DE102011001623A1

DE102011001623A1 - Verfahren zum Herstellen eines Präparats unter Verwendung von Zellen der Haarwurzelscheide, Präparat und Kit

Info

Publication number: DE102011001623A1
Application number: DE102011001623A
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Richter; Christian Toloczyki
Original assignee: EURODERM GmbH
Current assignee: EURODERM GmbH
Priority date: 2011-03-29
Filing date: 2011-03-29
Publication date: 2012-10-04

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen eines Präparats, insbesondere einer Suspension, welche Zellen des menschlichen Körpers aufweist. Sie betrifft ferner ein Präparat und ein Kit. Das Verfahren umfasst ein enzymatisches Ablösen von Zellen von der Haarwurzelscheide; ein Waschen der abgelösten Zellen und ein Suspendieren der Zellen in einer Pufferlösung unter Erhalt eines Präparats und wird vorzugsweise ohne Zentrifugierschritt mit leicht zugänglichen Gerätschaften durchgeführt.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen eines Präparats gemäß Anspruch 1. Sie betrifft ferner ein Präparat gemäß Anspruch 22 und ein Kit gemäß Anspruch 23.
Die Verwendung von Körperzellen wie Melanozytenvorläuferzellen und/oder Keratinozytenvorläuferzellen, beispielsweise zur Erhöhung oder Verstärkung einer Pigmentierung bestimmter Hautbereiche, ist bekannt, u. a. aus der PCT/EP 2008/007684 der Anmelderin der vorliegenden Erfindung, deren Inhalt hiermit in seiner Gesamtheit durch Bezugnahme in die vorliegende Anmeldung aufgenommen wird. Aus der PCT/EP 2008/007684 geht zudem ein Verfahren zum Vorbereiten der eingesetzten Körperzellen hervor.
Eine erfindungsgemäße Aufgabe ist es, ein weiteres Verfahren zum Herstellen eines Präparats, welches Zellen des Körpers aufweist, oder zu deren Vorbereitung, anzugeben.
Diese Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird durch ein Verfahren gemäß Anspruch 1 gelöst. Daneben wird ein Präparat mit Zellen gemäß Anspruch 22, sowie ein Kit zum Herstellen eines Präparats gemäß Anspruch 23 vorgeschlagen.
Gemäß Anspruch 1 wird ein Verfahren zum Herstellen eines Präparats, insbesondere einer Suspension, welche Zellen des menschlichen Körpers aufweist, vorgeschlagen. Dabei ist das Abtrennen der Pufferlösung durch Filtration unter Erhalt eines letzten Filterrückstands ein optionaler Schritt, der nicht Gegenstand bestimmter Ausführungsformen ist. In manchen dieser bestimmten Ausführungsformen der Erfindung ist statt des Abtrennens der Pufferlösung ein kontinuierlich durchlaufendes Waschverfahren vorgesehen, bei dem sich die Enzymlösung nach und nach herausverdünnt. In anderen erfindungsgemäßen Ausführungsformen sind kein solches Waschverfahren und auch kein Abtrennen vorgesehen.
Das erfindungsgemäße Präparat, welches unter Einsatz des erfindungsgemäßen Verfahrens erzeugt wurde, weist die Merkmale des Anspruchs 22 auf.
Gemäß Anspruch 23 wird ein Kit vorgeschlagen, mit welchem das erfindungsgemäße Verfahren durchführbar ist und mittels welchem das erfindungsgemäße Präparat herstellbar ist.
Vorteilhafte Weiterbildungen sind Gegenstand der Unteransprüche und Ausführungsformen. Bei allen folgenden Ausführungen ist der Gebrauch des Ausdrucks „kann sein” bzw. „kann haben” usw. synonym zu „ist vorzugsweise” bzw. „hat vorzugsweise” usw. zu verstehen und soll eine erfindungsgemäße Ausführungsform erläutern.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst in manchen oder allen erfindungsgemäßen Ausführungsformen das Auftragen eines hiermit erzeugten Präparats oder Erzeugnisses auf einen Körperabschnitt eines Patienten und/oder das Injizieren des erzeugten Präparats oder Erzeugnisses in einen Körperabschnitt und/oder andere Applikationsformen nicht.
Erfindungsgemäße Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können eines oder mehrere der folgenden Merkmale aufweisen.
In bestimmten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die verwendeten Zellen Melanozytenvorläuferzellen und/oder Keratinozytenvorläuferzellen und/oder mesenchymale Vorläuferzellen (im Folgenden auch kurz: „Vorläuferzellen”) oder weisen solche im Verband oder in einer Gruppe oder Mischung auf. In manchen Ausführungsformen liegen derartige Zellen auch in einer Zellmischung vor, die man erhält, wenn man die von der Haarwurzelscheide gewonnenen Zellen nicht nach ihrer Herkunft, Funktion oder Beschaffenheit trennt. Trennt man die gewonnen Zellen jedoch nach Erhalt, so kann man durch Verwenden von vornehmlich Melanozytenvorläuferzellen und/oder Keratinozytenvorläuferzellen und/oder mesenchymalen Vorläuferzellen eine höhere Wirkung nach ihrem Auftragen im Sinne der vorliegenden Erfindung erzielen oder geeigneter für eine spezifische Anwendung machen.
Wenn im Folgenden auf Melanozytenvorläuferzellen bzw. -stammzellen und/oder Keratinozytenvorläuferzellen bzw. -stammzellen Bezug genommen wird, so gilt dies uneingeschränkt auch für mesenchymale Vorläuferzellen und Stammzellen, selbst wenn dies nicht ausdrücklich erwähnt ist.
Das Präparat kann biokompatible Substanzen wie PBS (= Phosphate Buffered Saline, Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung) und/oder eine oder mehrere biokompatible, die Viskosität des Präparats erhöhende Substanzen wie z. B. Hyaluronan oder Kollagen umfassen.
Unter „Melanozytenvorläuferzellen” werden erfindungsgemäß sowohl autologe als auch allogene und xenogene Melanozytenvorläuferzellen bzw. -stammzellen verstanden, unter „Keratinozytenvorläuferzellen” sowohl autologe als auch allogene und xenogene Keratinozytenvorläuferzellen bzw. -stammzellen, unter „mesenchymalen Vorläuferzellen” sowohl autologe als auch allogene und xenogene mesenchymale Vorläuferzellen bzw. Stammzellen.
In bestimmten Ausführungsformen wurden, in anderen Ausführungsformen werden die erfindungsgemäßen Zellen mittels Zupfen von Haaren aus der vitalen Haut des Spenders oder mittels Zupfen oder anderweitigem Gewinnen von Haaren aus einer vorliegenden Hautbiopsie des Spenders gewonnen.
In manchen Ausführungsformen sind die Zellen zur Verwendung gewonnen und vorgesehen, ohne zuvor zur Anzucht von Zellen in eine Kultur verbracht zu werden oder verbracht worden zu sein.
In bestimmten Ausführungsformen sind oder werden die Zellen nicht verändert, insbesondere nicht genetisch verändert.
Die erfindungsgemäße Aufgabe wird ferner gelöst durch ein Präparat mit den Merkmalen des Anspruchs 11.
Da mit dem erfindungsgemäßen Präparat dieselben Vorteile wie mit dem oben beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren erzielbar sind, wird zur Vermeidung von Wiederholungen an dieser Stelle explizit auf deren obenstehende Diskussion verwiesen.
Das erfindungsgemäße Präparat weist erfindungsgemäße Zellen, beispielsweise Melanozytenvorläuferzellen und/oder Keratinozytenvorläuferzellen und/oder mesenchymale Vorläuferzellen, auf.
In einigen erfindungsgemäßen Ausführungsformen liegt das Präparat als Suspension vor.
In manchen erfindungsgemäßen Ausführungsformen ist das Präparat geeignet und/oder vorgesehen, unmittelbar auf eine Körperstelle aufgebracht zu werden, um beispielsweise die in der o. g. PCT/EP 2008/007684 beschriebenen Wirkungen zu erzielen.
Ferner wird die erfindungsgemäße Aufgabe auch gelöst durch ein Kit mit den Merkmalen des Anspruchs 23. Die mit diesen Verfahren erzielbaren Vorteile sind dieselben, die mit dem vorstehend beschriebenen Verfahren erzielbar sind, weshalb zur Vermeidung von Wiederholungen auf deren diesbezügliche Diskussion verwiesen wird.
Die Zellen können dabei mittels Zupfen von Haaren aus der vitalen Haut des Spenders oder mittels Zupfen oder anderweitigem Gewinnen von Haaren aus einer vorliegenden Hautbiopsie des Spenders gewonnen sein.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die Zellen zur Verwendung gewonnen und vorgesehen, ohne zuvor zur Anzucht von Zellen in eine Kultur verbracht zu werden oder verbracht worden zu sein. Dies kann gelten bis hin zum Erhalt eines Auftragzustandes des Präparats.
Das erfindungsgemäße Kit umfasst in manchen Ausführungsformen optional ein Gestell, ferner, ebenfalls optional, eine Schablone. Zudem umfasst es in bestimmten erfindungsgemäßen Ausführungsformen eine Haarfollikeleinheit (A). Die Haarfollikeleinheit (A) weist alle oder mehrere Gegenstände einer Gruppe auf, welche z. B.

mindestens eine Spritze, z. B. etwa 5 ml
mindestens eine Kanüle, z. B. etwa 40 mm, 18 G
mindestens ein Zellsieb
mindestens eine Klemme
mindestens eine Schere

umfasst.
Das erfindungsgemäße Kit umfasst in einigen Ausführungsformen eine Präparationseinheit (B). Die Präparationseinheit (B) weist alle oder mehrere Gegenstände einer Gruppe auf, welche z. B.

mindestens eine kleine Spritze (z. B. zwei kleine Spritzen), z. B. etwa 5 ml
mindestens eine Kanüle (z. B. zwei Kanülen), z. B. etwa 40 mm, 18 G
mindestens ein Sterilfilter (z. B. zwei Sterilfilter)
mindestens eine Pinzette
mindestens eine große Spritze, z. B. etwa 30 ml
mindestens eine Kanüle, z. B. etwa 80 mm, 14 G
mindestens eine Lüftungskanüle, z. B. etwa 25 mm, 21 G

umfasst.
Das erfindungsgemäße Kit umfasst in einigen Ausführungsformen eine Applikationseinheit (C). Die Applikationseinheit (C) weist alle oder mehrere Gegenstände einer Gruppe auf, welche:

mindestens eine Pinzette
mindestens eine Spritze, z. B. etwa 2 ml
mindestens eine Kanüle, z. B. etwa 40 mm, 18 G
mindestens ein Sprühfläschchen, z. B. etwa 5 ml
mindestens einen Sprühkopf

umfasst.
Die bei der Anwendung des erfindungsgemäßen Kits verwendeten Lösungen, Enzyme usw. liegen in einigen erfindungsgemäßen Ausführungsformen vor als Ampullen mit folgendem Inhalt:
Ampulle 1 PBS-Puffer, z. B. etwa 5 ml (Haarfollikel-Sammellösung)
Ampulle 2 PBS-Puffer, z. B. etwa 5 ml (zum Lösen des Dispase-Lyophilisats von Ampulle 3)
Ampulle 3 Dispase-Lyophilisat, z. B. etwa 5 mg (5 U) Dispase
Ampulle 4 PBS-Puffer mit EDTA, z. B. etwa 5 ml (zum Lösen des Trypsin/Hyaluronidase-Lyophilisat-Gemischs von Ampulle 5)
Ampulle 5 Trypsin (z. B. etwa 2 mg (15.000 BAEE)) plus Hyaluronidase (z. B. etwa 25 mg (7500 IU)) – Lyophilisatgemisch
Ampulle 6 PBS-Puffer enthaltend Mg-Ionen, z. B. etwa 30 ml (Waschpuffer)
Ampulle 7 PBS-Puffer, z. B. etwa 2 ml (Zellresuspensionspuffer).
Im Kit der hier dargestellten Ausführungsformen sind somit zwei enzymatische Verdaus enthalten. Der erste erfolgt mit Dispase der zweite mit Trypsin und Hyaluronidase im Gemisch. Der Dispaseverdau erfolgt vorzugsweise ohne EDTA, der Trypsinverdau vorzugsweise mit EDTA.
Statt der drei erwähnten Enzyme kommen grundsätzlich auch andere Enzyme in Frage, allein oder in Kombination und anstelle oder zusätzlich zu den genannten Enzymen, wie z. B. Papain, Elastase, Pronase, Accutase^TM, Collagenase und weitere Enzyme aus der Enzymklasse EC 3 (Hydrolasen). So kann beispielsweise Dispase durch eine oder mehrere andere, vorzugsweise neutrale Proteasen ersetzt oder ergänzt werden, Trypsin kann durch eine oder mehrere andere Proteasen ersetzt oder ergänzt werden, und Hyaluronidase kann durch ein oder mehrere andere Enzyme, die Hyaluronsäure spalten können, ersetzt werden.
Der PBS-Puffer mit EDTA kann beispielsweise als Flüssigkeit in Form einer klaren, farblosen, geruchlosen Lösung, hergestellt nach Ph. Eur (europäisches Arzneibuch in der aktuellen Version), mit einem pH von etwa 5,5 bis etwa 6 (z. B. 5,42 bis 6,04) und einer Osmolarität von etwa 330 bis etwa 370 mOsm/kg, z. B. 331–368 verwendet werden, wie sie beispielsweise von der Firma Biochrom AG, Deutschland unter der Artikelnummer L2113 in einer 100 ml Glasflasche erhältlich ist.
Die Trypsin/Hyaluronidase/EDTA-Lösung kann z. B. etwa 0,8%-ig (EDTA, w/v) vorliegen. Die Lösung bewirkt insbesondere eine Ablösung der Zellen vom Haarschaft. Die Ablösung erfolgt vorzugsweise bei etwa 37°C. Jedoch sind auch höhere Temperaturen möglich, bei denen die Viabilität der Zellen noch gewährleistet ist, oder niedrigere, bei denen noch eine Aktivität von Trypsin gewährleistet ist.
Zur enzymatischen Ablösung kann eine Inkubation mit Trypsin, etwa 30 bis etwa 30.000 BASE pro ml, insbesondere etwa 500 bis etwa 10.000 BASE pro ml, in PBS über etwa 1–50, insbesondere über etwa 15–30 min, erfolgen.
Der PBS-Puffer kann beispielsweise von der Firma BioConcept, Schweiz in einer 500 ml-Flasche in flüssiger Form mit einem pH von 7,3 ± 0,2 und einer Osmolarität von 285 ± 10 als PBS ohne Ca/Mg mit der Artikelnr. 3-05F29 (PBS1) oder als PBS-Puffer mit Ca/Mg unter der Artikeln. 8-05F00 (PBS2) als sterile, farblose und klare Flüssigkeit, die bei Raumtemperatur gelagert werden kann, bezogen werden. Dieses PBS kann zur Herstellung von M-Lösung geeignet sein.
Vorteilhaft an dem Vorgehen des enzymatischen Ablösens ist insbesondere, dass durch die mögliche Verwendung von Enzymen eine nachteilige Auswirkung auf die behandelten Zellen und/oder deren Veränderung, u. a. genetische Veränderung, vermieden werden kann. Die enzymatische Ablösung ist daher besonders schonend für die zu gewinnenden Zellen.
Ein mittels der vorliegenden Erfindung erzielbarer Vorteil liegt darin, dass der erfindungsgemäße Erfolg beim Herstellen der Zellsuspension ohne Zentrifugation erzielt werden kann. Dies erlaubt es vorteilhaft, die Erfindung ohne besondere apparative Ausgestaltung, selbst ohne Anschluss an eine Spannungsquelle, auszuführen. Dies kann beispielsweise mittels des im Folgenden beschriebenen Waschens der Haarfollikel nach der Enzymbehandlung ermöglicht werden. Derart vorgelöste Zellen bleiben zumindest zum Großteil an den Haaren hängen und werden erst durch ihr Bewegen, beispielsweise durch Schütteln im Endvolumen an Zellresuspensionspuffer, abgelöst. Sie können im Anschluss hieran direkt in ein geeignetes Behältnis, z. B. ein Sprühfläschchen, überführt und appliziert werden.
Zum Erläutern, wie das erfindungsgemäße Verfahren unter Einsatz eines erfindungsgemäßen Kits ablaufen kann, wird im Folgenden auf die Zeichnung verwiesen. In der Zeichnung gilt:
1 zeigt eine Schablone mit Symbolen zum Anleiten einer Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Kits in einer lediglich beispielhaften Ausführungsform.
Zur Vorbereiten der Herstellung des Präparats wird das in einigen erfindungsgemäßen Ausgestaltungen des Kits enthaltene dreidimensionale Gestell derart auf eine ebenfalls in manchen Ausgestaltungen im Kit enthaltene Schablone 100 (beispielsweise aus Papier mit farbigen Symbolen), gestellt, dass durch die Öffnungen des Gestells für Ampullen hindurch die jeweils den Öffnungen entsprechenden Symbole der Schablone 100 zu sehen sind. Die Verwendung der Schablone ist nicht erforderlich, sie dient allein der besseren Orientierung bei den folgenden Schritten; ferner unterstützt sie beim korrekten Verwenden des jeweils benötigten Inhalts der verschiedenen Ampullen des Kits. Das Gestell kann in bestimmten erfindungsgemäßen Ausführungsformen des Kits Pfeilmarkierungen aufweisen, wie sie in 1 erkennbar auch die Schablone 100 aufweisen kann. Anhand der dargestellten Pfeile kann sich der Anwender im Folgenden leicht orientieren, indem er ihnen in jeweils Pfeilrichtung folgt. Ein Auslassen von einzelnen Schritten des im Folgenden beschriebenen Vorgehens fällt dem Anwender somit auf, weil z. B. eine in Pfeilrichtung zurückliegende Vertiefung nicht gefüllt oder benutzt wurde, oder passiert erst gar nicht.
Anschließend werden die sich in der Verpackung des Kits befindenden Ampullen in die entsprechenden Aussparungen des Gestells eingesetzt. Dies senkt vorteilhaft die Gefahr eines späteren Verwechselns der einzelnen Ampullen. Dabei wird eine erste Ampulle in eine erste Öffnung 1 gestellt oder gesteckt, durch welche hindurch der Schriftzug Amp 1 der Schablone zu erkennen ist. Eine zweite Ampulle wird in eine zweite Öffnung 2 (Amp 2) gestellt, eine dritte Ampulle wird in eine dritte Öffnung 3 (Amp 3) gestellt, eine vierte Ampulle wird in eine vierte Öffnung 4 (Amp 4) gestellt, eine fünfte Ampulle wird in eine fünfte Öffnung 5 (Amp 5) gestellt, eine sechste Ampulle wird in eine sechste Öffnung 6 (auf der Schablone mit Amp 6 markiert) gestellt, und eine siebte Ampulle wird in eine siebte Öffnung 7 (Amp 7) gestellt.
Zum Gewinnen der Haarfollikel wird zunächst die Haarfollikeleinheit (A) bzw. Packung A geöffnet. Ein hierin enthaltenes Zellsieb wird in eine erste Vertiefung 11 des Gestells gesetzt oder gestellt. Die erste Vertiefung 11 ist im vorliegenden Beispiel jene, welche der in die erste Öffnung 1 eingesetzten Ampulle 1 am nächsten liegt. Die Vertiefung 11 kann – wie jede der übrigen Vertiefungen – eine Schale oder ein anderes Behältnis zur Aufnahme einer Flüssigkeit aufweisen.
Der Inhalt der ersten Ampulle, nämlich PBS-Puffer etwa 5 ml (hier als Haarfollikel-Sammellösung bezeichnet), wird mit Hilfe einer ebenfalls in der Packung A des Kits enthaltenen Spritze und einer Kanüle der ersten Ampulle entnommen und in das Zellsieb gegeben, welches sich nun in der ersten Vertiefung 11 befindet.
Eine Anzahl von Haarfollikeln, vorzugsweise etwa 50 bis etwa 500 und insbesondere etwa 250 Haarfollikel, die zuvor, insbesondere vor Beginn aller hier beschriebenen Schritte des Verwendens des Kits, bereits ausgezupft sein können, werden von totem Haarmaterial befreit. Das tote Haarmaterial kann z. B. mit einer ebenfalls in der Packung A vorhandenen Schere abgeschnitten werden.
Die Haarfollikel werden in ihrem nun vorliegenden Zustand in die im Zellsieb vorliegende Lösung gegeben.
Zur enzymatischen Präparation der Haarfollikelzellen wird in einigen erfindungsgemäßen Ausführungsformen wie folgt vorgegangen: Zunächst wird die in bestimmten Ausführungsformen des Kits vorliegende Präparationseinheit (B) bzw. Packung B geöffnet.
Der Inhalt der zweiten Ampulle, nämlich PBS-Puffer etwa 5 ml (zum Lösen des Dispase-Lyophilisats), welche in einer zweiten Öffnung 2 steckt oder steht, wird mittels einer (beispielsweise etwa 5 ml fassenden) Spritze und einer (beispielsweise etwa 40 mm langen) Kanüle zu Lyophilisat gegeben, welches sich in einer dritten Ampulle befindet, welche in einer dritten Öffnung 3 steckt und Dispase etwa 5 mg (5 U) Lyophilisat enthält. Nach einem Einbringen in die dritte Ampulle und/oder Auflösen des Inhalts der Spritze in der dritten Ampulle, wird der Inhalt der dritten Ampulle anschließend mittels der Spritze wieder aufgezogen. Die Kanüle wird von der gefüllten Spritze abgenommen. Statt der Kanüle wird ein Sterilfilter auf die Spritze aufgesetzt.
Der Spritzeninhalt wird durch den Sterilfilter hindurch aus der Spritze heraus in die zweite Vertiefung 12, welche im Beispiel der 1 der dritten Ampulle nun am nächsten liegt, gegeben.
Das Zellsieb, welches die Haarfollikel aufweist, wird aus der ersten Vertiefung 11 entnommen und in eine zweite Vertiefung 12 derart ein- oder vielmehr aufgesetzt, dass das Zellsieb passiv, d. h ohne Unterstützung des Anwenders, z. B. aufgrund seines Eigengewichts, in die zweite Vertiefung 12 eintauchen kann. Zum Hantieren mit dem Zellsieb kann die dem Kit in manchen Ausführungsformen beigefügte Pinzette verwendet werden. Das Zellsieb wird über eine erste Wartezeit von vorzugsweise etwa 10 bis 20 Minuten, insbesondere etwa 15 Minuten, in der zweiten Vertiefung 12 stehen gelassen.
Der Inhalt der vierten Ampulle, welche PBS-Puffer mit EDTA, etwa 5 ml (zum Lösen des Trypsin-/Hyaluronidase-Lyophilisat-Gemisches) enthält, wird mit einer zweiten (beispielsweise 5 ml fassenden) Spritze und einer zweiten (beispielsweise etwa 40 mm langen) Kanüle, beide können im Kit enthalten sein, zu Lyophilisat in die fünfte Ampulle geben werden, welche Trypsin, etwa 2 mg (15.000 BASE), und Hyaluronidase, etwa 25 mg (7500 IU), -Lyophilisatgemisch enthält. Der Inhalt wird, vorzugsweise nach seinem Auflösen, wieder mittels der zweiten Spritze, aufgezogen.
Die zweite Kanüle wird von der gefüllten zweiten Spritze abgenommen. Stattdessen wird ein Sterilfilter auf die zweite Spritze aufgesetzt. Der Spritzeninhalt wird durch den Sterilfilter hindurch in eine dritte Vertiefung 13, welcher der fünften Ampulle am nächsten liegt, gegeben.
Das Zellsieb mit den Haarfollikeln wird aus der zweiten Vertiefung 12 gehoben und in oder auf die dritte Vertiefung 13 derart passiv ein- oder aufgesetzt, dass das Zellsieb in die dritte Vertiefung 13 eintauchen kann. In der dritten Vertiefung 13 wird das Zellsieb eine zweite Wartezeit, vorzugsweise etwa 30 Minuten, stehengelassen.
Aus der sechsten Ampulle, sie enthält PBS-Puffer mit Mg-Ionen, etwa 30 ml (hier als Waschpuffer bezeichnet), wird mit einer (beispielsweise etwa 30 ml fassenden) Spritze und einer (beispielsweise etwa 80 mm langen) Kanüle, unter Verwendung einer (beispielsweise etwa 25 mm fassenden) Lüftungskanüle, etwa 30 ml Lösung entnommen und je ca. 5 ml davon in die sechs dafür vorgesehenen Vertiefungen 14, 15, 16, 17, 18 und 19 verteilt.
Das Zellsieb mit den Haarfollikeln wird aus der dritten Vertiefung 13 gehoben, um nacheinander behutsam in die nun befüllten sechs Vertiefungen 14, 15, 16, 17, 18 und 19 passiv eingetaucht und aus diesen wieder herausgehoben zu werden.
Zur Vorbereitung der Applikation wird die Applikationseinheit (C) bzw. Packung C geöffnet. Dann wird die siebte Ampulle, welche PBS-Puffer, etwa 2 ml (hier als Zellresuspensionspuffer bezeichnet) enthält, durch Abheben ihres Gummistopfens oder Deckels geöffnet. Das Zellsieb wird in die letzte Vertiefung, die Vertiefung 20, gestellt. Die Haarfollikel werden vorsichtig mittels der Pinzette aus dem Zellsieb in die siebte Ampulle transferiert. Anschließend wird die siebte Ampulle wieder mit dem Gummistopfen verschlossen.
Die siebte Ampulle wird dann für vorzugsweise etwa zwei bis etwa sechs Minuten, insbesondere etwa vier Minuten, leicht geschüttelt. Das erfindungsgemäße Verfahren ist damit in einigen Ausführungsformen beendet.
Dabei wurde unter Verwenden des erfindungsgemäßen Kits eine erfindungsgemäße Suspension bzw. ein erfindungsgemäßes Präparat hergestellt.
Das im Kit in einigen Ausführungsformen vorliegende Behältnis, beispielsweise ein Fläschchen, welches z. B. etwa 5 ml Volumen fasst und z. B. einen Schraubverschluss aufweisen kann (z. B. ein Sprayfläschchen), wird in die dafür vorgesehene achte Öffnung 8 im Gestell gestellt. Die achte Öffnung 8 steht über einer entsprechenden Markierung, z. B. „Spray”, der Schablone.
Der Inhalt der siebten Ampulle 7 wird mit Hilfe einer (beispielsweise etwa 2 ml fassenden) Spritze und einer (beispielsweise etwa 40 mm langen) Kanüle in das Sprayfläschchen überführt. Dieser Vorgang wird behutsam und langsam durchgeführt, um die in der Lösung befindlichen Zellen nicht zu schädigen. Die Haarreste verbleiben in der siebten Ampulle 7.
Ein Sprühkopf wird dann auf das Sprayfläschchen aufgesetzt oder geschraubt, oder dieses wird auf andere Weise verschlossen. Die Zellsuspension ist damit bereit, auf eine zu behandelnde Körperstelle aufgesprüht zu werden.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform des Kits weist der Zellresuspensionspuffer zusätzlich Hyaluronsäure (beispielsweise ca. 0,3%) auf, was vorteilhaft zur Erhöhung der Viskosität beiträgt. Anstelle von Hyaluronsäure kann selbstverständlich auch jede andere die Viskosität erhöhende Substanz, die keinen nachteiligen Einfluss auf den erfindungsgemäss zu erzielenden Erfolg hat, eingesetzt werden. Zur Applikation der hierbei gewonnenen, höherviskosen Lösung kann das Kit alternativ oder zusätzliche einen Pinsel aufweisen.
Ebenso kann das wie beschrieben erhaltene Präparat nicht nur zum Aufpinseln oder Aufsprühen, sondern auch zum Auftupfen oder dergleichen vorgesehen sein und/oder entsprechend appliziert werden.
Es wird darauf hingewiesen, dass in manchen Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ein Zentrifugieren nicht vorgesehen ist. Das Verfahren kann in solchen Ausführungsformen somit ohne Zentrifugieren ablaufen. Dies kann den apparativen Aufwand, welcher zur Durchführung des Verfahrens erforderlich ist, vorteilhaft gering halten.
Bezugszeichenliste

100: Schablone
1: erste Öffnung für eine erste Ampulle
2: zweite Öffnung für eine zweite Ampulle
3: dritte Öffnung für eine dritte Ampulle
4: vierte Öffnung für eine vierte Ampulle
5: fünfte Öffnung für eine fünfte Ampulle
6: sechste Öffnung für eine sechste Ampulle
7: siebte Öffnung für eine siebte Ampulle
8: achte Öffnung für ein Sprayfläschchen
11: erste Vertiefung
12: zweite Vertiefung
13: dritte Vertiefung
14, 15, 16, 17, 18, 19: Vertiefungen
20: letzte Vertiefung

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

EP 2008/007684 [0002, 0002, 0022]

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Präparats, insbesondere einer Suspension, welches menschliche Körperzellen aufweist, umfassend die folgenden Schritte in der angegebenen Reihenfolge: (1) In-Kontakt-Bringen von Haarfollikeln mit mindestens einer wässrigen Pufferlösung, die ein oder mehrere Enzyme enthält, die in der Lage sind, die Haftung der menschlichen Körperzellen an den Haarfollikeln zu schwächen, für mindestens etwa 5 Minuten, (2) Abtrennen der Pufferlösung von (1) durch Filtration unter Erhalt eines Filterrückstands, (3) mindestens einmaliges Waschen des Filterrückstands mit Enzym-freier wässriger Pufferlösung, (4) optionales Abtrennen der Pufferlösung von (3) durch Filtration unter Erhalt eines letzten Filterrückstands, (5) Bewegen, insbesondere Schütteln, des ersten oder letzten Filterrückstands mit Enzym-freier wässriger Pufferlösung unter Erhalt eines Präparats, das Haarfollikel und davon abgelöste menschliche Körperzellen in Enzym-freier wässriger Pufferlösung umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, weiter umfassend das Abtrennen der Haarfollikel von der die abgelösten menschlichen Körperzellen enthaltenden Pufferlösung.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem in Schritt (1) die Haarfollikel mit einer ersten Enzym-haltigen Pufferlösung in Kontakt gebracht werden, gefolgt von der Abtrennung der Pufferlösung durch Filtration und In-Kontakt-Bringen des Filterrückstands mit einer zweiten Enzym-haltigen Pufferlösung unter Erhalt des ersten Filterrückstands.
Verfahren nach Anspruch 3, bei dem die erste Pufferlösung Dispase und/oder eine oder mehrere andere neutrale Proteasen enthält.
Verfahren nach Anspruch 4, bei dem die Haarfollikel für mindestens etwa 5 Minuten, insbesondere etwa 10 bis etwa 30 Minuten, mit der ersten Pufferlösung in Kontakt gebracht werden.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 3 bis 5, bei dem die zweite Pufferlösung Trypsin und/oder eine oder mehrere andere Proteasen enthält.
Verfahren nach Anspruch 6, bei dem die zweite Pufferlösung zusätzlich Hyaluronidase enthält.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 3 bis 7, bei dem die Haarfollikel für mindestens etwa 5 Minuten, insbesondere etwa 20 bis etwa 40 Minuten, mit der zweiten Pufferlösung in Kontakt gebracht werden.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, bei dem in Schritt (2) und/oder Schritt (4) eine Sterilfiltration durchgeführt wird.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9, bei dem die Schritte (3) und/oder (4) nacheinander mindestens etwa dreimal, insbesondere etwa sechsmal, durchgeführt werden.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10, in dem es sich bei mindestens einem und vorzugsweise allen der eingesetzten Pufferlösungen um PBS-Puffer handelt.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 11, in dem die in Schritt (3) verwendete Pufferlösung Magnesiumionen enthält.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 12, bei dem das Volumen der pro Arbeitsgang eingesetzten Lösung etwa 3 ml bis etwa 10 ml und insbesondere etwa 5 ml beträgt.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 13, das unter Verwendung eines Kits, das alle verwendeten Pufferlösungen und/oder die für deren Herstellung benötigten Substanzen umfasst, durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 14, bei dem das Kit das oder die eingesetzten Enzym(e) in lyophilisierter Form enthält.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 14 und 15, bei dem das Kit zusätzlich die für die erforderlichen Arbeitsgänge benötigten Gerätschaften, insbesondere Spritzen, Kanülen und Filter, umfasst.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 14 und 15, bei dem das Kit die benötigten Flüssigkeiten in Ampullen verpackt aufweist und das Verfahren zusätzlich die Verwendung eines Gestells zur Aufnahme aller Ampullen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 17, bei dem zusätzlich eine Schablone (100), auf der das Gestell platziert werden kann, verwendet wird.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 18, bei dem es sich bei den menschlichen Körperzellen um solche der Haarwurzelscheide, insbesondere um Melanozytenvorläuferzellen und/oder Keratinozytenvorläuferzellen und/oder mesenchymale Vorläuferzellen, handelt oder die menschlichen Körperzellen derartige Zellen umfassen.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 19, welches kein Kultivieren der Zellen umfasst und/oder keinen Zentrifugier-Schritt umfasst und/oder keinen Schritt des Stoppens des enzymatischen Ablösungsvorgangs umfasst.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 20, beim dem etwa 50 bis etwa 500, insbesondere etwa 250 Haarfollikel eingesetzt werden.
Präparat, erhältlich gemäß dem Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 21.
Kit zur Durchführung des Verfahrens nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 21, das alle verwendeten Pufferlösungen und/oder die für deren Herstellung benötigten Substanzen umfasst.
Kit nach Anspruch 23, welches umfasst: PBS-Puffer; Dispase-Lyophilisat; PBS-Puffer mit EDTA; Trypsin mit Hyaluronidase-Lyophilisatgemisch; und PBS-Puffer mit Mg-Ionen.
Kit nach Anspruch 24, in dem jede der genannten Substanzen in einer Ampulle vorliegt.
Kit nach Anspruch 25, welches zusätzlich ein Gestell zur Aufnahme der Ampullen und gegebenenfalls eine Schablone (100), auf der das Gestell platziert werden kann, umfasst.