DE102011005288B4 - Process for the preparation of a protein hydrolyzate with ACE-inhibiting tryptophan-containing dipeptides - Google Patents
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Abstract
Verfahren zur Herstellung eines Proteinhydrolysats mit ACE-hemmenden tryptophanhaltigen Dipeptiden, durch enzymatische Hydrolyse eines proteinhaltigen Substrats in mindestens zwei Behandlungsschritten mit unterschiedlichen proteolytischen Enzymen, wobei das proteinhaltige Substrat Lysozym, alpha-Lactalbumin, beta-Lactoglobulin, Casein, Ovalbumin und/oder Lactoferrin enthält, dadurch gekennzeichnet, dass in einem Behandlungsschritt eine enzymatische Hydrolyse des proteinhaltigen Substrats mit Thermolysin und in einem weiteren Behandlungsschritt eine enzymatische Hydrolyse des proteinhaltigen Substrats mit Chymotrypsin durchgeführt wird.A process for producing a protein hydrolyzate with ACE-inhibiting tryptophan-containing dipeptides by enzymatic hydrolysis of a proteinaceous substrate in at least two treatment steps with different proteolytic enzymes, wherein the proteinaceous substrate contains lysozyme, alpha-lactalbumin, beta-lactoglobulin, casein, ovalbumin and / or lactoferrin, characterized in that in a treatment step, an enzymatic hydrolysis of the proteinaceous substrate with thermolysin and in a further treatment step, an enzymatic hydrolysis of the proteinaceous substrate is carried out with chymotrypsin.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Proteinhydrolysats mit ACE-hemmenden tryptophanhaltigen Dipeptiden durch enzymatische Hydrolyse von proteinhaltigen Substraten, insbesondere Lebensmittelproteinen. Das erfindungsgemäße Verfahren findet Anwendung in der Lebensmittelindustrie, insbesondere bei der Herstellung von funktionellen Lebensmitteln.The present invention relates to a method for producing a protein hydrolyzate with ACE-inhibiting tryptophan-containing dipeptides by enzymatic hydrolysis of protein-containing substrates, in particular food proteins. The method according to the invention finds application in the food industry, in particular in the production of functional foods.
Bluthochdruck (periphere arterielle Hypertonie, systolischer Blutdruck über 140 mmHg) ist heute eine Volkskrankheit, die in den Industrienationen ab dem 50. Lebensjahr jeden zweiten Erwachsenen betrifft und unbehandelt zu einer Reihe von Folgeerkrankungen, wie Schlaganfall und Herzinfarkt, führen kann. Hinsichtlich der Kosten für das Gesundheitssystem sind mit Bluthochdruck einhergehende Herz-/Kreislauferkrankungen die „Spitzenreiter“ aller Krankheitsklassen. Im Jahre 2002 wurden ca. 35 Mrd. Euro für Krankheiten des Herz-/Kreislaufsystems ausgegeben, das entspricht etwa 15 % der jährlichen Gesamtausgaben.High blood pressure (peripheral arterial hypertension, systolic blood pressure over 140 mmHg) is today a widespread disease, which affects every second adult in the industrialized nations from the age of 50 and, if left untreated, can lead to a number of secondary diseases such as stroke and myocardial infarction. With regard to health care costs, cardiovascular diseases associated with hypertension are the "front runners" of all disease classes. In 2002, about € 35 billion was spent on cardiovascular diseases, which is equivalent to about 15% of total annual expenditure.
Für die Blutdruckeinstellung ist die Aktivität des sogenannten Angiotensin Converting Enzyme (ACE) von zentraler Bedeutung. Im Rahmen der Blutdruckregulation katalysiert diese Peptidase die Spaltung von Angiotensin I zu dem hochwirksamen Vasokonstriktor Angiotensin II. ACE katalysiert ferner den Abbau des vasodilatorisch wirksamen Bradykinin. Die selektive Blockade des ACE führt daher zu einer effektiven Blutdrucksenkung, was in den 1980er Jahren zur Entwicklung einer wirtschaftlich überaus erfolgreichen Klasse an Pharmazeutika geführt hat, den sogenannten „ACE-Blockern“ (ACE-Inhibitoren). Schätzungen zufolge werden in Deutschland heute etwa 20 % der Bevölkerung bzw. jeder zweite im Alter über 55 Jahre mit Arzneimitteln gegen zu hohen Blutdruck behandelt. Medikamente gegen Hypertonie stehen nach Schmerzmitteln (Analgetika) an zweiter Stelle der verordnungsstärksten Arzneimittel. Das Gesundheitssystem der BRD wurde im Jahre 2005 mit etwa 1,5 Milliarden Euro für Medikamente zur Behandlung von Bluthochdruck belastet, wovon etwa die Hälfte auf die Verschreibung von ACE-Hemmern entfiel.For the blood pressure adjustment, the activity of the so-called Angiotensin Converting Enzyme (ACE) is of central importance. In the context of blood pressure regulation, this peptidase catalyzes the cleavage of angiotensin I to the highly potent vasoconstrictor angiotensin II. ACE also catalyzes the degradation of the vasodilatory bradykinin. The selective blockade of ACE therefore leads to an effective blood pressure reduction, which in the 1980s led to the development of an economically highly successful class of pharmaceuticals, the so-called "ACE blockers" (ACE inhibitors). It is estimated that about 20% of the population in Germany today, and every second person over the age of 55 is treated with medicines for high blood pressure. Medication for hypertension is the second most prescribed drug after painkillers (analgesics). The health system of the FRG was burdened in 2005 with about 1.5 billion euros for drugs for the treatment of hypertension, of which about half accounted for the prescription of ACE inhibitors.
Vor diesem Hintergrund wird nach Präventionswegen gesucht, mit denen eine medikamentenunabhängige Einstellung des Blutdrucks und damit Verringerung des Folgeerkrankungsrisikos erreicht werden kann. Eine Senkung des Blutdrucks ist beispielsweise mit Hilfe bioaktiver Nahrungsbestandteile möglich.Against this background, a search is being made for prevention methods with which a drug-independent adjustment of the blood pressure and thus a reduction of the consequential disease risk can be achieved. A reduction in blood pressure is possible, for example, with the help of bioactive food components.
Es ist bekannt, dass Peptide aus Proteinhydrolysaten von Lebensmittelproteinen, im Speziellen aus Milchproteinen, ACE in vitro inhibieren können. Die ACE-hemmenden Peptide liegen in der Struktur von Lebensmittelproteinen vor und werden durch enzymatische Hydrolyse gewonnen. Die bekanntesten Peptide sind die beiden prolinhaltigen Tripeptide Val-Pro-Pro und IIe-Pro-Pro, die bei der Milchfermentation mit speziellen Mikroorganismen (Lactobacillus helveticus LBK-16H, Aspergillus oryzae) durch proteolytischen Abbau aus Casein gebildet werden. Diese auch als „Casokinine“ oder „Lactotripeptide“ bekannten Peptide können entweder endogen in Sauermilchprodukten gebildet oder nach vorhergehender Anreicherung bestimmten Lebensmitteln zugesetzt werden.It is known that peptides from protein hydrolysates of food proteins, in particular milk proteins, can inhibit ACE in vitro. The ACE-inhibiting peptides are present in the structure of food proteins and are obtained by enzymatic hydrolysis. The best-known peptides are the two proline-containing tripeptides Val-Pro-Pro and IIe-Pro-Pro, which are formed by lactose fermentation with special microorganisms (Lactobacillus helveticus LBK-16H, Aspergillus oryzae) by proteolytic degradation from casein. These peptides, also known as "casokinins" or "lactotripeptides", can either be formed endogenously in sour milk products or added to certain foods after prior enrichment.
Funktionelle Milchprodukte zur Blutdrucksenkung, die Val-Pro-Pro und IIe-Pro-Pro enthalten, sind mittlerweile in Japan („Calpis“) und mehreren europäischen Ländern („Evolus“ in Finnland, Portugal, Schweiz) kommerziell erhältlich. Die Produkte erwiesen sich jedoch in aktuellen Studien als nicht ausreichend wirksam: Nach oraler Aufnahme wurde keine ACE-Hemmung in vivo, sowie keine signifikante Absenkung des Blutdrucks bei Hypertonikern erreicht [Engberink et al. (2008) Hypertension, 51, 399-405; Wuerzner et al. (2009) J Hypertension, 27, 1404-1409; Geleijnse & Engberink (2010) Curr. Opin. Lipidol. 21, 58-63]. Gründe für die unzureichende Wirksamkeit von Oligopeptiden (größer als 3 Aminosäuren) sind unter anderem in der mangelnden Stabilität im Gastrointestinaltrakt zu suchen. Zahlreiche in der Literatur beschriebenen, in vitro wirksame Oligopeptide dürften aufgrund dieser Tatsache keine Wirkung in vivo haben [Foltz et al. (2010) J. Nutr. 140, 117-118].Functional blood pressure lowering dairy products containing Val-Pro-Pro and IIe-Pro-Pro are now commercially available in Japan ("Calpis") and several European countries ("Evolus" in Finland, Portugal, Switzerland). However, the products did not prove to be sufficiently effective in recent studies: after ingestion, no ACE inhibition was observed in vivo and no significant reduction in hypertensive blood pressure [Engberink et al. (2008) Hypertension, 51, 399-405; Wuerzner et al. (2009) J Hypertension, 27, 1404-1409; Geleijnse & Engberink (2010) Curr. Opin. Lipidol. 21, 58-63]. Reasons for the inadequate efficacy of oligopeptides (greater than 3 amino acids) include the lack of stability in the gastrointestinal tract. Many in vitro effective oligopeptides described in the literature are unlikely to have any effect in vivo due to this fact [Foltz et al. (2010) J. Nutr. 140, 117-118].
Neben prolinhaltigen Peptiden sind Di- und Tripeptide, die einen Tryptophanrest am C- oder NTerminus aufweisen (hierin auch als „tryptophanhaltige Peptide“ bezeichnet) als weitere Klasse hochwirksamer ACE-Inhibitoren bekannt.In addition to proline-containing peptides, di- and tripeptides having a tryptophan residue at the C or NT terminus (also referred to herein as "tryptophan-containing peptides") are known as another class of potent ACE inhibitors.
Die Veröffentlichung
Die
Weiterhin offenbart die
Bei herkömmlichen Hydrolyse-Verfahren ist es jedoch schwierig, die gewünschten Di- und Tripeptide selektiv aus den Proteinquellen freizusetzen.However, in conventional hydrolysis methods it is difficult to selectively liberate the desired di- and tripeptides from the protein sources.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein verbessertes Verfahren zur enzymatischen Hydrolyse von Proteinen oder Proteingemischen anzugeben, mit dessen Hilfe die Freisetzung tryptophanhaltiger Peptide erfolgt.The object of the present invention is therefore to specify an improved process for the enzymatic hydrolysis of proteins or protein mixtures, with the aid of which the release of tryptophan-containing peptides takes place.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung eines Proteinhydrolysats mit ACE-hemmenden tryptophanhaltigen Dipeptiden, bei dem ein proteinhaltiges Substrat einer enzymatischen Hydrolyse in mindestens zwei Behandlungsschritten mit unterschiedlichen proteolytischen Enzymen unterzogen wird. Dabei wird in einem Behandlungsschritt eine enzymatische Hydrolyse des proteinhaltigen Substrats mit Thermolysin und in einem weiteren Behandlungsschritt eine enzymatische Hydrolyse des proteinhaltigen Substrats mit mindestens einem weiteren proteolytischen Enzym ausgewählt aus Chymotrypsin, Carboxypeptidase B, Trypsin, Alcalase und deren Mischung untereinander durchgeführt.According to the invention, the object is achieved by a process for the preparation of a protein hydrolyzate with ACE-inhibiting tryptophan-containing dipeptides, in which a protein-containing substrate is subjected to enzymatic hydrolysis in at least two treatment steps with different proteolytic enzymes. In this case, enzymatic hydrolysis of the protein-containing substrate with thermolysin is carried out in one treatment step and enzymatic hydrolysis of the protein-containing substrate with at least one further proteolytic enzyme selected from chymotrypsin, carboxypeptidase B, trypsin, Alcalase and their mixture with each other in a further treatment step.
Die Hydrolyse des proteinhaltigen Substrats mit Thermolysin wird dabei entweder als erster Behandlungsschritt oder als zweiter Behandlungsschritt durchgeführt. Bevorzugt erfolgt neben der Hydrolyse mit Thermolysin eine Hydrolyse mit Chymotrypsin, wobei das proteinhaltige Substrat besonders bevorzugt zunächst mit Chymotrypsin und anschließend mit Thermolysin durchgeführt wird.The hydrolysis of the proteinaceous substrate with thermolysin is carried out either as a first treatment step or as a second treatment step. In addition to hydrolysis with thermolysin, hydrolysis with chymotrypsin preferably takes place, the protein-containing substrate being particularly preferably carried out first with chymotrypsin and then with thermolysin.
Mit dem erfindungsgemäßen Hydrolyseverfahren werden insbesondere beim proteolytischen Abbau von Lysozym und alpha-Lactalbumin bioaktive tryptophanhaltige Peptide, insbesondere Dipeptide, freigesetzt. Tryptophanhaltige Di- und Tripeptide zeichnen sich durch eine besonders gute ACE-hemmende Wirkung verbunden mit einer hohen Proteolysestabilität im Dünndarm aus, woraus eine sehr gute Bioverfügbarkeit und eine mögliche Senkung des Blutdrucks resultieren. Neben den bereits bekannten Peptiden IIe-Trp und Trp-Leu werden mit dem erfindungsgemäßen Verfahren die Dipeptide Ala-Trp und Trp-Trp mit hoher Effizienz aus den proteinhaltigen Substraten freigesetzt. Die Dipeptide Ala-Trp und Trp-Trp zeigen eine besonders gute ACE-hemmende Wirkung (Ala-Trp: IC50 = 20 µM, Trp-Trp: IC50 = 18 µM). Die Freisetzung der ACE-hemmenden Peptide Ala-Trp und Trp-Trp aus dem Hühnerei-Lysozym war bisher unbekannt, so dass bisher keine praktische Anwendung für diese Dipeptide existiert. Das Peptid Ala-Trp kommt dreimal in der 129 Aminosäuren langen Sequenz von Lysozym vor, so dass das Eiprotein eine sehr gute Quelle für dieses und andere tryptophanhaltige Peptide darstellt.With the hydrolysis process according to the invention bioactive tryptophan-containing peptides, in particular dipeptides, are released, in particular during the proteolytic degradation of lysozyme and alpha-lactalbumin. Tryptophan-containing di- and tripeptides are characterized by a particularly good ACE-inhibiting effect combined with a high proteolysis stability in the small intestine, resulting in a very good bioavailability and a possible reduction in blood pressure. In addition to the already known peptides IIe-Trp and Trp-Leu, the dipeptides Ala-Trp and Trp-Trp are released from the protein-containing substrates with high efficiency by the method according to the invention. The dipeptides Ala-Trp and Trp-Trp show a particularly good ACE-inhibiting action (Ala-Trp: IC 50 = 20 μM, Trp-Trp: IC 50 = 18 μM). The release of the ACE-inhibiting peptides Ala-Trp and Trp-Trp from the chicken egg lysozyme was previously unknown, so that there is no practical application for these dipeptides. The peptide Ala-Trp occurs three times in the 129 amino acid sequence of lysozyme, making the egg protein a very good source of this and other tryptophan-containing peptides.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren handelt es sich um enzymatisches Hydrolyseverfahren mit mindestens zwei Behandlungsschritten (mehrstufige Hydrolyse). Dabei wird der enzymatische Verdau des proteinhaltigen Substrats mit mindestens zwei unterschiedlichen proteolytischen Enzymen in mindestens zwei aufeinander folgenden Hydrolyseschritten durchgeführt. Ein Behandlungsschritt davon umfasst die Hydrolyse des proteinhaltigen Substrats mit Thermolysin und ein weiterer Behandlungsschritt umfasst die Hydrolyse mit Chymotrypsin, Carboxypeptidase B, Alcalase und/oder Trypsin, vorzugsweise Chymotrypsin. Bevorzugt umfasst ein erfindungsgemäßes Verfahren zwei Behandlungsschritte.The process according to the invention is an enzymatic hydrolysis process with at least two treatment steps (multistage hydrolysis). In this case, the enzymatic digestion of the protein-containing substrate is carried out with at least two different proteolytic enzymes in at least two successive hydrolysis steps. A treatment step thereof comprises hydrolysis of the proteinaceous substrate with thermolysin and another treatment step comprises hydrolysis with chymotrypsin, carboxypeptidase B, alcalase and / or trypsin, preferably chymotrypsin. A method according to the invention preferably comprises two treatment steps.
Vor, zwischen und nach den Hydrolyseschritten erfolgen gegebenenfalls weitere, im Stand der Technik gebräuchliche Schritte. Bevorzugt erfolgt eine Aufreinigung des hydrolysierten Substrats nach den Hydrolyseschritten (Behandlungsschritten), eine Umpufferung des hydrolysierten Substrats zwischen den Hydrolyseschritten, eine Hitzeinaktivierung der proteolytischen Enzyme nach den Hydrolyseschritten und/oder eine Isolierung der erhaltenen tryptophanhaltigen Dipeptide nach Beendigung des letzten Hydrolyseschritts.Before, between and after the hydrolysis steps, if appropriate, further steps customary in the prior art take place. Preference is given to purification of the hydrolyzed substrate after the Hydrolysis steps (treatment steps), a Umpufferung the hydrolyzed substrate between the hydrolysis steps, a heat inactivation of the proteolytic enzymes after the hydrolysis steps and / or isolation of the obtained tryptophan dipeptides after completion of the last hydrolysis step.
Vorzugsweise erfolgt dem letzten Behandlungsschritt, welcher vorzugsweise der zweite Behandlungsschritt ist, eine Inaktivierung des proteolytischen Enzyms. Anschließend daran erfolgt bevorzugt eine Trocknung des erhaltenen Proteinhydrolysats, vorzugsweise durch Sprühtrocknung. Dies hat den Vorteil, dass das Proteinhydrolysat in getrockneter Form eine bessere Haltbarkeit aufweist als das flüssige Proteinhydrolysat.Preferably, the last treatment step, which is preferably the second treatment step, is an inactivation of the proteolytic enzyme. Subsequently, drying of the protein hydrolyzate obtained preferably takes place, preferably by spray drying. This has the advantage that the protein hydrolyzate in dried form has a better shelf life than the liquid protein hydrolyzate.
Das proteinhaltige Substrat wird zur Durchführung der Hydrolyse vorzugsweise in wässriger Lösung oder wässriger Suspension eingesetzt. Dabei liegt das proteinhaltige Substrat vorzugsweise in einer Konzentration von 1 bis 50 Gew.-%, bevorzugt 5 bis 20 Gew.-%, in der wässrigen Lösung oder der wässrigen Suspension vor.The proteinaceous substrate is preferably used to carry out the hydrolysis in aqueous solution or aqueous suspension. The protein-containing substrate is preferably present in a concentration of 1 to 50 wt .-%, preferably 5 to 20 wt .-%, in the aqueous solution or the aqueous suspension.
Die Dauer der einzelnen Behandlungsschritte kann gezielt eingestellt werden, indem die Freisetzung der gewünschten bioaktiven tryptophanhaltigen Dipeptide während der Hydrolyse überwacht wird. Bevorzugt wird der Hydrolyseschritt abgestoppt, sobald eine Stagnation der Bildung ausgewählter tryptophanhaltiger Peptide zu verzeichnen ist.The duration of the individual treatment steps can be adjusted in a targeted manner by monitoring the release of the desired bioactive tryptophan-containing dipeptides during the hydrolysis. Preferably, the hydrolysis step is stopped as soon as a stagnation of the formation of selected tryptophan-containing peptides is recorded.
Der Verlauf der Hydrolyse und die Bildung der gewünschten tryptophanhaltigen Dipeptide werden vorzugsweise durch geeignete Verfahren wie HPLC, insbesondere RP-HPLC, oder Gelpermeationschromatographie (GPC) überwacht. Dazu wird während der Hydrolyse eine Teilprobe entnommen und mit einem der vorgenannten Verfahren analysiert. Alternativ oder in Kombination zu den vorgenannten Verfahren zur Identifikation der chemischen Zusammensetzung des Hydrolysats (HPLC, GPC) wird aus einer Teilprobe des Hydrolysats die ACE-hemmende Wirkung ermittelt.The course of the hydrolysis and the formation of the desired tryptophan-containing dipeptides are preferably monitored by suitable methods such as HPLC, in particular RP-HPLC, or gel permeation chromatography (GPC). For this purpose, a partial sample is taken during the hydrolysis and analyzed by one of the aforementioned methods. Alternatively or in combination with the abovementioned methods for identifying the chemical composition of the hydrolyzate (HPLC, GPC), the ACE-inhibiting action is determined from a partial sample of the hydrolyzate.
Proteinhaltige Substrate im Sinne der Erfindung sind Proteine oder Proteingemische, insbesondere aus Lebensmitteln erhältliche Proteine oder Proteingemische. Bevorzugte Proteingemische, die als proteinhaltige Substrate in einem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden, sind Vollei, Eipulver, Molke, Molkenpulver und/oder Molkenproteinisolat.Protein-containing substrates for the purposes of the invention are proteins or protein mixtures, in particular proteins or protein mixtures obtainable from foods. Preferred protein mixtures which are used as proteinaceous substrates in a method according to the invention are whole egg, egg powder, whey, whey powder and / or whey protein isolate.
Vorzugsweise enthält das proteinhaltige Substrat alpha-Lactalbumin, Lysozym, beta-Lactoglobulin, Casein, Ovalbumin oder Lactoferrin. Bevorzugt sind die vorgenannten Proteine dabei zu mindestens 40 Gew.-% in dem proteinhaltigen Substrat enthalten (Massenanteil der Gesamtheit der vorgenannten Proteine am proteinhaltigen Substrat). Besonders bevorzugt wird als proteinhaltiges Substrat ein alpha-Lactalbumin- und/oder ein Lysozym-haltiges Substrat eingesetzt. Besonders bevorzugte Substrate sind alpha-Lactalbumin- und/oder Lysozym mit einer Reinheit von vorzugsweise mindestens 90 Gew.-%.Preferably, the proteinaceous substrate contains alpha-lactalbumin, lysozyme, beta-lactoglobulin, casein, ovalbumin or lactoferrin. Preferably, the abovementioned proteins are at least 40% by weight in the protein-containing substrate (percentage by mass of the entirety of the abovementioned proteins on the protein-containing substrate). Particularly preferred protein-containing substrate used is an alpha-lactalbumin and / or a lysozyme-containing substrate. Particularly preferred substrates are alpha-lactalbumin and / or lysozyme having a purity of preferably at least 90% by weight.
Bevorzugte alpha-Lactalbumin-haltige Substrate sind ausgewählt aus Molke, Molkenpulver, Molkenproteinisolat, Molkenproteinkonzentrat, Molkenproteinpräparaten und aus Molke gewonnenem alpha-Lactalbumin. Dabei können diese alpha-Lactalbumin-haltigen Substrate gegebenenfalls durch Verfahrensschritte wie Mikrofiltration, isoelektrische Ausfällung, Chromatographie und dergleichen weiterverarbeitet oder veredelt worden sein, so dass alpha-Lactalbumin im ursprünglichen Substrat angereichert vorliegt. Besonders bevorzugte alpha-Lactalbumin-haltige Substrate, die in einem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden, sind isoliertes alpha-Lactalbumin oder alpha-Lactalbumin angereichertes Molkenproteinkonzentrat. Ganz besonders bevorzugt wird alpha-Lactalbumin angereichertes Molkenproteinkonzentrat eingesetzt, in welchem alpha-Lactalbumin aus der Molke durch Ultrafiltrationstechnik angereichert wurde.Preferred alpha-lactalbumin-containing substrates are selected from whey, whey powder, whey protein isolate, whey protein concentrate, whey protein preparations and whey-derived alpha-lactalbumin. These alpha-lactalbumin-containing substrates may optionally have been further processed or refined by process steps such as microfiltration, isoelectric precipitation, chromatography and the like, so that alpha-lactalbumin is enriched in the original substrate. Particularly preferred alpha-lactalbumin-containing substrates used in a method according to the invention are isolated alpha-lactalbumin or alpha-lactalbumin enriched whey protein concentrate. Very particular preference is given to using alpha-lactalbumin-enriched whey protein concentrate in which alpha-lactalbumin from the whey was enriched by ultrafiltration technology.
Bevorzugte Lysozym-haltige Substrate sind ausgewählt aus Eiklar, Eiklarproteinisolat, Eiklarproteinkonzentrat und Milchprotein aus Kuh-, Esel-, Stuten- oder Kamelmilch. Vorzugsweise wurde Lysozym in einem der vorgenannten Substrate angereichert. Besonders bevorzugt wird gereinigtes Lysozym eingesetzt. Ganz besonders bevorzugt wird gereinigtes Lysozym aus Hühnereiweiß mit einer Reinheit von mindestens 80 Gew.-% eingesetzt.Preferred lysozyme-containing substrates are selected from egg white, egg white protein isolate, egg white protein concentrate and milk protein from cow, donkey, mares or camel milk. Preferably, lysozyme was enriched in one of the aforementioned substrates. Purified lysozyme is particularly preferably used. Very particular preference is given to using purified lysozyme from egg white with a purity of at least 80% by weight.
Enthält das proteinhaltige Substrat Lactose, so wird das proteinhaltige Substrat bevorzugt vor, während oder nach der Hydrolyse zusätzlich mit Lactase und/oder β-Galactosidase behandelt.If the proteinaceous substrate contains lactose, the proteinaceous substrate is preferably additionally treated with lactase and / or β-galactosidase before, during or after the hydrolysis.
In einem der Behandlungsschritte zur Hydrolyse des proteinhaltigen Substrats in einem erfindungsgemäßen Verfahren wird die Peptidase Thermolysin eingesetzt. Thermolysin ist eine thermostabile Metallopeptidase aus dem thermophilen Bakterium Bacillus thermoproteolyticus. Thermolysin trägt die E.C.(Enzyme Commission)-Nummer 3.4.24.27.In one of the treatment steps for hydrolysis of the protein-containing substrate in a method according to the invention, the peptidase thermolysin is used. Thermolysin is a thermostable Metallopeptidase from the thermophilic bacterium Bacillus thermoproteolyticus. Thermolysin carries the EC (Enzyme Commission) number 3.4.24.27.
Zur enzymatischen Hydrolyse mit Thermolysin wird vorzugsweise ein Massenverhältnis Substrat/Enzym von 1:20 bis 1:1000, bevorzugt von 1:50 bis 1:500, besonders bevorzugt von 1:100 bis 1:300 eingestellt (die Angabe bezieht sich auf Masse des proteinhaltigen Substrats zur Masse des Enzyms).For enzymatic hydrolysis with thermolysin preferably a mass ratio substrate / enzyme of 1:20 to 1: 1000, preferably from 1:50 to 1: 500, more preferably from 1: 100 to 1: 300 set (the statement refers to the mass of proteinaceous substrate to the mass of the enzyme).
Die Hydrolyse mit Thermolysin wird bevorzugt in Wasser oder in einer wässrigen Lösung, insbesondere einer Pufferlösung, durchgeführt. Als Pufferlösung wird vorzugsweise PBS (Phosphat-gepufferte Saline) oder HEPES eingesetzt. Zur Stabilisierung des Thermolysin enthält das Wasser oder die Pufferlösung vorzugsweise Ca2+-Ionen. Die Pufferlösung enthält vorzugsweise kein EDTA. Die Hydrolyse mit Thermolysin wird bevorzugt bei pH 5 bis 9,5, besonders bevorzugt 6 bis 8,5, ganz besonders bevorzugt bei 7 bis 8 durchgeführt.The hydrolysis with thermolysin is preferably carried out in water or in an aqueous solution, in particular a buffer solution. The buffer solution used is preferably PBS (phosphate-buffered saline) or HEPES. To stabilize the thermolysin, the water or buffer solution preferably contains Ca 2+ ions. The buffer solution preferably contains no EDTA. The hydrolysis with thermolysin is preferably carried out at
Als Aktivität von Thermolysin werden vorzugsweise 10 U/ml bis 100 U/ml, insbesondere 20 U/ml bis 40 U/ml, eingestellt. Eine Enzymeinheit (Unit, U) wird dabei definiert als diejenige Menge Enzym, welche in einer Minute eine Menge Folin's Reagenz (1,2-Naphthochinon-4-sulfonsäure Natriumsalz), die einem 1 µg Tyrosin entspricht, aus Milch-Casein bei 35 °C und pH 7,2 freisetzt.The activity of thermolysin is preferably adjusted to 10 U / ml to 100 U / ml, in particular 20 U / ml to 40 U / ml. An enzyme unit (Unit, U) is defined as the amount of enzyme which in a minute a quantity of Folin's reagent (1,2-naphthoquinone-4-sulfonic acid sodium salt), which corresponds to a 1 ug tyrosine, from milk casein at 35 ° Releases C and pH 7.2.
Zur Hydrolyse des proteinhaltigen Substrats mit Thermolysin wird das Substrat zunächst in Wasser oder der wässrigen Lösung vorgelegt und anschließend wird Thermolysin zugegeben. Die Inkubation des proteinhaltigen Substrats mit Thermolysin erfolgt vorzugsweise bei einer Temperatur von 60 bis 90 °C, bevorzugt von 70 bis 80 °C. Die Behandlung mit Thermolysin wird vorzugsweise für 1 bis 36 h, bevorzugt für 10 bis 30 h, besonders bevorzugt für 12 bis 24 durchgeführt.For hydrolysis of the protein-containing substrate with thermolysin, the substrate is initially introduced into water or the aqueous solution and then thermolysin is added. The incubation of the protein-containing substrate with thermolysin is preferably carried out at a temperature of 60 to 90 ° C, preferably from 70 to 80 ° C. The treatment with thermolysin is preferably carried out for 1 to 36 h, preferably for 10 to 30 h, particularly preferably for 12 to 24.
Zum Ende der Behandlung mit Thermolysin erfolgt vorzugsweise eine Inaktivierung des Enzyms, insbesondere durch thermische Inaktivierung. Besonders bevorzugt ist eine thermische Inaktivierung bei mindestens 95 °C für mindestens 5 min.At the end of the treatment with thermolysin preferably takes place inactivation of the enzyme, in particular by thermal inactivation. Particularly preferred is a thermal inactivation at least 95 ° C for at least 5 min.
Zusätzlich zur Hydrolyse des proteinhaltigen Substrats mit Thermolysin wird das proteinhaltige Substrat in einem weiteren Behandlungsschritt mit Chymotrypsin, Carboxypeptidase B, Trypsin und/oder Alcalase hydrolysiert.In addition to hydrolysis of the proteinaceous substrate with thermolysin, the proteinaceous substrate is hydrolyzed in a further treatment step with chymotrypsin, carboxypeptidase B, trypsin and / or alcalase.
Chymotrypsin (E.C. 3.4.21.1) ist eine Serinpeptidase, welche im Pankreas gebildet wird. Vorzugsweise wird Chymotrypsin aus Rinderpankreas eingesetzt. In einer Ausführungsform der Erfindung ist das verwendete Chymotrypsin mit N-alpha-p-Tosyl-L-Lysin-Chlormethylketon (TLCK) vorbehandelt, um evtl. vorhandene Trypsininterferenz zu unterbinden.Chymotrypsin (E.C. 3.4.21.1) is a serine peptidase which is produced in the pancreas. Chymotrypsin is preferably used from bovine pancreas. In one embodiment of the invention, the chymotrypsin used is pretreated with N-alpha-p-tosyl-L-lysine-chloromethyl ketone (TLCK) in order to prevent possibly existing trypsin interference.
Die Hydrolyse mit Chymotrypsin erfolgt vorzugsweise in Wasser oder einer wässrigen Pufferlösung, bevorzugt in einer wässrigen Pufferlösung mit 5 - 15 mmol/l (insbesondere 10 mmol/l) Calciumchlorid, um eine optimale Chymotrypsinaktivität zu gewährleisten. Als Reaktionspuffer wird vorzugsweise PBS (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung) oder HEPES eingesetzt. Die Hydrolyse mit Chymotrypsin wird bevorzugt bei einem pH-Wert von pH 6,5 bis 8,5, bevorzugt bei pH 7 bis 8, besonders bevorzugt bei pH 7,5 bis 7,8 durchgeführt. Es wird zur Hydrolyse mit Chymotrypsin vorzugsweise ein Substrat:Enzym-Verhältnis von 1:20 bis 1:1000, bevorzugt von 1:50 bis 1:500, besonders bevorzugt von 1:100 bis 1:300 eingestellt.The hydrolysis with chymotrypsin is preferably carried out in water or an aqueous buffer solution, preferably in an aqueous buffer solution with 5-15 mmol / l (in particular 10 mmol / l) calcium chloride, in order to ensure optimal chymotrypsin activity. The reaction buffer used is preferably PBS (phosphate-buffered saline) or HEPES. The hydrolysis with chymotrypsin is preferably carried out at a pH of 6.5 to 8.5, preferably at pH 7 to 8, particularly preferably at pH 7.5 to 7.8. It is for hydrolysis with chymotrypsin preferably a substrate: enzyme ratio of 1:20 to 1: 1000, preferably from 1:50 to 1: 500, more preferably from 1: 100 to 1: 300 set.
Die Inkubation des proteinhaltigen Substrats mit Chymotrypsin erfolgt vorzugsweise bei einer Temperatur von 30 bis 60 °C, bevorzugt von 45 bis 55 °C. Die Behandlung mit Chymotrypsin wird vorzugsweise für 1 bis 36 h, bevorzugt für 10 bis 30 h, ganz besonders bevorzugt für 12 bis 24 h durchgeführt.The incubation of the protein-containing substrate with chymotrypsin is preferably carried out at a temperature of 30 to 60 ° C, preferably from 45 to 55 ° C. The treatment with chymotrypsin is preferably carried out for 1 to 36 hours, preferably for 10 to 30 hours, most preferably for 12 to 24 hours.
Zum Ende der Behandlung mit Chymotrypsin erfolgt vorzugsweise eine Inaktivierung des Enzyms, insbesondere durch thermische Inaktivierung. Besonders bevorzugt ist eine thermische Inaktivierung bei einer Temperatur von 80 bis 100 °C, bevorzugt, bei 85 bis 95 °C. Die thermische Behandlung wird vorzugsweise für 30 Sekunden bis 20 Minuten, vorzugsweise von 1 min bis 10 min, besonders bevorzugt von 3 min bis 5 min durchgeführt.At the end of the treatment with chymotrypsin preferably takes place inactivation of the enzyme, in particular by thermal inactivation. Particularly preferred is a thermal inactivation at a temperature of 80 to 100 ° C, preferably, at 85 to 95 ° C. The thermal treatment is preferably carried out for 30 seconds to 20 minutes, preferably from 1 minute to 10 minutes, more preferably from 3 minutes to 5 minutes.
Besonders bevorzugt wird ein Lysozym- und/oder alpha-Lactalbuminhaltiges Substrat in einem erfindungsgemäßen Verfahren mit Thermolysin und Chymotrypsin hydrolysiert. Bevorzugt erfolgt zunächst der Behandlungsschritt mit Chymotrypsin und anschließend daran der Behandlungsschritt mit Thermolysin.Particularly preferably, a lysozyme and / or alpha-lactalbumin-containing substrate is hydrolyzed in a method according to the invention with thermolysin and chymotrypsin. Preferably, the treatment step with chymotrypsin and then followed by the treatment step with thermolysin.
Carboxypeptidase B (E.C. 3.4.17.2) ist eine nach basischen Aminosäuren spaltende Metallopeptidase, die vom Pankreas sezerniert wird und aus ihren Vorstufen durch Trypsin mittels limitierter Proteolyse entsteht. Vorzugsweise wird erfindungsgemäß Carboxypeptidase aus Schweinepankreas eingesetzt. Carboxypeptidase B (EC 3.4.17.2) is a basic amino acid-cleaving metallopeptidase secreted by the pancreas and produced from its precursors by trypsin through limited proteolysis. Preferably, carboxypeptidase from porcine pancreas is used according to the invention.
Die Hydrolyse mit Carboxypeptidase B erfolgt vorzugsweise in Wasser oder einer wässrigen Pufferlösung. Als Pufferlösung wird vorzugsweise PBS (Phosphat-gepufferte Saline) oder HEPES eingesetzt. Die Hydrolyse mit Carboxypeptidase B wird bevorzugt bei einem pH-Wert von pH 6 bis 9, bevorzugt bei pH 7 bis 8, durchgeführt. Es wird zur Hydrolyse mit Carboxypeptidase B vorzugsweise ein Substrat:Enzym-Verhältnis von 1:20 bis 1:1000, bevorzugt von 1:50 bis 1:500, besonders bevorzugt von 1:100 bis 1:300 eingestellt.The hydrolysis with carboxypeptidase B is preferably carried out in water or an aqueous buffer solution. The buffer solution used is preferably PBS (phosphate-buffered saline) or HEPES. The hydrolysis with carboxypeptidase B is preferably carried out at a pH of pH 6 to 9, preferably at pH 7 to 8. For hydrolysis with carboxypeptidase B it is preferable to set a substrate: enzyme ratio of from 1:20 to 1: 1000, preferably from 1:50 to 1: 500, more preferably from 1: 100 to 1: 300.
Die Inkubation des proteinhaltigen Substrats mit Carboxypeptidase B erfolgt vorzugsweise bei einer Temperatur von 20 bis 50 °C, bevorzugt von 35 bis 40 °C. Die Behandlung mit Carboxypeptidase B wird vorzugsweise für 1 bis 36 h, bevorzugt für 10 bis 30 h, ganz besonders bevorzugt für 12 bis 24 h durchgeführt.The incubation of the proteinaceous substrate with carboxypeptidase B is preferably carried out at a temperature of 20 to 50 ° C, preferably from 35 to 40 ° C. The treatment with carboxypeptidase B is preferably carried out for 1 to 36 hours, preferably for 10 to 30 hours, most preferably for 12 to 24 hours.
Zum Ende der Behandlung mit Carboxypeptidase B erfolgt vorzugsweise eine Inaktivierung des Enzyms, insbesondere durch thermische Inaktivierung. Besonders bevorzugt ist eine thermische Inaktivierung bei einer Temperatur von 80 bis 100 °C, bevorzugt, bei 90 bis 98 °C. Die thermische Behandlung wird vorzugsweise für 30 Sekunden bis 20 Minuten, vorzugsweise von 1 min bis 10 min, besonders bevorzugt von 3 min bis 5 min durchgeführt.At the end of the treatment with carboxypeptidase B, preference is given to inactivating the enzyme, in particular by thermal inactivation. Particularly preferred is a thermal inactivation at a temperature of 80 to 100 ° C, preferably, at 90 to 98 ° C. The thermal treatment is preferably carried out for 30 seconds to 20 minutes, preferably from 1 minute to 10 minutes, more preferably from 3 minutes to 5 minutes.
Trypsin ist eine vom Pankreas sezernierte Serinpeptidase (E.C. 3.4.21.4). Die Hydrolyse mit Trypsin erfolgt vorzugsweise in Wasser oder einer wässrigen Pufferlösung. Als Pufferlösung wird vorzugsweise PBS (Phosphat-gepufferte Saline) oder HEPES eingesetzt. Die Hydrolyse mit Trypsin wird bevorzugt bei einem pH-Wert von pH 6,5 bis 8,5, bevorzugt bei pH 7 bis 8, durchgeführt. Es wird zur Hydrolyse mit Trypsin vorzugsweise ein Substrat:Enzym-Verhältnis von 1:20 bis 1:1000, bevorzugt von 1:50 bis 1:500, besonders bevorzugt von 1:100 bis 1:300 eingestellt.Trypsin is a pancreatic serine peptidase (E.C. 3.4.21.4). The hydrolysis with trypsin is preferably carried out in water or an aqueous buffer solution. The buffer solution used is preferably PBS (phosphate-buffered saline) or HEPES. The hydrolysis with trypsin is preferably carried out at a pH of pH 6.5 to 8.5, preferably at pH 7 to 8. It is for hydrolysis with trypsin preferably a substrate: enzyme ratio of 1:20 to 1: 1000, preferably from 1:50 to 1: 500, more preferably from 1: 100 to 1: 300 set.
Die Inkubation des proteinhaltigen Substrats mit Trypsin erfolgt vorzugsweise bei einer Temperatur von 30 bis 50 °C, bevorzugt von 35 bis 40 °C. Die Behandlung mit Trypsin wird vorzugsweise für 1 bis 36 h, bevorzugt für 10 bis 30 h, ganz besonders bevorzugt für 12 bis 24 h durchgeführt.The incubation of the protein-containing substrate with trypsin is preferably carried out at a temperature of 30 to 50 ° C, preferably from 35 to 40 ° C. The treatment with trypsin is preferably carried out for 1 to 36 h, preferably for 10 to 30 h, most preferably for 12 to 24 h.
Alcalase (Handelsname für das Enzym Subtilisin) ist eine Serinpeptidase (E.C. 3.4.21.62), die industriell durch Submers- bzw. Tauchfermentation von Bacillus licheniformis gewonnen wird. Die Hydrolyse mit Alcalase erfolgt vorzugsweise in Wasser oder einer wässrigen Pufferlösung. Als Pufferlösung wird vorzugsweise PBS (Phosphat-gepufferte Saline) oder HEPES eingesetzt. Die Hydrolyse mit Alcalase wird bevorzugt bei einem pH-Wert von pH 6,5 bis 8,5, bevorzugt bei pH 7 bis 8, durchgeführt. Es wird zur Hydrolyse mit Alcalase vorzugsweise ein Substrat:Enzym-Verhältnis von 1:20 bis 1:1000, bevorzugt von 1:50 bis 1:500, besonders bevorzugt von 1:100 bis 1:300 eingestellt.Alcalase (trade name for the enzyme subtilisin) is a serine peptidase (E.C. 3.4.21.62), which is obtained industrially by submerged or submerged fermentation of Bacillus licheniformis. The hydrolysis with Alcalase is preferably carried out in water or an aqueous buffer solution. The buffer solution used is preferably PBS (phosphate-buffered saline) or HEPES. The hydrolysis with Alcalase is preferably carried out at a pH of pH 6.5 to 8.5, preferably at pH 7 to 8. For hydrolysis with Alcalase it is preferable to set a substrate: enzyme ratio of from 1:20 to 1: 1000, preferably from 1:50 to 1: 500, more preferably from 1: 100 to 1: 300.
Die Inkubation des proteinhaltigen Substrats mit Alcalase erfolgt vorzugsweise bei einer Temperatur von 45 bis 65 °C, bevorzugt bei 50 bis 60 °C. Die Behandlung mit Alcalase wird vorzugsweise für 1 bis 48 h, bevorzugt für 10 bis 30 h, ganz besonders bevorzugt für 12 bis 24 h durchgeführt.The incubation of the protein-containing substrate with Alcalase is preferably carried out at a temperature of 45 to 65 ° C, preferably at 50 to 60 ° C. The treatment with Alcalase is preferably carried out for 1 to 48 hours, preferably for 10 to 30 hours, most preferably for 12 to 24 hours.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das proteinhaltige Substrat, vorzugsweise alpha-Lactalbumin oder Lysozym, in Wasser oder einer wässrigen Pufferlösung, insbesondere PBS oder HEPES, suspendiert oder gelöst und anschließend für vorzugsweise 12 bis 24 h belassen (rehydrieren). Anschließend wird die auf diese Weise vorbereitete proteinhaltige Suspension oder Lösung mit Thermolysin versetzt und zur Hydrolyse bei einer Temperatur von 60 bis 90 °C, bevorzugt von 70 bis 80 °C für 8 bis 36 h, bevorzugt für 10 bis 30 h, besonders bevorzugt für 12 bis 24 inkubiert. Um eine gleichmäßige Hydrolyse des Proteins zu gewährleisten, findet die Behandlung mit Thermolysin vorzugsweise unter Rühren oder Umwälzen der Lösung oder Suspension statt. Nach Beendigung des ersten Hydrolyseschritts mit Thermolysin werden in der Lösung oder Suspension die geeigneten Bedingungen für das proteolytische Enzym des zweiten Behandlungsschritts eingestellt. Dafür wird ggf. die Temperatur gesenkt. Gegebenenfalls wird der pH-Wert eingestellt, vorzugsweise durch Zugabe von NaOH oder HCI. Danach erfolgt die Zugabe des proteolytischen Enzyms oder der proteolytischen Enzyme ausgewählt aus Chymotrypsin, Carboxypeptidase B, Trypsin, Alcalase und deren Mischung untereinander. Die Hydrolyse wird bevorzugt bei den für die einzelnen Enzyme obengenannten Bedingungen durchgeführt. Nach Beendigung des zweiten Behandlungsschrittes erfolgt eine thermische Inaktivierung der proteolytischen Enzyme bei mindestens 95 °C für mindestens 5 min.In a preferred embodiment of the invention, the proteinaceous substrate, preferably alpha-lactalbumin or lysozyme, is suspended or dissolved in water or an aqueous buffer solution, in particular PBS or HEPES, and then left (rehydrated) for preferably 12 to 24 hours. Subsequently, the protein-containing suspension or solution prepared in this way is mixed with thermolysin and for hydrolysis at a temperature of 60 to 90 ° C, preferably from 70 to 80 ° C for 8 to 36 h, preferably for 10 to 30 h, particularly preferably for 12 to 24 incubated. In order to ensure a uniform hydrolysis of the protein, the treatment with thermolysin preferably takes place with stirring or by circulating the solution or suspension. After completion of the first hydrolysis step with thermolysin, the appropriate conditions for the proteolytic enzyme of the second treatment step are set in the solution or suspension. If necessary, the temperature is lowered. Optionally, the pH is adjusted, preferably by adding NaOH or HCl. Thereafter, the addition of the proteolytic enzyme or the proteolytic enzymes is selected from chymotrypsin, carboxypeptidase B, trypsin, Alcalase and their mixture with each other. The hydrolysis is preferably carried out at the conditions mentioned above for the individual enzymes. After completion of the second treatment step, a thermal inactivation of the proteolytic enzymes at least 95 ° C for at least 5 min.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das proteinhaltige Substrat, vorzugsweise ein alpha-Lactalbumin- oder Lysozym-haltiges Substrat, besonders bevorzugt alpha-Lactalbumin oder Lysozym, in Wasser oder einer wässrigen Pufferlösung, insbesondere PBS oder HEPES, suspendiert oder gelöst und anschließend für vorzugsweise 12 bis 24 h belassen (rehydrieren). Anschließend wird die auf diese Weise vorbereitete proteinhaltige Suspension oder Lösung mit Chymotrypsin versetzt und zur Hydrolyse bei einer Temperatur von 30 bis 60 °C, bevorzugt von 45 bis 55 °C für 1 bis 36 h, bevorzugt für 10 bis 30 h, ganz besonders bevorzugt für 12 bis 24 h inkubiert. Um eine gleichmäßige Hydrolyse des Proteins zu gewährleisten, findet die Behandlung mit Chymotrypsin vorzugsweise unter Rühren oder Umwälzen der Lösung oder Suspension statt. Nach Beendigung des ersten Hydrolyseschritts mit Chymotrypsin werden in der Lösung oder Suspension die geeigneten Bedingungen für Thermolysin eingestellt. Dafür wird ggf. die Temperatur erhöht. Danach erfolgt die Zugabe von Thermolysin zur Lösung oder Suspension. Zur Hydrolyse mit Thermolysin wird die so vorbereitete thermolysinhaltige Lösung oder Suspension bei einer Temperatur von 60 bis 90 °C, bevorzugt von 70 bis 80 °C für 8 bis 36 h, bevorzugt für 10 bis 30 h, besonders bevorzugt für 12 bis 24 inkubiert (vorzugsweise unter Rühren oder Umwälzen der Lösung oder Suspension). Nach Beendigung des zweiten Behandlungsschrittes erfolgt eine thermische Inaktivierung der proteolytischen Enzyme bei mindestens 95 °C für mindestens 5 min. In a further preferred embodiment of the invention, the proteinaceous substrate, preferably an alpha-lactalbumin or lysozyme-containing substrate, more preferably alpha-lactalbumin or lysozyme, in water or an aqueous buffer solution, in particular PBS or HEPES, suspended or dissolved and then for preferably leave for 12 to 24 h (rehydrate). Subsequently, the protein-containing suspension or solution prepared in this way is mixed with chymotrypsin and for the hydrolysis at a temperature of 30 to 60 ° C, preferably from 45 to 55 ° C for 1 to 36 h, preferably for 10 to 30 h, most particularly preferred incubated for 12 to 24 h. In order to ensure a uniform hydrolysis of the protein, the treatment with chymotrypsin preferably takes place with stirring or by circulating the solution or suspension. After completion of the first hydrolysis step with chymotrypsin, the appropriate conditions for thermolysin are adjusted in the solution or suspension. For this the temperature is possibly increased. Thereafter, the addition of thermolysin to the solution or suspension. For hydrolysis with thermolysin, the thermolysin-containing solution or suspension prepared in this way is incubated at a temperature of 60 to 90 ° C., preferably from 70 to 80 ° C. for 8 to 36 h, preferably for 10 to 30 h, particularly preferably for 12 to 24 ( preferably with stirring or circulation of the solution or suspension). After completion of the second treatment step, a thermal inactivation of the proteolytic enzymes at least 95 ° C for at least 5 min.
Die Enzyme liegen zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens entweder in Lösung (frei) oder trägergebunden vor. Für die Hydrolyse mit trägergebundenen Enzymen werden diese auf einem inerten Trägermaterial immobilisiert.The enzymes are present for carrying out the method according to the invention either in solution (free) or carrier-bound. For the hydrolysis with carrier-bound enzymes, these are immobilized on an inert support material.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird die Hydrolyse in einem Enzymreaktor mit trägergebundenen oder mit freien Enzymen durchgeführt. Werden trägergebundene Enzyme eingesetzt, so werden diese in einem Rührkessel- oder einem Festbettreaktor, einem Membran- oder Hohlfaserreaktor eingesetzt. Werden freie Enzyme eingesetzt, findet die Hydrolyse bevorzugt in einem Membranreaktor statt. Vorzugsweise werden die einzelnen Behandlungsschritte zur Hydrolyse in einem kontinuierlichen Membranreaktor durchgeführt. Dieser ermöglicht eine kontinuierliche Produktseparation mit gleichzeitiger Überwachung der Hydrolysebedingungen wie pH-Wert und Temperatur.In one embodiment of the invention, the hydrolysis is carried out in an enzyme reactor with carrier-bound or with free enzymes. If carrier-bound enzymes are used, they are used in a stirred tank or a fixed bed reactor, a membrane or hollow fiber reactor. If free enzymes are used, the hydrolysis preferably takes place in a membrane reactor. Preferably, the individual treatment steps are carried out for hydrolysis in a continuous membrane reactor. This allows continuous product separation with simultaneous monitoring of hydrolysis conditions such as pH and temperature.
Im Anschluss an die Behandlungsschritte zur Hydrolyse des erhaltenen Proteinhydrolysats, wird das Proteinhydrolysat gegebenenfalls konzentriert und/oder aufgereinigt. Bevorzugt wird zur Anreicherung der ACE-hemmenden tryptophanhaltigen Dipeptide eine Ultra- oder Nanofiltration des erhaltenen Proteinhydrolysats durchgeführt. Bevorzugt erfolgt diese mit Membranen mit einer Ausschlussgrenze von 0.5 kDa bis 1 kDa, beispielsweise aus regenerierter Cellulose und/oder Polyethersulfon. So könnten größere Peptide abtrennt und Peptide mit 2 bis 4 Aminosäuren angereichert werden. Mögliche Reste von unhydrolysiertem Protein werden ebenfalls durch diese Verfahrensschritte abgetrennt. Das Retentat, welches die tryptophanhaltigen Dipeptide enthält, wird anschließend vorzugsweise getrocknet.Following the treatment steps for hydrolysis of the resulting protein hydrolyzate, the protein hydrolyzate is optionally concentrated and / or purified. For the enrichment of the ACE-inhibiting tryptophan-containing dipeptides it is preferred to carry out an ultrafiltration or nanofiltration of the protein hydrolyzate obtained. This is preferably carried out with membranes having an exclusion limit of 0.5 kDa to 1 kDa, for example regenerated cellulose and / or polyethersulfone. Thus, larger peptides could be separated and peptides enriched with 2 to 4 amino acids. Possible residues of unhydrolyzed protein are also separated by these process steps. The retentate containing the tryptophan-containing dipeptides is then preferably dried.
Die Anreicherung des Dipeptide im erhaltenen Proteinhydrolysat erfolgt im Labormaßstab vorzugsweise mittels präparativer RP-HPLC. Dazu wird bevorzugt ein C18-Säulenmaterial verwendet.The enrichment of the dipeptide in the protein hydrolyzate obtained is carried out on a laboratory scale, preferably by preparative RP-HPLC. For this purpose, a C18 column material is preferably used.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren sind Proteinhydrolysate erhältlich, die sich durch einen hohen Anteil ACE-hemmender Dipeptide, insbesondere Ala-Trp, Trp-Trp, IIe-Trp und Trp-Leu auszeichnen. Durch das erfindungsgemäße Verfahren sind besonders hohe Gehalte an ACE-hemmenden tryptophanhaltigen Dipeptiden im Proteinhydrolysat erzielbar.The process according to the invention makes it possible to obtain protein hydrolysates which are distinguished by a high proportion of ACE-inhibiting dipeptides, in particular Ala-Trp, Trp-Trp, IIe-Trp and Trp-Leu. By the method according to the invention, particularly high contents of ACE-inhibiting tryptophan-containing dipeptides in the protein hydrolyzate can be achieved.
Die Erfindung umfasst daher auch Proteinhydrolysate, die durch ein erfindungsgemäßes Verfahren erhältlich sind. Erfindungsgemäße Proteinhydrolysate enthalten mindestens eines der Dipeptide Ala-Trp und Trp-Trp. Erfindungsgemäß ist Ala-Trp zu mindestens 1,5 Gew.-% und Trp-Trp zu mindestens 0,01 Gew.-% im Proteinhydrolysat enthalten. Vorzugsweise enthält das erfindungsgemäße Proteinhydrolysat mindestens eines der weiteren Dipeptide, ausgewählt aus IIe-Trp und Leu-Trp.The invention therefore also encompasses protein hydrolysates obtainable by a process according to the invention. Protein hydrolysates according to the invention contain at least one of the dipeptides Ala-Trp and Trp-Trp. According to the invention, Ala-Trp contains at least 1.5% by weight and Trp-Trp contains at least 0.01% by weight in the protein hydrolyzate. The protein hydrolyzate according to the invention preferably contains at least one of the further dipeptides selected from IIe-Trp and Leu-Trp.
Bevorzugt weisen erfindungsgemäße Proteinhydrolysate im Anschluss an die Hydrolyse in einem erfindungsgemäßen Verfahren (ohne dass ein weiterer Anreicherungs- und/oder Aufreinigungsschritt vorgenommen wurde) folgende Gehalte tryptophanhaltiger Dipeptide auf:
- - Ala-Trp:
mindestens vorzugsweise 1,5-4 Gew.-%, - - Trp-Trp:
mindestens 0,01 Gew.-%,bevorzugt mindestens von 0,1 - 0,5 Gew.-%, - - IIe-Trp:
mindestens 0,01 Gew.-%,bevorzugt mindestens von 0,1 - 0,5 Gew.-%, - - Trp-Leu:
mindestens 0,01 Gew.-%,bevorzugt zwischen 0,01und
- Ala-Trp: at least 1.5% by weight, preferably 1.5-4% by weight,
- Trp-Trp: at least 0.01% by weight, preferably at least 0.1% by weight, particularly preferably from 0.1 to 0.5% by weight,
- - IIe-Trp: at least 0.01% by weight, preferably at least 0.1% by weight, particularly preferably from 0.1 to 0.5% by weight,
- Trp-Leu: at least 0.01% by weight, preferably between 0.01 and 0.2% by weight.
Wird in einem erfindungsgemäßen Verfahren ein Anreicherungs- oder Aufreinigungsschritt vorgenommen, so sind höhere Gehalte an Dipeptiden im erfindungsgemäßen Proteinhydrolysat erhältlich. Der Peptidgehalt im Hydrolysat (mg Peptid pro Gramm Proteinhydrolysat) ist vorzugsweise 5 - 10-mal höher als im nicht durch Aufreinigung und/oder Anreicherung weiterbehandelten Hydrolysat. Ein durch Aufreinigung und/oder Anreicherung erhältliches erfindungsgemäßes Proteinhydrolysat weist daher bevorzugt die folgenden Gehalte tryptophanhaltiger Dipeptide auf:
- - Ala-Trp:
mindestens 7,5 Gew.-%, vorzugsweise 7,5 - 40 Gew.-%, - - Trp-Trp:
mindestens 0,05 Gew.-%,bevorzugt mindestens von 0,1 - 5 Gew.-%, - - IIe-Trp:
mindestens 0,05 Gew.-%,bevorzugt mindestens von 0,1 - 5 Gew.-% - - Trp-Leu:
mindestens 0,05 Gew.-%,bevorzugt zwischen 0,01 und 2 Gew.-%.
- Ala-Trp: at least 7.5% by weight, preferably 7.5-40% by weight,
- Trp-Trp: at least 0.05% by weight, preferably at least 0.1% by weight, particularly preferably from 0.1 to 5% by weight,
- IIe-Trp: at least 0.05% by weight, preferably at least 0.1% by weight, particularly preferably from 0.1 to 5% by weight
- Trp-Leu: at least 0.05% by weight, preferably between 0.01 and 2% by weight.
Bevorzugt liegen erfindungsgemäße Proteinhydrolysate in getrockneter Form vor.Preference is given to protein hydrolysates according to the invention in dried form.
Die Erfindung umfasst ferner die Verwendung der erfindungsgemäßen Proteinhydrolysate und die Verwendung mindestens eines der Dipeptide Ala-Trp und Trp-Trp als ACE-Inhibitoren. Dafür werden die erfindungsgemäßen Proteinhydrolysate oder daraus isolierte ACE-hemmende Dipeptide, insbesondere Ala-Trp, Trp-Trp, IIe-Trp und/oder Trp-Leu (besonders bevorzugt Ala-Trp und/oder Trp-Trp) vorzugsweise zu Nahrungsmitteln, Futtermitteln oder Arzneimitteln zugesetzt. Bevorzugt werden die erfindungsgemäßen Proteinhydrolysate einem Nahrungsmittel (beispielsweise in der Form diätetischer Lebensmittel oder Functional Food) oder separat als Nahrungsmittelzusatz verwendet zugesetzt.The invention further comprises the use of the protein hydrolysates according to the invention and the use of at least one of the dipeptides Ala-Trp and Trp-Trp as ACE inhibitors. For this purpose, the protein hydrolysates according to the invention or ACE-inhibiting dipeptides isolated therefrom, in particular Ala-Trp, Trp-Trp, IIe-Trp and / or Trp-Leu (particularly preferably Ala-Trp and / or Trp-Trp) are preferably added to foods, feedstuffs or Medicaments added. The protein hydrolysates according to the invention are preferably added to a foodstuff (for example in the form of dietetic foods or functional food) or used separately as a food additive.
Aufgrund der ACE-hemmenden Eigenschaften der tryptophanhaltigen Dipeptide des erfindungsgemäßen Proteinhydrolysats werden die Nahrungsmittel, Futtermittel oder Arzneimittel bevorzugt zur Behandlung und/oder Prävention von Bluthochdruck als ACE-Inhibitoren verwendet.Because of the ACE-inhibiting properties of the tryptophan-containing dipeptides of the protein hydrolyzate of the present invention, the foods, feeds or drugs are preferably used for the treatment and / or prevention of hypertension as ACE inhibitors.
Dafür liegt das erfindungsgemäße Proteinhydrolysat entweder in flüssiger oder in getrockneter Form im Nahrungsmittel, Futtermittel oder Arzneimittel vor. Bevorzugt liegt das erfindungsgemäße Proteinhydrolysat in einer durch Sprüh- oder Walzentrocknung erhältlichen Pulverform im Nahrungsmittel, Futtermittel oder Arzneimittel vor.For this, the protein hydrolyzate according to the invention is present either in liquid or in dried form in food, feed or medicines. The protein hydrolyzate according to the invention is preferably present in a powder form obtainable by spray drying or drum drying in foodstuffs, feedstuffs or medicaments.
Aufgrund der durch das Hydrolyseverfahren verbesserten Freisetzung von ACEinhibierenden Peptiden mit niedrigen IC50-Werten sind vorteilhaft nur geringe Mengen an Proteinhydrolysatzusatz erforderlich. Da Proteinhydrolysate häufig einen bitteren oder unangenehmen Geschmack aufweisen, bietet dies vor allem einen sensorischen Vorteil für den Verbraucher.Due to the improved by the hydrolysis process release of ACEinhibierenden peptides with low IC 50 values advantageously only small amounts of protein hydrolyzate addition are required. Since protein hydrolysates often have a bitter or unpleasant taste, this provides above all a sensory benefit for the consumer.
Die Erfindung bietet den Vorteil, dass ACE-hemmende tryptophanhaltige Peptide mit dem erfindungsgemäßen Verfahren aus Lebensmittelproteinen, insbesondere aus dem Molkenprotein alpha-Lactalbumin und dem Eiprotein Lysozym verbessert freigesetzt werden können. Die dadurch erhaltenen Proteinhydrolysate bzw. die daraus erhältlichen tryptophanhaltigen Dipeptide weisen eine gute ACE-hemmende Wirkung auf und können als Inhaltstoffe für funktionelle Nahrungsmittel, Nahrungsergänzungsmittel bzw. pharmazeutische Präparationen sowie für diätetische bzw. funktionelle Tiernahrungsmittel verwendet werden.The invention offers the advantage that ACE-inhibiting tryptophan-containing peptides can be released in an improved manner from food proteins, in particular from the whey protein alpha-lactalbumin and the egg protein lysozyme, using the method according to the invention. The protein hydrolysates obtained thereby or the tryptophan-containing dipeptides obtainable therefrom have a good ACE-inhibiting action and can be used as ingredients for functional foods, dietary supplements or pharmaceutical preparations as well as for dietetic or functional animal foods.
Das erfindungsgemäße Hydrolyseverfahren ist hinsichtlich der Freisetzung tryptophanhaltiger Peptide aus Lebensmittelproteinen gegenüber den im Stand der Technik beschriebenen Verfahren signifikant verbessert und eignet sich vorteilhaft insbesondere zur Hydrolyse von Molkeprotein bzw. anderen alpha-Lactalbumin-haltigen Substraten sowie von Iysozymhaltigen Substraten. Durch mehrstufige Hydrolyse, wobei das proteinhaltige Substrat mit einer Kombination aus Thermolysin und in einem weiteren Behandlungsschritt mit einem weiteren proteolytischen Enzym ausgewählt aus Chymotrypsin, Carboxypeptidase B, Trypsin, Alcalase und deren Mischung untereinander hydrolysiert wird, wird eine besonders gute und effektive Freisetzung von tryptophanhaltigen Peptiden erreicht.The hydrolysis process according to the invention is significantly improved with respect to the release of tryptophan-containing peptides from food proteins compared with the processes described in the prior art and is advantageously particularly suitable for the hydrolysis of whey protein or other substrates containing alpha-lactalbumin and of substrates containing iysozyme. By hydrolysis in several stages, wherein the proteinaceous substrate is hydrolyzed with a combination of thermolysin and in a further treatment step with a further proteolytic enzyme selected from chymotrypsin, carboxypeptidase B, trypsin, alcalase and their mixture, a particularly good and effective release of tryptophan-containing peptides reached.
Ohne an eine bestimmte Theorie gebunden sein zu wollen, führen die Erfinder die überraschend gute Freisetzung der bioaktiven tryptophanhaltigen Peptide durch das erfindungsgemäße Verfahren darauf zurück, dass Thermolysin selektiv Peptidbindungen an der N-terminalen Seite von hydrophoben Aminosäuren spaltet und so gezielt hydrophobe Bereiche des Proteins freisetzen kann. Without wishing to be bound by any particular theory, the inventors attribute the surprisingly good release of the bioactive tryptophan-containing peptides by the method according to the invention to the fact that thermolysin selectively cleaves peptide bonds on the N-terminal side of hydrophobic amino acids and thus specifically release hydrophobic regions of the protein can.
Anhand nachfolgender Figuren und Ausführungsbeispiele wird die Erfindung näher erläutert, ohne diese einzuschränken.Based on the following figures and embodiments, the invention will be explained in more detail without limiting it.
Dabei zeigen
-
1 . (1) Chromatogramm (RP-HPLC mit Fluoreszenzdetektion) des TC-Hydrolysates aus Beispiel 1 bei λex = 280 nm λem = 355 nm. (2) Massenspektrum des ausgewählten Peaks (A) aus (a). Die gefundene Ionen-Masse von m/z = 276.2 m/z entspricht dem [M+H]+ Ion des Dipeptids Alanyl-Tryptophan (Ala-Trp). -
2 . (1) Chromatogramm (RP-HPLC mit Fluoreszenzdetektion) des TC-Hydrolysates aus Beispiel 1 bei λex = 280 nm λem = 355 nm. (2) Massenspektrum des ausgewählten Peaks (B) aus (a). Die gefundene Ionen-Masse von m/z = 391,3 m/z entspricht dem [M+H]+ Ion des Dipeptids Trytophanyl-Tryptophan (Trp-Trp). -
3 Vergleich der Lysozymhydrolysate, hergestellt mit Chymotrypsin und Thermolysin (1) und Alcalase und Trypsin (Vergleichsbeispiel, 2)aus Beispiel 2 im Gehalt am Dipeptid Ala-Trp (mg/g Hydrolysat, schwarze Balken) und in ihrer ACE-Inhibierung in vitro, dargestellt als als IC50 (mg/Protein/I, weiße Balken). -
4 Vergleich der Alpha-Lactalbuminhydrolysate mit Chymotrypsin und Thermolysin (1) und Alcalase und Trypsin (Vergleichsbeispiel, 2) aus Beispiel 4 im Gehalt am Dipeptid IIe-Trp (mg/g Hydrolysat, schwarze Balken) und in ihrer ACE-Inhibierung in vitro, dargestellt als IC50 (mg/Protein/I, weiße Balken).
-
1 , (1) Chromatogram (RP-HPLC with fluorescence detection) of the TC hydrolyzate of Example 1 at λ ex = 280 nm λ em = 355 nm. (2) Mass spectrum of the selected peak (A) from (a). The found ion mass of m / z = 276.2 m / z corresponds to the [M + H] + ion of the dipeptide alanyl-tryptophan (Ala-Trp). -
2 , (1) Chromatogram (RP-HPLC with fluorescence detection) of the TC hydrolyzate of Example 1 at λ ex = 280 nm λ em = 355 nm. (2) Mass spectrum of the selected peak (B) from (a). The found ion mass of m / z = 391.3 m / z corresponds to the [M + H] + ion of the dipeptide tryptophanyl-tryptophan (Trp-Trp). -
3 Comparison of the lysozyme hydrolysates prepared with chymotrypsin and thermolysin (1) and alcalase and trypsin (Comparative Example, 2) from Example 2 in the content of the dipeptide Ala-Trp (mg / g hydrolyzate, black bars) and in their ACE inhibition in vitro as IC 50 (mg / protein / l, white bars). -
4 Comparison of the alpha-lactalbumin hydrolyzates with chymotrypsin and thermolysin (1) and alcalase and trypsin (Comparative Example, 2) from Example 4 in the content of the dipeptide IIe-Trp (mg / g hydrolyzate, black bars) and in their ACE inhibition in vitro as IC 50 (mg / protein / l, white bars).
Ausführungsbeispiel 1: Zweistufige Hydrolyse von Lysozym aus Hühnerei mit Thermolysin und Chymotrypsin
Eine 5% Lysozymlösung (Lysozym aus Hühnerei, Reinheit ca. 90 Gew.-%) wurde in einem erfindungsgemäßen Verfahren zunächst mit Thermolysin und anschließend mit Chymotrypsin hydrolysiert.A 5% lysozyme solution (lysozyme from chicken egg, purity about 90% by weight) was hydrolyzed first in a process according to the invention with thermolysin and then with chymotrypsin.
Die Verfahrensbedingungen sind in der folgenden Tabelle 1 beschrieben.
Tabelle 1: Verfahrensablauf zur zweistufigen Hydrolyse von Lysozym mit Thermolysin und Chymotrypsin (Herstellung von Thermolysin-Chymotrypsin-Hydrolysat (TC))
Das daraus erhältliche Hydrolysat wies (über mehrere Versuche gemittelt) einen Ala-Trp Gehalt von 31,8 ± 0,8 mg/g Hydrolysat auf. Es konnte somit nachgewiesen werden, dass das erhaltene Hydrolysat eine gute Ala-Trp-Ausbeute aufweist. The hydrolyzate obtained therefrom had an Ala-Trp content of 31.8 ± 0.8 mg / g hydrolyzate (averaged over several experiments). It could thus be demonstrated that the obtained hydrolyzate has a good Ala-Trp yield.
In dem erhaltenen Proteinhydrolysat konnten mittels LC-MS die ACE-Inhibitoren Alanyl-Tryptophan (Ala-Trp, AW) und Tryptophanyl-Tryptophan (Trp-Trp, WW) identifiziert werden.
Die isolierten Dipeptide Ala-Trp und Trp-Trp zeigten in vitro eine deutliche ACE-hemmende Wirkung. Die folgende Tabelle 2 zeigt die ermittelten IC50-Werte der beiden Dipeptide. Die ACE-Inhibierung wurde nach der Methode von [
Ausführungsbeispiel 2: Zweistufige Hydrolyse von Lysozym aus Hühnerei mit Chymotrypsin und ThermolysinExemplary Embodiment 2: Two-Stage Hydrolysis of Hen's Egg Lysozyme with Chymotrypsin and Thermolysin
Eine 5% Lysozymlösung (Lysozym aus Hühnerei, Reinheit ca. 90 Gew.-%) wurde in einem erfindungsgemäßen Verfahren zunächst mit Chymotrypsin und anschließend mit Thermolysin hydrolysiert.A 5% lysozyme solution (chicken egg lysozyme, purity about 90% by weight) was hydrolyzed in a process according to the invention first with chymotrypsin and then with thermolysin.
Dafür wurde folgendermaßen verfahren (Tabelle 3):
Tabelle 3: Verfahrensablauf zur zweistufigen Hydrolyse von Lysozym mit Chymotrypsin und Thermolysin (Herstellung von Chymotrypsin-Thermolysin-Hydrolysat (CT))
Als Kontrolle (Vergleichsbeispiel) wurde eine 5% Lysozymlösung mit Alcalase und Trypsin (AT) hydrolysiert. Die Verfahrensbedingungen sind in der folgenden Tabelle 4 beschrieben.
Tabelle 4: Verfahrensablauf zur einstufigen Hydrolyse von Lysozym mit Alcalase und Trypsin (Herstellung von Alcalase-Trypsin-Hydrolysat, AT)
Die Menge des in beiden Proteinhydrolysaten enthaltenen Dipeptids Ala-Trp, und die in vitro ACE Hemmung der Proteinhydrolysate wurde miteinander verglichen (
Im erfindungsgemäßen Verfahren konnte im Vergleich zur Hydrolyse mit Alcalase/Trypsin eine dreifach höhere Ausbeute an Ala-Trp erzielt werden. Entsprechend wurde eine deutlich verbesserte ACE-Inhibierung in vitro festgestellt. Das unhydrolysierte intakte Lysozym wies dagegen bis zu einer Konzentration von 3,2 g/l keine ACE-Hemmung in vitro auf.In the process according to the invention, a threefold higher yield of Ala-Trp could be achieved in comparison with the hydrolysis with alcalase / trypsin. Accordingly, a markedly improved ACE inhibition was found in vitro. The unhydrolysed intact lysozyme, however, showed no ACE inhibition in vitro up to a concentration of 3.2 g / l.
Ausführungsbeispiel 3: Zweistufige Hydrolyse von Lysozym aus Hühnerei mit Thermolysin und Alcalase/Tryspin
Eine
Die Verfahrensbedingungen sind in der folgenden Tabelle 5 beschrieben.
Tabelle 5: Verfahrensablauf zur zweistufigen Hydrolyse von Lysozym mit Thermolysin und Alcalase/Trypsin (Herstellung von Thermoylsin- Alcalase/Trypsin-Hydrolysat)
Das daraus erhältliche Hydrolysat wies (über mehrere Versuche gemittelt) einen Ala-Trp Gehalt von 28,7 ± 1,1 mg/g Hydrolysat auf. Der IC50-Wert des Hydrolysats wurde in bekannter Weise analog zu Beispiel 1 bestimmt und betrug über mehrere Versuche gemittelt) 32 ± 8 mg/ml. Es konnte somit nachgewiesen werden, dass das erhaltene Hydrolysat sehr gute ACE-hemmende Eigenschaften aufweist.The hydrolyzate obtainable therefrom (averaged over several experiments) had an Ala-Trp content of 28.7 ± 1.1 mg / g hydrolyzate. The IC 50 value of the hydrolyzate was determined in a known manner analogously to Example 1 and averaged over several experiments) was 32 ± 8 mg / ml. It could thus be demonstrated that the hydrolyzate obtained has very good ACE-inhibiting properties.
Ausführungsbeispiel 4: Zweistufige Hydrolyse von alpha-Lactalbuminhaltigem Proteinsubstrat mit Chymotrypsin und ThermolysinExemplary Embodiment 4 Two-Step Hydrolysis of Alpha-Lactalbumin-Containing Protein Substrate with Chymotrypsin and Thermolysin
Eine
Als Kontrolle wurde eine 5% Molkenkonzentratlösung mit den gleichen Verfahrensschritten wie in Tabelle 3, Ausführungsbeispiel 2 beschrieben mit Alcalase/Trypsin hydrolysiert.As a control, a 5% whey concentrate solution was hydrolyzed with alcalase / trypsin by the same procedures as described in Table 3,
Die Menge des Dipeptids IIe-Trp, welches in den beiden aus Molkenkonzentrat erhaltenen Proteinhydrolysaten enthalten ist, wurde miteinander verglichen (
Ausführungsbeispiel 5: Gestufte Hydrolyse von Lysozym mit Trypsin und ThermolysinEmbodiment 5: Stepwise hydrolysis of lysozyme with trypsin and thermolysin
Eine 5% Lysozymlösung (Lysozym aus Hühnerei, Reinheit ca. 90 Gew.-%) wurde in einem erfindungsgemäßen Verfahren zunächst mit Trypsin und anschließend mit Thermolysin hydrolysiert.A 5% lysozyme solution (chicken egg lysozyme, purity about 90% by weight) was hydrolyzed in a process according to the invention first with trypsin and then with thermolysin.
Dafür wurde folgendermaßen verfahren (Tabelle 7):
Tabelle 7: Verfahrensablauf zur zweistufigen Hydrolyse von Lysozym mit Trypsin und Thermolysin (Herstellung von Trypsin-Thermolysin-Hydrolysat)
Das daraus erhältliche Hydrolysat wies (über mehrere Versuche gemittelt) einen Ala-Trp Gehalt von 15,5 ± 0,6 mg/g Hydrolysat auf. Der IC50-Wert des Hydrolysats wurde in bekannter Weise analog zu Beispiel 1 bestimmt und betrug über mehrere Versuche gemittelt) 103 ± 14 mg/ml. Es konnte somit nachgewiesen werden, dass das erhaltene Hydrolysat gute ACE-hemmende Eigenschaften aufweist.The hydrolyzate obtainable therefrom (averaged over several experiments) had an Ala-Trp content of 15.5 ± 0.6 mg / g hydrolyzate. The IC 50 value of the hydrolyzate was determined in a known manner analogously to Example 1 and averaged over several experiments) 103 ± 14 mg / ml. It could thus be demonstrated that the obtained hydrolyzate has good ACE-inhibiting properties.
Claims (10)
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| DE102011005288.7A DE102011005288B4 (en) | 2011-03-09 | 2011-03-09 | Process for the preparation of a protein hydrolyzate with ACE-inhibiting tryptophan-containing dipeptides |
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| Cheung et al. (1980) J. Biol. Chem. 255, 401-407 |
Also Published As
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