DE102010003001B4

DE102010003001B4 - Mikrofluidisches Dielektrophorese-System

Info

Publication number: DE102010003001B4
Application number: DE102010003001.5A
Authority: DE
Inventors: Christian Dorrer
Original assignee: Robert Bosch GmbH
Current assignee: Robert Bosch GmbH
Priority date: 2010-03-18
Filing date: 2010-03-18
Publication date: 2024-02-08
Anticipated expiration: 2030-03-19
Also published as: US20140116882A1; FR2957538B1; FR2957538A1; US20110226624A1; DE102010003001A1; US9034173B2

Abstract

Mikrofluidisches Dielektrophorese-System (1), mindestens umfassend
• eine Zuführeinrichtung (3) für ein flüssiges Medium mit darin enthaltenen Partikeln,
• N ≥ 2 mikrofluidische mit Elektroden ausgestattete dielektrophoretisch aktive Kanäle (K_n mit 1 <_ n <_ N ),
• Leitungen (2, 2a, 2b) zur fluidischen Verbindung der Zuführeinrichtung (3) mit den Kanälen (K_n), zur Verbindung der Kanäle (K_n) miteinander, sowie zur Abführung des Mediums und/oder der Partikeln aus den Kanälen (K_n), sowie
• Ventile (a_ij, b_i) zur Einstellung der Durchflussrichtung des Mediums in den Leitungen (2, 2a, 2b) dadurch gekennzeichnet, dass die dielektrophoretisch aktiven Kanäle (K₁ bis K_N) derart angeordnet und durch Leitungen (2, 2a, 2b) verbunden sind, dass sie durch Schaltung der Ventile (a_ij, b_i) in Bezug auf die Durchflussrichtung des Mediums parallel oder in Reihe geschaltet betrieben werden und die Elektroden der verschiedenen Kanäle (K₁ bis K_N) unabhängig voneinander ansteuerbar sind.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein mikrofluidisches Dielektrophorese-System, insbesondere zur Akkumulation und/oder Aufkonzentration von dielektrischen, polarisierbaren Partikeln aus einem flüssigen Medium, dessen Verwendung sowie ein Verfahren zur Durchführung einer Dielektrophorese, insbesondere zur Akkumulation und/oder Aufkonzentration von polarisierbaren Partikeln aus einem flüssigen Medium, insbesondere mittels eines erfindungsgemäßen mikrofluidischen Dielektrophorese-Systems.
Stand der Technik
Ein wichtiges Anwendungsgebiet der Dielektrophorese ist das Aufkonzentrieren und Separieren von polarisierbaren Partikeln aus einer Suspension. Die Manipulation der Partikel kann dabei in einem mit Elektroden ausgestatteten fluidischen Kanal als Flusszelle erfolgen. Durch Anlegen einer Wechselspannung wird durch die Elektroden bei der Dielektrophorese ein inhomogenes elektrisches Feld erzeugt. Durch das inhomogene elektrische Feld wird in den polarisierbaren Partikeln ein Dipolmoment induziert, das in Wechselwirkung mit dem angelegten Feld tritt. Durch ein dielektrophoretisches Kraftfeld bewegen sich die Partikel dann entweder in Bereiche hoher (positive DEP) oder niedriger (negative DEP) Feldstärkegradienten und können dort gegebenenfalls in einem „Feldkäfig“ akkumuliert werden. Zur Aufkonzentration von Partikeln hat sich unter anderem ein Verfahren etabliert, bei dem polarisierbare Partikel durch positive Dielektrophorese (pDEP) zurückgehalten werden, während kontinuierlich neues Probenvolumen durch die Flusszelle geführt wird. Nach Abschalten der Elektrodenspannung und damit der dielektrophoretischen Kraft können die Partikel dann gesammelt ausgespült werden. Aufgrund der kurzen Reichweite des elektrischen Feldes bieten sich zur Realisierung des beschriebenen Funktionsprinzips insbesondere mikrofluidische Systeme an. Ein typischer Aufbau eines solchen mikrofluidischen Systems besteht aus einem mikrofluidischen Chip, der mit einem mit Elektroden ausgestatteten dielektrophoretisch aktiven Kanalstück als Flusszelle und Zuleitungskanälen ausgestattet ist. Solche Aufbauten sind beispielsweise in den Fachveröffentlichungen Strategies for dielectrophoretic separation in laboratoryon-a-chip systems (Hughes, M. P. Electrophoresis 2002, 23, 2569) und High-Throughput Postive-Dielectrophoretic Bioparticle Microconcentrator (Gadish, N.; Voldman, J. Anal. Chem. 2006, 78, 7870) und der dort zitierten Literatur beschrieben. Ein mikrofluidisches Kanalsystem kann über flexible Schläuche mit weiteren Komponenten kontaktiert werden. Die Zuführung von Probenvolumen kann aus einem Reservoir, mittels Spritzen- oder peristaltischen Pumpen erfolgen. Nicht mehr benötigte Flüssigkeit kann in ein Abfallreservoir geleitet werden.
Solche Dielektrophorese (DEP)-Chips, die das selektive Separieren und Aufkonzentrieren polarisierbarer Partikel, zum Beispiel Polymerpartikel oder Biopartikel, wie Viren, Bakterien oder Zellen, gegebenenfalls aus komplexen Substanzgemischen, beispielsweise für eine nachfolgende Analyse, ermöglichen können, stehen derzeit im Interesse der Forschung und Entwicklung. In Bezug auf biotechnologische Anwendungen besteht oft das Problem, dass Bakterien, Viren oder Zellen aus einem vergleichsweise großen Probenvolumen extrahiert werden müssen. Um große Flüssigkeitsmengen (mL) in akzeptabler Zeit durch ein mikrofluidisches System zu leiten, sind vergleichsweise große Kanalquerschnitte und damit große Kanalvolumina erforderlich. Als Folge werden nicht alle Partikel vom dielektrophoretischen Kraftfeld erfasst und die zum abschließenden Ausspülen der Partikel aus dem jeweiligen Kanal benötigte Flüssigkeitsmenge ist wiederum relativ groß, was die erreichbare Partikelkonzentration limitiert, beziehungsweise die Effizienz der Aufkonzentration in Relation zu einem Kanal mit kleinerem Volumen herabsetzt.
In der WO 97 / 07 245 A1 wird eine Vorrichtung zur Sequenzierung von Polynukleotiden vorgeschlagen, in der mit einer Verteilereinrichtung die Proben in parallel betriebene Trennkanäle eingespeist und dort gleichzeitig prozessiert, beispielsweise getrennt werden können.
Aus der Druckschrift US 2005 / 0 273 995 A1 ist ein mikrofluidisches Dielektrophorese-System bekannt, welches den Fluss der zu isolierenden Partikel parallel und in Serie durch verschiedene Kanäle steuern kann.
Offenbarung der Erfindung
Erfindungsgemäß wird vorgeschlagen, ein Dielektrophorese-System bereitzustellen, das mindestens

• eine Zuführeinrichtung für ein flüssiges Medium mit darin enthaltenen Partikeln,
• N ≥ 2 mikrofluidische, mit Elektroden ausgestattete, dielektrophoretisch aktive Kanäle K_n mit 1 ≤ n ≤ N,
• Leitungen zur fluidischen Verbindung der Zuführvorrichtung mit den Kanälen, zur Verbindung der Kanäle miteinander, sowie zur Abführung des Mediums und/oder der Partikeln aus den Kanälen, sowie
• Ventile zur Einstellung der Durchflussrichtung des Mediums in den Leitungen,

Mit anderen Worten können die dielektrophoretisch aktiven Kanäle des Dielektrophorese-Systems der Erfindung in Bezug auf den Durchfluss des Mediums sowohl in einer Parallelschaltung, als auch altemativ dazu in einer Reihenschaltung betrieben werden. Die Umschaltung zwischen der Parallel- und der Reihenschaltung kann erfindungsgemäß gezielt über die Ventileinstellung gesteuert werden.
Erfindungsgemäß kann mit der Parallelschaltung der dielektrophoretisch aktiven Kanäle ein hoher Durchsatz an Probenvolumen, das heißt an Medium mit darin enthaltenen polarisierbaren Partikeln ermöglicht werden. In einer Akkumulationsphase kann zusätzlich mit hoher Effizienz die Akkumulation von polarisierbaren Partikeln in den mikrofluidischen Kanälen erfolgen. Durch die mögliche Reihenschaltung dieser Kanäle und die unabhängige Steuerung der Elektroden und damit der einzelnen dielektrophoretischen Kraftfelder ist es möglich die in den einzelnen Kanälen akkumulierten Partikel durch Abschalten der Spannung an den Elektroden selektiv freizugeben und in einem in Strömungsrichtung nachgeschalteten Kanal, in dem die dielektrophoretische Kraft noch aktiv ist, zu sammeln. Aus diesem Kanal können die auf diese Weise nochmals akkumulierten und aufkonzentrierten Partikel dann gesammelt ausgespült werden. Mit anderen Worten kann in einer separaten Aufkonzentrationsphase ein zusätzlicher Aufkonzentrationseffekt erzielt werden.
Unter dielektrophoretisch aktiven Kanälen werden erfindungsgemäß mikrofluidische Kanäle verstanden, die mit Elektroden ausgestattet sind und in denen zumindest in einem Teilbereich, durch Anlegen einer Spannung an die Elektroden, ein dielektrophoretisches Kraftfeld erzeugt werden kann. Die dielektrophoretisch aktiven Kanäle sind mit anderen Worten Flusszellen oder Kammern, durch die ein Probenvolumen, beispielsweise eine Suspension oder Lösung mit darin enthaltenen polarisierbaren Partikeln, insbesondere kontinuierlich, hindurchgeleitet werden kann. Hierbei können die polarisierbaren Partikel im vorbeiströmenden Probenvolumen durch das dielektrophoretische Kraftfeld manipuliert werden.
Die Elektroden zur Erzeugung des dielektrophoretischen Kraftfelds können erfindungsgemäß interdigitierend angeordnete Elektroden, insbesondere ein Elektrodensystem aus zwei kammartig/fingerartig ausgebildeten, ineinander, insbesondere altemierend, eingreifenden Elektroden sein (englisch: „interdigitated elektrodes“, IDE). Die Elektroden des Interdigitalelektrodensystems können dabei in Form von parallelen, geraden Streifen ausgebildet und angeordnet sein.
Gleichermaßen ist es erfindungsgemäß möglich, eine oder mehrere kammartig ausgebildete, gegebenenfalls eine oder mehrere kammartige und/oder interdigitierende Elektroden und eine oder mehrere flächige Elektroden in Kombination miteinander zur Ausstattung eines oder mehrerer mikrofluidischer Kanäle einzusetzen. Unter flächigen Elektroden werden Elektroden verstanden, die insbesondere eine durchgehende, ununterbrochene, planare Fläche aufweisen. Der Einsatz einer flächigen Elektrode kann den Vorteil haben, dass diese in Bezug auf ein kammartiges oder Interdigitalelektrodensystem nur grob justiert werden muss und damit auch der Zusammenbau der Zelle vereinfacht werden kann. Darüber hinaus kann eine flächige Elektrode in Kombination mit interdigitierenden Elektroden gegebenenfalls die Akkumulationseffizienz einer Flusszelle verbessern.
Die Elektroden können in bekannter Weise in Planartechnik ausgeführt und am jeweiligen Kanalboden und/oder -deckel angebracht sein. Die Elektroden können sich aber auch seitlich des/der Kanäle, also an den Kanalwänden, befinden. Vorteilhafterweise kann die Auswahl und Anordnung der Elektroden auf die jeweiligen Erfordernisse der zu prozessierenden Proben abgestimmt und auf diese Weise die Effizienz der Flusszellen und des erfindungsgemäßen Dielektrophorese-Systems verbessert werden.
Unter dem „Deckel“ der Flusszellen, also der dielektrophoretisch aktiven Kanäle, kann dabei insbesondere diejenige Fläche im Kanal verstanden werden, welche im Betriebsmodus oben, insbesondere bezüglich der Gravitationsrichtung, liegt. Unter dem „Boden“ der Kanäle kann insbesondere diejenige Fläche verstanden werden, welche im Betriebsmodus unten, insbesondere bezüglich der Gravitationsrichtung, liegt.
Die erfindungsgemäßen Elektroden sind unabhängig voneinander, beispielsweise durch eine externe und/oder eine in das Dielektrophorese-System integrierte Steuerungseinrichtung, ansteuerbar. Insbesondere können die Elektroden der einzelnen Kanäle, und damit die dielektrophoretischen Kraftfelder, separat an- und abgeschaltet werden. An die Elektroden der einzelnen Kanäle kann weiterhin grundsätzlich die gleiche, es können aber auch voneinander verschiedene Elektrodenspannungen angelegt werden. Mit anderen Worten kann jeweils in den verschiedenen Kanälen ein gleiches dielektrophoretisches Kraftfeld oder es können dielektrophoretische Kraftfelder unterschiedlicher Stärke erzeugt werden. Erfindungsgemäß bevorzugt ist, dass mindestens innerhalb einer Gruppe von mikrofluidischen Kanälen K_n mit 1 ≤ n ≤ N mit N ≥ 2 das erzeugte dielektrophoretische Kraftfeld gleich ausgebildet ist. Mit „K₁“ wird dann in Bezug auf die Strömungsrichtung des Mediums der bei Reihenschaltung zuerst durchströmte mikrofluidische Kanal innerhalb einer solchen Gruppe bezeichnet. Mit „K_N“ wird in Bezug auf die Strömungsrichtung des Mediums der bei Reihenschaltung zuletzt durchströmte mikrofluidische Kanal innerhalb einer solchen Gruppe von Kanälen bezeichnet. Ist erfindungsgemäß nur eine Gruppe von Kanälen innerhalb des mikrofluidischen dielektrophoretischen Systems vorgesehen, die jeweils ein gleiches dielektrophoretisches Kraftfeld aufweisen können, stellt N damit auch die Gesamtzahl der dielektrophoretisch aktiven Kanäle dar.
Ein flüssiges Medium mit darin enthaltenen Partikeln kann beispielsweise eine Partikelsuspension oder ein Biofluid, beispielsweise Blut oder Urin, sein, wobei insbesondere letztere, gegebenenfalls vor der Durchführung der Dielektrophorese, noch einer Vorbehandlung, beispielsweise einer Entsalzung, unterworfen werden können.
Unter Partikeln werden erfindungsgemäß insbesondere polarisierbare Mikropartikel mit einer Größe von 0.1 µm bis 500 µm verstanden. Grundsätzlich ist das erfindungsgemäße System jedoch nicht hierauf beschränkt, sondern kann auch auf beispielsweise kleinere oder größere Partikel angepasst werden. Die Partikel können beispielsweise synthetische Polymer- oder Silikapartikel und/oder Biopartikel, wie Organellen, Zellen, Bakterien und/oder Viren sein. Synthetische Polymerpartikel können zum Beispiel Mikropartikel aus Latex, Polystyrol, Polymethylmethacrylat oder Melaminharz sein. Synthetische Polymerpartikel können beispielsweise als Testpartikel für die Optimierung des Dielektrophorese-Systems eingesetzt werden.
Das flüssige Medium kann beispielsweise, insbesondere für biotechnologische Anwendungen, ausgewählt sein aus Wasser oder für die jeweiligen Biopartikel, wie Bakterien, Viren und/ oder Zellen, geeigneten, wässrigen Pufferlösungen, ist jedoch nicht hierauf beschränkt. Das flüssige Medium kann auch andere Lösungsmittel, beispielsweise Ethanol oder Methanol, umfassen.
In einer Ausführungsform der Erfindung können die dielektrophoretisch aktiven Kanäle K₁ bis K_N zusammen auf einem mikrofluidischen Element, insbesondere einem mikrofluidischen Chip, angeordnet sein. Dies hat den Vorteil, dass die Kanäle als Flusszellen und gegebenenfalls deren Zu- und Ableitungen sowie gegebenenfalls auch die Ventile in einem Herstellungsprozess erzeugt werden können.
Alternativ können in einer anderen Ausgestaltung des erfindungsgemäßen mikrofluidischen Dielektrophorese-Systems die dielektrophoretisch aktiven Kanäle auf unterschiedlichen mikrofluidischen Elementen angeordnet sein. Die Kanäle können über flexible Schläuche als Leitungen miteinander verbunden sein. Gegebenenfalls können die Ventile als externe Komponenten in den Flüssigkeitspfad geschaltet werden.
Die Ventile des erfindungsgemäßen Dielektrophorese-Systems können zum Beispiel pneumatische Ventile sein, die durch eine externe und/oder eine in das System integrierte Steuerungseinrichtung angesteuert und geschaltet werden können. Die Ventile können zur Einstellung der Parallelschaltung und/oder der Reihenschaltung einzeln oder in Gruppen angesteuert werden.
Die Gesamtheit der Leitungen, die beispielsweise durch mikrofluidische Kanäle oder durch flexible Schläuche gebildet werden können, der hierüber miteinander verbundenen dielektrophoretisch aktiven Kanäle sowie der Ventile, werden erfindungsgemäß auch als Kanalsystem bezeichnet.
Eine erfindungsgemäße mikrofluidische Flusszelle und/oder ein erfindungsgemäßes mikrofluidisches Kanalsystem, umfassend die dielektrophoretisch aktiven Kanäle K₁ bis K_N, kann insbesondere durch mikrotechnologische Verfahren hergestellt werden. Zum Beispiel kann ein platten- oder folienförmiges Substrat, beispielsweise ein Glassubstrat, ein Siliziumsubstrat, ein Leiterplattensubstrat oder ein Polymersubstrat, insbesondere ein Pyrexsubstrat, ein Teflonsubstrat, ein Polystyrolsubstrat, ein Substrat aus einem Cyclo-Olefin-Copolymer, ein Polyestersubstrat oder ein PDMS-Substrat, oder ein durch Spritzgießen oder Tiefenätzen oder Prägen, insbesondere Heißprägen, strukturiertes Substrat, beispielsweise ein strukturiertes Glassubstrat, Siliziumsubstrat oder Polymersubstrat, insbesondere ein Pyrexsubstrat, ein Teflonsubstrat, ein Polystyrolsubstrat, ein Substrat aus einem Cyclo-Olefin-Copolymer, ein Polyestersubstrat oder ein PDMS-Substrat, verwendet werden. Hierauf können anschließend, beispielsweise mittels Dünnschichttechnik und/oder Lithographie, Elektroden aufgebracht werden. Danach kann das resultierende System mit einer Deckelung, beispielsweise einer Glasplatte oder einer Polymerplatte oder -folie, insbesondere einer PDMS-Folie oder einer Polystyrol- oder Pyrexplatte, oder einer durch Spritzgießen oder Tiefenätzen oder Blasformen oder Prägen, insbesondere Heißprägen, strukturierten Glasplatte oder Polymerfolie oder -platte abgedeckt werden.
Die mikrofluidischen dielektrophoretisch aktiven Kanäle können beispielsweise eine Länge von ≥ 5 mm bis ≤ 100 mm, insbesondere von ≥ 10 mm bis ≤ 80 mm, insbesondere ≥ 20 mm bis ≤ 60 mm, zum Beispiel von 40 mm, und/oder eine Breite von ≥ 50 µm bis ≤ 50 mm, insbesondere von ≥ 1 mm bis ≤ 30 mm, zum Beispiel von 25 mm, und/oder eine Höhe von ≥ 20 µm bis ≤ 2000 µm, insbesondere von ≥ 100 µm bis ≤ 200 µm, beispielsweise von 130 µm oder 150 µm, aufweisen.
Das erfindungsgemäße Kanalsystem des Dielektrophorese-Systems kann einen Einlass und einen Auslass aufweisen. Über einen Einlass kann das Kanalsystem mit einer Zuführeinrichtung verbunden werden. In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform des Dielektrophorese-Systems kann die Zuführeinrichtung insbesondere eine Spritzenpumpe, eine Peristaltikpumpe oder eine Mikropumpe sein. Altemativ kann die Zuführeinrichtung auch ein Probeneinlassreservoir sein. Es ist erfindungsgemäß auch möglich das Probeneinlassreservoir und die jeweilig gewählte Pumpe zu einer Zuführeinrichtung zu kombinieren. Der Auslass ist vorzugsweise mit einem Probenauffangreservoir und/oder mit einem Abfallreservoir verbunden oder verbindbar. Erfindungsgemäß ist es auch möglich den Auslass des Kanalsystems mit einer Pumpe zu verbinden, die mittels Saugen das Ausspülen des Mediums und/oder der Partikel unterstützen kann.
Durch das erfindungsgemäße mikrofluidische Dielektrophorese-System können vorteilhafterweise polarisierbare synthetische Partikel und/oder Biopartikel, wie Bakterien, Zellen oder Viren, aus einer vorbeiströmenden Probenflüssigkeit akkumuliert und aufkonzentriert werden. Dabei kann eine hohe Ausbeute an akkumulierten Biopartikeln und/oder ein hoher Probendurchsatz, beispielsweise von mehreren Millilitern Probenflüssigkeit, als Medium mit darin enthaltenen Partikeln innerhalb von 1 bis 60 Minuten, beispielsweise 30 min, insbesondere innerhalb von 5 bis 15 Minuten erzielt werden.
In einer weiteren Ausgestaltung können einer oder mehrere der mikrofluidischen dielektrophoretisch aktiven Kanäle K₁ bis K_N Mischerstrukturen enthalten. Die Mischerstrukturen können Wirbel in der Strömung des Mediums induzieren. Vorteilhafterweise kann somit durch Integration von Mischerstrukturen in einen Kanal erreicht werden, dass ein größerer Anteil der im Medium mitgeführten Partikel in den Einflussbereich des dielektrophoretischen Kraftfeldes gelangt. Die Mischerstrukturen können zum Beispiel in Form eines symmetrischen oder asymmetrischen Fischgrät-Musters angeordnet sein, sind jedoch nicht hierauf beschränkt. Durch solche so genannten „Herringbone-Mischerstrukturen“ können zudem gegebenenfalls weitere Inhomogenitäten des dielektrophoretischen Feldes induziert werden. Beide vorstehend beschriebenen Effekte können dazu beitragen die Effizienz der Akkumulation und Aufkonzentration der Partikel weiter zu verbessern. Darüber hinaus ist eine effiziente Akkumulation der Partikel auch bei einer höheren Flussrate möglich, als bei Systemen ohne Mischerstrukturen. Mit anderen Worten kann durch Einbringen einer geeigneten Mischerstruktur in einen oder mehrere, insbesondere alle, dielektrophoretisch aktive Kanäle auch der Durchsatz an Probenvolumen vorteilhafterweise erhöht werden.
In einer Ausführungsform der Erfindung können die mit Elektroden ausgestatteten mikrofluidischen Kanäle als mindestens zwei einander in Durchflussrichtung des Mediums nachgeschaltete Gruppen K_n,A, mit 1 ≤ n ≤ N mit N ≥ 2 und K_m,B mit 1 ≤ m ≤ M mit M ≥ 2 ausgebildet sein, wobei die Gruppen der Kanäle K_1,A bis K_N,A und K_1,B bis K_M,B mit unterschiedlichen Elektrodenspannungen, beispielsweise unterschiedlichen Frequenzen und/oder Amplituden, betrieben werden können. Mit anderen Worten kann das erfindungsgemäße Dielektrophorese-System mindestens zwei Gruppen dielektrophoretisch aktiver Kanäle aufweisen, in denen unterschiedliche dielektrophoretische Kraftfelder erzeugt werden können. Hierdurch können vorteilhafterweise während einer Akkumulationsphase, in der die Flusszellen parallel betrieben werden, gleichzeitig unterschiedliche polarisierbare Partikel jeweils in den dielektrophoretischen „Feldkäfigen“ der zu den beiden Gruppen gehörenden aktiven Kanäle gesammelt werden. Mit „K_1,A“ bzw. „K_1,B“ wird in Bezug auf die Strömungsrichtung des Mediums der bei Reihenschaltung der mikrofluidischen dielektrophoretisch aktiven Kanäle zuerst durchströmte Kanal innerhalb der jeweiligen Gruppe bezeichnet. Mit „K_N,A“ bzw. „K_M,B“ wird in Bezug auf die Strömungsrichtung des Mediums der bei Reihenschaltung zuletzt durchströmte Kanal innerhalb einer solchen Gruppe von Kanälen bezeichnet. Sind erfindungsgemäß beispielsweise zwei Gruppen von dielektrophoretisch aktiven Kanälen innerhalb des erfindungsgemäßen Dielektrophorese-Systems vorgesehen, die jeweils ein gleiches dielektrophoretisches Kraftfeld aufweisen können, stellt die Summe N + M die Gesamtzahl der dielektrophoretisch aktiven Kanäle dar. Das erfindungsgemäße Dielektrophorese-System ist jedoch nicht auf lediglich zwei solcher vorstehend beschriebenen Gruppen von Kanälen beschränkt.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Dielektrophorese, insbesondere zur Akkumulation und/oder Aufkonzentration von polarisierbaren Partikeln aus einem flüssigen Medium, insbesondere mittels eines mikrofluidischen Dielektrophorese-Systems, mindestens umfassend

• eine Zuführeinrichtung für ein flüssiges Medium mit darin enthaltenen Partikeln,
• N ≥ 2 mikrofluidische dielektrophoretisch aktive Kanäle K_n mit 1 ≤ n ≤ N, die mit Elektroden ausgestattet sind,
• Leitungen zur fluidischen Verbindung der Zuführeinrichtung mit den Kanälen, zur Verbindung der Kanäle miteinander sowie zur Abführung des Mediums und/oder der Partikel aus den Kanälen, sowie
• Ventile zur Einstellung der Durchflussrichtung des Mediums in den Leitungen,

A) eine Akkumulationsphase umfassend die Schritte
- aa) Schaltung der Ventile zu einer Parallelschaltung der Kanäle,
- ab)Zuführung von Medium mit darin enthaltenen Partikeln zu den Kanälen K₁ bis K_N,
- ac) Akkumulation der Partikel in den Kanälen K₁ bis K_N, wobei zur Akkumulation der Partikel eine Wechselspannung an die Elektroden angelegt wird;
B) eine Aufkonzentrationsphase umfassend die Schritte
- ba) Schaltung der Ventile zu einer Reihenschaltung der Kanäle, K₁ bis K_N,
- bb) Freigeben der akkumulierten Partikel durch selektives Abschalten der Elektroden der Kanäle K_n mit 1 ≤ n ≤ N-1,
- bc) Transportieren der freigegebenen Partikel in und/oder durch die jeweils nachgeschalteten Kanäle K_n+1 und
- bd) Sammeln der Partikel im Kanal K_N und
C) Ausspülen der gesammelten Partikel aus dem Kanal K_N.

Während der Akkumulationsphase A) kann an die Elektroden zur Erzeugung eines inhomogenen elektrischen Feldes eine hochfrequente Wechselspannung, beispielsweise von 15V bis 50 V, zum Beispiel 30V, mit einer Frequenz von 0,5 MHz bis 1,5 MHz, beispielsweise von 1 MHz, angelegt werden. Eine polarisierbare Partikel, beispielsweise Biopartikel umfassende Lösung oder Suspension kann durch die parallel geschalteten dielektrophoretisch aktiven Kanäle geleitet, insbesondere gepumpt, werden. Die Art und Stärke des dielektrophoretischen Kraftfelds kann auf die jeweils zu akkumulierenden Partikel abgestimmt werden. Die Parallelschaltung der Kanäle ermöglicht dabei erfindungsgemäß neben der effizienten Akkumulation der Partikel einen hohen Durchsatz an Probenvolumen und eine hohe Flussrate.
In der Aufkonzentrationsphase B) kann durch die mögliche Reihenschaltung der Kanäle und die unabhängige Steuerung der Elektroden und damit der einzelnen dielektrophoretischen Kraftfelder ermöglicht werden, dass die in den einzelnen Kanälen akkumulierten Partikel durch selektives Abschalten der Spannung an den Elektroden selektiv freigegeben und in einem oder mehreren Kanälen, in denen die dielektrophoretische Kraft noch aktiv ist, gesammelt werden können. Aus diesem bzw. diesen Kanälen können die dadurch nochmals akkumulierten und aufkonzentrierten Partikel dann gesammelt ausgespült werden. Mit andern Worten kann erfindungsgemäß in einer separaten Phase B) ein zusätzlicher Aufkonzentrationseffekt erzielt werden.
Die im Kanal K_N aufkonzentrierten Partikel können dann im Schritt C) gesammelt ausgespült werden. Vorteilhafterweise kann das abschließende Ausspülen der Partikel aus dem Kanal K_N mit einem im Vergleich zum Volumen der Summe sämtlicher dielektrophoretisch aktiver Kanäle geringen Volumen an Eluens erfolgen. Hierdurch kann also nochmals die Effizienz der Aufkonzentration gesteigert werden.
Als Eluens zum Ausspülen der Partikel aus dem Kanalsystem, insbesondere dem bei Reihenschaltung zuletzt durchflossenen Kanal K_N, kann zum Beispiel das flüssige Medium eingesetzt werden. Das Eluens kann aber auch vom Medium verschieden sein und beispielsweise ausgewählt werden aus Wasser oder, insbesondere für Biopartikel, wie Bakterien, Viren und/ oder Zellen, geeigneten, wässrigen Pufferlösungen oder anderen für die Partikel geeigneten Lösungsmitteln.
In einer Ausführungsvariante des erfindungsgemäßen Verfahrens können die Schritte der Aufkonzentrationsphase bb) Freigeben der akkumulierten Partikel in Kanal K_n und bc) Transportieren der freigegebenen Partikel in den jeweils nachgeschalteten Kanal K_n+1 durch sukzessives Abschalten der Elektroden, also Abschalten der angelegten Spannung in den Kanälen K₁ bis K_N-1, insbesondere beginnend mit dem bei Reihenschaltung zuerst durchflossenen Kanal K₁ erfolgen. Der Zyklus von Abschalten der Elektrodenspannung und Freigeben der Partikel im Kanal K_n sowie Transportieren und Akkumulieren der Partikel in dem jeweils nachgeschalteten Kanal K_n+1 wird dann N-1 Mal wiederholt.
Erfindungsgemäß umfasst ist auch, dass vor dem Ausspülen der Partikel in Schritt C) oder nach dem Ausspülen des Kanals K_N die Partikel weiteren Prozessschritten, bei Zellen oder Bakterien beispielsweise einer Lyse und/oder einer Ablösungsphase, insbesondere DNA/RNA-Freilegungsphase unterworfen werden können. Mit anderen Worten kann das erfindungsgemäße Verfahren beispielsweise weiterhin eine Lysephase umfassen. Während der Lysephase und/oder Ablösungsphase kann an die Elektroden eines Interdigitalelektrodensystems eine niederfrequente Wechselspannung, beispielsweise von ≥ 30 V bis ≤ 50 V mit einer Frequenz von ≥ 1 kHz bis ≤ 20 kHz, beispielsweise von 10 kHz, angelegt werden. Während der Lysephase kann das Pumpen der polarisierbare Biopartikel umfassenden Lösung oder Suspension gestoppt werden. Die Lyse kann auch chemisch, insbesondere mittels Einsatz von Detergenzien, beispielsweise von Natrium-Dodecylsulfat, oder von chaotropen Salzen, beispielsweise von Guanidin-Thiocyanat, durchgeführt werden. Im Anschluss an die Lysephase kann dann entsprechend das Lysat ausgespült und/oder weiterverwendet werden.
In einer anderen erfindungsgemäßen Ausgestaltung des Verfahrens können die mit Elektroden ausgestatteten mikrofluidischen dielektrophoretisch aktiven Kanäle K_n in mindestens zwei einander in Durchflussrichtung nachgeschalteten Gruppen K_n,A mit 1 ≤ n ≤ N mit N ≥ 2 und K_m,B mit 1 ≤ m ≤ M mit M ≥ 2 mit Elektrodenspannungen unterschiedlicher Frequenz und/oder Amplitude betrieben werden. Durch diese Unterteilung, bzw. Gruppenbildung, ist es vorteilhafterweise möglich innerhalb einer Akkumulationsphase A) mindestens zwei unterschiedliche Partikelsorten gleichzeitig zu akkumulieren. Vorteilhafterweise können so gleichzeitig verschiedene Partikel, beispielsweise für eine nachfolgende Analytik, gesammelt werden, für deren Akkumulation beispielsweise unterschiedliche Frequenzen benötigt werden.
In einer weiteren Ausführungsvariante des Verfahrens, in dem mindestens zwei einander in Durchflussrichtung nachgeschaltete Gruppen K_n,A und K_m,B zur Aufkonzentration von Partikeln eingesetzt werden, können die Partikeln jeweils in den bei Reihenschaltung zuletzt durchflossenen Kanälen K_N,A und K_M,B der Gruppen gesammelt werden. Die Kanäle K_N,A und K_M,B können dann gleichzeitig oder nacheinander in einem Schritt CA) und CB) ausgespült werden.
Welche Variante des Ausspülens gewählt wird, kann vorteilhafterweise auf die jeweiligen Erfordernisse angepasst werden. Ein gleichzeitiges Ausspülen kann zum Beispiel zweckmäßig sein, wenn die Partikel nach abgeschlossener Dielektrophorese gemeinsam analysiert und/oder weiter prozessiert werden können. Sollen die Partikel nachfolgend jedoch getrennt voneinander analysiert und/oder weiterbehandelt werden, so können sie nacheinander, beispielsweise in separate Probenauffangreservoire, ausgespült werden.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung einer eines erfindungsgemäßen mikrofluidischen Dielektrophorese-Systems in der Medizintechnik und/oder Mikrobiologie, beispielsweise in der medizinischen Analytik, insbesondere in einem integrierten mikrofluidischen Lab-on-a-Chip-System, zum Beispiel zur Probenvorbehandlung, insbesondere für die DNA- und/oder RNA-Analytik oder Analyse von Proteinen.
Zeichnungen
Die Erfindung wird nachfolgend an Hand von Ausführungsbeispielen in Verbindung mit den Figuren erläutert, ohne auf die gezeigten Ausgestaltungen beschränkt zu sein.
Es zeigt

1 einen schematischen Aufbau eines erfindungsgemäßen mikrofluidischen Dielektrophorese-Systems mit parallel geschalteten Kanälen.
2 eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen mikrofluidischen Dielektrophorese-Systems aus 1 mit in Reihe geschalteten Kanälen.

1 zeigt ein erfindungsgemäßes Dielektrophorese-System 1 umfassend die mikrofluidischen dielektrophoretisch aktiven Kanäle K₁ bis K_N (N ≥ 2). Die Kanäle K₁ bis K_N sind jeweils mit Elektroden (nicht dargestellt) ausgestattet, die in den Kanälen K₁ bis K_N zumindest in einem Teilbereich ein inhomogenes elektrisches Feld erzeugen. Durch das so erzeugte dielektrophoretische Kraftfeld können in einem durch den jeweiligen Kanal strömenden flüssigen Medium enthaltene polarisierbare Partikel, beispielsweise Bakterien, Viren, Zellen oder auch Polymerpartikel, zurückgehalten und akkumuliert werden. Die Kanäle K₁ bis K_N sind durch Leitungen 2 miteinander verbunden und mit einer Zuführeinrichtung 3 für das Medium mit den darin enthaltenen Partikeln, beispielsweise einer Spritzenpumpe oder Mikropumpe, kontaktiert. Die Laufbahn des Mediums in den Leitungen 2 lässt sich dabei über Ventile a_ij und b_i einstellen. Nur zum Zwecke der Übersichtlichkeit sind nur die Ventile a₁₁, a₂₁, in den Medium zuführenden Leitungen 2a zu den Kanälen K₁ und K₂, und die Ventile a₁₂, und a₂₂ in den aus den Kanälen Medium abführenden Leitungen 2b, sowie die Ventile b₁ und b₂ gezeigt. Die Ventile a_ij und b_i können entweder in ein mikrofluidisches Kanalsystem integriert oder als externe Komponenten über Schläuche als Leitungen 2, 2a, 2b in den Durchflusspfad des Mediums geschaltet sein. Die Kanäle K₁ bis K_N sind erfindungsgemäß derart miteinander verschaltet, dass sie durch Schaltung der Ventile a_ij und b_i in Bezug auf die Durchflussrichtung des Mediums parallel oder in Reihe geschaltet betrieben werden können. In einer ersten, hier dargestellten, Akkumulationsphase A) können die Kanäle K₁ bis K_N zur Ansammlung von Partikeln parallel geschaltet sein. Die Ventile a_ij, in der gezeigten Ausführungsform die Ventile a₁₂, und a₂₂, sind zu diesem Zweck durchgeschaltet, während die Ventile b_i, in der gezeigten Ausführungsform b₁ und b₂, sperren. Die Kanäle K₁ bis K_N können somit gleichzeitig von flüssigem Medium mit Partikeln, beispielsweise einer Partikelsuspension, durchströmt werden. In jedem Kanal K₁ bis K_N können die im Medium enthaltenen Partikel zurückgehalten und akkumuliert werden. Dies ermöglicht vorteilhafterweise den Durchsatz eines großen Probenvolumens und eine hohe Gesamt-Flussrate durch das erfindungsgemäße Dielektrophorese-System. Einer oder mehrere der mikrofluidischen dielektrophoretisch aktiven Kanäle K₁ bis K_N können zusätzlich Mischerstrukturen (nicht gezeigt) enthalten. Vorteilhafterweise kann durch Integration von Mischerstrukturen in einen Kanal erreicht werden, dass ein größerer Anteil der im Medium mitgeführten Partikel in den Einflussbereich des dielektrophoretischen Feldes gelangt. Somit kann die Akkumulation und Aufkonzentration der Partikel weiter verbessert werden.
2 zeigt in einer schematischen Darstellung das in 1 gezeigte erfindungsgemäße mikrofluidische Dielektrophorese-System 1, wobei die Kanäle K₁ bis K_N in einer zweiten Aufkonzentrationsphase B) bezüglich des durchfließenden Mediums in Reihe geschaltet sind. Zu diesem Zweck sind die Ventile a_ij gesperrt, während die Ventile b_i, also die Ventile b₁ und b₂, auf Durchfluss geschaltet sind. Die Elektrodenspannung und damit die auf die Partikel wirkende dielektrophoretische Kraft kann dann in den Kanälen K₁ bis K_N-1 selektiv abgeschaltet werden. Die in den Kanälen K₁ bis K_N-1 akkumulierten Partikel können durch das selektive Abschalten der dielektrophoretischen Kraft freigegeben werden und können insbesondere im zuletzt durchflossenen Kanal K_N, bzw. in dem in Strömungsrichtung ersten Kanal, in dem die dielektrophoretische Kraft noch aktiv ist, aufkonzentriert werden. Die Abschaltung der Elektrodenspannung kann vorteilhafterweise auch sukzessive, beispielsweise beginnend mit dem zuerst vom Medium durchflossenen Kanal K₁, erfolgen. Die Partikel werden dann in den nachgeschalteten Kanal K₂ transportiert, in dem die dielektrophoretische Kraft noch aktiv ist. Dort werden die Partikel festgehalten, bis auch im Kanal K₂ die Elektrodenspannung abgeschaltet wird. Dieser Zyklus von Abschalten der Elektrodenspannung und Freigeben im Kanal K_n sowie Transportieren in den und Akkumulieren der Partikel im jeweils nachgeschalteten Kanal K_n+1 wird insgesamt N-1 Mal wiederholt. Die im Kanal K_N aufkonzentrierten Partikel können dann gesammelt ausgespült werden. Vorteilhafterweise kann das abschließende Ausspülen der Partikel aus dem Kanal K_N mit einem vergleichsweise geringen Volumen an Eluens erfolgen. Hierdurch kann also ein zusätzlicher Aufkonzentrationseffekt erzielt werden.
Zusammenfassend wird erfindungsgemäß ein Dielektrophorese-System bereitgestellt, mit dem insbesondere die Effizienz der Aufkonzentration von synthetischen, insbesondere polymeren, Partikeln, beispielsweise aus Latex oder Polystyrol, oder biologischen Partikeln, beispielsweise Bakterien, Viren oder Zellen, aus einem flüssigen Medium verbessert werden kann. Insbesondere kann durch die erfindungsgemäße Verschaltung der dielektrophoretisch aktiven Kanäle eine zusätzliche Aufkonzentratioh der Partikel ermöglicht werden. Außerdem wird beim abschließenden Ausspülen der Partikel ein geringeres Volumen an Eluens benötigt, was den erreichbaren Aufkonzentrationsfaktor der Partikel gegenüber bisher bekannten mikrofluidischen Systemen und Verfahren nochmals verbessert.

Claims

Mikrofluidisches Dielektrophorese-System (1), mindestens umfassend • eine Zuführeinrichtung (3) für ein flüssiges Medium mit darin enthaltenen Partikeln, • N ≥ 2 mikrofluidische mit Elektroden ausgestattete dielektrophoretisch aktive Kanäle (K_n mit 1 <_ n <_ N ), • Leitungen (2, 2a, 2b) zur fluidischen Verbindung der Zuführeinrichtung (3) mit den Kanälen (K_n), zur Verbindung der Kanäle (K_n) miteinander, sowie zur Abführung des Mediums und/oder der Partikeln aus den Kanälen (K_n), sowie • Ventile (a_ij, b_i) zur Einstellung der Durchflussrichtung des Mediums in den Leitungen (2, 2a, 2b) dadurch gekennzeichnet, dass die dielektrophoretisch aktiven Kanäle (K₁ bis K_N) derart angeordnet und durch Leitungen (2, 2a, 2b) verbunden sind, dass sie durch Schaltung der Ventile (a_ij, b_i) in Bezug auf die Durchflussrichtung des Mediums parallel oder in Reihe geschaltet betrieben werden und die Elektroden der verschiedenen Kanäle (K₁ bis K_N) unabhängig voneinander ansteuerbar sind.
Mikrofluidisches Dielektrophorese-System (1) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die dielektrophoretisch aktiven Kanäle (K₁ bis K_N) zusammen auf einem mikrofluidischen Element, insbesondere einem mikrofluidischen Chip oder die dielektrophoretisch aktiven Kanäle (K₁ bis K_N) auf unterschiedlichen mikrofluidischen Elementen angeordnet sind.
Mikrofluidisches Dielektrophorese-System nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Zuführeinrichtung (3) eine Spritzenpumpe, eine Peristaltikpumpe oder eine Mikropumpe ist.
Mikrofluidisches Dielektrophorese-System (1) nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass einer oder mehrere der mikrofluidischen dielektrophoretisch aktiven Kanäle (K₁ bis K_N) Mischerstrukturen enthalten.
Mikrofluidisches Dielektrophorese-System (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die mit Elektroden ausgestatteten mikrofluidischen Kanäle (K₁ bis K_N) als mindestens zwei einander in Durchflussrichtung des Mediums nachgeschaltete Gruppen (K_n,A mit 1 <_ n <_ N mit N ≥ 2) und (K_m,B mit 1 ≤ m <_ M mit M ≥ 2) ausgebildet sind, wobei die Gruppen (K_n,A und K_m,B) mit Elektrodenspannungen unterschiedlicher Frequenz und/oder Amplitude betrieben werden.
Verfahren zur Dielektrophorese, insbesondere zur Aufkonzentration von Partikeln aus einem flüssigen Medium, mittels eines mikrofluidischen Dielektrophorese-Systems (1), nach einem der Ansprüche 1 bis 5, umfassend A) eine Akkumulationsphase umfassend die Schritte aa) Schaltung der Ventile (a_ij, b_i) zu einer Parallelschaltung der Kanäle (K₁ bis K_N) , ab) Zuführung von Medium mit enthaltenen Partikeln zu den Kanälen (K₁ bis K_N), ac) Akkumulation der Partikel in den Kanälen (K₁ bis K_N), wobei die Elektroden mit einer hochfrequenten Wechselspannung beaufschlagt werden; B) eine Aufkonzentrationsphase umfassend die Schritte ba) Schaltung der Ventile (a_ij, b_i) zu einer Reihenschaltung der Kanäle (K₁ bis KN), bb) Freigeben der akkumulierten Partikel durch Abschalten der Elektroden der Kanäle (K₁ bis K_N-1), bc) Transportieren der freigegebenen Partikel in und/oder durch die jeweils nachgeschalteten Kanäle (K_n+1 bis K_N) und bd) Sammeln der Partikel im Kanal (K_N), C) Ausspülen der gesammelten Partikel aus dem Kanal K_N.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Aufkonzentrationsschritte bb) Freigeben der akkumulierten Partikel im Kanal (K_n) und bc) Transportieren der freigegebenen Partikel in den jeweils nachgeschalteten Kanal (K_n+1) durch sukzessives Abschalten der Elektroden in den Kanälen (K₁ bis K_N-1), insbesondere beginnend mit dem zuerst durchflossenen Kanal (K₁), erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass die mit Elektroden ausgestatteten mikrofluidischen dielektrophoretisch aktiven Kanäle (K_n) in mindestens zwei einander in Durchflussrichtung nachgeschalteten Gruppen (K_n,A mit 1 ≤ n ≤ N mit N ≥ 2) und (K_m,B mit 1 ≤ m ≤ M mit M ≥ 2) mit Elektrodenspannungen unterschiedlicher Frequenz und/oder Amplitude betrieben werden.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Aufkonzentration von Partikeln jeweils in den zuletzt durchflossenen Kanälen (K_N,A und K_N,B) der Gruppen erfolgt und diese Kanäle (K_N,A und K_N,B) gleichzeitig oder nacheinander in einem Schritt CA) und CB) ausgespült werden.
Verwendung eines mikrofluidischen Dielektrophorese-Systems nach einem der Ansprüche 1 bis 5 in einem mikrofluidischen Lab-on-a-Chip-System.