, Fluka oder Acros bezogen.
Beispiel 1
Synthetisierte Verbindungen
Die Grundstrukturen der für die Experimente verwendeten Verbindungen bzw. Inhibitoren sind bereits bekannt und wurden daher nach den aus der Literatur bekannten Verfahren synthetisiert, am Ende mit präparativer HPLC gereinigt und liegen als TFA-Salze vor (Stürzebecher et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 9, 3147–3152 (1999); Steinmetzer et al., J. Med. Chem. 49, 4116–4126, (2006); Steinmetzer et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 19, 67–73, (2009); Schweinitz et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 19, 1960–1965, (2009); Stürzebecher et al. J. Med. Chem. 40, 3091–3099, (1997)). Verbindungen mit einem 3-Amidinoazaphenylalanin als zentralem Baustein werden ebenfalls nach Literatur-Methoden synthetisiert (Zega et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 14 (2004) 1563–1567).
Beispielsweise wird der besonders wirksame Inhibitor 2 nach folgendem Schema synthetisiert (Schema 1).
Schema 1: Synthese des Inhibitors 2: (a) Dioxan/1 N NaOH, 1 h bei 0°C rühren und bei RT über Nacht; (b) PyBOP, 2.0 eq. DIPEA in DMF, 15 min 0°C und 3 h bei RT; (c) 2 eq. Baronsäure, 1 mol% Pd(OAc)₂ and 2 mol% S-Phos in Toluen mit 3 eq. 2 M Cs₂CO₃ Lösung, 4 h am Rückfluß; (d) i: 2.5 eq. Hydroxylamin × HCl und 2.5 eq. DIPEA, Rückfluß in Ethanol, 4 h, rühren bei RT über Nacht, gefolgt von Einengen des Lösungsmittel i. V., ii: 3 eq. Ac₂O in Essigsäure, 30 min RT, Einengen des Lösungsmittels; iii: Zinkstaub in 90% Essigsäure, rühren über Nacht 30°C; iv: 90% TFA, RT, 1 h, Einengen des Lösungsmittel und Reinigung des Produktes mittels präparativer RP-HPLC und Lyophilisierung.
Die Verbindungen mit C-terminaler Harnstoffstruktur (z. B., 14, 15, 22–24, 27–31) im C-terminalen sekundären Amidrest R₃ der allgemeinen Struktur (i) werden hergestellt, indem man von Intermediat A, dessen Synthese früher bereits beschrieben wurde (siehe Steinmetzer et al., J. Med. Chem. 49, 4116–4126, (2006), Zwischenprodukt 10 im Schema 2 dieser Publikation) die Boc-Schutzgruppe mit TFA oder 1 N HCl in Eisessig abspaltet, das freigesetzte Amin mit verschieden substituierten Isocyanaten umsetzt und final nach bekannten Methoden aus dem Nitril die Amidinogruppe aufbaut. Im Schema 2 ist beispielhaft die Synthese des Inhibitors 15 mit C-terminaler Ethyl-Harnstoffstruktur dargestellt. Zur Synthese des Inhibitors 14 wurde dagegen das Intermediat B (Schema 2) mit N-Succinimidyl-N-Methylcarbamat umgesetzt, während im Falle von Inhibitor 27 Intermediat B mit N-Methyl-N-Nitrosoharnstoff versetzt wurde. Der finale Aufbau der Amidinogruppe erfolgte analog der im Schema 1 beschriebenen Prozedur.
Schema 2: Synthese des Inhibitors 15: (a) 1 N HCl in Essigsäure, 1 h, RT; (b) 1,5 eq. Ethylisocyanat und 2 eq. TEA in DCM über Nacht bei RT; (c) i: 2.5 eq. Hydroxylamin × HCl und 2.5 eq. DIPEA, Rückfluß in Ethanol, 4 h, rühren bei RT über Nacht, gefolgt von Einengen des Lösungsmittel i. V., ii: 3 eq. Ac₂O in Essigsäure, 30 min RT, Einengen des Lösungsmittels; iii: H₂ mit 10 Gewichtsprozent von 10% Pd/C, rühren über Nacht bei RT in 90% Essigsäure; iv: Einengen des Lösungsmittel und Reinigung des Produktes mittels präparativer RP-HPLC und Lyophilisierung.
Die Strukturen und analytischen Daten der synthetisierten Inhibitoren sind in Tabelle 1 zusammengefasst.
Tabelle 1: Übersicht und analytische Charakterisierung der synthetisierten Inhibitoren (n. b. = nicht bestimmt). Alle Verbindungen liegen als TFA-Salze vor.
Beispiel 2
Rekombinante Herstellung der Proteasedomäne der TMPRSS2
Klonierung der Protease-Domäne der TMPRSS2:
Die Serinprotease-Domäne wurde vom Expressionsplasmid pCAGGS-TMPRSS2 amplifiziert, wobei
5'-GGATATCATATGAAACATCACCATCACCATCACATCGTGGGCGGTGAGAG-3' und 5'-GGATATGAATTCTTAGCCGTTTGCCTTCATTTG-3' als sense und antisense Primer verwendet wurden. Die Primer wurden so gewählt, dass sich am 5'-Ende der Protease-Domäne eine Nde1-Schnittstelle und am 3'-Ende eine EcoR1-Schnittstelle anschließt. Das ~750 Basenpaar lange Amplifikationsprodukt wurde gereinigt, mit den Restrikionsenzymen Nde1 und EcoR1 verdaut und in einen pET24-b Vektor (Novagen, Merck Biosciences, Bad Soden, Deutschland) zur Proteinexpression in Escherichia coli cloniert.
Die katalytische Domäne der TMPRSS2 wird, wie weiter unten beschrieben, in Form von inclusion bodies exprimiert, anschließend denaturiert, gereinigt, zurückgefaltet und aktiviert.
Expression, Aufreinigung, Rückfaltung und Aktivierung der katalytischen Domäne der TMPRSS2:
BL21(DE3) codon plus Zellen, die den Expressionsvektor enthalten, wurden in LB-Medium, 30 μg/ml Kanamycin und 35 μg/ml Chloramphenicol bei 37 und 220 rpm inkubiert. Die Expression wurde durch Zugabe von 1 mM IPTG bei einer Zelldichte von OD₆₀₀ = 1,2 induziert und die Inkubation für weitere drei Stunden fortgesetzt.
Die Zellen wurden geerntet, in Puffer A (50 mM Tris HCl, pH 7.5, 0,9% NaCl) resuspendiert, durch Ultraschall aufgeschlossen und die DNA mittels Benzonase (25 U/g Zellpellet, Novagen) abgebaut. Die inclusion bodies wurden gewaschen und in Puffer B (8 M Harnstoff, 100 mM NaH₂PO₄, pH 8.0, 10 mM Tris, 5 mM DTT, 5 ml pro 1 ml Pellet) denaturiert. Die unlöslichen Bestandteile wurden durch Zentrifugieren vom denaturierten Protein abgetrennt.
Die His-Tag gebundene Protease wurde über eine Metall-Chelat Chromatographie (NiNTA Agarose, Qiagen, Hilden, Deutschland) auf gereinigt und die TMPRSS2 enthaltenen Fraktionen vereinigt. Zur Renaturierung wurde die rapid dilution Methode in Renaturierungspuffer (50 mM Tris, pH 7.5, 0,5 M L-Arginin, 20 mM CaCl₂, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, Glutathion frisch zugesetzt) zu einer Endkonzentration von 50 μg/ml angewendet. Nach drei Tagen Inkubation bei 4 O wurde die Proteinlösung filtriert, zu einer Konzentration von > 300 μg/ml durch Tangentialfiltration (vivaflow 200,10 kDa cut-off, Sartorius, Göttingen, Deutschland) und Ultrafiltration (vivaspin 20, 10 kDa cut-off, Sartorius) eingeengt und der Puffer zu Aktivierungspuffer (50 mM Tris, pH 7,5, 1 M NaCl, 0,05% Brij 58) ausgetauscht.
Da für die Aktivität der Serinprotease ein freier N-Terminus essentiell ist, muss die TMPRSS2 durch Abspalten der n-terminalen Peptidsequenz MK(His)₆ aktiviert werden. Dies wurde durch Inkubation der Protease für sieben Stunden mit 2,5 U/ml aktivierter DAPase^TM (Qiagen) und anschließender Trennung von aktivierter von nicht-aktivierter TMPRSS2 und His-tag gebundener DAPase über Chelat-Chromatographie erreicht.
Die Ausbeute dieser Vorschrift beträgt etwa 0,6 mg aktiver katalytischer Domäne pro 2 l Zellkultur.
Zur Analyse des aufgereinigten Proteins wurde eine SDS-Page mit anschließendem Western-Blot durchgeführt (1), wobei TMPRSS2 spezifische Antikörper verwendet wurden.
Beispiel 3
Enzymkinetische Untersuchungen zur Bestimmung der TMPRSS2-Hemmwirkung
Die Bestimmung der TMPRSS2-Hemmwirkung wurde mit einem Fluoreszenz-Plattenreader Safire² der Firma Tecan (λ_Ex = 380 nm, λ_Em = 460 nm) und H-dCha-Pro-Arg-AMC × 2 TFA als Substrat durchgeführt. Als Enzym wurde die rekombinant hergestellte Proteasedomäne der TMPRSS2 verwendet.

Für die Bestimmung der Hemmkonstanten wurde der Messpuffer (50 mM Tris HCl, pH 8.0, 154 mM NaCl) mit Substrat (Konzentrationen 200, 100, 50 μM im Ansatz) mit verschiedenen Inhibitorkonzentration kombiniert, die mindestens über den Bereich einer Größenordnung variiert wurden. Nach Enzymzugabe wurden die steady-state Geschwindigkeiten mittels linearer Regression bestimmt. Parallel zu jeder Inhibitormessung wurden mittels einer v/S-Charakteristik K_m und V_max (in der Einheit ΔRFU/s) ermittelt. Die Berechnung der K_i-Werte erfolgte durch Anpassung der bestimmten Geschwindigkeiten als Funktion der Inhibitor- und Substratkonzentrationen an die Geschwindigkeitsgleichung für kompetitiv reversibelbindende Inhibitoren:

Tabelle 2: K_i-Werte ausgewählter Inhibitoren für die Hemmung der TMPRSS2.

Inhibitor	K_i(nM)
1	4,0
2	0,93
3	17,0
4	4,8
5	7,8
6	19,0
7	40,1
8	207,2
9	71,8
10	7,8
11	71,6
12	28,5
13	27,5
14	9,6
15	10,9
16	4,5
17	0,95
18	19,0
19	2,7
20	36,2
21	8,9
22	6,5
23	22,3
24	17,6
25	7,3
26	5,4
27	14,0
28	77,6
29	72,5
30	36,2
31	8,0
32	214
33	17400
34	357
35	14870
36	146
37	24970
38	853
39	16,5
40	28,8
41	56,2

Beispiel 4
Hemmung der TMPRSS2-vermittelten Virusvermehrung in Gegenwart synthetischer Serinproteaseinhibitoren
Für die Experimente wurden MDCK-TMPRSS2-Zellen mit induzierbarer Expression der Protease TMPRSS2 verwendet. MDCK-TMPRSS2-Zellen wurden durch stabile Transfektion von MDCK-Zellen (Madin Darby Canine Kidney) mit den Plasmiden pcEFTet-On/NEO und pTRE2pur-TMPRSS2-FLAG (Böttcher et al. Vaccine 27, 6324–6329 (2009); Böttcher et al. J Virol 84, 5605–5614 (2010)) generiert. Die Expression der TMPRSS2 in diesen Zellen kann durch Zugabe von Doxycyclin (Dox) zum Kulturmedium induziert werden (Tet-On Expressionssystem, Gossen and Bujard, Science 1995).
Um die Wirksamkeit synthetischer Serinproteaseinhibitoren auf die Hemmung der proteolytischen Aktivierung von Influenzaviren durch TMPRSS2 zu analysieren, wurde die multizyklische Replikation und Virusausbreitung in MDCK-TMPRSS2 Zellen in Anwesenheit der Inhibitoren untersucht. Dazu wurden MDCK-TMPRSS2-Zellen zunächst in 24-well Platten für 24 h in An- und Abwesenheit von 0.2 μg/ml Doxycyclin kultiviert. Die Zellen wurden anschließend mit dem humanen Influenza-Isolat A/Memphis/14/96 (H1N1) infiziert und für 24 h in An- bzw. Abwesenheit verschiedener Inhibitoren bei 37°C und 5% CO₂ inkubiert. Im Anschluss wurden infizierte Zellen immunohistochemisch gegen das virale Nukleoprotein gefärbt. Dabei konnte eine konzentrationsabhängige Hemmung der Virusvermehrung und -Ausbreitung durch die verwendeten synthetischen Inhibitoren gezeigt werden. Exemplarisch ist in 2 die Hemmung der Virusausbreitung in mit Inhibitor 2 behandelten Zellen gezeigt.
Beispiel 5
Hemmung der TMPRSS2-vermittelten Virusvermehrung durch synthetische Serinproteaseinhibitoren in humanen Atemwegsepithelzellen
Zum Nachweis der Hemmwirkung einer TMPRSS2-vermittelten Virusausbreitung wurden Calu-3-Zellen (humane Atemwegsepithelzellen, endogene Expression von TMPRSS2) verwendet. Dazu wurden die Zellen in 6 Well-Platten kultiviert und mit dem humanen Influenzavirus-Isolat A/Memphis/14/96 (H1N1) in An- und Abwesenheit von Inhibitor 2 (50 μM) für 72 h infiziert und zu verschiedenen Zeitpunkten der Virustiter im Zellkulturüberstand mittels Plaque-Test (Bestimmung infektiöser Viren pro ml; pfu: plaque forming units) ermittelt. Dabei konnte eine deutliche Verzögerung der Virusvermehrung sowie eine bis 1000fache Abnahme des Virustiters in Anwesenheit von Inhibitor 2 im Vergleich zur Kontrolle ohne Inhibitor (Mock) beobachtet werden. Dies ist in 3 gezeigt.
Abbildungslegenden
Fig. 1
Zur Analyse des aufgereinigten Proteins wurde eine SDS-Page mit anschließendem Western-Blot durchgeführt, wobei TMPRSS2 spezifische Antikörper verwendet wurden. Der Western-Blot ist in 1 dargestellt. 1 zeigt die SDS-Page und den Nachweis der Proteasedomäne der TMPRSS2 durch Western-Blot.
g
Western-Blot unter Verwendung spezifischer TMPRSS2-Antikörper:

1. MDCK-Zellen ohne TMPRSS2-Expression
2. MDCK-Zellen mit TMPRSS2-Expression
3. Active TMPRSS2 exprimiert in E. coli

Fig. 2
2 zeigt die Hemmung der multizyklischen Replikation und Virusausbreitung in MDCK-TMPRSS2 Zellen in Anwesenheit von Inhibitor 2.
Fig. 3
3 zeigt die Hemmung der TMPRSS2-abhängigen Virusausbreitung in Calu-3-Zellen durch Inhibitor 2.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

WO 2010/149459 [0004]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Paolini-Giacobino, Genomics 44, 309–320 (1997) [0003]
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Stürzebecher et al. J. Med. Chem. 40, 3091–3099, (1997) [0006]
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Steinmetzer et al., J. Med. Chem. 49, 4116–4126, (2006) [0024]
Böttcher et al. Vaccine 27, 6324–6329 (2009) [0038]
Böttcher et al. J Virol 84, 5605–5614 (2010) [0038]

Claims

Verwendung von Verbindungen gemäß der allgemeinen Formel (I) und von pharmazeutisch geeigneten Salzen dieser Verbindungen,
wobei • X CH oder N ist, und • R₁ ein einfach oder mehrfach substituierter oder unsubstituierter zyklischer Aryl- oder Heteroarylrest ist, der ein bis drei Ringe enthalten kann, die entweder aneinander gebunden oder miteinander fusioniert sind, und • R₂ eine Amidinogruppe der folgenden Struktur ist,
in der R₄ bevorzugt H ist, aber auch -OH, -OCH₃ und -O-CO(CH₂)_nCH₃ mit n gleich eine ganze Zahl von 0 bis 5 sein kann, und • R₃ eine sekundäre Amingruppe ist, die über eine Amidbindung an das zentrale Phenylalanin- oder Azaphenylalanin-Derivat gebunden ist und mehrfach substituiert oder unsubstituiert sein kann, zur Inhibierung der Serinprotease TMPRSS2 und als Medikament für die Behandlung von Influenzainfektionen oder zur Therapie inflammatorischer Atemwegserkrankungen und von Infektionen mit dem Sars-Coronavirus.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Inhibitoren eine Struktur gemäß Formel (II) besitzen, wobei
– X und R₂ wie zuvor definiert sind, und – Y ein CH oder N ist, falls R₇ direkt an Y gebunden ist, oder Y ein CH₂ oder NH ist, falls R₇ nicht direkt an Y gebunden ist, und – m gleich 0, 1 oder 2 ist, und – R₅ – ein Aryl- oder Heteroarylrest ist, der auch teilweise hydriert sein kann, und der mit bis zu zwei Resten unabhängig voneinander substituiert sein kann, die ausgewählt werden aus H, Cl, Br, unverzweigtes oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, OH, Alkoxy mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, NH₂, Amidin, Guanidin, CF₃, ON oder – ein Amid der Struktur R₆-CO-NH- ist, wobei R₆ ein unverzweigter oder verzweigter Alkylrest mit 1–4 Kohlenstoffatomen ist, der substituiert sein kann mit NH₂, CH₃NH, (CH₃)₂N, CH₃)₃N⁺, Cl, Br, OH, Alkoxy mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, CF₃, CN, Amidin, Guanidin oder – ein verzweigter oder unverzweigter Alkylrest mit 3–7 Kohlenstoffatomen ist, wobei der Alkylrest substituiert sein kann mit NH₂, CH₃NH, (CH₃)₂N, Cl, Br, OH, Alkoxy mit 1 bis 2 Kohlenstoffatomen, CN, Amidin oder Guanidin, und – R₇ – NH₂, oder ein verzweigter oder unverzweigter NH-Alkyl- oder ein Alkylrest mit 1–6 Kohlenstoffatomen ist, wobei der Alkylrest substituiert sein kann mit NH₂, CO-NH₂, CH₃NH, (CH₃)₂N, Cl, Br, OH, Alkoxy mit 1 bis 2 Kohlenstoffatomen, CN, Amidin, Guanidin oder NH-CO-NH-R₈, und R₈ ein H, Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder Aryl, Aralkyl, Heteroaryl ist, oder – ein -(CH₂)_p-CO-R₉ ist, mit p gleich 0, 1, 2 oder 3 und wobei R₉ OH, O-Alkyl mit 1–7 Kohlenstoffatomen, NH₂ oder NH-Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ist, oder – ein -(CH₂)_p-NHCONH-R₁₀ ist, wobei R10 H oder ein Alkyl, Cycloalkyl, Aralkyl, Aryl oder Heteroarylrest ist, der unsubstituiert oder substituiert sein kann, wobei der gegebenenfalls vorhandene Substituent Cl, Br, unverzweigtes oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, OH, Alkoxy mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, NH₂, Amidin, CF₃, oder CN sein kann, – im Falle von X = N auch ein verzweigter oder unverzweigter aliphatischer oder aromatischer oder heteroaromatischer Acylrest mit 1–10 Kohlenstoffatomen ist, und der mit bis zu zwei Resten unabhängig voneinander substituiert sein kann, die ausgewählt werden aus H, Cl, Br, unverzweigtes oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, OH, Alkoxy mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, NH₂, Amidin, Guanidin, CF₃ oder CN ist.
Verwendung nach Ansprüchen 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Inhibitoren eine Struktur gemäß Formel (III) besitzen
worin – X wie zuvor definiert ist, und – R₇ definiert ist wie zuvor, bevorzugt aber ein -(CH₂)_n-NH₂ oder -(CH₂)_n-Guanidin mit n = eine ganze Zahl von 0 bis 5 ist, oder ein -(CH₂)₃-CO-NHCH₃, und – R₁₀ und R₁₁ unabhängig voneinander ausgewählt werden aus H, Cl, Br, unverzweigtes oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, OH, Alkoxy mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, NH₂, H₂N-CH₂, Amidin, Guanidin, CF₃ oder CN, wobei sie bevorzugt Cl sind.
Verwendung nach Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass X in den Inhibitoren ein CH ist und das resultierende zentrale 3-Amidinophenylalanin-Derivat bevorzugt in der L-Konfiguration vorliegt.
Verwendung nach Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Verbindungen gemäß Formel I bis III um eine der folgenden Strukturen handelt
Verwendung einer pharmazeutisch akzeptablen Komposition enthaltend Verbindungen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 und/oder deren pharmazeutisch akzeptable Salze anorganischer und organischer Säuren oder Basen als aktive Komponente und einen physiologisch akzeptablen Trägerstoff zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung viraler Infektionen oder von inflammatorischen Atemwegserkrankungen.
Verwendung einer pharmazeutisch akzeptablen Komposition gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass sie peroral, parenteral, intravenös, intramuskulär, subkutan, intracisternal, intravaginal, intraperitoneal, intravasculär, intrathekal, intratracheal, topisch, lokal oder als Aerosol verabreicht wird.
Verwendung von Verbindungen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 sowie deren pharmazeutisch akzeptabler Salze anorganischer und organischer Säuren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Therapie und/oder Prophylaxe von viralen Erkrankungen, besonders von Influenza-Infektionen.
Verwendung von Verbindungen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 sowie deren pharmazeutisch akzeptabler Salze anorganischer und organischer Säuren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Therapie inflammatorischer Atemwegserkrankungen.
Verwendung von Verbindungen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 sowie deren pharmazeutisch akzeptabler Salze anorganischer und organischer Säuren zur Hemmung der Serinprotease TMPRSS2.