DE102011080947B3

DE102011080947B3 - Einzelanalyterfassung mittels magnetischer Durchflussmessung

Info

Publication number: DE102011080947B3
Application number: DE102011080947A
Authority: DE
Inventors: Michael Johannes Helou; Oliver Hayden; Sandro Francesco Tedde; Mathias Reisbeck
Original assignee: Siemens AG; Siemens Corp
Current assignee: Siemens AG; Siemens Corp
Priority date: 2011-08-15
Filing date: 2011-08-15
Publication date: 2013-01-31
Anticipated expiration: 2031-08-16
Also published as: US20140193851A1; EP2726844A1; WO2013023909A1; CN103733042B; CN103733042A

Abstract

Verfahren zur magnetischen Durchflussmessung eines Analyten, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: – magnetische Markierung von Analyten (1) in einer Probe, – Flusserzeugung der Analyten (1) über eine Sensoranordnung, wobei der Fluss (40) der Analyten (1) zumindest über ein magnetoresistives Bauteil (20) geführt wird, – Erzeugung eines magnetischen Gradientenfeldes, mittels welchem die markierten Analyte (1) über dem magnetoresistiven Bauteil (20) angereichert werden, sowie eines homogenen Magnetfeldes (220), wobei das homogene Magnetfeld (220) und das magnetoresistive Bauteil (20) so zueinander angeordnet sind, dass das homogene Magnetfeld (220) nicht vom magnetoresistiven Bauteil (20) erfasst wird, – Erfassung einzelner markierter Analyte (1), – wobei die magnetische Markierung derart vorgenommen wird, dass die markierten Analyte (1) je ein magnetisches Streufeld aufweisen, dessen durch das magnetoresistive Bauteil (20) erfassbare Maxima in einem Abstand vom Analytmittelpunkt (rmag) liegen, der kleiner ist als der hydrodynamische Analytradius (ropt).

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die magnetische Durchflussmessung von magnetisch markierten Analyten, insbesondere die magnetische Durchflusszytometrie.
Im der magnetischen Durchflusszytometrie werden bislang zwei Ansätze zur Einzelzelldetektion verfolgt, bei denen das Problem der eindeutigen Trennung von zwei direkt aufeinanderfolgenden Zellen folgendermaßen umgangen wird:
Wie beispielsweise aus Loureiro et al., ”Journal of Applied Physics”, 2011, 109, 07B311 bekannt, werden superparamagnetisch markierte Zellanalyten von einem magnetoresistiven Sensor erfasst. Durch den Verzicht auf eine Anreicherung der markierten Zellen sind diese zwar nicht sehr hoch konzentriert, jedoch führt dies gleichermaßen zu einer sehr geringen Wiederfindungsrate, d. h. dass nur ein geringer Prozentsatz der markierten Zellen überhaupt vom magnetoresistiven Sensor erfasst werden kann.
Die US 6 736 978 B1 offenbart eine Methode, Analyte, welche in einem flüssigen Strom fließen, zu überwachen. Dabei wird ein riesenmagnetoresistiver Sensor eingesetzt, um die magnetischen Eigenschaften des Stroms, die abhängen von Analytkonzentration und -verteilung, zu messen und ein elektrisches Ausgangs-Signal zu erzeugen. Der Strom fließt dabei ausreichend nah an dem riesenmagnetoresistiven Sensor vorbei, um ein Ausgangs-Signal zu erzeugen.
Die US 2009/0001024 A1 offenbart eine Methode, die Überwachung von Analyten, welche in einem flüssigen Strom an einem riesenmagnetoresistiven Sensor vorbei fließen, zu verbessern. Dabei wird der flüssige Strom mit Pufferströmen von der Seite und von oben umhüllt, um die Analyten einreihig zu vereinzeln.
Die WO 2008/001261 A1 offenbart eine Anordnung mit einem magnetoresistiven Sensor zum Messen von magnetischen Partikeln umfassend eine Einheit zur Generierung unterschiedlich konfigurierter Magnetfelder für unterschiedlich angeregte Zustände der magnetischen Partikel. Weiterhin umfasst die Anordnung eine Sensoreinheit zum Messen unterschiedlicher Signale in Abhängigkeit der magnetischen Partikel in den unterschiedlich konfigurierten Magnetfeldern und eine Einheit zum Auswerten der Signale.
Die DE 10 2007 057 667 A1 offenbart eine Anordnung und ein Verfahren zur dynamischen Detektion und Selektion magnetisch gekennzeichneter Partikel mit einem Mikrofluidikkanal und einer Wheatstone'schen Brückenschaltung mit zumindest einem magnetoresistiven Element. Der Mikrofluidikkanal ist in der Brückenschaltung so angeordnet, dass die durch den Mikrofluidikkanal fließenden magnetisch gekennzeichneten Partikel den Abgleich mit der Brückenschaltung messbar beeinflussen.
Alternativ wird im Stand der Technik mit verdünnten Proben gearbeitet. Mit der Verminderung der Konzentration einer Zellsuspension in Kombination mit einer Anreicherung der magnetisch markierten Zellen vergrößert sich der Abstand und die Zellen können einzeln über den Sensor geführt werden, jedoch ergibt sich daraus sehr nachteilig eine unerwünschte Verlängerung der Messzeit.
Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung eine Einzelzelldetektion mit hoher Wiederfindungsrate und kurzer Messzeit anzugeben.
Die Aufgabe wird durch ein Verfahren gemäß Patentanspruch 1 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind Gegenstand der Unteransprüche.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur magnetischen Durchflussmessung eines Analyten umfasst die folgenden Schritte:
Zunächst erfolgt die magnetische Markierung von Analyten in einer Probe. Dann wird ein Fluss der Analyte erzeugt, welcher die Analyte über eine Sensoranordnung führt, wobei der Fluss der Analyten dabei zumindest über ein magnetoresistives Bauteil geführt wird. Außerdem wird ein magnetisches Gradientenfeld erzeugt, mittels welchem die markierten Analyte über dem magnetoresistiven Bauteil angereichert werden, und es wird ein homogenes Magnetfeldes erzeugt, welches so zum magnetoresistiven Bauteil verläuft, dass das homogene Magnetfeld nicht vom magnetoresistiven Bauteil erfasst wird. Mittels der Sensoranordnung mit dem zumindest einen magnetoresistiven Bauteil erfolgt die Erfassung einzelner markierter Analyte. Die magnetische Markierung wird in dem erfindungsgemäßen Verfahren dabei derart vorgenommen, dass die markierten Analyte je ein magnetisches Streufeld in dem homogenen Magnetfeld hervorrufen, dessen erfassbare Maxima in einem Abstand vom Analytmittelpunkt liegen, der kleiner ist als der hydrodynamische Analytradius.
Zur Erzeugung des magnetischen Gradientenfeldes sowie des homogenen Magnetfeldes wird insbesondere nur eine magnetische Einheit benötigt, die eine doppelte Funktion erfüllt. In weiterem Abstand von der magnetischen Einheit erzeugt diese das Gradientenfeld zur Anreicherung der magnetisch markierten Analyte. Nahe an der magnetischen Einheit verlaufen die Magnetfeldlinien jedoch homogen. Die magnetische Einheit ist dabei so zum Sensor, d. h. dem magnetoresistiven Bauteil angeordnet, dass das homogene Feld in eine Richtung verläuft, in der der Sensor nicht sensitiv ist. Das heißt zum Beispiel, dass das homogene Magnetfeld in z-Richtung verläuft, während der Sensor in x-Richtung, senkrecht dazu, sensitiv ist.
Das durch die magnetische Markierung eines Analyten im homogenen Magnetfeld hervorgerufene Streufeld wird durch das magnetoresistive Bauteil erfasst. Insbesondere wird die x-Komponente dieses Streufeldes gemessen, wobei die x-Richtung als die Durchflussrichtung definiert ist, d. h. die Richtung des Streufeldes, die parallel zur Oberfläche des magnetoresistiven Bauteils liegt. Diese erfassbaren Streufeldmaxima legen also einen Abstand vom Analytmittelpunkt fest, welcher im Folgenden auch magnetischer Radius genannt wird. Durch die magnetische Markierung von Analyten, beispielsweise Zellanalyten, oder auch Beads können diese einen magnetischen Durchmesser aufweisen, der geringer ist als der optische oder hydrodynamische Durchmesser, was heißt, dass das maximale Streufeld in x-Richtung innerhalb des Analytumfanges liegt. Dadurch und durch die Detektion der x-Komponente eben dieses Streufeldes, beispielsweise mit einem magnetoresistiven Bauelement, welches in dieser horizontalen x-Richtung sensitiv ist, kann die Detektion von zwei unmittelbar aufeinanderfolgenden Zellen als zwei Einzelevents getrennt erfolgen.
Dies hat also den Vorteil, auch bei hohen Zellkonzentrationen, in denen die Analyten in kleinstmöglichem Abstand vorliegen, diese einzeln zu detektieren, also auch wirklich sogenannte Einzelevents auflösen zu können. Durch die geeignete magnetische Markierung wird also das Streufeld eines markierten Analyten insbesondere in einem vertikalen externen Magnetfeld so beeinflusst, dass eine hohe Wiederfindungsrate der magnetischen Einzelanalytdetektion gewährleistet ist.
Die Sensoranordnung kann insbesondere mindestens ein aber auch mehrere magnetoresistive Bauteile, d. h. z. B. Einzelwiderstände aufweisen. Vorzugsweise weist die Sensoranordnung magnetoresistive Einzelwiderstände auf, die etwa in einer Wheatstone'schen Messbrücke verschaltet sind. Wie aus der Patentanmeldung DE 10 2010 040 391.1 bekannt ist, können dadurch besonders vorteilhaft charakteristische Signalverläufe generiert werden.
In einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird bei dem Verfahren die magnetische Markierung mit magnetischen Nanobeads, insbesondere superparamagnetischen Nanobeads vorgenommen. Die Nanobeads weisen insbesondere hydrodynamische Durchmesser zwischen 10 nm und 500 nm auf. Je nach zu markierenden Analyten, beispielsweise je nach Zellsorte, bestimmt deren Oberfläche und/oder Epitopenanzahl, welche Größe und Art der Markierung besonders vorteilhaft ist. Die kleinen Nanobeads zwischen 10 nm und 500 nm Durchmesser haben den Vorteil, dass damit Belegungsdichten auf der Analytoberfläche zwischen 10% und 90% erreicht werden können, welche eine Verlagerung des Streufeldmaximums in das Innere des Analyten erzielen. Insbesondere wird ein Analyt, z. B. eine Zelle, so markiert, dass das Maximum der x-Komponente des Streufeldes sich zwischen 50% und 90% des Zellradius vom Zellmittelpunkt entfernt befindet.
In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird bei dem Verfahren die magnetische Markierung mit Nanobeads vorgenommen, welche das Material Magnetit oder das Material Maghemit aufweisen. Insbesondere weisen die zur Markierung verwendeten Nanobeads ein Material auf, dessen Sättigungsmagnetisierung in etwa zwischen 80 und 90 emu/g beträgt.
Der Materialanteil an den Nanobeads ist dabei insbesondere so gewählt, dass die Sättigungsmagnetisierung der Magnetbeads in etwa zwischen 10 (A·m²)/kg und 60 (A·m²)/kg beträgt.
Beispielsweise kann mit einer derart geeigneten magnetischen Markierung bei Zellen mit durchschnittlich 12 μm Durchmesser ein Streufeldmaximum in x-Richtung bei einem Abstand vom Zellmittelpunkt von durchschnittlich 4 μm hervorgerufen werden. Dies ist ein besonders vorteilhafter verringerter magnetischer Radius, der gewährleistet, dass die so markierten Zellen in einem externen vertikalen Magnetfeld einzeln erfasst werden können, auch wenn diese in direktem Kontakt zueinander über die Sensoranordnung fließen.
In einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung werden in dem Verfahren die einzelnen markierten Analyte mittels des magnetischen Gradientenfeldes über dem magnetoresistiven Bauteil angereichert, so dass sie dort lokal in hoher Konzentration vorliegen. Ausgehend von Probenkonzentrationen zwischen 0,1 und 10⁴ Analyten pro Mikroliter wird die Konzentration durch die Anreicherung auf das zwischen 100fache bis zu 10000fache erhöht. Dies hat den Vorteil einer sehr hohen Widerfindungsrate, da nur ein verschwindend geringer Anteil an zu detektierenden Analyten nicht nahe genug am Sensor vorbeigeführt wird, um von diesem erfasst zu werden. Gleichzeitig birgt die hohe Konzentration, bei der auch die einzelnen Analyte in direktem Kontakt miteinander stehen können, nicht den Nachteil, dass diese als Einzelevent gezählt werden, sondern aufgrund des verringerten magnetischen Radius der letztendlich von der magnetoresistiven Sensoranordnung erfasst wird, auch bei direktem Kontakt der Zellen noch getrennt werden können. Das Verfahren birgt also gleichzeitig die Vorteile einer hohen Widerfindungsrate des Messsystems, auch bei zwei direkt aufeinander folgenden Zellen und den Vorteil eine Messung an einer Suspension vornehmen zu können, in der die zu detektierenden Analyte in sehr hoher Konzentration vorliegen. Bewirkt die magnetische Markierung, dass das Streufeldmaximum innerhalb der Zelle liegt, wird also eine Messung von zwei direkt aufeinanderfolgenden markierten Analyten als zwei Einzelevents möglich. Insbesondere überfließen also bei dem Verfahren die einzelnen Analyte das magnetoresistive Bauteil in direktem Kontakt miteinander.
Zur Anreicherung der magnetisch markierten Analyte kann neben dem magnetischen Gradientenfeld, welches insbesondere durch einen Permanentmagneten hervorgerufen werden kann, noch zusätzlich eine magnetophoretische Anreicherung der magnetisch markierten Analyte erfolgen. Eine vorteilhafte magnetophoretische Anreicherung ist beispielsweise aus der Patentanmeldung DE 10 2009 047 801.9 bekannt. Dabei wird zur magnetischen Durchflusszytometrie ein System für einen gezielten Transport magnetisch markierter Zellen in einem strömenden Medium angegeben.
In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird bei dem Verfahren die Durchflussgeschwindigkeit so eingestellt, dass die Analyte mit konstanter Geschwindigkeit über das magnetoresistive Bauteil geführt werden. Insbesondere wird die Durchflussgeschwindigkeit so eingestellt, dass die Analyte, welche insbesondere Zellen sind, über dem magnetoresistiven Bauteil abrollen. Dabei werden sie insbesondere bei Kontakt mit der Kanalwand, an oder in der vorzugsweise das magnetoresistive Bauteil angeordnet ist, in Rotation versetzt und rollen an der Wand und damit über dem magnetoresistiven Bauteil ab. Bei dem magnetoresistiven Bauteil oder beispielsweise den mehreren magnetoresistiven Brückenelementen handelt es sich insbesondere um GMR-Sensoren (giant magneto resistance).
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden in exemplarischer Weise mit Bezug auf die 1 bis 5 der angehängten Zeichnung beschrieben.
1 zeigt eine Seitenansicht der magnetischen Einheit 22 zur Erzeugung des Gradientenfeldes sowie des homogenen Magnetfeldes 220, welches mit Pfeilen senkrecht zur magnetischen Einheit 22 eingezeichnet ist. Die magnetische Markierung des Analyten 1 bewirkt ein magnetisches Streufeld des Analyten 24, dessen Magnetfeldlinienverlauf um den Analyten 1 herum gezeigt ist. Der Analyt 1 ist im Querschnitt als Kreis dargestellt. Der Pfeil 40, von links nach rechts in der 1 weisend, zeigt die Flussrichtung des Analyten 1 an. Die magnetische Einheit 22 befindet sich beispielsweise unterhalb eines Durchflusskanals für eine Analytprobe, welche beispielsweise eine Zellprobe ist.
Die doppelte Funktion der magnetischen Einheit 22 kann z. B. folgendermaßen beschrieben werden: Das Gradientenfeld, erzeugt vom externen Magneten 22, zieht die superparamagnetisch markierten Zellen 1 an die Sensoroberfläche 20. Dort liegen die Zellen 1 stochastisch verteilt vor. Im Fluss 40 werden die Zellen 1 z. B. mit Hilfe von Nickelstreifen magnetophoretisch über die magnetoresistiven Sensoren 20 geführt. Direkt über dem Sensor 20 wird ein im Wesentlichen homogenes Feld 220 generiert, welches, wie in 1 gezeigt, nur in z-Richtung verläuft. So ein vertikales Feld 220 sieht der Sensor 20 nicht, denn er ist nur in x-Richtung sensitiv. In 1 sieht man also beispielsweise eine superparamagnetisch markierte Zelle 1, die das Feld 220 in ihrer Umgebung verzerrt. Die x-Komponente dieses Streufeldes 24 ist das Feld, das mit dem Sensor 20 erfasst wird. In der Vorrichtung wird also die Inhomogenität des Magneten 22 ausgenutzt, der das externe Feld generiert. Dabei handelt es sich z. B. um einen NeFeB Magneten. Je nach Qualität des Magneten 22 variiert der homogenen Bereich 220 nahe am Magneten 22. Genau dieser Bereich wird unter dem Sensor 20 platziert. Das Gradientenfeld, das für die Anreicherung benötigt wird, ist dann gegeben durch die Inhomogenität des Magnetfeldes außerhalb des homogenen Bereichs 220.
Die 2 zeigt ein Diagramm mit einer Verteilungsfunktion N und quadratisch eingezeichneten Messpunkten. Dabei wurde gemessen, wie viele Analyte 1, welche beispielsweise Zellen sind, ein Streufeld 24 aufweisen, dessen Maximum in x-Richtung, welche von den Sensoren detektiert wird, einen gewissen Abstand Δx vom Zentrum des Analyten beträgt. Dieser Abstand Δx ist in μm angegeben.
In der 3 ist wiederum die Darstellung des Permanentmagneten 22 und des durch den Permanentmagneten 22 erzeugten homogenen Magnetfeldes 220 dargestellt. Die Zelle 1 weist einen optischen oder hydrodynamischen Durchmesser r_opt auf, aber auch einen sogenannten magnetischen Durchmesser r_mag, welcher insbesondere kleiner ist als der optische Durchmesser r_opt, d. h. der innerhalb der Zelle 1 liegt. Dieser kleinere Durchmesser liegt daran, dass die maximale Streufeldkomponente in x-Richtung, die von den Magnetsensoren 20 erfasst wird, an einer Position der Zelle liegt, welche sich innerhalb der Zelle 1 befindet. D. h. auch wenn die magnetischen Marker auf der Oberfläche der Zelle 1 sitzen, ist das durch die magnetische Markierung erzeugte Streufeld 24 nicht nur außerhalb, sondern auch innerhalb der Zelle 1 zu finden und sogar dessen Maximum in x-Richtung.
Die 4 zeigt schematisch den Messaufbau, sozusagen einen Ausschnitt aus einer Mikrofluidik mit einem Durchflusskanal. Der Kanalboden 11 weist zumindest einen Magnetsensor 20 auf und unterhalb des Kanalbodens 11 ist die magnetische Einheit 22 zur Erzeugung des Gradientenfeldes sowie des homogenen Magnetfeldes 220 angebracht. Der Magnetsensor 20 weist insbesondere eine Länge x₂₀ in Durchflussrichtung 40 auf. Der erste maximale Messausschlag passiert jedoch nicht in dem Moment, in dem die Zelle 1 mit ihrem optischen oder hydrodynamischen Durchmesser r_opt den Sensor 20 erreicht, sondern wie durch eine gestrichelte Linie angezeigt, erst wenn das in der Zelle 1 verlaufende magnetische Streufeld 24 sein Maximum der x-Komponente über den Rand des Sensors 20 schiebt. Diese Stelle markiert den magnetischen Radius r_mag, welcher insbesondere kleiner ist als der optische Radius r_opt der Zelle 1. Hat die Zelle 1 den Magnetsensor 20 überstrichen, wird ein zweiter maximaler Messausschlag in die andere Magnetfeldrichtung registriert.
Die 5 schließlich zeigt wie sich das über einen Zeitraum aufgenommene magnetoresistive Signal von mehreren aufeinanderfolgenden Zellen 1 verhält. Für den Fall, dass der magnetische Durchmesser r_mag mit dem optischen oder tatsächlichen Zellendurchmesser r_opt der Zelle 1 zusammenfällt, würde bei Überstreichen von zwei aneinanderliegenden Zellen 1 wie oben in der 5 gezeigt, ein erster positiver Messausschlag, verursacht durch die erste den Sensor 20 überstreichende Zelle 1, und ein zweiter negativer Messausschlag, verursacht durch das Ende der zweiten Zelle 1, detektiert werden. Da aber nun der magnetische Durchmesser innerhalb der Zelle 1 liegt, sind die Messausschläge, die mit dem Maximum der x-Komponente des Streufeldes 24 einer Zelle 1 zusammenhängen soweit voneinander getrennt Δt₁, dass jede Zelle 1 ein vollständiges Messsignal von zwei Messausschlägen hervorruft, wie im unteren Diagramm der 5 gezeigt. Der zeitliche Abstand der Messausschläge Δt eines Zellsignals korreliert mit dem magnetischen Durchmesser 2·r_mag einer magnetisch markierten Zelle 1. In der 5 ist auch wieder das homogene Magnetfeld 220 in z-Richtung eingezeichnet. Der Abstand der Zellen 1 zum Kanalboden 11 ist mit z₂₀ markiert. Die Zellen 1 überstreichen den Magnetsensor 20 in Durchflussrichtung 40.

Claims

Verfahren zur magnetischen Durchflussmessung eines Analyten, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: – magnetische Markierung von Analyten (1) in einer Probe, – Flusserzeugung der Analyten (1) über eine Sensoranordnung, wobei der Fluss (40) der Analyten (1) zumindest über ein magnetoresistives Bauteil (20) geführt wird, – Erzeugung eines magnetischen Gradientenfeldes, mittels welchem die markierten Analyte (1) über dem magnetoresistiven Bauteil (20) angereichert werden, sowie eines homogenen Magnetfeldes (220), wobei das homogene Magnetfeld (220) und das magnetoresistive Bauteil (20) so zueinander angeordnet sind, dass das homogene Magnetfeld (220) nicht vom magnetoresistiven Bauteil (20) erfasst wird, – Erfassung einzelner markierter Analyte (1), – wobei die magnetische Markierung derart vorgenommen wird, dass die markierten Analyte (1) je ein magnetisches Streufeld aufweisen, dessen durch das magnetoresistive Bauteil (20) erfassbare Maxima in einem Abstand vom Analytmittelpunkt (r_mag) liegen, der kleiner ist als der hydrodynamische Analytradius (r_opt).
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die magnetische Markierung mit magnetischen Nanobeads, insbesondere superparamagnetischen Nanobeads, vorgenommen wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem die magnetische Markierung mit Nanobeads vorgenommen wird, deren hydrodynamischer Durchmesser zwischen 10 nm und 500 nm beträgt.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem die magnetische Markierung mit Nanobeads vorgenommen wird, welche das Material Magnetit oder Maghemit aufweisen.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem die magnetische Markierung mit Nanobeads vorgenommen wird, welche eine Magnetisierung zwischen 10 (A·m²)/kg und 60 (A·m²)/kg aufweisen.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem die einzelnen markierten Analyte (1) mittels des magnetischen Gradientenfeldes über dem magnetoresistiven Bauteil (20) angereichert werden, so dass sie dort lokal in hoher Konzentration vorliegen, welche ausgehend von Probenkonzentrationen von 0,1 bis 10⁴ Analyte pro μl zwischen dem 100fachen bis 10000fachen nach der Anreicherung beträgt.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem die einzelnen Analyte (1) bei Überfließen des magnetoresistiven Bauteils (20) in direktem Kontakt miteinander stehen.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem die Durchflussgeschwindigkeit so eingestellt wird, dass die Analyte (1) mit konstanter Geschwindigkeit über das magnetoresistive Bauteil (20) geführt werden, insbesondere darüber abrollen.