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DE102019009219B4 - Zusammensetzungen und Verfahren zum Nachweis der Nukleinsäure von Gruppe-B-Streptococcus - Google Patents

Zusammensetzungen und Verfahren zum Nachweis der Nukleinsäure von Gruppe-B-Streptococcus Download PDF

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DE102019009219B4
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dna
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Barbara L. EATON
Benjamin Grobarczyk
Yves Ozog
Renaud Close
Laurent Franzil
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Gen Probe Inc
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Abstract

Offenbart sind Nukleinsäureoligomere, einschließlich Amplifikationsoligomere und Nachweissonden, zum Nachweis der Nukleinsäure von Gruppe-B-Streptococcus (GBS; Streptococcus agalactiae). Ebenfalls offenbart werden Verfahren zur spezifischen Nukleinsäure-Amplifikation und zum Nachweis unter Verwendung der offenbarten Oligomere sowie entsprechender Reaktionsgemische und Kits.

Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Gruppe-B-Streptococcus (GBS) oder Streptococcus agalactiae, ist ein grampositives Bakterium, das mit einer vorübergehenden Kolonisierung der Schleimhäute im ganzen Körper verbunden ist, einschließlich der Vagina, des Gastrointestinaltraktes und der Urethra. GBS verursacht selten Krankheiten bei gesunden Personen, kann jedoch bei immungeschwächten Patienten, älteren Personen und Neugeborenen schwere Krankheiten verursachen. Von besonderer Bedeutung ist eine neonatale Infektion, die durch vertikale Übertragung während der Geburt und Entbindung verursacht wird. Die Übertragung von einer asymptomatisch kolonisierten Mutter auf das Neugeborene kann zu einer früh einsetzenden invasiven GBS-Krankheit führen, die in den USA die häufigste Ursache für Sepsis und Meningitis bei Neugeborenen ist. Früh einsetzende invasive GBS-Krankheiten bei Neugeborenen können zum Tod oder zu langfristigen Behinderungen wie geistiger Behinderung und Hör- oder Sehverlust führen. Buchan et al. J. Clin. Microbiol. 53: 443-448, 2015.
  • Die Identifizierung von GBS während des Routine-Screenings führt zu einer intrapartalen Prophylaxe, um sowohl die Übertragung von Bakterien als auch die Wahrscheinlichkeit einer invasiven Erkrankung zu verringern. Die Implementierung dieser Screening- und Prophylaxe-Strategie hat die Inzidenz von früh einsetzender GBS-Infektion um 60 bis 86% reduziert. Lin et al., Am. J. Obstet. Gynecol. 184: 1204-1210, 2001. Seit 2010 enthalten die CDC-Richtlinien molekulardiagnostische Tests als Option parallel oder zusätzlich zur Kultur. Aktuelle Tests umfassen die Cepheid GBS LB- und BD max GBS-Tests, die auf das CFB-Gen abzielen.
  • Auf dem Fachgebiet besteht ein Bedarf an GBS-Assays mit verbesserter Empfindlichkeit und/oder dem Potential zum Schutz gegen Isolatvarianz eines einzelnen Gens, einschließlich beispielsweise Assays, die GBS-Serotypen Ia, Ib, Ic, II, III, IV, V, VI, VII, VIII und IX nachweisen können, einschließlich nicht hämolytisches Isolat.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung zur Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit von Gruppe-B-Streptococcus (GBS) in einer Probe. In einigen Ausführungsformen umfasst die Zusammensetzung mindestens eine von einer ersten Amplifikationsoligomeren-Kombination und einer zweiten Amplifikationsoligomeren-Kombination, wobei
  • (I) die erste Amplifikationsoligomeren-Kombination ein erstes und ein zweites SIP-spezifisches Amplifikationsoligomer umfasst, die in der Lage sind, eine Zielregion einer GBS-SIP-Zielnukleinsäure zu amplifizieren, wobei das erste und das zweite SIP-spezifische Amplifikationsoligomer jeweils erste (A) und zweite (B) SIP-spezifische Zielhybridisierungssequenzen umfassen, ausgewählt aus
    1. (a) (A) SEQ ID NO:3 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B) SEQ ID NO:4 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und
    2. (b) (A) SEQ ID NO:7 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B) SEQ ID NO:8 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon;
    und
    (II) die zweite Amplifikationsoligomeren-Kombination erste und zweite CFB-spezifische Amplifikationsoligomere umfasst, die in der Lage sind, eine Zielregion einer GBS-CFB-Zielnukleinsäure zu amplifizieren, wobei die ersten und zweiten CFB-spezifischen Amplifikationsoligomere jeweils erste (A') und zweite (B') CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenzen umfassen, ausgewählt aus
    1. (a) (A') einer Sequenz, die aus ungefähr 17 bis ungefähr 24 zusammenhängenden Nukleotiden besteht, die in der Sequenz von SEQ ID NO:26 enthalten sind, oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon, und (B') SEQ ID NO: 13 oder SEQ ID NO: 15 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon;
    2. (b) (A') SEQ ID NO:16 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B') SEQ ID NO: 17 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon;
    3. (c) (A') SEQ ID NO:18 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B') SEQ ID NO: 15 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und
    4. (d) (A') SEQ ID NO:20 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B') SEQ ID NO:21 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon.
  • In einigen Ausführungsformen einer obengenannten Zusammensetzung, in denen die Zusammensetzung die erste Amplifikationsoligomeren-Kombination enthält, enthält die Zusammensetzung ferner ein SIP-spezifisches Nachweissondenoligomer, das eine SIP-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz umfasst, die zwischen ungefähr 15 und ungefähr 35 Nukleotiden lang ist und so konfiguriert ist, dass sie zu einer Zielsequenz hybridisiert, die in einem SIP-Amplikon enthalten ist, das durch das erste und zweite SIP-spezifische Amplifikationsoligomer amplifizierbar ist. In einigen derartigen Ausführungsformen sind die ersten und zweiten SIP-spezifischen Zielhybridisierungssequenzen die Zielhybridisierungssequenzen von (I)(a) und die SIP-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz ist SEQ ID NO:9 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon. In anderen Ausführungsformen sind die erste und die zweite SIP-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (I)(b) und die SIP-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz ist SEQ ID NO:11 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon. In einigen Varianten umfasst das SIP-spezifische Nachweissondenoligomer ferner eine nachweisbare Markierung, wie beispielsweise eine fluoreszierende oder chemilumineszierende Markierung. In einigen Ausführungsformen, die ein nachweisbar markiertes Sondenoligomer umfassen, ist die nachweisbare Markierung eine fluoreszierende Markierung und das SIP-spezifische Nachweissondenoligomer umfasst ferner einen nicht fluoreszierenden Quencher.
  • In einigen Ausführungsformen einer obengenannten Zusammensetzung, in denen die CFB-spezifischen Zielhybridisierungssequenzen die Zielhybridisierungssequenzen von (II)(a) sind, umfasst die erste CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz von (II)(a) mindestens die Sequenz von SEQ ID NO:28 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon. In einigen solchen Ausführungsformen ist die erste CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz von (II)(a) in der Sequenz von SEQ ID NO:27 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon enthalten; in einigen derartigen Varianten ist die erste CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz von (II)(a) SEQ ID NO:12 oder SEQ ID NO:14 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon. In anderen Ausführungsformen, in denen die CFB-spezifischen Zielhybridisierungssequenzen die Zielhybridisierungssequenzen von (II)(a) sind, ist die erste CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz von (II)(a) SEQ ID NO:18 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon. Besonders geeignete erste (A') und zweite (B') CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenzen von (II)(a) umfassen
    • (i) (A') SEQ ID NO:12 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon und (B') SEQ ID NO:13 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon;
    • (ii) (A') SEQ ID NO:12 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon und (B') SEQ ID NO:15 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon;
    • (iii) (A') SEQ ID NO:14 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon und (B') SEQ ID NO:15 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon; und
    • (iv) (A') SEQ ID NO:18 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon und (B') SEQ ID NO:15 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon.
  • In einigen Ausführungsformen einer obengenannten Zusammensetzung, in denen die Zusammensetzung die erste Amplifikationsoligomeren-Kombination umfasst, umfasst die Zusammensetzung ferner ein CFB-spezifisches Nachweissondenoligomer, das eine CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz umfasst, die ungefähr 15 bis ungefähr 35 Nukleotide lang ist und konfiguriert ist, um zu einer Zielsequenz zu hybridisieren, die in einem CFB-Amplikon enthalten ist, das durch das erste und zweite CFB-spezifische Amplifikationsoligomer amplifizierbar ist. In einigen solchen Ausführungsformen sind die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (II)(b) und die CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz ist SEQ ID NO:24 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon; die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz sind die Zielhybridisierungssequenzen von (II)(d), und die CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz ist SEQ ID NO:25 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon; die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz sind die Zielhybridisierungssequenzen von (II)(a) und die CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz ist SEQ ID NO:22 oder SEQ ID NO:23 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon; oder die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz sind die Zielhybridisierungssequenzen von (II)(c) und die CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz ist SEQ ID NO:23 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon. In einigen Varianten umfasst das CFB-spezifische Nachweissondenoligomer ferner eine nachweisbare Markierung, wie beispielsweise eine fluoreszierende oder chemilumineszierende Markierung. In einigen Ausführungsformen, welche eine nachweisbar markierte Oligomersonde umfassen, ist die nachweisbare Markierung eine Fluoreszenzmarkierung und das CFB-spezifische Nachweissondenoligomer enthält ferner einen nicht fluoreszierenden Quencher.
  • In bestimmten Ausführungsformen einer obengenannten Zusammensetzung zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit von GBS in einer Probe enthält die Zusammensetzung sowohl die ersten als auch die zweiten Amplifikationsoligomeren-Kombinationen.
  • In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit von GBS in einer Probe bereit, wobei die Zusammensetzung eine Amplifikationsoligomeren-Kombination mit ersten und zweiten SIP-spezifischen Amplifikationsoligomeren umfasst, die in der Lage sind, einen Zielbereich einer GBS-SIP-Zielnukleinsäure zu amplifizieren. Besonders geeignete erste und zweite SIP-spezifische Amplifikationsoligomere umfassen erste (A) und zweite (B) SIP-spezifische . Zielhybridisierungssequenzen, ausgewählt aus
    1. (a) (A) SEQ ID NO:3 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B) SEQ ID NO:4 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon ; und
    2. (b) (A) SEQ ID NO:7 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B) SEQ ID NO:8 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon.
  • In einigen Varianten umfasst die Zusammensetzung ferner ein SIP-spezifisches Nachweissondenoligomer, das eine SIP-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz umfasst, die ungefähr 15 bis ungefähr 35 Nukleotide lang ist und konfiguriert ist, um mit einer Zielsequenz zu hybridisieren, die in einem SIP-Amplikon enthalten ist, das durch das erste und zweite SIP-spezifische Amplifikationsoligomer amplifizierbar ist. In einigen solchen Ausführungsformen sind die erste und die zweite SIP-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (a) und die SIP-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz ist SEQ ID NO:9 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon. In anderen Ausführungsformen sind die erste und die zweite SIP-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (b), und die SIP-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz ist SEQ ID NO:11 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon. In einigen Varianten umfasst das SIP-spezifische Nachweissondenoligomer weiter eine nachweisbare Markierung, wie beispielsweise eine fluoreszierende oder chemilumineszierende Markierung. In einigen Ausführungsformen, die ein nachweisbar markiertes Sondenoligomer umfassen, ist die nachweisbare Markierung eine fluoreszierende Markierung und das SIP-spezifische Nachweissondenoligomer umfasst ferner einen nicht fluoreszierenden Quencher. In einigen Varianten einer obengenannten Zusammensetzung, umfasst die Zusammensetzung ferner eine zweite Amplifikationsoligomeren-Kombination, die in der Lage ist, eine Zielregion einer GBS-CFB-Zielnukleinsäure zu amplifizieren.
  • In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit von GBS in einer Probe bereit, wobei die Zusammensetzung eine Amplifikationsoligomeren-Kombination umfasst, die erste und zweite CFB-spezifische Amplifikationsoligomere umfasst, die in der Lage sind, eine Zielregion einer GBS-CFB-Zielnukleinsäure zu amplifizieren. Besonders geeignete erste und zweite CFB-spezifische Amplifikationsoligomere umfassen erste (A) und zweite (B) CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenzen, ausgewählt aus
    1. (a) (A) einer Sequenz, die aus ungefähr 17 bis ungefähr 24 zusammenhängenden Nukleotiden besteht, die in der Sequenz von SEQ ID NO:26 enthalten sind, oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon, und (B) SEQ ID NO:13 oder SEQ ID NO:15 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon;
    2. (b) (A) SEQ ID NO:16 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B) SEQ ID NO:17 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon;
    3. (c) (A) SEQ ID NO:18 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B) SEQ ID NO:15 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und
    4. (d) (A) SEQ ID NO:20 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B) SEQ ID NO:21 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon.
  • In bestimmten Ausführungsformen umfasst die erste CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz von (a) mindestens die Sequenz von SEQ ID NO:28 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon. In einigen solchen Ausführungsformen ist die erste CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz von (a) in der Sequenz von SEQ ID NO:27 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon enthalten; in einigen derartigen Varianten ist die erste CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz von (a) SEQ ID NO:12 oder SEQ ID NO:14 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon. In anderen Ausführungsformen ist die erste CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz von (a) SEQ ID NO:18 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon. Besonders geeignete erste (A) und zweite (B) CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenzen von (a) umfassen
    • (i) (A) SEQ ID NO:12 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon und (B) SEQ ID NO:13 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon;
    • (ii) (A) SEQ ID NO:12 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon und (B) SEQ ID NO:15 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon;
    • (iii) (A) SEQ ID NO:14 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon und (B) SEQ ID NO:15 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon; und
    • (iv) (A) SEQ ID NO:18 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon und (B) SEQ ID NO:15 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon.
  • In einigen Varianten umfasst die Zusammensetzung ferner ein CFB-spezifisches Nachweissondenoligomer, das eine CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz umfasst, die ungefähr 15 bis ungefähr 35 Nukleotide lang ist und konfiguriert ist, um mit einer in einem CFB-Amplikon enthaltenen Zielsequenz zu hybridisieren, das durch das erste und zweite CFB-spezifische Amplifikationsoligomer amplifizierbar ist. In einigen solchen Ausführungsformen sind die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (b) und die CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz ist SEQ ID NO:24 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon; die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz sind die Zielhybridisierungssequenzen von (d) und die CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz ist SEQ ID NO:25 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon; die erste und zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz sind die Zielhybridisierungssequenzen von (a) und die CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz ist SEQ ID NO:22 oder SEQ ID NO:23 oder ein RNA-Äquivalent oder DNA/RNA-Chimäre davon; oder die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz sind die Zielhybridisierungssequenzen von (c) und die CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz ist SEQ ID NO:23 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon. In einigen Varianten umfasst das CFB-spezifische Nachweissondenoligomer ferner eine nachweisbare Markierung, wie beispielsweise eine fluoreszierende oder chemilumineszierende Markierung. In einigen Ausführungsformen, die ein nachweisbar markiertes Sondenoligomer umfassen, ist die nachweisbare Markierung eine fluoreszierende Markierung und das CFB-spezifische Nachweissondenoligomer umfasst ferner einen nicht fluoreszierenden Quencher. In einigen Varianten einer obengenannten Zusammensetzung umfasst die Zusammensetzung ferner eine zweite Amplifikationsoligomeren-Kombination, die in der Lage ist, eine Zielregion einer GBS-SIP-Zielnukleinsäure zu amplifizieren.
  • In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine wässrige Formulierung zur Amplifikation von GBS-Nukleinsäure bereit, die eine Zusammensetzung wie oben und einen organischen Puffer umfasst. In einigen Ausführungsformen umfasst die wässrige Formulierung ferner eine oder mehrere Komponenten, ausgewählt aus einem DNA-Polymeraseenzym, einem Reverse-Transkriptase-Enzym, einem Nachweissondenoligomer und einem Füllstoff (z.B. Trehalose, Raffinose oder einer Kombination davon). In einigen Ausführungsformen enthält die wässrige Formulierung anorganisches Salz in einer Konzentration von 4 mM oder weniger.
  • In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Reaktionsgemisch zur Amplifikation von GBS-Nukleinsäure bereit, das eine wässrige Formulierung wie oben umfasst.
  • In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine getrocknete Formulierung zur Amplifikation von GBS-Nukleinsäure bereit, die eine Zusammensetzung wie oben und ein Füllmittel umfasst. In einigen Ausführungsformen ist das Füllmittel Trehalose, Raffinose oder eine Kombination davon. In einigen Ausführungsform enthält die getrocknete Formulierung weiterhin eine oder mehr Komponenten ausgewählt aus einem anorganischen Salz, einem DNA-Polymerase-Enzym, einem Reverse-Transkriptase-Enzym und einem Nachweissondenoligomer. In einigen Ausführungsformen, die ferner ein anorganisches Salz umfassen, beträgt der Massenanteil des anorganischen Salzes an der Masse der getrockneten Formulierung 0,249 % oder weniger. In bestimmten Varianten ist die getrocknete Formulierung eine lyophilisierte Formulierung.
  • In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Reaktionsgemisch zur Amplifikation von GBS-Nukleinsäure bereit, wobei das Reaktionsgemisch mit Wasser oder einem organischen Puffer aus einer getrockneten Formulierung wie oben rekonstituiert wird. In einigen Ausführungsformen enthält das Reaktionsgemisch ein anorganisches Salz wie z.B. Magnesium, Kalium oder Natrium; in einigen derartigen Varianten beträgt die Konzentration des anorganischen Salzes 4 mM oder weniger.
  • In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen Kit zur Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit von GBS in einer Probe bereit. In einigen Ausführungsformen umfasst der Kit eine erste Amplifikationsoligomeren-Kombination und/oder eine zweite Amplifikationsoligomeren-Kombination, wobei
    • (I) Die erste Amplifikationsoligomeren-Kombination ein erstes und ein zweites SIP-spezifisches Amplifikationsoligomer umfasst, die in der Lage sind, eine Zielregion einer GBS-SIP-Zielnukleinsäure zu amplifizieren, wobei das erste und das zweite SIP-spezifische Amplifikationsoligomer jeweils erste (A) und zweite (B) SIP-spezifische Zielhybridisierungssequenzen umfassen, ausgewählt aus
      1. (a) (A) SEQ ID NO:3 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B) SEQ ID NO:4 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und
      2. (b) (A) SEQ ID NO:7 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B) SEQ ID NO:8 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und
    • (II) die zweite Amplifikationsoligomeren-Kombination erste und zweite CFB-spezifische Amplifikationsoligomere umfasst, die eine Zielregion einer GBS-CFB-Zielnukleinsäure amplifizieren können, wobei die ersten und zweiten CFB-spezifischen Amplifikationsoligomere jeweils erste (A') und zweite (B') CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenzen umfassen, ausgewählt aus
      • (a) (A') einer Sequenz, die aus ungefähr 17 bis ungefähr 24 zusammenhängenden Nukleotiden besteht, die in der Sequenz von SEQ ID NO:26 enthalten sind, oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon, und (B') SEQ ID NO: 13 oder SEQ ID NO: 15 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon;
      • (b) (A') SEQ ID NO: 16 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B') SEQ ID NO: 17 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon;
      • (c) (A') SEQ ID NO: 18 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B') SEQ ID NO: 15 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und
      • (d) (A') SEQ ID NO:20 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B') SEQ ID NO:21 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon.
  • In einigen Ausführungsformen eines obigen Kits, wobei der Kit die erste Amplifikationsoligomeren-Kombination umfasst, umfasst der Kit weiterhin ein SIP-spezifisches Nachweissondenoligmer mit einer SIP-spezifischen Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz, die ungefähr 15 bis ungefähr 35 Nukleotide lang ist und konfiguriert ist, um mit einer Zielsequenz zu hybridisieren, die in einem SIP-Amplikon enthalten ist, das durch das erste und zweite SIP-spezifische Amplifikationsoligomer amplifizierbar ist. In einigen solchen Ausführungsformen sind die erste und die zweite SIP-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (I)(a) und die SIP-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz ist SEQ ID NO:9 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon. In anderen Ausführungsformen sind die erste und die zweite SIP-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (I)(b) und die SIP-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz ist SEQ ID NO:11 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon. In einigen Varianten umfasst das SIP-spezifische Nachweissondenoligomer ferner eine nachweisbare Markierung, wie beispielsweise eine fluoreszierende oder chemilumineszierende Markierung. In einigen Ausführungsformen, die ein nachweisbar markiertes Sondenoligomer umfassen, ist die nachweisbare Markierung eine fluoreszierende Markierung und das SIP-spezifische Nachweissondenoligomer umfasst ferner einen nicht fluoreszierenden Quencher.
  • In einigen Ausführungsformen eines obigen Kits, in denen die CFB-spezifischen Zielhybridisierungssequenzen die Zielhybridisierungssequenzen von (II)(a) sind, umfasst die erste CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz von (II)(a) mindestens die Sequenz von SEQ ID NO:28 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon. In einigen solchen Ausführungsformen ist die erste CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz von (II)(a) in der Sequenz von SEQ ID NO:27 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon enthalten; in einigen derartigen Varianten ist die erste CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz von (II)(a) SEQ ID NO:12 oder SEQ ID NO:14 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon. In anderen Ausführungsformen, in denen die CFB-spezifischen Zielhybridisierungssequenzen die Zielhybridisierungssequenzen von (II)(a) sind, ist die erste CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz von (II)(a) SEQ ID NO:18 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon. Besonders geeignete erste (A') und zweite (B') CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenzen von (II)(a) umfassen
    • (i) (A') SEQ ID NO:12 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon und (B') SEQ ID NO:13 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon;
    • (ii) (A') SEQ ID NO:12 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon und (B') SEQ ID NO:15 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon;
    • (iii) (A') SEQ ID NO:14 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon und (B') SEQ ID NO:15 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon; und
    • (iv) (A') SEQ ID NO:18 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon und (B') SEQ ID NO:15 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon.
  • In einigen Ausführungsformen eines obigen Kits, in denen der Kit die erste Amplifikationsoligomeren-Kombination umfasst, umfasst der Kit ferner ein CFB-spezifisches Nachweissondenoligomer, das eine CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz umfasst, die ungefähr 15 bis ungefähr 35 Nukleotide lang ist und so konfiguriert ist, um mit einer Zielsequenz zu hybridisieren, die in einem CFB-Amplikon enthalten ist, das durch das erste und zweite CFB-spezifische Amplifikationsoligomer amplifizierbar ist. In einigen solchen Ausführungsformen sind die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (II)(b) und die CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz ist SEQ ID NO:24 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon; die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz sind die Zielhybridisierungssequenzen von (II)(d), und die CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz ist SEQ ID NO:25 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon; die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz sind die Zielhybridisierungssequenzen von (II)(a) und die CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz ist SEQ ID NO:22 oder SEQ ID NO:23 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon; oder die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz sind die Zielhybridisierungssequenzen von (II)(c) und die CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz ist SEQ ID NO:23 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon. In einigen Varianten umfasst das CFB-spezifische Nachweissondenoligomer ferner eine nachweisbare Markierung, wie beispielsweise eine fluoreszierende oder chemilumineszierende Markierung. In einigen Ausführungsformen mit einem nachweisbar markierten Sondenoligomer, ist die nachweisbare Markierung eine Fluoreszenzmarkierung und das CFB-spezifische Nachweissondenoligomer enthält ferner einen nicht fluoreszierenden Quencher.
  • In bestimmten Ausführungsformen eines Kits zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit von GBS in einer Probe, wie oben beschrieben, umfasst der Kit sowohl die erste als auch die zweite Amplifikationsoligomeren-Kombinationen.
  • In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen Kit zur Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit von GBS in einer Probe bereit, wobei der Kit eine Amplifikationsoligomeren-Kombination umfasst, die ein erstes und ein zweites SIP-spezifisches Amplifikationsoligomer umfasst, die in der Lage sind, eine Zielregion einer GBS-SIP-Zielnukleinsäure zu amplifizieren. Besonders geeignete erste und zweite SIP-spezifische Amplifikationsoligomere umfassen erste (A) und zweite (B) SIP-spezifische Zielhybridisierungssequenzen, ausgewählt aus
    1. (a) (A) SEQ ID NO:3 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B) SEQ ID NO:4 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und
    2. (b) (A) SEQ ID NO:7 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B) SEQ ID NO:8 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon.
  • In einigen Varianten umfasst der Kit ferner ein SIP-spezifisches Nachweissondenoligomer, das eine SIP-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz umfasst, die ungefähr 15 bis ungefähr 35 Nukleotide lang ist und konfiguriert ist, um mit einer Zielsequenz zu hybridisieren, die in einem SIP-Amplikon enthalten ist, das durch das erste und zweite SIP-spezifische Amplifikationsoligomer amplifizierbar ist. In einigen solchen Ausführungsformen sind die erste und die zweite SIP-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (a) und die SIP-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz ist SEQ ID NO:9 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon. In anderen Ausführungsformen sind die erste und die zweite SIP-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (b), und die SIP-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz ist SEQ ID NO:11 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon. In einigen Varianten umfasst das SIP-spezifische Nachweissondenoligomer ferner eine nachweisbare Markierung, wie beispielsweise eine fluoreszierende oder chemilumineszierende Markierung. In einigen Ausführungsformen, die ein nachweisbar markiertes Sondenoligomer umfassen, ist die nachweisbare Markierung eine fluoreszierende Markierung und das SIP-spezifische Nachweissondenoligomer umfasst ferner einen nicht fluoreszierenden Quencher. In einigen Varianten eines obigen Kits, umfasst der Kit ferner eine zweite Amplifikationsoligomeren-Kombination, die in der Lage ist, eine Zielregion einer GBS-CFB-Zielnukleinsäure zu amplifizieren.
  • In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen Kit zur Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit von GBS in einer Probe bereit, wobei der Kit eine Amplifikationsoligomeren-Kombination umfasst, die ein erstes und ein zweites CFB-spezifisches Amplifikationsoligomer umfasst, die in der Lage sind, eine Zielregion einer GBS-CFB-Zielnukleinsäure zu amplifizieren. Besonders geeignete erste und zweite CFB-spezifische Amplifikationsoligomere umfassen erste (A) und zweite (B) CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenzen, ausgewählt aus
    1. (a) (A) einer Sequenz, die aus ungefähr 17 bis ungefähr 24 zusammenhängenden Nukleotiden besteht, die in der Sequenz von SEQ ID NO:26 enthalten sind, oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon, und (B) SEQ ID NO:13 oder SEQ ID NO:15 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon;
    2. (b) (A) SEQ ID NO:16 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B) SEQ ID NO:17 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon;
    3. (c) (A) SEQ ID NO:18 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B) SEQ ID NO:15 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und
    4. (d) (A) SEQ ID NO:20 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B) SEQ ID NO:21 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon.
  • In bestimmten Ausführungsformen umfasst die erste CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz von (a) mindestens die Sequenz von SEQ ID NO:28 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon. In einigen solchen Ausführungsformen ist die erste CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz von (a) in der Sequenz von SEQ ID NO:27 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon enthalten; in einigen derartigen Varianten ist die erste CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz von (a) SEQ ID NO:12 oder SEQ ID NO:14 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon. In anderen Ausführungsformen ist die erste CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz von (a) SEQ ID NO:18 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon. Besonders geeignete erste (A) und zweite (B) CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenzen von (a) umfassen
    • (i) (A) SEQ ID NO:12 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon und (B) SEQ ID NO:13 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon;
    • (ii) (A) SEQ ID NO:12 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon und (B) SEQ ID NO:15 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon;
    • (iii) (A) SEQ ID NO:14 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon und (B) SEQ ID NO:15 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon; und
    • (iv) (A) SEQ ID NO:18 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon und (B) SEQ ID NO:15 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon.
  • In einigen Varianten umfasst der Kit ferner ein CFB-spezifisches Nachweissondenoligomer, das eine CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz umfasst, die ungefähr 15 bis ungefähr 35 Nukleotide lang ist und konfiguriert ist, um mit einer Zielsequenz zu hybridisieren, die in einem CFB-Amplikon enthalten ist, das durch das erste und zweite CFB-spezifische Amplifikationsoligomer amplifizierbar ist. In einigen solchen Ausführungsformen sind die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (b) und die CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz ist SEQ ID NO:24 oder ein RNA-Äquivalent oder DNA/RNA-Chimäre davon; die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz sind die Zielhybridisierungssequenzen von (d) und die CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz ist SEQ ID NO:25 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon; die erste und zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz sind die Zielhybridisierungssequenzen von (a) und die CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz ist SEQ ID NO:22 oder SEQ ID NO:23 oder ein RNA-Äquivalent oder DNA/RNA-Chimäre davon; oder die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz sind die Zielhybridisierungssequenzen von (c) und die CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz ist SEQ ID NO:23 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon. In einigen Varianten umfasst das CFB-spezifische Nachweissondenoligomer ferner eine nachweisbare Markierung, wie beispielsweise eine fluoreszierende oder chemilumineszierende Markierung. In einigen Ausführungsformen, die ein nachweisbar markiertes Sondenoligomer umfassen, ist die nachweisbare Markierung eine fluoreszierende Markierung und das CFB-spezifische Nachweissondenoligomer umfasst ferner einen nicht fluoreszierenden Quencher. In einigen Varianten eines obigen Kits, enthält der Kit weiterhin eine zweite Amplifikationsoligomer-Kombination, die in der Lage ist, eine Zielregion einer GBS-SIP-Zielnukleinsäure zu amplifizieren.
  • In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit von GBS in einer Probe bereit. In einigen Ausführungsformen umfasst das Verfahren
    • (1) Inkontaktbringen einer Probe, von der vermutet wird, dass sie GBS enthält, mit einer ersten Amplifikationsoligomeren-Kombination und/oder einer zweiten Amplifikationsoligomeren-Kombination, wobei
      • (I) die erste Amplifikationsoligomeren-Kombination erste und zweite SIP-spezifische Amplifikationsoligomere zum Amplifizieren einer Zielregion einer GBS-SIP-Zielnukleinsäure umfasst, wobei die ersten und zweiten SIP-spezifischen Amplifikationsoligomere jeweils erste (A) und zweite (B) SIP-spezifische Zielhybridisierungssequenzen umfassen, ausgewählt aus
        • (a) (A) SEQ ID NO:3 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B) SEQ ID NO:4 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und
        • (b) (A) SEQ ID NO:7 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B) SEQ ID NO:8 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und
      • (II) die zweite Amplifikationsoligomeren-Kombination umfasst ein erstes und ein zweites CFB-spezifisches Amplifikationsoligomer zur Amplifikation einer Zielregion einer GBS-CFB-Zielnukleinsäure, wobei das erste und das zweite CFB-spezifische Amplifikationsoligomer jeweils erste (A') und zweite (B') CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenzen umfassen, ausgewählt aus
        • (a) (A') einer Sequenz, die aus ungefähr 17 bis ungefähr 24 zusammenhängenden Nukleotiden besteht, die in der Sequenz von SEQ ID NO:26 enthalten sind, oder in einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon, und (B') SEQ ID NO: 13 oder SEQ ID NO: 15 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon;
        • (b) (A') SEQ ID NO: 16 oder einem RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon und (B') SEQ ID NO: 17 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon;
        • (c) (A') SEQ ID NO: 18 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B') SEQ ID NO: 15 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und
        • (d) (A') SEQ ID NO:20 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B') SEQ ID NO:21 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon;
    • (2) Durchführen einer Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion in vitro, wobei eine beliebige GBS-SIP- und/oder CFB-Zielnukleinsäure, falls in der Probe vorhanden, als Matrize zum Erzeugen eines oder mehrerer Amplikons verwendet wird, die mindestens einer der SIP- und CFB-Zielregionen entsprechen; und
    • (3) Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit des einen oder der mehreren Amplikons, wodurch die Anwesenheit oder Abwesenheit von GBS in der Probe bestimmt wird.
  • In einigen Ausführungsformen eines obigen Verfahrens umfasst das Verfahren das Inkontaktbringen der Probe mit sowohl der ersten als auch der zweiten Amplifikationsoligomeren-Kombination. In einigen solchen Ausführungsformen ist das Verfahren ein Multiplexverfahren, umfassend das Inkontaktbringen der Probe mit sowohl der ersten als auch der zweiten Amplifikationsoligomeren-Kombination innerhalb des gleichen Reaktionsgemisches.
  • In einigen Ausführungsformen eines obigen Verfahrens, in dem das Verfahren das Inkontaktbringen der Probe mit der ersten Amplifikationsoligomeren-Kombination umfasst, umfasst der Nachweisschritt das Inkontaktbringen der Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion in vitro mit einem SIP-spezifischen Nachweissondenoligmer, welches eine SIP-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz umfasst, die ungefähr 15 bis ungefähr 35 Nukleotide lang ist und so konfiguriert ist, um mit einer Zielsequenz zu hybridisieren, die in einem SIP-Amplikon enthalten ist, das durch das erste und zweite SIP-spezifische Amplifikationsoligomer amplifizierbar ist. In einigen solchen Ausführungsformen sind die erste und die zweite SIP-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (I)(a) und die SIP-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz ist SEQ ID NO:9 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon. In anderen Ausführungsformen sind die erste und die zweite SIP-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (I)(b) und die SIP-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz ist SEQ ID NO:11 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon. In einigen Varianten umfasst das SIP-spezifische Nachweissondenoligomer ferner eine nachweisbare Markierung, wie beispielsweise eine fluoreszierende oder chemilumineszierende Markierung. In einigen Ausführungsformen, die ein nachweisbar markiertes Sondenoligomer umfassen, ist die nachweisbare Markierung eine fluoreszierende Markierung und das SIP-spezifische Nachweissondenoligomer umfasst ferner einen nicht fluoreszierenden Quencher.
  • In einigen Ausführungsformen eines obigen Verfahrens, in denen die CFB-spezifischen Zielhybridisierungssequenzen die Zielhybridisierungssequenzen von (II)(a) sind, umfasst die erste CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz von (II)(a) mindestens die Sequenz von SEQ ID NO:28 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon. In einigen solchen Ausführungsformen ist die erste CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz von (II)(a) in der Sequenz von SEQ ID NO:27 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon enthalten; in einigen derartigen Varianten ist die erste CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz von (II)(a) SEQ ID NO: 12 oder SEQ ID NO: 14 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon. In anderen Ausführungsformen, in denen die CFB-spezifischen Zielhybridisierungssequenzen die Zielhybridisierungssequenzen von (II)(a) sind, ist die erste CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz von (II)(a) SEQ ID NO: 18 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon. Besonders geeignete erste (A') und zweite (B') CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenzen von (II)(a) umfassen
    • (i) (A') SEQ ID NO:12 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon und (B') SEQ ID NO:13 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon;
    • (ii) (A') SEQ ID NO:12 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon und (B') SEQ ID NO:15 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon;
    • (iii) (A') SEQ ID NO:14 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon und (B') SEQ ID NO:15 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon; und
    • (iv) (A') SEQ ID NO:18 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon und (B') SEQ ID NO:15 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon.
  • In einigen Ausführungsformen eines obigen Verfahrens, bei denen das Verfahren das Inkontaktbringen der Probe mit der zweiten Amplifikationsoligomeren-Kombination umfasst, umfasst der Nachweisschritt das Inkontaktbringen der Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion in vitro mit einem CFB-spezifischen Nachweissondenoligomer, das eine CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz umfasst, die ungefähr 15 bis ungefähr 35 Nukleotide lang ist und so konfiguriert ist, um mit einer Zielsequenz zu hybridisieren, die in einem CFB-Amplikon enthalten ist, das durch das erste und zweite CFB-spezifische Amplifikationsoligomer amplifizierbar ist. In einigen solchen Ausführungsformen sind die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (II)(b) und die CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz ist SEQ ID NO:24 oder ein RNA-Äquivalent oder DNA/RNA-Chimäre davon; die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz sind die Zielhybridisierungssequenzen von (II)(d), und die CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz ist SEQ ID NO:25 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon; die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz sind die Zielhybridisierungssequenzen von (II)(a) und die CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz ist SEQ ID NO:22 oder SEQ ID NO:23 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon; oder die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz sind die Zielhybridisierungssequenzen von (II)(c) und die CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz ist SEQ ID NO:23 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon. In einigen Varianten umfasst das CFB-spezifische Nachweissondenoligomer ferner eine nachweisbare Markierung, wie beispielsweise eine fluoreszierende oder chemilumineszierende Markierung. In einigen Ausführungsformen, die ein nachweisbar markiertes Sondenoligomer umfassen, ist die nachweisbare Markierung eine fluoreszierende Markierung und das CFB-spezifische Nachweissondenoligomer umfasst ferner einen nicht fluoreszierenden Quencher.
  • In gewissen Varianten eines obigen Verfahrens zur Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit von GBS in einer Probe wird der Nachweisschritt in Echtzeit durchgeführt.
  • In bestimmten Varianten eines obigen Verfahrens zur Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit von GBS in einer Probe ist die Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion in-vitro eine PCR-Amplifikationsreaktion (z.B. eine Echtzeit-PCR-Amplifikationsreaktion).
  • In einigen Ausführungsformen eines obigen Verfahrens, in dem das Verfahren das Inkontaktbringen der Probe sowohl mit der ersten als auch mit der zweiten Amplifikationsoligomeren-Kombination (z.B. ein Multiplexverfahren) umfasst, umfasst der Nachweisschritt das Inkontaktbringen der Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion in vitro mit (i) einem SIP-spezifischen Nachweissondenoligomer, umfassend eine SIP-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz, die ungefähr 15 bis ungefähr 35 Nukleotide lang ist und so konfiguriert ist, um mit einer Zielsequenz zu hybridisieren, die in einem durch das erste und zweite SIP-spezifische Amplifikationsoligomer amplifizierbaren SIP-Amplikon enthalten ist, und (ii) ein CFB-spezifisches Nachweissondenoligomer, umfassend eine CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz, die ungefähr 15 bis ungefähr 35 Nukleotiden lang ist und konfiguriert ist, um mit einer Zielsequenz zu hybridisieren, die in einem CFB-Amplikon enthalten ist, das durch das erste und zweite CFB-spezifische Amplifikationsoligomer amplifizierbar ist, wobei sowohl das SIP-spezifische als auch das CFB-spezifische Nachweissondenoligomer eine fluoreszierende Markierung und einen nicht fluoreszierenden Quencher umfassen. In einigen solchen Ausführungsformen ist die Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion in vitro eine Echtzeit-PCR-Amplifikationsreaktion.
  • In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit von GBS in einer Probe bereit, wobei das Verfahren umfasst
    • (1) Inkontaktbringen einer Probe, von der vermutet wird, dass sie GBS enthält, mit einer Amplifikationsoligomeren-Kombination, die ein erstes und ein zweites SIP-spezifisches Amplifikationsoligomer umfasst, zur Amplifikation einer Zielregion einer GBS-SIP-Zielnukleinsäure, wobei das erste und das zweite SIP-spezifische Amplifikationsoligomer jeweils erste (A) und zweite (B) SIP-spezifische Zielhybridisierungssequenzen umfassen, ausgewählt aus
      1. (a) (A) SEQ ID NO:3 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B) SEQ ID NO:4 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und
      2. (b) (A) SEQ ID NO:7 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B) SEQ ID NO:8, oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon;
    • (2) Durchführen einer Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion in vitro, wobei eine beliebige GBS-SIP-Zielnukleinsäure, falls in der Probe vorhanden, als Matrize zum Erzeugen eines Amplikons verwendet wird, das der SIP-Zielregion entspricht; und
    • (3) Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit des Amplikons, wodurch die Anwesenheit oder Abwesenheit von GBS in der Probe nachgewiesen wird.
  • In einigen Varianten umfasst der Nachweisschritt das Inkontaktbringen der Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion in-vitro mit einem SIP-spezifischen Nachweissondenoligomer, das eine SIP-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz umfasst, die ungefähr 15 bis ungefähr 35 Nukleotide lang ist und konfiguriert ist, um mit einer Zielsequenz zu hybridisieren, die innerhalb eines SIP-Amplikons enthalten ist, welches durch das erste und zweite SIP-spezifische Amplifikationsoligomer amplifizierbar ist. In einigen solchen Ausführungsformen sind die erste und die zweite SIP-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (a) und die SIP-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz ist SEQ ID NO:9 oder ein RNA-Äquivalent oder DNA/RNA-Chimäre davon. In anderen Ausführungsformen sind die erste und die zweite SIP-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (b), und die SIP-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz ist SEQ ID NO:11 oder ein RNA-Äquivalent oder DNA/RNA-Chimäre davon. In einigen Varianten umfasst das SIP-spezifische Nachweissondenoligomer ferner eine detektierbare Markierung, wie beispielsweise eine fluoreszierende oder chemilumineszierende Markierung. In einigen Ausführungsformen, die ein nachweisbar markiertes Sondenoligomer umfassen, ist die nachweisbare Markierung eine fluoreszierende Markierung und das SIP-spezifische Nachweissondenoligomer umfasst ferner einen nicht fluoreszierenden Quencher. In bestimmten Varianten wird der Nachweisschritt in Echtzeit ausgeführt. In bestimmten Varianten ist die Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion in vitro eine PCR-Amplifikationsreaktion (z.B. eine Echtzeit-PCR-Amplifikationsreaktion). In einigen Ausführungsformen umfasst das Verfahren ferner das Inkontaktbringen der Probe mit einer zweiten Amplifikationsoligomeren-Kombination, die ein erstes und ein zweites CFB-spezifisches Amplifikationsoligomer zum Amplifizieren einer Zielregion einer GBS-CFB-Zielnukleinsäure umfasst, wobei bei dem Amplifikationsschritt irgendeine GBS-CFB-Zielnukleinsäure, falls in der Probe vorhanden, als Matrize zum Erzeugen eines Amplikons verwendet wird, das der CFB-Zielregion entspricht, und wobei der Nachweisschritt den Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit des Amplikons umfasst, das der CFB-Zielregion entspricht.
  • In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit von GBS in einer Probe bereit, wobei das Verfahren umfasst
    • (1) Inkontaktbringen einer Probe, die vermutlich GBS enthält, mit einer Amplifikationsoligomeren-Kombination mit ersten und zweiten CFB-spezifischen Amplifikationsoligomeren zur Amplifikation einer Zielregion einer GBS-CFB - Zielnukleinsäure, wobei die ersten und zweiten CFB-spezifischen Amplifikationsoligomere jeweils erste (A) und zweite (B) CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenzen umfassen, ausgewählt aus
      1. (a) (A) einer Sequenz, die aus ungefähr 17 bis ungefähr 24 zusammenhängenden Nukleotiden besteht, die in der Sequenz von SEQ ID NO:26 enthalten sind, oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B) SEQ ID NO:13 oder SEQ ID NO:15 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon;
      2. (b) (A) SEQ ID NO:16 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B) SEQ ID NO:17 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon;
      3. (c) (A) SEQ ID NO:18 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B) SEQ ID NO:15 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und
      4. (d) (A) SEQ ID NO:20 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B) SEQ ID NO:21 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon;
    • (2) Durchführen einer Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion in vitro, wobei eine beliebige GBS-CFB-Zielnukleinsäure, falls in der Probe vorhanden, als Matrize zur Erzeugung eines Amplikons verwendet wird, das der CFB-Zielregion entspricht; und
    • (3) Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit des Amplikons, wodurch die Anwesenheit oder Abwesenheit von GBS in der Probe bestimmt wird.
  • In bestimmten Ausführungsformen umfasst die erste CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz von (a) mindestens die Sequenz von SEQ ID NO:28 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon. In einigen solchen Ausführungsformen ist die erste CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz von (a) in der Sequenz von SEQ ID NO:27 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon enthalten; in einigen derartigen Varianten ist die erste CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz von (a) SEQ ID NO:12 oder SEQ ID NO:14 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon. In anderen Ausführungsformen ist die erste CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz von (a) SEQ ID NO:18 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon. Besonders geeignete erste (A) und zweite (B) CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenzen von (a) umfassen
    • (i) (A) SEQ ID NO:12 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon und (B) SEQ ID NO:13 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon;
    • (ii) (A) SEQ ID NO:12 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon und (B) SEQ ID NO:15 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon;
    • (iii) (A) SEQ ID NO:14 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon und (B) SEQ ID NO:15 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon; und
    • (iv) (A) SEQ ID NO:18 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon und (B) SEQ ID NO:15 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon.
  • In einigen Varianten umfasst der Nachweisschritt das Inkontaktbringen der Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion in-vitro mit einer CFB-spezifischen Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz, die ungefähr 15 bis ungefähr 35 Nukleotide lang ist und konfiguriert ist, um mit einer Zielsequenz zu hybridisieren, die in einem CFB-Amplikon enthalten ist, das durch das erste und zweite CFB-spezifische Amplifikationsoligomer amplifizierbar ist. In einigen solchen Ausführungsformen sind die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (b) und die CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz ist SEQ ID NO:24 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon; die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz sind die Zielhybridisierungssequenzen von (d) und die CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz ist SEQ ID NO:25 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon; die erste und zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz sind die Zielhybridisierungssequenzen von (a) und die CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz ist SEQ ID NO:22 oder SEQ ID NO:23 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon; oder die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz sind die Zielhybridisierungssequenzen von (c) und die CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz ist SEQ ID NO:23 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon. In einigen Varianten umfasst das CFB-spezifische Nachweissondenoligomer ferner eine nachweisbare Markierung, wie beispielsweise eine fluoreszierende oder chemilumineszierende Markierung. In einigen Ausführungsformen, die ein nachweisbar markiertes Sondenoligomer umfassen, ist die nachweisbare Markierung eine fluoreszierende Markierung und das CFB-spezifische Nachweissondenoligomer umfasst ferner einen nicht fluoreszierenden Quencher. In bestimmten Varianten wird der Nachweisschritt in Echtzeit ausgeführt. In bestimmten Varianten ist die Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion in vitro eine PCR-Amplifikationsreaktion (z B. eine Echtzeit-PCR-Amplifikationsreaktion). In einigen Ausführungsformen umfasst das Verfahren ferner das Inkontaktbringen der Probe mit einer zweiten Amplifikationsoligomeren-Kombination, die ein erstes und ein zweites SIP-spezifisches Amplifikationsoligomer zum Amplifizieren einer Zielregion einer GBS-SIP-Zielnukleinsäure umfasst, wobei bei dem Amplifikationsschritt eine beliebige GBS-SIP-Zielnukleinsäure, falls in der Probe vorhanden, als Matrize zum Erzeugen eines Amplikons verwendet wird, das der SIP-Zielregion entspricht, und wobei der Nachweisschritt den Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit des Amplikons umfasst, das der SIP-Zielregion entspricht.
  • In einigen Ausführungsformen eines obigen Verfahrens zum Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit von GBS in einer Probe bestimmt das Verfahren die Anwesenheit oder Abwesenheit eines der GBS-Serotypen Ia, Ib, Ic, II, III, IV, V, VI, VII, VIII und IX. In einigen solchen Ausführungsformen bestimmt das Verfahren ferner die Anwesenheit oder Abwesenheit eines nicht hämolytischen Stammes von GBS.
  • In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Nachweissondenoligomer bereit. In einigen Ausführungsformen ist das Nachweissondenoligomer ein SIP-spezifisches Nachweissondenoligomer, das eine SIP-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz umfasst, die ungefähr 15 bis ungefähr 35 Nukleotide lang ist und konfiguriert ist, um mit einer Zielsequenz zu hybridisieren, die in einem SIP-Amplikon enthalten ist, welches durch eine erste Amplifikationsoligomeren-Kombination amplifizierbar ist und erste und zweite SIP-spezifische Amplifikationsoligomere umfasst, die dazu in der Lage sind, eine Zielregion einer GBS-SIP Zielnukleinsäure zu amplifizieren, wobei die ersten und zweiten SIP-spezifischen Amplifikationsoligomere jeweils erste (A) und zweite (B) SIP-spezifische Zielhybridisierungssequenzen umfassen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
    1. (a) (A) SEQ ID NO:3 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B) SEQ ID NO:4 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und
    2. (b) (A) SEQ ID NO:7 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B) SEQ ID NO:8 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon.
  • In einigen Ausführungsformen eines SIP-spezifischen Nachweissondenoligomers, wie oben, wird die SIP-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz ausgewählt aus (a) SEQ ID NO:9 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (b) SEQ ID NO:11 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon. In einigen Varianten umfasst das SIP-spezifische Nachweissondenoligomer ferner eine nachweisbare Markierung, wie beispielsweise eine fluoreszierende oder chemilumineszierende Markierung. In einigen Ausführungsformen, die ein nachweisbar markiertes Sondenoligomer umfassen, ist die nachweisbare Markierung eine fluoreszierende Markierung und das SIP-spezifische Nachweissondenoligomer umfasst ferner einen nicht fluoreszierenden Quencher.
  • In anderen Ausführungsformen ist das Nachweissondenoligomer ein CFB-spezifisches Nachweissondenoligomer, das eine CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz umfasst, die ungefähr 15 bis ungefähr 35 Nukleotide lang ist und konfiguriert ist, um mit einer Zielsequenz zu hybridisieren, die in einem CFB-Amplikon enthalten ist, welches durch eine zweite Amplifikationsoligomeren-Kombination amplifizierbar ist und erste und zweite CFB-spezifische Amplifikationsoligomere umfasst, die dazu in der Lage sind, eine Zielregion einer GBS-CFB-Zielnukleinsäure zu amplifizieren, wobei die ersten und zweiten CFB-spezifischen Amplifikationsoligomere jeweils erste (A') und zweite (B') CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenzen umfassen, die ausgewählt sind, aus
    1. (a) (A') einer Sequenz, die aus ungefähr 17 bis ungefähr 24 zusammenhängenden Nukleotiden besteht, die in der Sequenz von SEQ ID NO:26 enthalten sind, oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon, und (B') SEQ ID NO:13 oder SEQ ID NO:15 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon;
    2. (b) (A') SEQ ID NO:16 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B') SEQ ID NO:17 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon;
    3. (c) (A') SEQ ID NO:18 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon und (B') SEQ ID NO:15 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon; und
    4. (d) (A') SEQ ID NO:20 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon und (B') SEQ ID NO:21 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon.
  • In einigen Ausführungsformen eines CFB-spezifischen obigen Nachweissondenoligomers wird die CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz ausgewählt aus (a) SEQ ID NO:24 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon, (b) SEQ ID NO:25 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon, (c) SEQ ID NO:22 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon, und (d) SEQ ID NO:23 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon. In einigen Varianten umfasst das CFB-spezifische Nachweissondenoligomer ferner eine nachweisbare Markierung, wie beispielsweise eine fluoreszierende oder chemilumineszierende Markierung. In einigen Ausführungsformen, die ein nachweisbar markiertes Sondenoligomer umfassen, ist die nachweisbare Markierung eine fluoreszierende Markierung und das CFB-spezifische Nachweissondenoligomer umfasst ferner einen nicht fluoreszierenden Quencher.
  • In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung bereit, die ein SIP-spezifisches Nachweissondenoligomer und ein CFB-spezifisches Nachweissondenoligomer, wie oben, umfasst.
  • In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine wässrige Formulierung zum Nachweis von GBS-Nukleinsäure, umfassend (1) ein SIP-spezifisches Nachweissondenoligomer und/oder ein CFB-spezifisches Nachweissondenoligomer, wie oben, und (2) einen organischen Puffer bereit. In einigen Ausführungsformen enthält die wässrige Formulierung weiterhin eine oder mehrere Komponenten ausgewählt aus einem Tensid (z.B. Polyethylenglycolmono[4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)phenyl]ether, Polysorbat 20, oder eine Kombination davon), einem DNA-Polymeraseenzym, einem Reverse-Transkriptase-Enzym, mindestens einem Amplifikationsoligomer und einem Füllmittel (z.B. Trehalose, Raffinose oder eine Kombination davon). In bestimmten Varianten, die ein Tensid umfassen, ist das Tensid ein nicht lineares Tensid, wie beispielsweise Polysorbat 20. In einigen Ausführungsformen enthält die wässrige Formulierung anorganisches Salz in einer Konzentration von 4 mM oder weniger. In einem verwandten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Reaktionsgemisch zum Nachweis von GBS bereit, umfassend eine wässrige Formulierung, wie oben.
  • In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine getrocknete Formulierung zum Nachweis von GBS-Nukleinsäure bereit, umfassend (1) ein SIP-spezifisches Nachweissondenoligomer und/oder ein CFB-spezifisches Nachweissondenoligomer, wie oben, und (2) ein Füllmittel. In einigen Ausführungsformen ist das Füllmittel Trehalose, Raffinose oder eine Kombination davon. In einigen Ausführungsformen umfasst die getrocknete Formulierung ferner eine oder mehrere Komponenten, ausgewählt aus einem anorganischen Salz, einem DNA-Polymeraseenzym, einem Reverse-Transkriptase-Enzym, mindestens einem Amplifikationsoligomer und einem Tensid (z.B. Polyethylenglykolmono[4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl]ether, Polysorbat 20 oder eine Kombination davon). In einigen Ausführungsformen, die ferner ein anorganisches Salz umfassen, beträgt der Massenanteil des anorganischen Salzes an der Masse der getrockneten Formulierung 0,249 % oder weniger. In bestimmten Varianten, die ein Tensid umfassen, ist das Tensid ein nicht lineares Tensid, wie beispielsweise Polysorbat 20. In bestimmten Varianten ist die getrocknete Formulierung eine lyophilisierte Formulierung. In einem verwandten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Reaktionsgemisch zum Nachweis von GBS bereit, wobei das Reaktionsgemisch mit Wasser und einem organischen Puffer aus einer getrockneten Formulierung, wie oben, rekonstituiert wird. In einigen Ausführungsformen enthält das Reaktionsgemisch ein anorganisches Salz wie z.B. Magnesium, Kalium oder Natrium; in einigen derartigen Varianten beträgt die Konzentration des anorganischen Salzes 4 mM oder weniger.
  • Diese und andere Aspekte der Erfindung werden unter Bezugnahme auf die folgende detaillierte Beschreibung der Erfindung und die beigefügten Zeichnungen ersichtlich.
  • DEFINITIONEN
  • Sofern nicht anders definiert, haben alle hierin verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe die gleiche Bedeutung, wie sie üblicherweise von einem Fachmann auf dem Gebiet der beschriebenen Verfahren und Zusammensetzungen verstanden werden. Allgemeine Definitionen können in Fachbüchern gefunden werden, die für die Technik der Molekularbiologie relevant sind, z.B. Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2. Aufl. (Singleton et al., 1994, John Wiley & Sons, New York, NY) oder The Harper Collins Dictionary of Biology (Hale & Marham, 1991, Harper Perennial, New York, NY). Wie hierin verwendet, haben die folgenden Begriffe und Ausdrücke die ihnen zugeschriebenen Bedeutungen, sofern nicht anders angegeben.
  • Die Ausdrücke „ein“, „einer“ und „das“ umfassen mehrfache Verweise, sofern der Kontext nicht eindeutig etwas anderes angibt. Beispielsweise wird hierin „eine Nukleinsäure“, wie hier verwendet, als eine oder mehrere Nukleinsäure(n) darstellend verstanden. Als solche können die Ausdrücke „ein“ (oder „eine“), „einer oder mehrere“ und „mindestens einer“ hierin austauschbar verwendet werden.
  • Es sei darauf hingewiesen, dass der Begriff „ungefähr“ vor Temperaturen, Konzentrationen, Zeiten, usw., die in der vorliegenden Offenbarung diskutiert werden, implizit ist, so dass leichte und unwesentliche Abweichungen hierin innerhalb des Schutzbereichs der vorliegenden Lehre liegen. Im Allgemeinen bezeichnet der Begriff „ungefähr“ eine unwesentliche Änderung in einer Menge von einer Komponente einer Zusammensetzung, welche keine signifikante Wirkung auf die Aktivität oder Stabilität der Zusammensetzung hat. Alle Wertbereiche sind so zu interpretieren, dass sie die Endpunkte einschließen, sofern keine ausdrücklichen Ausschlüsse vorliegen, wie z.B. „nicht die Endpunkte einschließend“; daher umfasst z.B. der Begriff „innerhalb von 10-15“ die Werte 10 und 15. Die Verwendung von „umfassen“, „umfasst“, „umfassend“, „enthalten“, „enthält“, „enthaltend“, „einschließen“, „einschließt“ und „einschließend“ soll auch nicht einschränkend sein. Es versteht sich, dass sowohl die vorstehende allgemeine Beschreibung als auch die detaillierte Beschreibung nur beispielhaft und erläuternd sind und die Lehre nicht einschränken. Soweit durch Bezugnahme aufgenommenes Material nicht mit dem ausdrücklichen Inhalt dieser Offenbarung vereinbar ist, ist der ausdrückliche Inhalt maßgebend.
  • Sofern nicht spezifisch angegeben, werden Ausführungsformen in der Beschreibung, die verschiedene Komponenten „umfassen“, auch als „bestehend aus“ oder „im Wesentlichen bestehend aus“ den genannten Komponenten betrachtet; Ausführungsformen in der Beschreibung, die „bestehend aus“ verschiedenen Komponenten rezitieren, werden auch als „umfassend“ oder „im Wesentlichen bestehend aus“ den rezitierten Komponenten betrachtet; und Ausführungsformen in der Beschreibung, die „im Wesentlichen bestehend aus“ verschiedenen Komponenten rezitieren, werden auch als „bestehend aus“ oder „umfassend“ die rezitierten Komponenten betrachtet (diese Austauschbarkeit gilt nicht für die Verwendung dieser Begriffe in den Ansprüchen). „Bestehend im Wesentlichen aus“ bedeutet, dass zusätzliche Komponenten, Zusammensetzungen oder Verfahrensschritte, die die grundlegenden und neuen Eigenschaften der hierin beschriebenen Zusammensetzungen und Verfahren nicht wesentlich verändern, in diesen Zusammensetzungen oder Verfahren enthalten sein können. Zu diesen Merkmalen gehört die Fähigkeit, eine in einer Probe vorhandene Nukleinsäuresequenz von Gruppe-B-Streptococcus (GBS) mit einer Spezifität nachzuweisen, die die GBS-Nukleinsäure von anderen bekannten Pathogenen unterscheidet, gegebenenfalls mit einer Empfindlichkeit, mit der das in einer Probe vorhandene Bakterium bei einer Konzentration von ungefähr 100 KBE/ml nachgewiesen werden kann und gegebenenfalls innerhalb von ungefähr 60 Minuten und/oder innerhalb von ungefähr 40 Zyklen ab dem Beginn einer Amplifikationsreaktion, wenn eine zyklische Amplifikationsreaktion verwendet wird.
  • „Probe“ umfasst jede Probe, die GBS oder Komponenten davon enthalten kann, wie Nukleinsäuren oder Fragmente von Nukleinsäuren. Proben umfassen „biologische Proben“, die jegliches Gewebe oder Material umfassen, das von einem lebenden oder toten Menschen stammt und das GBS oder eine davon abgeleitete Zielnukleinsäure enthalten kann, einschließlich z.B. Vaginalabstrichproben, zervikale Bürstenabstriche, Atmungsorgangewebe oder Exsudate wie bei einer Bronchoskopie, bronchoalveolären Lavage (BAL) oder Lungenbiopsie, Sputum, Speichel, peripheres Blut, Plasma, Serum, Lymphknoten, Magen-Darm-Gewebe, Stuhl, Urin, Sperma oder andere Körperflüssigkeiten oder - materialien. Die biologische Probe kann behandelt werden, um die Gewebe- oder Zellstruktur physikalisch oder mechanisch zu zerstören, wodurch intrazelluläre Komponenten in eine Lösung freigesetzt werden, die ferner Enzyme, Puffer, Salze, Detergenzien und dergleichen enthalten kann, die verwendet werden, um unter Verwendung von Standardverfahren eine biologische Probe zur Analyse herzustellen. Proben können auch verarbeitete Proben umfassen, wie solche, die durch Überleiten von Proben über oder durch eine Filtervorrichtung oder nach Zentrifugation oder durch Anhaften an ein Medium, eine Matrix oder einen Träger erhalten werden.
  • „Nukleinsäure“ und „Polynukleotid“ beziehen sich auf eine multimere Verbindung, die Nukleoside oder Nukleosidanaloga umfasst, die stickstoffhaltige heterocyclische Basen oder Basenanaloga aufweisen, die miteinander verbunden sind, um ein Polynukleotid zu bilden, einschließlich herkömmlicher RNA, DNA, gemischter RNA-DNA und Polymeren, die Analoga davon sind. Ein Nukleinsäure-„Grundgerüst“ kann aus einer Vielzahl von Bindungen bestehen, einschließlich einer oder mehrerer Zucker-Phosphodiester-Bindungen, Peptid-Nukleinsäure-Bindungen („Peptid-Nukleinsäuren") oder PNA; PCT-Veröffentlichung Nr. WO 95/32305 ). Phosphorothioatbindungen, Methylphosphonatbindungen oder Kombinationen davon. Zuckerreste einer Nukleinsäure können Ribose, Desoxyribose oder ähnliche Verbindungen mit Substitutionen sein, z.B. 2'-Methoxy- oder 2'-Halogenidsubstitutionen. Stickstoffhaltige Basen können übliche Basen (A, G, C, T, U), Analoga davon sein (zum Beispiel Inosin oder andere, siehe The Biochemistry of the Nucleic Acids 5-36, Adams et al., Hrsg., 11. Aufl., 1992), Derivate von Purinen oder Pyrimidinen (z.B. N4 -Methyldeoxyguanosin, Deaza- oder Aza-Purine, Deaza- oder Aza-Pyrimidine, Pyrimidinbasen mit Substituentengruppen in der Position 5 oder 6, Purinbasen mit einem Substituenten in der Position 2, 6 oder 8, 2-Amino-6-methylaminopurin, O6-Methylguanin, 4-Thiopyrimidine, 4-Amino-Pyrimidine, 4-Dimethylhydrazin-Pyrimidine und O4-Alkyl-Pyrimidine; US Patent Nr. 5,378,825 und PCT-Veröffentlichung Nr. WO 93/13121 ). Nukleinsäuren können einen oder mehrere „abasische“ Reste enthalten, wobei das Grundgerüst keine stickstoffhaltige Base für die Position(en) des Polymers enthält ( US-Patent Nr. 5,585,481 ). Eine Nukleinsäure kann nur herkömmliche RNA- oder DNA-Zucker, -Basen und -Bindungen umfassen oder sowohl herkömmliche Komponenten als auch Substitutionen umfassen (z.B. herkömmliche Basen mit 2'-Methoxybindungen oder Polymere, die sowohl herkömmliche Basen als auch ein oder mehrere Basenanaloga enthalten). Zu den Nukleinsäuren gehören „verriegelte Nukleinsäuren“ (LNA), ein Analogon, das ein oder mehrere LNA-Nukleotidmonomere mit einer bicyclischen Furanoseeinheit enthält, die in einer RNA-nachahmenden Zuckerkonformation gebunden ist und die Hybridisierungsaffinität gegenüber komplementären RNA- und DNA-Sequenzen erhöht (Vester und Wengel, 2004 Biochemistry 43 (42): 13233-41). Ausführungsformen von Oligomeren, die die Stabilität eines Hybridisierungskomplexes beeinflussen können, umfassen PNA-Oligomere, Oligomere, die mit 2'-Methoxy oder 2'-Fluor substituierte RNA enthalten, oder Oligomere, die die Gesamtladung, Ladungsdichte oder sterische Assoziationen eines Hybridisierungskomplexes beeinflussen, einschließlich Oligomere, die geladene Bindungen (z.B. Phosphorthioate) oder neutrale Gruppen (z.B. Methylphosphonate) enthalten. 5-Methylcytosine können in Verbindung mit einem der vorstehenden Grundgerüste/Zucker/Bindungen einschließlich RNA- oder DNA-Grundgerüsten (oder Gemischen davon) verwendet werden, sofern nicht anders angegeben. Es versteht sich, dass bei Bezugnahme auf Bereiche für die Länge eines Oligonukleotids, Amplikons oder einer anderen Nukleinsäure dieser jeweilige Bereich alle ganzen Zahlen umfasst (z.B. 19 bis 25 lange zusammenhängende Nukleotide umfassen 19, 20, 21, 22, 23, 24 und 25).
  • Ein „Nukleotid“, wie es hier verwendet wird, ist eine Untereinheit einer Nukleinsäure, die aus einer Phosphatgruppe, einem 5-Kohlenstoff-Zucker und einer stickstoffhaltigen Base besteht (hier auch als „Nukleobase“ bezeichnet). Der in RNA vorkommende 5-Kohlenstoff-Zucker ist Ribose. In der DNA ist der 5-Kohlenstoff-Zucker 2'-Desoxyribose. Der Begriff umfasst auch Analoga solcher Untereinheiten, wie eine Methoxygruppe an der 2'-Position der Ribose (hier auch als „2'-O-Me“ oder „2'-Methoxy“ bezeichnet).
  • Mit „RNA- und DNA-Äquivalenten“ sind RNA- und DNA-Moleküle gemeint, die im Wesentlichen die gleichen Hybridisierungseigenschaften für komplementäre Basenpaare aufweisen. RNA- und DNA-Äquivalente haben unterschiedliche Zuckerreste (d.h. Ribose gegenüber Desoxyribose) und können sich durch die Anwesenheit von Uracil in RNA und Thymin in DNA unterscheiden. Die Unterschiede zwischen RNA- und DNA-Äquivalenten tragen nicht zu Unterschieden in der Homologie bei, da die Äquivalente den gleichen Grad an Komplementarität zu einer bestimmten Sequenz aufweisen. Mit „DNA/RNA-Chimäre“ ist eine Nukleinsäure gemeint, die sowohl DNA- als auch RNA-Nukleotide umfasst. Sofern der Kontext nicht eindeutig etwas anderes vorschreibt, schließt die Bezugnahme auf eine GBS-Nukleinsäure GBS-RNA- und DNA-Äquivalente und DNA/RNA-Chimäre davon ein.
  • Eine „Zielnukleinsäure“, wie sie hier verwendet wird, ist eine Nukleinsäure, die eine zu amplifizierende Zielsequenz umfasst. Zielnukleinsäuren können DNA oder RNA sein und können entweder einzelsträngig oder doppelsträngig sein. Die Zielnukleinsäure kann neben der Zielsequenz andere Sequenzen enthalten, die möglicherweise nicht amplifiziert werden.
  • Der Ausdruck „Zielsequenz“, wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf die bestimmte Nukleotidsequenz der Zielnukleinsäure, die amplifiziert und/oder nachgewiesen werden soll. Die „Zielsequenz“ umfasst die Komplexierungssequenzen, mit denen Oligonukleotide (z.B. Priming-Oligonukleotide und/oder Promotor-Oligonukleotide) während eines Amplifikationsprozesses (z.B. PCR, TMA) komplexieren. Wenn die Zielnukleinsäure ursprünglich einzelsträngig ist, bezieht sich der Begriff „Zielsequenz“ auch auf die Sequenz, die zu der „Zielsequenz“, wie sie in der Zielnukleinsäure vorhanden ist, komplementär ist. Wenn die Zielnukleinsäure ursprünglich doppelsträngig ist, bezieht sich der Begriff „Zielsequenz“ sowohl auf den Sense-(+) als auch den Antisense-(-) Strang.
  • Der Begriff „Zielhybridisierungssequenz“ oder „zielspezifische Sequenz“ wird hier verwendet, um den Teil eines Oligomers zu bezeichnen, der konfiguriert ist, mit einer Zielnukleinsäuresequenz zu hybridisieren. Vorzugsweise sind die Zielhybridisierungssequenzen so konfiguriert, dass sie spezifisch mit einer Zielnukleinsäuresequenz hybridisieren. Zielhybridisierungssequenzen können zu 100 % komplementär zu dem Teil der Zielsequenz sein, für welchen sie zur Hybridisierung konfiguriert sind; unbedingt erforderlich ist dies allerdings nicht. Zielhybridisierungssequenzen können in Bezug auf eine Zielsequenz auch inserierte, deletierte und/oder substituierte Nukleotidreste einschließen. Eine weniger als 100 %ige Komplementarität einer Zielhybridisierungssequenz zu einer Zielsequenz kann beispielsweise auftreten, wenn die Zielnukleinsäure eine Vielzahl von Stämmen innerhalb einer Spezies ist, wie dies bei einem Oligomer der Fall wäre, das konfiguriert ist, um mit verschiedenen Serotypen von GBS zu hybridisieren. Es versteht sich, dass es andere Gründe gibt, eine Zielhybridisierungssequenz so zu konfigurieren, dass sie weniger als 100 % Komplementarität zu einer Zielnukleinsäure aufweist.
  • Der Ausdruck „Gezieltes Ansteuern einer Sequenz“, wie er hier in Bezug auf eine Region von GBS-Nukleinsäure verwendet wird, bezieht sich auf ein Verfahren, bei dem ein Oligonukleotid auf eine Weise an eine Zielsequenz hybridisiert, die eine Amplifikation und einen Nachweis, wie hier beschrieben, ermöglicht. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Oligonukleotid komplementär zu der Ziel-GBS-Nukleinsäuresequenz und enthält keine Fehlpaarungen. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist das Oligonukleotid komplementär, enthält jedoch 1, 2, 3, 4 oder 5 Fehlpaarungen mit der Ziel-GBS-Nukleinsäuresequenz. Vorzugsweise hybridisiert das Oligomer spezifisch mit der Zielsequenz.
  • Der Ausdruck „konfiguriert zu“ bezeichnet eine tatsächliche Anordnung der Polynukleotidsequenzkonfiguration einer referenzierten Oligonukleotid-Zielhybridisierungssequenz. Beispielsweise weisen Amplifikationsoligomere, die konfiguriert sind, um ein spezifisches Amplikon aus einer Zielsequenz zu erzeugen, Polynukleotidsequenzen auf, die mit der Zielsequenz hybridisieren und in einer Amplifikationsreaktion verwendet werden können, um das Amplikon zu erzeugen. Ebenfalls als Beispiel weisen Oligonukleotide, die konfiguriert sind, um spezifisch an eine Zielsequenz zu hybridisieren, eine Polynukleotidsequenz auf, die spezifisch an die referenzierte Sequenz unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert.
  • Der Ausdruck „konfiguriert, um spezifisch zu hybridisieren“, wie er hier verwendet wird, bedeutet, dass die Zielhybridisierungsregion eines Amplifikationsoligonukleotids, einer Nachweissonde oder eines anderen Oligonukleotids so gestaltet ist, dass sie eine Polynukleotidsequenz aufweist, die eine Sequenz der referenzierten GBS-Zielregion gezielt ansteuern könnte. Solch ein Oligonukleotid ist nicht nur darauf beschränkt, diese Sequenz gezielt anzusteuern, sondern ist nützlich in Form einer Zusammensetzung, in einem Kit oder in einem Verfahren zur Herstellung einer GBS-Zielnukleinsäure. Das Oligonukleotid soll als Bestandteil eines Assays zur Amplifikation und zum Nachweis von GBS aus einer Probe fungieren und soll daher gezielt GBS in Gegenwart anderer Nukleinsäuren ansteuern, die üblicherweise in Testproben zu finden sind. „Spezifisch hybridisieren an“ bedeutet nicht ausschließlich hybridisieren an, da ein gewisser geringer Grad an Hybridisierung an Nicht-Ziel-Nukleinsäuren auftreten kann, wie es auf dem Fachgebiet bekannt ist. Vielmehr bedeutet „spezifisch hybridisieren an“, dass das Oligonukleotid so konfiguriert ist, dass es in einem Assay aktiv ist, um primär das Ziel zu hybridisieren, so dass ein genauer Nachweis der Zielnukleinsäure in einer Probe bestimmt werden kann.
  • Der Ausdruck „Region“, wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf einen Teil einer Nukleinsäure, wobei der Teil kleiner als die gesamte Nukleinsäure ist. Wenn die in Bezug genommene Nukleinsäure beispielsweise ein Oligonukleotid-Promotorprimer ist, kann der Begriff „Region“ den kleineren Promotoranteil bezeichnen. Ähnlich und auch nur als Beispiel, wenn die Nukleinsäure eine GBS-Zielnukleinsäure ist, kann der Begriff „Region“ verwendet werden, um sich auf einen kleineren Bereich der Nukleinsäure zu beziehen, wobei der kleinere Bereich von einem oder mehreren Oligonukleotiden der vorliegenden Offenbarung gezielt angesteuert wird. Als ein weiteres nicht einschränkendes Beispiel kann, wenn die in Bezug genommene Nukleinsäure ein Amplikon ist, der Begriff „Region“ verwendet werden, um sich auf die kleinere Nukleotidsequenz zu beziehen, die zur Hybridisierung durch die Zielhybridisierungssequenz einer Sonde identifiziert wurde.
  • „Oligomer“, „Oligonukleotid“ oder „Oligo“ bezieht sich auf eine Nukleinsäure mit im Allgemeinen weniger als 1.000 Nukleotiden (nt), einschließlich solcher in einem Größenbereich mit einer Untergrenze von unefähr 2 bis 5 nt und einer Obergrenze von ungefähr 500 bis 900 nt. Einige besondere Ausführungsformen sind Oligomere in einem Größenbereich mit einer Untergrenze von ungefähr 5 bis 15, 16, 17, 18, 19 oder 20 nt und einer Obergrenze von ungefähr 50 bis 600 nt, und andere besondere Ausführungsformen liegen in einem Größenbereich mit einer Untergrenze von ungefähr 10 bis 20 nt und einer Obergrenze von ungefähr 22 bis 100 nt. Oligomere können aus natürlich vorkommenden Quellen gereinigt werden, sie können jedoch unter Verwendung jeder bekannten enzymatischen oder chemischen Methode synthetisiert werden. Der Begriff „Oligonukleotid“ bezeichnet keine bestimmte Funktion des Reagens; Vielmehr wird es allgemein verwendet, um alle hier beschriebenen Reagenzien abzudecken. Ein Oligonukleotid kann verschiedene Funktionen erfüllen. Beispielsweise kann es als Primer fungieren, wenn es spezifisch für einen komplementären Strang ist und mit diesem hybridisieren kann und in Gegenwart einer Nukleinsäure-Polymerase weiter verlängert werden kann; es kann als Primer fungieren und einen Promotor bereitstellen, wenn es eine Sequenz enthält, die von einer RNA-Polymerase erkannt wird und die Transkription ermöglicht (z.B. ein T7-Primer); und es kann fungieren, um eine Zielnukleinsäure zu detektieren, wenn es in der Lage ist, mit der Zielnukleinsäure oder einem Amplikon davon zu hybridisieren, und ferner eine detektierbare Einheit (z.B. eine Acridiniumesterverbindung) bereitstellt. Oligomere können mit einem funktionellen Namen bezeichnet werden (z.B. Einfangsonde, Primer oder Promotorprimer), Fachleute werden jedoch verstehen, dass sich solche Ausdrücke auf Oligomere beziehen.
  • Wie hierin verwendet, bedeutet ein Oligonukleotid, das einer spezifizierten Referenznukleinsäuresequenz „im Wesentlichen entspricht“, dass das Oligonukleotid der Referenznukleinsäuresequenz ausreichend ähnlich ist, so dass das Oligonukleotid ähnliche Hybridisierungseigenschaften zu der Referenznukleinsäuresequenz aufweist, indem es mit der gleichen Zielnukleinsäuresequenz unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisieren würde. Ein Fachmann wird verstehen, dass „im Wesentlichen entsprechende Oligonukleotide“ von einer Referenzsequenz abweichen und immer noch mit derselben Zielnukleinsäuresequenz hybridisieren können. Es versteht sich auch, dass eine erste Nukleinsäure, die einer zweiten Nukleinsäure entspricht, die RNA oder ein DNA-Äquivalent davon sowie DNA/RNA-Chimäre davon umfasst und die Komplemente davon umfasst, sofern der Kontext nicht eindeutig etwas anderes vorschreibt. Diese Abweichung von der Nukleinsäure kann als Prozentsatz identischer Basen innerhalb der Sequenz oder als Prozentsatz perfekt komplementärer Basen zwischen der Sonde oder dem Primer und ihrer Zielsequenz angegeben werden. Somit entspricht in bestimmten Ausführungsformen ein Oligonukleotid „im Wesentlichen“ einer Referenznukleinsäuresequenz, wenn diese Prozentsätze der Basenidentität oder - komplementarität von 100 % bis ungefähr 80 %, vorzugsweise von 100 % bis ungefähr 85 % oder bevorzugter von 100 % bis ungefähr 90 % oder von 100 % bis ungefähr 95 % entsprechen. Diese Abweichung von der Nukleinsäure kann auch als Anzahl der Nukleobasensubstitutionen in einer Nukleinsäuresequenz relativ zu einer Referenzsequenz oder als Anzahl der Fehlpaarungen innerhalb einer Sequenz relativ zu einer Zielsequenz angegeben werden. Somit entspricht in bestimmten Ausführungsformen ein Oligonukleotid „im Wesentlichen“ einer Referenznukleinsäuresequenz, wenn diese Anzahl von Nukleobasensubstitutionen oder -fehlpaarungen bis zu vier, bevorzugt bis zu drei oder bevorzugter bis zu zwei oder bis zu einer Substitution(en) oder Fehlpaarung(en) beträgt. (d.h. von null bis vier, vorzugsweise von null bis drei oder bevorzugter von null bis zwei oder von null bis einschließlich eins). In ähnlicher Weise kann eine Region einer Nukleinsäure oder amplifizierten Nukleinsäure hierin als einer Referenznukleinsäuresequenz entsprechend bezeichnet werden. Ein Fachmann wird die verschiedenen Modifikationen der Hybridisierungsbedingungen verstehen, die bei verschiedenen Prozentsätzen der Komplementarität erforderlich sein können, um die Hybridisierung mit einer spezifischen Zielsequenz zu ermöglichen, ohne ein inakzeptables Maß an unspezifischer Hybridisierung zu verursachen.
  • Wie hierin verwendet, umfasst der Ausdruck „oder ihr Komplement oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon“ in Bezug auf eine DNA-Sequenz (zusätzlich zu der referenzierten DNA-Sequenz) das Komplement der DNA-Sequenz, ein RNA-Äquivalent der referenzierten DNA-Sequenz, ein RNA-Äquivalent des Komplements der referenzierten DNA-Sequenz, eine DNA/RNA-Chimäre der referenzierten DNA-Sequenz und eine DNA/RNA-Chimäre des Komplements der referenzierten DNA-Sequenz. In ähnlicher Weise umfasst der Ausdruck „oder ihr Komplement oder ein DNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon“ in Bezug auf eine RNA-Sequenz (zusätzlich zu der referenzierten RNA-Sequenz) das Komplement der RNA-Sequenz, ein DNA-Äquivalent der referenzierten RNA-Sequenz, ein DNA-Äquivalent des Komplements der referenzierten RNA-Sequenz, eine DNA/RNA-Chimäre der referenzierten RNA-Sequenz und eine DNA/RNA-Chimäre des Komplements der referenzierten RNA-Sequenz.
  • Ein „Amplifikationsoligonukleotid“ oder „Amplifikationsoligomer“ ist ein Oligonukleotid, das an eine Zielnukleinsäure oder deren Komplement hybridisiert und an einer Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion teilnimmt, z.B. als Primer oder Promotor-Primer dient. Bestimmte Amplifikationsoligomere enthalten mindestens ungefähr 10 zusammenhängende Basen und gegebenenfalls mindestens 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 oder 20 zusammenhängende Basen, die zu einer Region der Zielnukleinsäuresequenz oder deren komplementärer Strang komplementär sind. Die zusammenhängenden Basen können mindestens ungefähr 80 %, mindestens ungefähr 90 % oder vollständig komplementär zu der Zielsequenz sein, an die das Amplifikationsoligomer bindet. Ein Fachmann wird verstehen, dass die angegebenen Bereiche alle ganzen und rationalen Zahlen innerhalb des Bereichs umfassen (z.B. 92 % oder 98,377 %). Bestimmte Amplifikationsoligomere sind ungefähr 10 bis ungefähr 60 Basen lang und können gegebenenfalls modifizierte Nukleotide einschließen.
  • Ein „Primer“ ist ein Oligomer, das an eine Matrizennukleinsäure hybridisiert und ein 3'-Ende aufweist, das durch Polymerisation verlängert wird. Ein Primer kann optional modifiziert werden, z.B. durch Einschließen einer 5'-Region, die nicht zur Zielsequenz komplementär ist. Eine solche Modifikation kann funktionelle Additionen, wie Markierungen, Promotoren oder andere nicht zielspezifische Sequenzen einschließen, die zum Manipulieren oder Amplifizieren des Primers oder des Zieloligonukleotids verwendet werden oder nützlich sind.
  • Im Rahmen der transkriptionsvermittelten Amplifikation wird ein mit einer 5'-Promotorsequenz modifizierter Primer hier als „Promotor-Primer“ bezeichnet. Ein Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie oder Biochemie wird verstehen, dass ein Oligomer, das als Primer fungieren kann, so modifiziert werden kann, dass es eine 5'-Promotorsequenz enthält und dann als Promotor-Primer wirksam sein kann, und in ähnlicher Weise, jeder Promotor-Primer als Primer mit oder ohne seine 5'-Promotorsequenz dienen kann. Ein Promotor-Primer, der so modifiziert ist, dass er ein 3'-blockiertes Ende enthält, wird hier als „Promotor-Provider“ bezeichnet, der mit einer Zielnukleinsäure hybridisieren kann und eine stromaufwärtige Promotorsequenz bereitstellt, die zur Initiierung der Transkription dient, jedoch keinen Primer für eine Oligo-Fortsetzung bereitstellt.
  • „Nicht zielspezifische Sequenz“ oder „nicht zielhybridisierende Sequenz“, wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Region einer Oligomersequenz, wobei die Region unter standardmäßigen Hybridisierungsbedingungen nicht stabil mit einer Zielsequenz hybridisiert. Oligomere mit nicht zielspezifischen Sequenzen umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Promotorprimer und Molecular Beacons (molekulare Signalsonden).
  • „Nukleinsäure-Amplifikation“ bezieht sich auf ein beliebiges In-vitro-Verfahren, das mehrere Kopien einer Zielnukleinsäuresequenz oder ihrer komplementären Sequenz oder Fragmente davon erzeugt (d.h. eine amplifizierte Sequenz, die weniger als die vollständige Zielnukleinsäure enthält). Beispiele für Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren umfassen transkriptionsassoziierte Verfahren, wie transkriptionsvermittelte Amplifikation (TMA), Nukleinsäuresequenz-basierte Amplifikation (NASBA) und andere (z.B. US-Patente Nr. 5,399,491 , 5,554,516 , 5,437,990 , 5,130,238 , 4,868,105 und 5,124,246 ), Replikase-vermittelte Amplifikation (z.B. US-Patent Nr. 4,786,600 ), Polymerasekettenreaktion (PCR) (z.B. US-Patent Nr. 4,683,195 , 4,683,202 und 4,800,159 ), Ligasekettenreaktion (LCR) (z.B. EP-Patent Nr. 0320308 ), Helikase-abhängige Amplifikation (z.B. US-Patent Nr. 7,282,328 ) und Strangverdrängungsamplifikation (SDA) (z. B. US-Patent Nr. 5,422,252 ). Die Amplifikation kann linear oder exponentiell sein. Die Replikase-vermittelte Amplifikation verwendet selbstreplizierende RNA-Moleküle und eine Replikase wie QB-Replikase. Die PCR-Amplifikation verwendet DNA-Polymerase-, Primer- und Thermozyklus-Schritte, um mehrere Kopien der beiden komplementären DNA- oder cDNA-Stränge zu synthetisieren. Die LCR-Amplifikation verwendet mindestens vier separate Oligonukleotide, um ein Ziel und seinen komplementären Strang unter Verwendung mehrerer Zyklen von Hybridisierung, Ligation und Denaturierung zu amplifizieren. Die Helikase-abhängige Amplifikation verwendet eine Helicase, um die zwei Stränge eines DNA-Duplex zu trennen, wobei einzelsträngige Matrizen erzeugt werden, gefolgt von der Hybridisierung von sequenzspezifischen Primern, die mit den Matrizen hybridisieren, und der Verlängerung durch DNA-Polymerase, um die Zielsequenz zu amplifizieren. SDA verwendet einen Primer, der eine Nachweisstelle für eine Restriktionsendonuklease enthält, die einen Strang eines hemimodifizierten DNA-Duplex, der die Zielsequenz enthält, schneidet, gefolgt von einer Amplifikation in einer Reihe von Schritten der Primerverlängerung und Strangverdrängung. Bestimmte Ausführungsformen verwenden PCR oder TMA, aber es ist für Fachleute offensichtlich, dass hier offenbarte Oligomere leicht als Primer in anderen Amplifikationsverfahren verwendet werden können.
  • Die transkriptionsassoziierte Amplifikation verwendet eine DNA-Polymerase, eine RNA-Polymerase, Desoxyribonukleosidtriphosphate, Ribonukleosidtriphosphate, ein Promotor enthaltendes Oligonukleotid und kann gegebenenfalls andere Oligonukleotide einschließen, um letztendlich mehrere RNA-Transkripte aus einer Nukleinsäurematrize zu erzeugen (im Detail beschrieben in z.B. US-Patentschriften 5,399,491 und 5,554,516 von Kacian et al.; US Patent No. 5,437,990 von Burg et al.; PCT-Veröffentlichungen Nr. WO 88/01302 und WO 88/10315 (Gingeras et al.); US Patent No. 5,130,238 von Malek et al.; US-Patent Nr. 4,868,105 und 5,124,246 von Urdea et al.; PCT-Veröffentlichung Nr. WO 94/03472 (McDonough et al.) und PCT-Veröffentlichung Nr. WO 95/03430 (Ryder et al.)). Verfahren, die TMA verwenden, sind zuvor ausführlich beschrieben worden (z.B. US-Patente Nr. 5,399,491 und 5,554,516 ).
  • Bei zyklischen Amplifikationsverfahren, die Amplikons in Echtzeit nachweisen, ist der Begriff „Schwellenwertzyklus“ (Ct) ein Maß für die Entstehungszeit eines Signals, das mit der Amplifikation des Ziels zusammenhängt, und beträgt im Allgemeinen das 10-fache der Standardabweichung des normalisierten Reportersignals. Sobald eine Amplifikation den „Schwellenzyklus“ erreicht, wird allgemein angenommen, dass es ein positives Amplifikationsprodukt einer Sequenz gibt, an die die Sonde bindet. Die Identität des Amplifikationsprodukts kann dann durch dem Fachmann bekannte Verfahren wie Gelelektrophorese, Nukleinsäuresequenzierung und andere derartige analytische Verfahren bestimmt werden.
  • Mit „Amplikon“ oder „Amplifikationsprodukt“ ist ein Nukleinsäuremolekül gemeint, das in einer Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion erzeugt wird und das von einer Zielnukleinsäure abgeleitet ist. Ein Amplikon oder Amplifikationsprodukt enthält eine Zielnukleinsäuresequenz, die den gleichen oder entgegengesetzten Sense wie die Zielnukleinsäure haben kann.
  • Wie hier verwendet, ist der Begriff „relative Fluoreszenzeinheit“ („RFU“) eine Maßeinheit für die Fluoreszenzintensität. Die RFU variiert mit den Eigenschaften der für die Messung verwendeten Nachweismittel und kann als Messung zum Vergleichen der relativen Intensitäten zwischen Proben und Kontrollen verwendet werden.
  • „Nachweissondenoligomer“, „Nachweissonde“ oder „Sonde“ bezieht sich auf ein Oligomer, das spezifisch an eine Zielsequenz hybridisiert, einschließlich einer amplifizierten Sequenz, unter Bedingungen, die die Nukleinsäurehybridisierung fördern, zum Nachweis der Zielnukleinsäure. Der Nachweis kann entweder direkt (d.h. direkt an das Ziel hybridisierte Sonde) oder indirekt (d.h. eine an eine Zwischenstruktur hybridisierte Sonde, die die Sonde an das Ziel bindet) erfolgen. Nachweissonden können DNA, RNA, Analoga davon oder Kombinationen davon (z.B. DNA/RNA-Chimäre) sein und können markiert oder unmarkiert sein. Nachweissonden können ferner alternative Grundgerüstbindungen umfassen, wie z.B. 2'-O-Methylbindungen. Die Zielsequenz einer Sonde bezieht sich im Allgemeinen auf die spezifische Sequenz innerhalb einer größeren Sequenz, die die Sonde spezifisch hybridisiert. Eine Nachweissonde kann zielspezifische Sequenz(en) und nicht zielspezifische Sequenz(en) enthalten. Solche nicht zielspezifischen Sequenzen können Sequenzen einschließen, die eine gewünschte sekundäre oder tertiäre Struktur verleihen, wie eine Haarnadelstruktur, die zur Erleichterung des Nachweises und/oder der Amplifikation verwendet werden kann (siehe z.B. US-Patente Nr. 5,118,801 , 5,312,728 , 6,835,542 und 6,849,412 ). Sonden einer definierten Sequenz können durch Techniken hergestellt werden, die dem Durchschnittsfachmann bekannt sind, wie durch chemische Synthese und durch Expression in vitro oder in vivo aus rekombinanten Nukleinsäuremolekülen.
  • Mit „Hybridisierung“ oder „Hybridisieren“ ist die Fähigkeit von zwei vollständig oder teilweise komplementären Nukleinsäuresträngen gemeint, unter bestimmten Hybridisierungstestbedingungen in einer parallelen oder antiparallelen Orientierung zusammenzukommen, um eine stabile Struktur mit einer doppelsträngigen Region zu bilden. Die beiden Teilstränge dieser Doppelstrangstruktur, die manchmal als Hybrid bezeichnet werden, werden durch Wasserstoffbrückenbindungen zusammengehalten. Obwohl sich diese Wasserstoffbrückenbindungen am häufigsten zwischen Nukleotiden bilden, die die Basen Adenin und Thymin oder Uracil (A und T oder U) oder Cytosin und Guanin (C und G) an einzelnen Nukleinsäuresträngen enthalten, kann sich auch eine Basenpaarung zwischen Basen bilden, die keine Mitglieder dieser „kanonischen“ Paare sind. Die nicht kanonische Basenpaarung ist im Stand der Technik bekannt. Siehe z.B. RLP Adams et al., The Biochemistry of the Nucleic Acids (11. Aufl. 1992).
  • Mit „bevorzugt hybridisieren“ ist gemeint, dass unter stringenten Hybridisierungsbedingungen ein Amplifikations- oder Nachweissondenoligomer mit seiner Zielnukleinsäure hybridisieren kann, um ein stabiles Oligomer:Zielhybrid aber keine ausreichende Anzahl von stabilen Oligomer:Nicht-Zielhybriden zu bilden. Amplifikations- und Nachweisoligomere, die vorzugsweise an eine Zielnukleinsäure hybridisieren, sind nützlich, um Zielnukleinsäuren zu amplifizieren und nachzuweisen, aber nicht Nichtzielorganismen, insbesondere phylogenetisch eng verwandte Organismen. Somit hybridisiert das Oligomer in einem ausreichend größeren Ausmaß mit der Zielnukleinsäure als mit einer Nichtzielnukleinsäure, um es einem Fachmann zu ermöglichen, das Vorhandensein (oder die Abwesenheit) von Nukleinsäure, die von dem angegebenen Ziel abgeleitet ist, entsprechend genau zu amplifizieren und/oder nachzuweisen. Im Allgemeinen wird durch Verringern des Komplementaritätsgrades zwischen einer Oligonukleotidsequenz und ihrer Zielsequenz der Hybridisierungsgrad oder die Hybridisierungsrate des Oligonukleotids an seine Zielregion verringert. Der Einschluss von einem oder mehreren nichtkomplementären Nukleosiden oder Nukleobasen kann jedoch die Fähigkeit eines Oligonukleotids erleichtern, Nichtzielorganismen zu diskriminieren.
  • Die bevorzugte Hybridisierung kann unter Verwendung von Techniken gemessen werden, die auf dem Fachgebiet bekannt und hierin beschrieben sind, wie in den unten angegebenen Beispielen. In einigen Ausführungsformen gibt es mindestens einen 10-fachen Unterschied, mindestens einen 100-fachen Unterschied oder mindestens einen 1000-fachen Unterschied zwischen Ziel- und Nicht-Zielhybridisierungssignalen in einer Testprobe. In einigen Ausführungsformen sind Nicht-Zielhybridisierungssignale in einer Testprobe nicht höher als der Hintergrundsignalpegel.
  • Mit „stringenten Hybridisierungsbedingungen“ oder „stringenten Bedingungen“ sind Bedingungen gemeint, die es einem Oligomer ermöglichen, bevorzugt an eine Zielnukleinsäure und nicht an eine Nukleinsäure zu hybridisieren, die von einer eng verwandten Nichtzielnukleinsäure stammt. Während die Definition der stringenten Hybridisierungsbedingungen nicht variiert, kann die tatsächliche Reaktionsumgebung, die für die stringente Hybridisierung verwendet werden kann, in Abhängigkeit von Faktoren wie dem GC-Gehalt und der Länge des Oligomers, dem Grad der Ähnlichkeit zwischen der Oligomersequenz und Sequenzen von Nichtzielnukleinsäuren, die in der Testprobe vorhanden sein können, und der Zielsequenz variieren. Die Hybridisierungsbedingungen umfassen die Temperatur und die Zusammensetzung der Hybridisierungsreagenzien oder -lösungen. Beispielhafte Hybridisierungstestbedingungen zum Amplifizieren und/oder Nachweisen von Zielnukleinsäuren, die von einem oder mehreren Serotypen von GBS abgeleitet sind, mit den Oligomeren der vorliegenden Offenbarung entsprechen einer Temperatur von ungefähr 60°C, wenn die Salzkonzentration, wie ein einwertiges Salz, z.B. KCl im Bereich von ungefähr 0,6 bis 0,9 M ist. Andere akzeptable stringente Hybridisierungsbedingungen werden von Fachleuten auf diesem Gebiet leicht festgestellt.
  • Mit „Testbedingungen“ sind Bedingungen gemeint, die eine stabile Hybridisierung eines Oligonukleotids an eine Zielnukleinsäure ermöglichen. Die Testbedingungen erfordern keine bevorzugte Hybridisierung des Oligonukleotids an die Zielnukleinsäure.
  • „Markierung“ oder „nachweisbare Markierung“ bezieht sich auf eine Einheit oder Verbindung, die direkt oder indirekt mit einer Sonde verbunden ist, die nachgewiesen wird oder zu einem nachweisbaren Signal führt. Ein direktes Verbinden kann kovalente Bindungen oder nichtkovalente Wechselwirkungen (z.B. Wasserstoffbrückenbindung, hydrophobe oder ionische Wechselwirkungen und Bildung von Chelat- oder Koordinationskomplexen) verwenden, während ein indirektes Verbinden eine Brückeneinheit oder einen Linker (z.B. über einen Antikörper oder zusätzliche Oligonukleotide) verwenden kann, die ein nachweisbares Signal amplifizieren. Es kann jede nachweisbare Einheit verwendet werden, z.B. ein Radionuklid, ein Ligand wie Biotin oder Avidin, ein Enzym, ein Enzymsubstrat, eine reaktive Gruppe, ein Chromophor wie ein Farbstoff oder Partikel (z.B. Latex oder Metallperle), der eine nachweisbare Farbe verleiht, eine Lumineszenzverbindung (z.B. eine biolumineszierende, phosphoreszierende oder chemilumineszierende Verbindung) und eine fluoreszierende Verbindung (d.h. Fluorophor). Ausführungsformen von Fluorophoren umfassen solche, die Licht im Bereich von ungefähr 495 bis 650 nM absorbieren und Licht im Bereich von ungefähr 520 bis 670 nM emittieren, einschließlich solcher, die als FAM™, TET™, CAL FLUOR™ (Orange oder Rot) bekannt sind, und QUASAR™-Verbindungen. Fluorophore können in Kombination mit einem Quencher-Molekül verwendet werden, das Licht absorbiert, wenn es sich in unmittelbarer Nähe des Fluorophors befindet, um die Hintergrundfluoreszenz zu verringern. Solche Quencher sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und umfassen z.B. BLACK HOLE QUENCHER™ (oder BHQ™) oder TAMRA™-Verbindungen. Besondere Ausführungsformen umfassen eine „homogene nachweisbare Markierung“, die in einem homogenen System nachweisbar ist, in dem die gebundene markierte Sonde in einem Gemisch eine nachweisbare Änderung im Vergleich zur ungebundenen markierten Sonde aufweist, wodurch die Markierung nachgewiesen werden kann, ohne die hybridisierte von der nicht hybridisierten markierten Sonde physikalisch zu entfernen (z.B. US-Patente Nr. 5,283,174 , 5,656,207 und 5,658,737 ). Besondere homogene nachweisbare Markierungen umfassen chemilumineszierende Verbindungen, einschließlich Acridiniumester („AE“) -Verbindungen, wie Standard-AE oder AE-Derivate, die allgemein bekannt sind (US-Patente Nr. 5,656,207 , 5,658,737 und 5,639,604 ). Verfahren zum Synthetisieren von Markierungen, zum Anbringen von Markierungen an Nukleinsäure und zum Nachweisen von Signalen von Markierungen sind allgemein bekannt (z. B. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1989) in Chapt. 10 und US-Pat. Nr. 5,658,737 , 5,656,207 , 5,547,842 , 5,283,174 und 4,581,333 und EP Patentanmeldung Nr. 0 747 706 ). Besondere Verfahren zum Binden einer AE-Verbindung an eine Nukleinsäure sind bekannt (z.B. US-Patent Nr. 5,585,481 und US-Patent Nr. 5,639,604 , siehe Spalte 10, Zeile 6 bis Spalte 11, Zeile 3 und Beispiel 8). Bestimmte AE-Markierungspositionen sind die zentrale Region einer Sonde und nahe einer Region von A/T-Basenpaaren, am 3'- oder 5'-Terminus einer Sonde oder an oder nahe einer Fehlpaarungsstelle mit einer bekannten Sequenz, welche die Sonde im Vergleich zu der gewünschten Zielsequenz nicht nachweisen sollte. Andere nachweisbar markierte Sonden umfassen TaqMan™-Sonden, Molekularbrenner und Molekularbaken. TaqMan™-Sonden umfassen eine Donor- und Akzeptor-Markierung, bei der die Fluoreszenz beim enzymatischen Abbau der Sonde während der Amplifikation nachgewiesen wird, um das Fluorophor vom Quencher freizusetzen. Molekularbrenner und Baken existieren in offenen und geschlossenen Konfigurationen, wobei die geschlossene Konfiguration das Fluorophor löscht und die offene Position das Fluorophor vom Quencher trennt, um eine Fluoreszenz zu ermöglichen. Die Hybridisierung an das Ziel öffnet die ansonsten geschlossenen Sonden.
  • Sequenzen sind „ausreichend komplementär“, wenn sie eine stabile Hybridisierung von zwei Nukleinsäuresequenzen ermöglichen, z.B. stabile Hybride von Sonden- und Zielsequenzen, obwohl die Sequenzen nicht vollständig komplementär sein müssen. Das heißt, eine „ausreichend komplementäre“ Sequenz, die mit einer anderen Sequenz durch Wasserstoffbindung zwischen einer Teilmenge von komplementären Nukleotiden unter Verwendung von Standard-Basenpaaren (z.B. G:C, A:T oder A:U) hybridisiert, obwohl die beiden Sequenzen einen oder mehrere Rest(e) (einschließlich basischer Positionen) enthalten können, die nicht komplementär sind, solange die gesamten Sequenzen unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen einen stabilen Hybridisierungskomplex bilden. Ausreichend komplementäre Sequenzen können mindestens ungefähr 80 %, mindestens ungefähr 90 % oder vollständig komplementär zu den Sequenzen sein, die miteinander hybridisieren. Geeignete Hybridisierungsbedingungen sind für den Fachmann auf dem Gebiet wohl bekannt, können basierend auf der Sequenzzusammensetzung vorhergesagt werden, oder können durch Verwendung von Routinetests empirisch bestimmt werden (z.B. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. in §§ 1.90-1.91, 7.37-7.57, 9.47-9.51 und 11.47-11.57, insbesondere §§ 9.50-9.51, 11.12-11.13, 11.45-11.47 und 11.55-11.57).
  • Ein „nicht verlängerbares“ Oligomer schließt eine blockierende Einheit an oder nahe seinem 3'-Terminus ein, um eine Verlängerung zu verhindern. Eine Blockierungsgruppe nahe dem 3'-Ende befindet sich in einigen Ausführungsformen innerhalb von fünf Resten vom 3'-Ende und ist ausreichend groß, um die Bindung einer Polymerase an das Oligomer zu begrenzen, und andere Ausführungsformen enthalten eine Blockierungsgruppe, die kovalent an den 3'-Terminus gebunden ist. Es können viele verschiedene chemische Gruppen verwendet werden, um das 3'-Ende zu blockieren, z.B. Alkylgruppen, Nicht-Nukleotid-Linker, Alkandiol-Didesoxynukleotidreste und Cordycepin. Weitere Beispiele für blockierende Einheiten umfassen ein 3'-Desoxynukleotid (z.B. ein 2',3'-Didesoxynukleotid); ein 3'-phosphoryliertes Nukleotid; ein Fluorophor, einen Quencher oder eine andere Markierung, die die Verlängerung stört; ein invertiertes Nukleotid (z.B. verbunden mit dem vorhergehenden Nukleotid durch einen 3'-zu-3'-Phosphodiester, gegebenenfalls mit einem exponierten 5'-OH oder Phosphat); oder ein Protein oder Peptid, das an das Oligonukleotid gebunden ist, um eine weitere Verlängerung einer entstehenden Nukleinsäurekette durch eine Polymerase zu verhindern. Ein nicht verlängerbares Oligonukleotid der vorliegenden Offenbarung kann eine Länge von mindestens 10 Basen und eine Länge von bis zu 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50 oder mehr Nukleotiden aufweisen. Nichtverlängerbare Oligonukleotide, die eine nachweisbare Markierung umfassen, können als Sonden verwendet werden.
  • Verweise, insbesondere in den Ansprüchen, auf „die Sequenz von SEQ ID NO:X“ beziehen sich auf die Basensequenz des entsprechenden Sequenzprotokolleintrags und erfordern keine Identität des Grundgerüsts (z.B. RNA, 2'-O-Me-RNA, oder DNA) oder Basenmodifikationen (z.B. Methylierung von Cytosinresten), sofern der Kontext nicht eindeutig etwas anderes vorschreibt.
  • „Probenvorbereitung“ bezieht sich auf alle Schritte oder Verfahren, die eine Probe zur anschließenden Amplifikation und/oder zum Nachweis von in der Probe vorhandenen GBS-Nukleinsäuren behandeln. Proben können komplexe Gemische von Komponenten sein, deren Zielnukleinsäure eine Minderheitskomponente ist. Die Probenvorbereitung kann ein beliebiges bekanntes Verfahren zum Konzentrieren von Komponenten wie Mikroben oder Nukleinsäuren aus einem größeren Probenvolumen umfassen, beispielsweise durch Filtration von luftgetragenen oder wassergetragenen Partikeln aus einer größeren Volumenprobe oder durch Isolierung von Mikroben aus einer Probe unter Verwendung von mikrobiologischen Standardverfahren. Die Probenvorbereitung kann das physikalische Aufbrechen und/oder die chemische Lyse von Zellbestandteilen zur Freisetzung von intrazellulären Bestandteilen in eine im Wesentlichen wässrige oder organische Phase und die Entfernung von Ablagerungen umfassen, beispielsweise durch Filtration, Zentrifugation oder Adsorption. Die Probenvorbereitung kann die Verwendung eines Nukleinsäure-Oligonukleotids umfassen, das eine Zielnukleinsäure selektiv oder unspezifisch einfängt und von anderen Probenkomponenten trennt (z.B. wie in US-Patent Nr. 6,110,678 und in WO 2008/016988 beschrieben, auf die hier jeweils Bezug genommen wird).
  • „Trennen“ oder „Reinigen“ bedeutet, dass eine oder mehrere Komponente(n) einer Probe von anderen Probenkomponenten entfernt oder getrennt werden. Probenkomponenten umfassen Zielnukleinsäuren, üblicherweise in einer im Allgemeinen wässrigen Lösungsphase, die auch Zellfragmente, Proteine, Kohlenhydrate, Lipide und andere Nukleinsäuren umfassen kann. „Trennen“ oder „Reinigen“ bedeutet keinen Reinigungsgrad. Typischerweise werden durch Abtrennen oder Reinigen mindestens 70 % oder mindestens 80 % oder mindestens 95 % der Zielnukleinsäure von anderen Probenkomponenten entfernt.
  • Der Ausdruck „nichtlineares Tensid“, wie er hier verwendet wird, bedeutet ein Tensid mit einer verzweigten Kettenstruktur. Ein nichtlineares Tensid kann eine oder mehrere Ringstrukturen enthalten, die beispielsweise in einer Hauptkette und/oder in einer oder mehreren Verzweigungsketten vorliegen können. Beispielhafte nichtlineare Tenside umfassen Polysorbat 20, Polysorbat 40, Polysorbat 60 und Digitonin. In bestimmten Varianten ist ein nichtlineares Tensid nichtionisch.
  • Der Begriff „Spezifität“ im Zusammenhang mit einem Amplifikations- und/oder Nachweissystem wird hier verwendet, um sich auf die Charakteristik des Systems zu beziehen, die seine Fähigkeit beschreibt, zwischen Ziel- und Nichtzielsequenzen in Abhängigkeit von Sequenz- und Assaybedingungen zu unterscheiden. In Bezug auf die Nukleinsäure-Amplifikation bezieht sich die Spezifität im Allgemeinen auf das Verhältnis der Anzahl der produzierten spezifischen Amplifikate zur Anzahl der Nebenprodukte (z.B. das Signal-Rausch-Verhältnis). In Bezug auf den Nachweis bezieht sich die Spezifität im Allgemeinen auf das Verhältnis des von Zielnukleinsäuren erzeugten Signals zu dem von Nichtzielnukleinsäuren erzeugten Signal.
  • Der Begriff „Empfindlichkeit“ wird hier verwendet, um die Präzision zu bezeichnen, mit der eine Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion nachgewiesen oder quantifiziert werden kann. Die Empfindlichkeit einer Amplifikationsreaktion ist im Allgemeinen ein Maß für die kleinste Kopienzahl der Zielnukleinsäure, die zuverlässig im Amplifikationssystem nachgewiesen werden kann, und hängt beispielsweise vom verwendeten Nachweisassay und der Spezifität der Amplifikationsreaktion ab, z.B. das Verhältnis von spezifischen Amplikonen zu Nebenprodukten.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen, Kits und Verfahren zum Amplifizieren und Nachweisen der Nukleinsäure von Gruppe-B-Streptococcus (GBS; Streptococcus agalactiae) aus einer Probe bereit. Vorzugsweise sind die Proben biologische Proben. Die Zusammensetzungen, Kits und Verfahren liefern Oligonukleotid-Sequenzen, die Zielsequenzen des GBS-Genoms, einschließlich Zielsequenzen von GBS-Serotypen Ia, Ib, Ic, II, III, IV, V, VI, VII, VIII und IX, oder ihre komplementären Sequenzen erkennen. Solche Oligonukleotide können als Amplifikationsoligonukleotide verwendet werden, die Primer, Promotorprimer, blockierte Oligonukleotide und Promotorprovider-Oligonukleotide umfassen können, deren Funktionen zuvor beschrieben wurden (siehe z.B. US-Patente Nr. 4,683,195 ; 4,683,202 ; 4,800,159 ; 5,399,491 ; 5,554,516 ; 5,824,518 und 7,374,885 ; jeweils durch Bezugnahme hierin aufgenommen). Andere Oligonukleotide können als Sonden zum Nachweis amplifizierter Sequenzen von GBS oder zum Einfangen von GBS-Zielnukleinsäure verwendet werden.
  • Die Verfahren ermöglichen den sensitiven und spezifischen Nachweis von GBS-Nukleinsäuren. Die Verfahren umfassen das Durchführen einer Nukleinsäure-Amplifikation einer GBS-Zielregion und das Nachweisen des amplifizierten Produkts, indem beispielsweise das amplifizierte Produkt spezifisch mit einer Nukleinsäurenachweissonde hybridisiert wird, die ein Signal liefert, um das Vorhandensein von GBS in der Probe anzuzeigen. Der Amplifikationsschritt umfasst das Inkontaktbringen der Probe mit einem oder mehreren Amplifikationsoligomeren, die für eine Zielsequenz in einer GBS-Zielnukleinsäure spezifisch sind, um ein amplifiziertes Produkt herzustellen, wenn GBS-Nukleinsäure in der Probe vorhanden ist. Die Amplifikation synthetisiert zusätzliche Kopien der Zielsequenz oder ihres Komplements unter Verwendung mindestens einer Nukleinsäurepolymerase und eines Amplifikationsoligomers, um die Kopien von einem Matrizenstrang herzustellen (z.B. durch Verlängern der Sequenz von einem Primer unter Verwendung des Matrizenstrangs). Eine Ausführungsform zum Nachweis des amplifizierten Produkts verwendet einen Hybridisierungsschritt, der das Inkontaktbringen des amplifizierten Produkts mit mindestens einem Nachweissondenoligomer umfasst, das für eine durch die ausgewählten Amplifikationsoligomere amplifizierte Sequenz spezifisch ist, z.B. eine Sequenz, die in der Zielsequenz enthalten ist, flankiert durch ein Paar von ausgewählten Amplifikationsoligomeren.
  • Bevorzugte Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sind so konfiguriert, dass sie spezifisch mit der Nukleinsäure aller GBS-Serotypen Ia, Ib, Ic, II, III, IV, V, VI, VII, VIII und IX hybridisieren mit minimaler Kreuzreaktivität mit anderen, Nicht-GBS-Nukleinsäuren, bei denen der Verdacht besteht, dass sie sich in einer Probe befinden (z.B. andere bakterielle Krankheitserreger). In bestimmten Varianten ermöglichen die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen ferner den Nachweis von Sequenzen an einem nicht hämolytischen Stamm von GBS. In einigen Aspekten sind die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung so konfiguriert, dass sie spezifisch mit GBS-Nukleinsäure mit minimaler Kreuzreaktivität mit einem oder mehreren Nicht-GBS-Pathogenen hybridisieren, die in einer der Tabellen 9-11, 15, 16, 20 und 22 aufgeführt sind (siehe Beispiele weiter unten). In einem Aspekt sind die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung Teil eines Multiplexsystems, das ferner Komponenten und Verfahren zum Nachweis eines oder mehrerer dieser Nicht-GBS-Pathogene umfasst.
  • In bestimmten Aspekten der Erfindung wird eine Zusammensetzung bereitgestellt, die mindestens zwei Amplifikationsoligomere umfasst, um die Anwesenheit oder Abwesenheit von GBS in einer Probe zu bestimmen. Typischerweise umfasst die Zusammensetzung mindestens zwei Amplifikationsoligomere zum Amplifizieren einer Zielregion einer GBS-Zielnukleinsäure, die der Sequenz von SEQ ID NO:1 (SIP-Gen) oder SEQ ID NO:2 (CFB-Gen) entspricht. In solchen Ausführungsformen umfasst mindestens ein Amplifikationsoligomer eine Zielhybridisierungssequenz in der Sense-Orientierung („sense THS“) und mindestens ein Amplifikationsoligomer umfasst eine Zielhybridisierungssequenz in der Antisense-Orientierung („antisense THS“), wobei die Sense-THS und Antisense-THS jeweils so konfiguriert sind, dass sie spezifisch mit einer GBS-Zielsequenz hybridisieren, die einer in SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:2 enthaltenen Sequenz entspricht, und wobei die Zielhybridisierungssequenzen so ausgewählt sind, dass die von Antisense-THS gezielt angesteuerte GBS-Sequenz sich stromabwärts der GBS-Sequenz befindet, welche von dem Sense-THS gezielt angesteuert wird (d.h. die mindestens zwei Amplifikationsoligomere sind so angeordnet, dass sie die zu amplifizierende Zielregion flankieren).
  • In einigen Varianten umfasst eine Zusammensetzung (i) ein SIP-spezifisches Amplifikationsoligomer, das eine SIP-spezifische Zielhybridisierungssequenz umfasst, die im Wesentlichen der in SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:7 oder SEQ ID NO:8 gezeigten Sequenz entspricht oder mit dieser identisch ist oder das Komplement davon oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon. In einigen Varianten enthält eine Zusammensetzung (ii) ein CFB-spezifisches Amplifikationsoligomer umfassend eine CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz, die von ungefähr 17 bis ungefähr 24 zusammenhängende Nukleotide umfasst und im Wesentlichen einer Sequenz, die in der Sequenz von SEQ ID NO:26 oder dem Komplement davon oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon enthalten ist, entspricht oder mit dieser identisch ist; in einigen solchen Ausführungsformen umfasst die CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz eine Sequenz, die im Wesentlichen der Sequenz von SEQ ID NO:28 oder SEQ ID NO:27 oder dem Komplement davon oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon entspricht oder mit dieser identisch ist (z.B. eine Sequenz, die im Wesentlichen der in SEQ ID NO:12 oder SEQ ID NO:14 gezeigten Sequenz oder dem Komplement davon oder einem RNA-Äquivalent oder DNA/RNA-Chimäre davon entspricht oder mit dieser identisch ist) oder eine Sequenz ist, die im Wesentlichen der in SEQ ID NO:18 gezeigten Sequenz oder dem Komplement davon oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon entspricht oder mit dieser identisch ist. In einigen Varianten umfasst eine Zusammensetzung (iii) ein CFB-spezifisches Amplifikationsoligomer, das eine CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz umfasst, die im Wesentlichen der in SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:20 oder SEQ ID NO:21 gezeigten Sequenz oder dem Komplement davon oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon entspricht oder mit dieser identisch ist. In Varianten, die ein SIP-spezifisches oder CFB-spezifisches Amplifikationsoligomer von (i), (ii) oder (iii), wie oben, umfassen, umfasst die Oligomerkombination mindestens ein Amplifikationsoligomer umfassend eine SIP-spezifische oder CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz mit entgegengesetzter Polarität (Sense gegenüber Antisense oder umgekehrt) als Zielhybridisierungssequenz des Oligomers von (i), (ii) oder (iii), so dass mindestens zwei Amplifikationsoligomere eine zu amplifizierende Zielregion flankieren. In bestimmten Ausführungsformen wird die Zusammensetzung als wässrige oder getrocknete Formulierung zur Amplifikation von GBS-Nukleinsäure oder als Reaktionsgemisch, das eine solche Formulierung umfasst oder aus einer solchen rekonstituiert wird, bereitgestellt.
  • In spezifischeren Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfasst eine Zusammensetzung zum Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit von GBS in einer Probe (1) mindestens ein Amplifikationsoligomer, das eine SIP-spezifische oder CFB-spezifische Zielhybridisierungsregion umfasst, die im Wesentlichen mindestens einer Sense-Oligomersequenz entspricht, dargestellt in Tabelle 1, und (2) mindestens ein Amplifikationsoligomer, umfassend eine SIP-spezifische oder CFB-spezifische Zielhybridisierungsregion, die im Wesentlichen mindestens einer in Tabelle 1 dargestellten Antisense-Oligomersequenz entspricht. In einigen solchen Ausführungsformen umfasst die Zusammensetzung ein erstes SIP-spezifisches Amplifikationsoligomer und ein erstes CFB-spezifisches Amplifikationsoligomer von (1) oben und ein zweites SIP-spezifisches und zweites CFB-spezifisches Amplifikationsoligomer von (2) oben. In bestimmten Varianten umfassen oder bestehen die Sense- und/oder Antisense-Zielhybridisierungssequenz(en) einer Amplifikationsoligomeren-Kombination aus der oder den Sense- und/oder Antisense-Sequenz(en), die aus Tabelle 1 ausgewählt sind. Tabelle 1: Beispielhafte Sense- und Antisense-Amplifikationsoligomer-Zielhybridisierungssequenzen zur Amplifikation von GBS-SIP- oder CFB-Zielregionen
    SEO ID NO : Sequenz (5' → 3') Sense/Antisense 1 Zielgen
    3 CAGTCGCAAGTGTTCAAGC Sense SIP
    4 AACGCTTAGTGTATCACCATAT Antisense SIP
    7 AACAAATGCTGCTGGTCAAA Sense SIP
    8 AGAATATGTCTTCATTGGCGAA Antisense SIP
    SEQ ID NO : Sequenz (5' → 3') Sense/Antisense 1 Zielgen
    12 GTGGCTGGTGCATTGTTATTT Sense CFB
    13 CCATTTGCTGGGCTTGATTATT Antisense CFB
    14 TAGTGGCTGGTGCATTGTT Sense CFB
    15 CATTTGCTGGGCTTGATTATTAC T Antisense CFB
    16 CTGGAATACACGCTTTACTAGAG ATA Sense CFB
    17 ACTTGTTGTACCGTAACATTTGG Antisense CFB
    18 TATCTATCTGGAACTCTAGTGGC T Sense CFB
    20 CAAAGATAATGTTCAGGGAACA GA Sense CFB
    21 GCTTCTACACGACTACCAATAGA Antisense CFB
  • Die Sense-/Antisense-Bezeichnung dieser Sequenzen dient nur als Beispiel. Eine solche Bezeichnung beschränkt eine Sequenz nicht notwendigerweise auf die beigefügte Bezeichnung.
  • In bestimmten Varianten umfasst eine Zusammensetzung zum Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit von GBS in einer Probe, wie hierin beschrieben, ferner mindestens ein Nachweissondenoligomer, das konfiguriert ist, um spezifisch mit einer GBS-SIP- oder CFB-Zielsequenz zu hybridisieren, die unter Verwendung des ersten und zweiten Amplifikationsoligomers amplifizierbar ist (z.B. eine SIP- oder CFB-Zielsequenz, die in SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:2 enthalten ist, oder das Komplement davon, das von den Zielhybridisierungssequenzen des ersten und zweiten Amplifikationsoligomers flankiert wird). Zu besonders geeigneten SIP-spezifischen Nachweissondenoligomeren gehören zum Beispiel Oligomere, die eine SIP-spezifische Zielhybridisierungssequenz umfassen, die im Wesentlichen der in SEQ ID NO:9 oder SEQ ID NO:11 gezeigten Sequenz entspricht oder mit dieser identisch ist, oder Komplement davon oder ein RNA-Äquivalent oder DNA/RNA-Chimäre davon. Besonders geeignete CFB-spezifische Nachweissondenoligomere umfassen beispielsweise Oligomere, die eine CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz umfassen, die im Wesentlichen der in SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24 oder SEQ ID NO:25 gezeigten Sequenz oder dem Komplement davon oder einem RNA-Äquivalenten oder einer DNA/RNA-Chimäre davon entsprechen oder mit diesen identisch ist. Ein Nachweissondenoligomer kann ein 2'-Methoxy-Grundgerüst an einer oder mehreren Verknüpfungen im Nukleinsäure-Grundgerüst enthalten. In einigen Varianten enthält eine Zusammensetzung mindestens zwei Nachweissondenoligomere. In bestimmten Ausführungsformen wird ein Nachweissondenoligomer in einer wässrigen oder getrockneten Formulierung zum Nachweis von GBS-Nukleinsäure oder ein Reaktionsgemisch bereitgestellt, das eine solche Formulierung umfasst oder daraus rekonstituiert ist.
  • Typischerweise umfasst ein Nachweissondenoligomer gemäß der vorliegenden Erfindung weiterhin eine Markierung. Besonders geeignete Markierungen schließen Verbindungen ein, die ein nachweisbares Lichtsignal aussenden, z.B. Fluorophore oder lumineszierende (z.B. chemilumineszierende) Verbindungen, die in einem homogenen Gemisch nachgewiesen werden können. Auf einer bestimmten Sonde kann mehr als eine Markierung und mehr als eine Art von Markierung vorhanden sein, oder der Nachweis kann auf der Verwendung eines Sondengemischs beruhen, bei der jede Sonde mit einer Verbindung markiert ist, die ein nachweisbares Signal erzeugt (siehe z.B. US-Patente Nr. 6,180,340 und 6,350,579 , auf die hier jeweils Bezug genommen wird). Markierungen können durch verschiedene Mittel an eine Sonde gebunden werden, einschließlich kovalenter Bindungen, Chelatbildung und ionischer Wechselwirkungen, aber vorzugsweise ist die Markierung kovalent gebunden. Beispielsweise weist in einigen Ausführungsformen eine Nachweissonde eine angehängte Chemilumineszenzmarkierung auf, wie z.B. eine Acridiniumester (AE)-Verbindung (siehe z.B. US-Patente Nr. 5,185,439 , 5,639,604 , 5,585,481 und 5,656,744 ), die jeweils durch Bezugnahme hierin aufgenommen sind). Eine Markierung, wie z.B. eine fluoreszierende oder chemilumineszierende Markierung, ist typischerweise durch einen Nicht-Nukleotid-Linker an die Sonde gebunden (siehe z.B. US-Patente Nr. 5,585,481 , 5,656,744 und 5,639,604 , insbesondere in Spalte 10, Zeile 6 bis Spalte 11, Zeile 3 und Beispiel 8; jeweils durch Bezugnahme hierin aufgenommen).
  • In einigen Ausführungsformen umfasst eine Sonde (die z.B. eine fluoreszierende Markierung umfasst) ferner eine zweite Markierung, die mit der ersten Markierung interagiert. Die zweite Markierung kann beispielsweise ein Quencher sein. Nachweissonden, die sowohl eine fluoreszierende Markierung als auch einen Quencher umfassen, sind in Fluoreszenzresonanzenergietransfer-Assays (FRET-Assays) besonders nützlich. Spezifische Varianten solcher Nachweissonden umfassen z.B. eine TaqMan™-Nachweissonde (Roche Molecular Diagnostics) und ein „Molecular Beacon“ (siehe z.B. Tyagi et al., Nature Biotechnol. 16: 49-53, 1998; US-Patente Nr 5,118,801 und 5,312,728 ; jeweils durch Bezugnahme hierin aufgenommen). TaqMan™-Sonden (oder ähnliche doppelt markierte lineare Sonden, die sowohl eine Fluoreszenzmarkierung als auch einen Quencher umfassen) können in Assays verwendet werden, bei denen die Hybridisierung der Sonde an ein Ziel oder Amplikon und anschließender Nukleolyse durch eine Polymerase mit 5'-3'-Exonukleaseaktivität zur Freisetzung der fluoreszierenden Markierung führt und dadurch zu einer erhöhten Fluoreszenz oder einer Fluoreszenz, unabhängig von der Wechselwirkung mit der zweiten Markierung.
  • In einigen Anwendungen wird eine Nachweissonde verwendet, die mindestens ein gewisses Maß an Selbstkomplementarität aufweist, um den Nachweis von Sonde:Ziel-Duplexen in einer Testprobe zu erleichtern, ohne dass zunächst die nicht hybridisierte Sonde vor dem Nachweis entfernt werden muss. Spezifische Ausführungsformen solcher Nachweissonden umfassen zum Beispiel Sonden, die Konformationen bilden, die durch intramolekulare Hybridisierung gehalten werden, wie zum Beispiel Konformationen, die allgemein als Haarnadeln bezeichnet werden. Geeignete Haarnadelsonden umfassen eine „molekulare Torch“ (fluoreszenzmarkierte Sonde) (siehe z.B. US-Patente Nr. 6,849,412 ; 6,835,542 ; 6,534,274 und 6,361,945 ) und einen „molekularen Beacon“ (siehe z.B. US-Patent Nr. 5,118,801 und US-Patent Nr 5,312,728 ). Molekulare Torches umfassen unterschiedliche Regionen der Selbstkomplementarität (als „Zielbindungsdomäne“ und „Zielschließdomäne“ bezeichnet), die durch eine Verbindungsregion (z.B. einen Linker -(CH2CH2O)3-) verbunden sind und die unter vorbestimmten Hybridisierungstestbedingungen miteinander hybridisieren. Wenn sie einem geeigneten Ziel oder denaturierenden Bedingungen ausgesetzt werden, verschmelzen die zwei komplementären Regionen (die vollständig oder teilweise komplementär sein können) der molekularen Torch, wodurch die Zielbindungsdomäne für die Hybridisierung zu einer Zielsequenz verfügbar bleibt, wenn die vorbestimmten Hybridisierungstestbedingungen wiederhergestellt sind. Molekulare Torches sind so konstruiert, dass die Zielbindungsdomäne die Hybridisierung an die Zielsequenz gegenüber der Zielschließdomäne begünstigt. Die Zielbindungsdomäne und die Zielschließdomäne eines molekularen Torchs umfassen wechselwirkende Markierungen (z.B. Fluoreszenz/Quencher), die so positioniert sind, dass ein anderes Signal erzeugt wird, wenn der molekulare Torch selbsthybridisiert wird, als wenn der molekulare Torch an eine Zielnukleinsäure hybridisiert wird, wodurch der Nachweis von Sonde:Ziel-Duplexen in einer Testprobe in Gegenwart einer nicht hybridisierten Sonde mit einer damit verbundenen praktikablen Markierung ermöglicht wird.
  • In anderen Ausführungsformen ist eine Nachweissonde ein lineares Oligomer, das im Wesentlichen keine Konformationen bildet, die von intramolekularen Bindungen gehalten werden. In spezifischen Varianten umfasst ein Oligomer mit linearer Nachweissonde eine chemilumineszierende Verbindung als Markierung (z.B. eine Acridiniumester(AE)-Verbindung). In anderen Ausführungsformen enthält ein Oligomer mit linearer Nachweissonde ein Fluorophor als Markierung. In einigen Ausführungsformen eines linearen Nachweissondenoligomers, das ein Fluorophor umfasst, umfasst das Oligomer ferner eine Quencher-Einheit (z.B. eine TaqMan-Sonde).
  • Beispiele für wechselwirkende Donor/Akzeptor-Markierungspaare, die im Zusammenhang mit der Offenbarung verwendet werden können und nicht versuchen, FRET von Nicht-FRET-Paaren zu unterscheiden, umfassen Fluorescein/Tetramethylrhodamin, IAEDANS/Fluororescein, EDANS/DABCYL, Cumarin/DABCYL, Fluorescein/Fluorescein, BODIPY FL/BODIPY FL, Fluorescein/DABCYL, Luzifergelb/DABCYL, BODIPY/DABCYL, Eosin/DABCYL, Erythrosin/DABCYL, Tetramethylrhodamin/DABCYL, Texas Red/DABCYL, CY5/BH1, CY5/BH2, CY3/BH1, CY3/BH2 - und Fluorescein/QSY7-Farbstoff. Der Fachmann wird verstehen, dass bei unterschiedlichen Donor- und Akzeptorfarbstoffen die Energieübertragung durch das Auftreten einer sensibilisierten Fluoreszenz des Akzeptors oder durch Löschen der Donorfluoreszenz nachgewiesen werden kann. Nicht fluoreszierende Akzeptoren wie DABCYL und die QSY7-Farbstoffe beseitigen vorteilhafterweise das potentielle Problem der Hintergrundfluoreszenz, das sich aus einer direkten (d.h. nicht sensibilisierten) Akzeptoranregung ergibt. Beispielhafte Fluorophoreinheiten, die als ein Mitglied eines Donor-Akzeptor-Paares verwendet werden können, umfassen Fluorescein, ROX und die CY-Farbstoffe (wie CY5). Beispielhafte Quencher-Einheiten, die als ein anderes Mitglied eines Donor-Akzeptor-Paares verwendet werden können, umfassen DABCYL- und die BLACK HOLE QUENCHER-Einheiten, die von Biosearch Technologies, Inc. (Novato, CA) erhältlich sind.
  • In einigen Ausführungsformen ist ein markiertes Oligomer (z.B. eine Nachweissonde) nicht verlängerbar. Beispielsweise kann das markierte Oligomer durch 3'-Phosphorylierung mit einem 3'terminalen 3'-Desoxynukleotid (z.B. einem terminalen 2',3'-Didesoxynukleotid) mit einem 3'-terminalen invertierten Nukleotid nicht verlängerbar gemacht werden (z.B. in dem das letzte Nukleotid so invertiert ist, dass es mit dem vorletzten Nukleotid durch eine 3'-zu-3'-Phosphodiester-Bindung oder ein Analogon davon, wie ein Phosphorthioat, verbunden ist) oder ein daran gebundenes Fluorophor, einen Quencher oder eine andere Markierung aufweist, die die Verlängerung stört (möglicherweise, aber nicht notwendigerweise, über die 3'-Position des terminalen Nukleotids gebunden). In einigen Ausführungsformen ist das 3'-terminale Nukleotid nicht methyliert.
  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Zusammensetzungen, die ein oder mehrere der hier beschriebenen Nachweissondenoligomer(e) umfassen.
  • In einigen Aspekten stellt die vorliegende Erfindung Verfahren bereit, bei denen ein Oligomer oder eine Oligomerkombination, wie hierin beschrieben, verwendet wird. Jedes hierin offenbarte Verfahren ist auch als Offenbarung entsprechender Verwendungen von Materialien zu verstehen, die an dem auf den Zweck des Verfahrens gerichteten Verfahren beteiligt sind. Jede der Oligomere, die eine GBS-SIP- oder CFB -Zielhybridisierungssequenz und beliebige Kombinationen umfassen (z.B. Kits und Zusammensetzungen), die ein solches Oligomer umfassen, sind auch für den Einsatz zum Nachweis oder zur Quantifizierung von GBS und zur Verwendung in der Herstellung einer Zusammensetzung zum Nachweis oder zur Quantifizierung von GBS als offenbart zu verstehen.
  • Allgemein gesagt können Verfahren eine oder mehrere der folgenden Komponente(n) umfassen: Ziel-Einfangen, in welcher GBS-Nukleinsäure (z.B. aus einer Probe, wie einer klinischen Probe) an ein Einfang-Oligomer angelagert wird; Isolierung, z.B. Waschen, um Material zu entfernen, das nicht mit einem Erfassungs-Oligomer assoziiert ist; Amplifikation; und Amplikonerkennung, z.B. Amplikonquantifizierung, die in Echtzeit mit der Amplifikation durchgeführt werden kann. Bestimmte Ausführungsformen beinhalten jeden der vorhergehenden Schritte. Bestimmte Ausführungsformen beinhalten eine exponentielle Amplifikation, gegebenenfalls mit einem vorhergehenden linearen Amplifikationsschritt. Bestimmte Ausführungsformen umfassen eine exponentielle Amplifikation und einen Amplikonnachweis. Bestimmte Ausführungsformen betreffen zwei der oben aufgeführten Komponenten. Bestimmte Ausführungsformen umfassen zwei beliebige oben aufgeführte Komponenten, z.B. Waschen und Amplifizieren oder Amplifizieren und Nachweisen.
  • In einigen Ausführungsformen stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit von Streptokokken der Gruppe B (GBS) in einer Probe unter Verwendung einer Oligomerkombination, wie hierin beschrieben, bereit. Ein solches Verfahren umfasst im Allgemeinen (1) Inkontaktbringen der Probe mit mindestens zwei Amplifikationsoligomeren zum Amplifizieren einer GBS-SIP- oder CFB-Nukleinsäure-Zielregion, die einer SIP- oder CFB-Zielnukleinsäure entspricht, wobei die mindestens zwei Amplifikationsoligomere wie oben beschrieben sind; (2) Durchführen einer Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion in vitro, wobei eine in der Probe vorhandene GBS-SIP- oder CFB-Zielnukleinsäure als Matrize zur Erzeugung eines Amplifikationsprodukts verwendet wird; und (3) Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit des Amplifikationsprodukts, wodurch die Anwesenheit oder Abwesenheit von GBS in der Probe bestimmt wird. Ein Nachweisverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst typischerweise ferner den Schritt des Erhaltens der Probe, die mit den mindestens zwei Amplifikationsoligomeren in Kontakt gebracht werden soll. In bestimmten Ausführungsformen umfasst das „Erhalten“ einer in den Schritten (1)-(3) zu verwendenden Probe beispielsweise das Empfangen der Probe an einer Testeinrichtung oder an einem anderen Ort, an dem ein oder mehrere Schritte des Verfahrens durchgeführt werden, und/oder das Abrufen der Probe von einem Ort (z.B. aus dem Lager oder einem anderen Lagerungsort) in einer Einrichtung, an dem ein oder mehrere Schritt(e) des Verfahrens ausgeführt werden.
  • Das Amplifizieren einer GBS-Zielsequenz verwendet eine In-vitro-Amplifikationsreaktion unter Verwendung von mindestens zwei Amplifikationsoligomeren, die eine zu amplifizierende Zielregion flankieren. In besonderen Ausführungsformen ist die zu amplifizierende Zielregion eine GBS-SIP-Region, die im Wesentlichen der SEQ ID NO: 1 von ungefähr Nukleotidposition 56 bis ungefähr Nukleotidposition 189 oder von ungefähr Nukleotidposition 349 bis ungefähr Nukleotidposition 489 entspricht. Besonders geeignete Oligomerkombinationen zur Amplifikation dieser GBS-SIP-Zielregionen sind hierin beschrieben. Zum Beispiel kann in einigen Ausführungsformen eine Amplifikationsoligomeren-Kombination eine SIP-Zielregion zur Amplifikation von ersten und zweiten SIP-spezifischen Amplifikationsoligomeren enthalten, die jeweils (A) eine erste SIP-spezifische Zielhybridisierungssequenz, die SEQ-ID NO:3 oder eine Sequenz ist, die im Wesentlichen SEQ ID NO:3 entspricht, oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon umfassen, und (B) eine zweite SIP-spezifische Zielhybridisierungssequenz, die SEQ ID NO:4 oder eine Sequenz ist, die im Wesentlichen SEQ ID NO:4 entspricht, oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon umfassen. In anderen Ausführungsformen umfasst eine Amplifikationsoligomeren-Kombination zum Amplifizieren einer SIP-Zielregion ein erstes und ein zweites SIP-spezifisches Amplifikationsoligomer, umfassend jeweils (A) eine erste SIP-spezifische Zielhybridisierungssequenz, die SEQ ID NO:7 ist, oder eine Sequenz, die im Wesentlichen SEQ ID NO:7 entspricht, oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon und (B) eine zweite SIP-spezifische Zielhybridisierungssequenz, die SEQ ID NO:8 ist, oder eine Sequenz ist, die im Wesentlichen SEQ ID NO:8 entspricht, oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon.
  • In anderen Ausführungsformen ist die zu amplifizierende Zielregion eine GBS-CFB-Zielregion, die im Wesentlichen der SEQ ID NO:2 von ungefähr Nukleotidposition 38 bis ungefähr Nukleotidposition 151, von ungefähr Nukleotidposition 22 bis ungefähr Nukleotidposition 151, von ungefähr Nukleotidposition 192 bis ungefähr Nukleotidposition 329 oder von ungefähr Nukleotidposition 585 bis ungefähr Nukleotidposition 716 entspricht. Besonders geeignete Oligomerkombinationen zur Amplifikation dieser GBS-CFB-Zielregionen sind hierin beschrieben. Beispielsweise umfasst in einigen Ausführungsformen eine Amplifikationsoligomeren-Kombination zum Amplifizieren einer CFB-Zielregion ein erstes und ein zweites CFB-spezifisches Amplifikationsoligomer, die jeweils (A) eine erste CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz umfassen, die ungefähr 17 bis ungefähr 24 zusammenhängende Nukleotide umfasst, die im Wesentlichen einer Sequenz entsprechen oder mit dieser identisch sind, die in der Sequenz von SEQ ID NO:26 enthalten ist, oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon, und (B) eine zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz, die SEQ ID NO:13 oder SEQ ID NO:15 oder eine Sequenz ist, die im Wesentlichen SEQ ID NO: 13 oder SEQ ID NO: 15 entspricht, oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon; in spezifischeren Varianten einer solchen ersten CFB-spezifischen Zielhybridisierungssequenz von (A) wird die CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz ausgewählt aus (i) einer Sequenz, die im Wesentlichen der Sequenz von SEQ ID NO:28 oder SEQ ID NO:27 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon (z.B. eine Sequenz, die SEQ ID NO: 12 oder SEQ ID NO: 14 ist, oder eine Sequenz, die im Wesentlichen SEQ ID NO: 12 oder SEQ ID NO:14 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon) und (ii) eine Sequenz, die SEQ ID NO:18 oder eine Sequenz ist, die im Wesentlichen SEQ ID NO: 18 entspricht, oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon. In anderen Ausführungsformen umfasst eine Amplifikationsoligomeren-Kombination zum Amplifizieren einer CFB-Zielregion ein erstes und ein zweites CFB-spezifisches Amplifikationsoligomer, umfassend jeweils (A) eine erste CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz, die im Wesentlichen SEQ ID NO:16 oder eine Sequenz ist, die SEQ ID NO:16 entspricht, oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon, und (B) eine zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz, die SEQ ID NO: 17 oder eine im Wesentlichen der SEQ ID NO: 17 entsprechende Sequenz ist, oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon. In anderen Ausführungsformen umfasst eine Amplifikationsoligomeren-Kombination zum Amplifizieren einer CFB-Zielregion ein erstes und ein zweites CFB-spezifisches Amplifikationsoligomer, umfassend jeweils (A) eine erste CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz, die im Wesentlichen SEQ ID NO: 18 oder eine Sequenz entsprechend SEQ ID NO:18 ist, oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon, und (B) eine zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz, die SEQ ID NO: 15 oder eine Sequenz ist, die im Wesentlichen SEQ ID NO: 15 entspricht, oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon. In anderen Ausführungsformen umfasst eine Amplifikationsoligomeren-Kombination zum Amplifizieren einer CFB-Zielregion ein erstes und ein zweites CFB-spezifisches Amplifikationsoligomer, umfassend jeweils (A) eine erste CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz, die im Wesentlichen SEQ ID NO:20 oder eine Sequenz ist, die SEQ ID NO:20 entspricht oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B) eine zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz, die SEQ ID NO:21 oder eine im Wesentlichen der SEQ ID NO:21 entsprechende Sequenz ist oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon.
  • Ein Nachweisverfahren gemäß der vorliegenden Offenbarung kann ferner den Schritt des Erhaltens der Probe umfassen, die nachfolgenden Schritten des Verfahrens unterzogen werden soll. In bestimmten Ausführungsformen umfasst das „Erhalten“ einer zu verwendenden Probe beispielsweise das Empfangen der Probe an einer Testeinrichtung oder an einem anderen Ort, an dem ein oder mehrere Schritt(e) des Verfahrens durchgeführt werden, und/oder das Abrufen der Probe von einem Ort (z.B. aus dem Lager oder einer anderen Verwahrstelle) in einer Einrichtung, in der ein oder mehrere Schritt(e) des Verfahrens durchgeführt werden.
  • In bestimmten Ausführungsformen umfasst das Verfahren ferner das Reinigen der GBS-Zielnukleinsäure von anderen Komponenten in der Probe, z.B. vor einer Amplifikation, wie vor einem Einfangschritt. Eine solche Reinigung kann Verfahren zum Abtrennen und/oder Konzentrieren von Organismen, die in einer Probe enthalten sind, von anderen Probenkomponenten oder zum Entfernen oder Abbau von Nicht-Nukleinsäure-Probenkomponenten, z.B. Protein, Kohlenhydrat, Salz, Lipid usw., umfassen. In einigen Ausführungsformen wird DNA in der Probe z B. mit DNase abgebaut und gegebenenfalls die DNase entfernt oder inaktiviert oder die abgebaute DNA entfernt.
  • In bestimmten Ausführungsformen umfasst das Reinigen der Zielnukleinsäure das Einfangen der Zielnukleinsäure, um die Zielnukleinsäure spezifisch oder nicht spezifisch von anderen Probenkomponenten zu trennen. Nicht spezifische Ziel-Einfangs-Verfahren können das selektive Ausfällen von Nukleinsäuren aus einem im Wesentlichen wässrigen Gemisch, das Anhaften von Nukleinsäuren an einem Träger, der gewaschen wird, um andere Probenkomponenten zu entfernen, oder andere Mittel zum physikalischen Trennen von Nukleinsäuren aus einem Gemisch, das GBS-Nukleinsäure und andere Probenkomponenten enthält, umfassen.
  • Das Einfangen des Ziels erfolgt typischerweise in einem Lösungsphasengemisch, das ein oder mehrere Einfangsondenoligomere enthält, die unter Hybridisierungsbedingungen an die GBS-SIP- oder CFB-Zielsequenz hybridisieren. Bei Ausführungsformen, die eine Einfangssondenendung umfassen, wird der GBS-Ziel: Einfangssondenkomplex durch Einstellen der Hybridisierungsbedingungen eingefangen, so dass die Einfangssondenendung mit einer immobilisierten Sonde hybridisiert. Bestimmte Ausführungsformen verwenden einen partikulären festen Träger, wie paramagnetische Kügelchen.
  • Die Isolierung kann nach dem Einfangen erfolgen, wobei beispielsweise der Komplex auf dem festen Träger von anderen Probenkomponenten getrennt wird. Die Isolierung kann durch jede geeignete Technik erfolgen, z.B. durch ein- oder mehrmaliges Waschen eines mit der GBS-SIP- oder CFB-Zielsequenz assoziierten Trägers (z.B. zwei- oder dreimal), um andere Probenkomponenten und/oder ungebundenes Oligomer zu entfernen. In Ausführungsformen unter Verwendung eines partikulären festen Trägers, wie paramagnetischen Kügelchen, können mit dem GBS-Ziel assoziierte Partikel in einer Waschlösung suspendiert und aus der Waschlösung gewonnen werden, in einigen Ausführungsformen unter Verwendung magnetischer Anziehung. Um die Anzahl der Handhabungsschritte zu begrenzen, kann die GBS-SIP- oder CFB-Zielnukleinsäure amplifiziert werden, indem einfach die GBS-Zielsequenz in dem Komplex auf dem Träger mit Amplifikationsoligomeren gemischt wird und die Amplifikationsschritte fortgesetzt werden.
  • Das exponentielle Amplifizieren einer GBS-Zielsequenz verwendet eine In-vitro-Amplifikationsreaktion unter Verwendung von mindestens zwei Amplifikationsoligomeren, die eine zu amplifizierende Zielregion flankieren. In einigen Ausführungsformen werden mindestens erste und zweite Oligomere, wie hierin beschrieben, bereitgestellt. In einigen Ausführungsformen wird eine Vielzahl von Oligomerpaaren bereitgestellt; In einigen derartigen Varianten umfasst eine Vielzahl von Oligomerpaaren Oligomerpaare, die zur Hybridisierung an mindestens zwei GBS-Zielnukleinsäuren konfiguriert sind (z.B. mindestens ein Oligomerpaar, das zur Hybridisierung an eine SIP-Zielnukleinsäure konfiguriert ist, und mindestens ein Oligomerpaar, das zur Hybridisierung an eine CFB-Zielnukleinsäure konfiguriert ist). Die Amplifikationsreaktion kann zyklisch oder isotherm sein. Geeignete Amplifikationsverfahren umfassen beispielsweise Replikase-vermittelte Amplifikation, Polymerase-Kettenreaktion (PCR), LigaseKettenreaktion (LCR), Strangverdrängungsamplifikation (SDA) und Transkriptions-vermittelte oder Transkriptions-assoziierte Amplifikation (TMA).
  • Ein Nachweisschritt kann unter Verwendung einer Vielzahl bekannter Techniken durchgeführt werden, um ein Signal zu detektieren, das spezifisch mit der amplifizierten Zielsequenz assoziiert ist, wie z. B. durch Hybridisieren des Amplifikationsprodukts mit einer markierten Nachweissonde und Nachweis eines Signals, das von der markierten Sonde stammt (einschließlich eines Markers, der nach der Hybridisierung in einigen Ausführungsformen von der Sonde freigesetzt wurde). In einigen Ausführungsformen umfasst die markierte Sonde eine zweite Einheit, wie einen Quencher oder eine andere Einheit, die mit der ersten Markierung in Wechselwirkung tritt, wie oben diskutiert. Der Nachweisschritt kann auch zusätzliche Informationen über die amplifizierte Sequenz liefern, wie z. B. die gesamte oder einen Teil ihrer Nukleinsäure-Basensequenz. Der Nachweis kann durchgeführt werden, nachdem die Amplifikationsreaktion abgeschlossen ist, oder kann gleichzeitig mit der Amplifikation der Zielregion durchgeführt werden, z. B. in Echtzeit. In einer Ausführungsform ermöglicht der Nachweisschritt einen homogenen Nachweis, z. B. Nachweis der hybridisierten Sonde, ohne die nicht hybridisierte Sonde aus dem Gemisch zu entfernen (siehe z. B. US-Patente Nr. 5,639,604 und 5,283,174 ). In einigen Ausführungsformen sind die Nukleinsäuren mit einer Oberfläche assoziiert, die zu einer physikalischen Änderung führt, wie beispielsweise einer nachweisbaren elektrischen Änderung. Amplifizierte Nukleinsäuren können nachgewiesen werden, indem sie in oder auf einer Matrix konzentriert werden und die mit ihnen assoziierten Nukleinsäuren oder Farbstoffe (z. B. ein Interkalationsmittel wie Ethidiumbromid oder Cybergrün) nachgewiesen werden oder ein Anstieg des mit der Nukleinsäure in Lösungsphase assoziierten Farbstoffs nachgewiesen wird. Andere Nachweisverfahren können Nukleinsäurenachweissonden verwenden, die so konfiguriert sind, dass sie spezifisch mit einer Sequenz im amplifizierten Produkt hybridisieren und das Vorhandensein des Sonden-Produkt-Komplexes nachweisen, oder indem ein Komplex von Sonden verwendet wird, der das nachweisbare Signal, das mit den amplifizierten Produkten assoziiert ist, amplifizieren kann (z. B. US-Patente Nr. 5,424,413 , 5,451,503 und 5,849,481 , auf die hier jeweils Bezug genommen wird). Direkt oder indirekt markierte Sonden, die spezifisch mit dem amplifizierten Produkt assoziieren, liefern ein nachweisbares Signal, das die Anwesenheit der Zielnukleinsäure in der Probe anzeigt. Insbesondere enthält das amplifizierte Produkt eine Zielsequenz in oder komplementär zu einer Sequenz im GBS-SIP- oder CFB-Gen, und eine Sonde bindet direkt oder indirekt an eine im amplifizierten Produkt enthaltene Sequenz, um die Anwesenheit von GBS-Nukleinsäure in die getestete Probe anzuzeigen.
  • In Ausführungsformen, die das amplifizierte Produkt nahe oder am Ende des Amplifikationsschritts detektieren, kann eine lineare Nachweissonde verwendet werden, um ein Signal bereitzustellen, um die Hybridisierung der Sonde mit dem amplifizierten Produkt anzuzeigen. Ein Beispiel für einen solchen Nachweis verwendet eine Lumineszenz-markierte Sonde, die mit der Zielnukleinsäure hybridisiert. Die Lumineszenzmarkierung wird dann von einer nicht hybridisierten Sonde hydrolysiert. Der Nachweis erfolgt durch Chemilumineszenz mit einem Luminometer. (siehe z. B. die Internationale Patentanmeldung WO 89/002476 , hierin durch Bezugnahme aufgenommen). In anderen Ausführungsformen, die eine Echtzeitdetektion verwenden, kann die Nachweissonde eine Haarnadelsonde sein, wie beispielsweise eine Molecular Beacon-, Molecular Torch- oder Hybridisierungsschaltersonde, die mit einer Reportereinheit markiert ist, die detektiert wird, wenn sich die Sonde an das amplifizierte Produkt bindet (z. B. eine doppelt markierte Haarnadelsonde, die sowohl eine fluoreszierende Markierung als auch eine Quencher-Einheit umfasst). In anderen Ausführungsformen für die Echtzeitdetektion ist die Nachweissonde ein lineares Oligomer, wie z.B. ein Oligomer, das sowohl mit einem Fluorophor als auch einer Quencher-Einheit markiert ist (z.B. eine TaqMan-Sonde). Solche Sonden können Zielhybridisierungssequenzen und Nichtzielhybridisierungssequenzen umfassen. Verschiedene Formen solcher Sonden wurden bereits beschrieben (siehe z.B. US-Patent Nr. 5,210,015 ; 5,487,972 ; 5,118,801 ; 5,312,728 ; 5,925,517 ; 6,150,097 ; 6,849,412 ; 6,835,542 ; 6,534,274 ; und 6,361,945 ; und US-Patentanmeldung Nr. 20060068417A1 und 20060194240A1 ; jeweils durch Bezugnahme hierin aufgenommen).
  • Assays zum Nachweis der GBS-Nukleinsäure können gegebenenfalls eine Nicht-GBS-Nukleinsäure zur internen Kontrolle (IC) umfassen, die in denselben Assay-Reaktionsgemischen unter Verwendung von Amplifikations- und Nachweisoligomeren, die für die IC-Sequenz spezifisch sind, amplifiziert und nachgewiesen wird. IC-Nukleinsäuresequenzen können z. B. ein DNA-Plasmid, eine RNA-Matrizensequenz (z.B. ein In-vitro-Transkript) oder eine synthetische Nukleinsäure sein, die in eine Probe dotiert wird. Alternativ kann die IC-Nukleinsäuresequenz eine zelluläre Komponente sein, die aus exogenen zellulären Quellen oder endogenen zellulären Quellen bezogen auf die Probe stammen kann. In diesen Fällen wird eine interne Kontrollnukleinsäure zusammen mit der GBS-Nukleinsäure in den Amplifikationsreaktionsgemischen amplifiziert. Das interne Kontrollamplifikationsprodukt und das GBS-Zielsequenzamplifikationsprodukt können unabhängig voneinander nachgewiesen werden.
  • In bestimmten Ausführungsformen zeigt die Amplifikation und der Nachweis eines Signals von einer amplifizierten IC-Sequenz, dass die Assay-Reagenzien, Bedingungen und die Durchführung von Assay-Schritten in dem Assay ordnungsgemäß verwendet wurden, wenn kein Signal für die beabsichtigte GBS-Zielnukleinsäure erhalten wird (z.B. Proben die negativ für GBS getestet sind). Ein IC kann auch als interner Kalibrator für den Assay verwendet werden, wenn ein quantitatives Ergebnis gewünscht wird, d.h. das von der IC-Amplifikation und -Nachweis erhaltene Signal wird zum Einstellen eines Parameters verwendet, der in einem Algorithmus zum Quantifizieren der GBS-Nukleinsäuremenge in einer Probe verwendet wird, basierend auf dem Signal, das für eine amplifizierte GBS-Zielsequenz erhalten wurde. ICs eignen sich auch zur Überwachung der Integrität eines oder mehrerer Schritte in einem Assay. Die Primer und die Sonde für die IC-Zielsequenz werden unter Verwendung eines bekannten Verfahrens konfiguriert und synthetisiert, vorausgesetzt, dass die Primer und die Sonde zur Amplifikation der IC-Zielsequenz und zum Nachweis der amplifizierten IC-Sequenz unter im Wesentlichen den gleichen Assay-Bedingungen verwendet werden, die zur Amplifikation und zum Nachweis der GBS-Zielsequenz verwendet werden. In bevorzugten Ausführungsformen, die einen Ziel-Einfangs-basierten Reinigungsschritt umfassen, ist es bevorzugt, dass eine Ziel-Einfangs-Sonde, die für das IC-Ziel spezifisch ist, in den Assay in dem Ziel-Einfangs-Schritt einbezogen wird, so dass das IC in dem Assay auf analoge Weise behandelt wird wie für den beabsichtigten GBS-Analyten in allen Assay-Schritten.
  • Gegenstand der Erfindung sind auch Formulierungen zur Bestimmung der Anwesenheit oder der Abwesenheit von GBS in einer Probe. In einigen Ausführungsformen ist eine Formulierung eine wässrige Formulierung, umfassend (1) mindestens zwei SIP-spezifische oder CFB-spezifische Amplifikationsoligomere zur Amplifikation einer SIP- oder CFB-Zielregion, wie hierin beschrieben, und (2) einen organischen Puffer. Eine wässrige Formulierung zur Amplifikation einer GBS-Nukleinsäure kann eine oder mehrere zusätzliche Komponenten enthalten, wie z. B. ein DNA-Polymeraseenzym, ein Reverse-Transkriptase-Enzym oder ein Nachweissondenoligomer. In einigen Ausführungsformen ist eine Formulierung eine wässrige Formulierung, umfassend (1) ein SIP-spezifisches und/oder CFB-spezifisches Nachweissondenoligomer, wie hierin beschrieben, und (2) einen organischen Puffer. Eine wässrige Formulierung zum Enthalten von einem oder mehreren Nachweissondenoligomeren kann eine oder mehrere zusätzliche Komponenten enthalten, wie z.B. ein Tensid, ein DNA-Polymeraseenzym, ein Reverse-Transkriptase-Enzym oder mindestens ein Amplifikationsoligomer. Besonders geeignete Tenside umfassen beispielsweise Polyethylenglykolmono[4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)phenyl]ether und Polyoxyethylensorbitanfettsäureester (z.B. Polysorbat 20, Polysorbat 40 oder Polysorbat 60). In einigen Ausführungsform ist ein Tensid in einer wässrigen Nachweissonden-Formulierung ein nichtlineares Tensid wie zum Beispiel ein Polyoxyethylensorbitan-Fettsäureester (beispielsweise Polysorbat 20, Polysorbat 40 oder Polysorbat 60) oder Digitonin. Eine wässrige Formulierung wie oben zur Amplifikation oder zum Nachweis von GBS-Nukleinsäure kann ferner einen Füllstoff wie z.B. Trehalose, Raffinose oder eine Kombination davon enthalten. In einigen Ausführungsformen enthält eine wässrige Formulierung wie oben ein anorganisches Salz wie z.B. Magnesium, Kalium oder Natrium; in einigen derartigen Varianten beträgt die Konzentration des anorganischen Salzes 4 mM oder weniger. Ein besonders geeigneter organischer Puffer für eine obige wässrige Formulierung ist Tris (2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propandiol).
  • In einem verwandten Aspekt kann zur Langzeitlagerung eine wässrige Formulierung, wie sie hierin beschrieben ist, in z.B. Fläschchen, Ampullen oder andere Behälter aufgeteilt und nach im Stand der Technik bekannten Verfahren getrocknet (z.B. lyophilisiert) werden. Das getrocknete Produkt erscheint typischerweise als Pulver oder Kuchen. Die Behälter werden dann versiegelt. Verfahren zur Herstellung solcher getrockneter Formulierungen aus der wässrigen Formulierung sowie die durch solche Verfahren hergestellten getrockneten Formulierungen sind zusätzliche Aspekte der vorliegenden Erfindung. In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine getrocknete Formulierung bereit, die die Rekonstitution in eine wässrige Formulierung wie hierin beschrieben ermöglicht. Getrocknete Formulierungen zur Amplifikation oder zum Nachweis von GBS-Nukleinsäure enthalten typischerweise zusätzlich zu einem oder mehreren Amplifikationsoligomeren und/oder Nachweissonden, wie hierin beschrieben, einen Füllstoff wie z.B. Trehalose, Raffinose oder eine Kombination davon. In einigen Ausführungsformen, die ferner ein anorganisches Salz umfassen, beträgt der Massenanteil des anorganischen Salzes an der Masse der getrockneten Formulierung 0,249 % oder weniger, 0,222 % oder weniger oder 0,195 % oder weniger. Verfahren zur Herstellung einer getrockneten Formulierung aus einer lyophilisierten Formulierung, wie hierin beschrieben, sind ebenfalls von der vorliegenden Erfindung umfasst; solche Verfahren umfassen im Allgemeinen das Auflösen der getrockneten Formulierung in einem geeigneten Verdünnungsmittel (z.B. einem organischen Puffer oder Wasser), um eine rekonstituierte Formulierung bereitzustellen.
  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Reaktionsgemisch zur Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit einer GBS-Zielnukleinsäure in einer Probe. Ein Reaktionsgemisch gemäß der vorliegenden Offenbarung umfasst eines oder beide von (1) einer Oligomerkombination, wie hierin beschrieben, zur Amplifikation einer GBS-SIP- und/oder CFB-Zielnukleinsäure und (2) eines oder mehrerer Nachweissondenoligomere, wie hierin beschrieben, für das Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit eines GBS-SIP- und/oder CFB-Amplifikationsprodukts. Das Reaktionsgemisch kann ferner eine Reihe optionaler Komponenten enthalten, wie beispielsweise Einfangsonden, z.B. Poly-(k)-Einfangsonden, wie in US 2013/0209992 beschrieben, auf die hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird. Für ein Amplifikationsreaktionsgemisch enthält das Reaktionsgemisch typischerweise andere Reagenzien, die zur Durchführung einer In-vitro-Amplifikation geeignet sind, wie z.B. Puffer, Salzlösungen, geeignete Nukleotidtriphosphate (z. B. dATP, dCTP, dGTP und dTTP; und/oder ATP, CTP, GTP und UTP) und/oder Enzyme (z. B. eine thermostabile DNA-Polymerase oder reverse Transkriptase und/oder RNA-Polymerase) und umfassen typischerweise Testprobenbestandteile, in denen eine GBS-Zielnukleinsäure vorhanden sein kann oder nicht. Ein Reaktionsgemisch kann Amplifikationsoligomere für nur eine Zielregion eines GBS-Genoms enthalten, oder es kann Amplifikationsoligomere für mehrere GBS-Zielregionen enthalten (z.B. sowohl eine SIP-Zielregion als auch eine CFB-Zielregion). Zusätzlich ist für ein Reaktionsgemisch, das eine Nachweissonde zusammen mit einer Amplifikationsoligomeren-Kombination enthält, sind die Auswahl von Amplifikationsoligomeren und die von Nachweissondenoligomeren für ein Reaktionsgemisch durch eine gemeinsame Zielregion verbunden (d.h. das Reaktionsgemisch enthält eine Sonde, die an einer Sequenz bindet, die durch eine Amplifikationsoligomeren-Kombination des Reaktionsgemisches amplifizierbar ist). In einigen Ausführungsformen umfasst ein Reaktionsgemisch eine wässrige Formulierung wie oben beschrieben. In einigen Ausführungsformen wird ein Reaktionsgemisch mit Wasser oder einem organischen Puffer aus einer getrockneten Formulierung wie oben beschrieben rekonstituiert.
  • Ebenfalls von der vorliegenden Erfindung bereitgestellt werden Kits zur Durchführung der hier beschriebenen Verfahren. Ein Kit gemäß der vorliegenden Offenbarung umfasst eines oder beide von (1) einer Oligomerkombination, wie hierin beschrieben, zur Amplifikation einer GBS-SIP- und/oder CFB-Zielnukleinsäure und (2) eines oder mehrere Nachweissondenoligomere, wie hierin beschrieben, zur Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit eines GBS-SIP- und/oder CFB-Amplifikationsprodukts. In einigen Ausführungsformen ist jede hierin beschriebene Oligomerkombination in dem Kit vorhanden. Die Kits können ferner eine Anzahl optionaler Komponenten enthalten, wie beispielsweise Einfangsonden, z.B. Poly (k)-Einfangsonden, wie in US 2013/0209992 beschrieben. Andere Reagenzien, die in den Kits vorhanden sein können, umfassen Reagenzien, die zur Durchführung einer In-vitro-Amplifikation geeignet sind, wie z.B. Puffer, Salzlösungen, geeignete Nukleotidtriphosphate (z.B. dATP, dCTP, dGTP, dTTP und/oder ATP, CTP, GTP und UTP) und/oder Enzyme (z.B. eine thermostabile DNA-Polymerase oder eine reverse Transkriptase und/oder RNA-Polymerase). Oligomere, wie hierin beschrieben, können in einer Vielzahl unterschiedlicher Ausführungsformen verpackt werden, und Fachleute werden erkennen, dass die Offenbarung viele unterschiedliche Kit-Konfigurationen umfasst. Beispielsweise kann ein Kit Amplifikationsoligomere für nur eine Zielregion eines GBS-Genoms enthalten, oder es kann Amplifikationsoligomere für mehrere GBS-Zielregionen enthalten (z.B. sowohl eine SIP-Zielregion als auch eine CFB-Zielregion). Bei einem Kit, der eine Nachweissonde zusammen mit einer Amplifikationsoligomeren-Kombination enthält, sind die Auswahl der Amplifikationsoligomere und die der Nachweissondenoligomere für einen Kit durch eine gemeinsame Zielregion verbunden (d.h. der Kit enthält eine Sonde, die an eine Sequenz bindet, die durch eine Amplifikationsoligomeren-Kombination des Kits amplifizierbar ist). In bestimmten Ausführungsformen umfasst der Kit ferner einen Satz von Anweisungen zum Ausführen von Verfahren gemäß der vorliegenden Offenbarung, wobei die Anweisungen einer Packungsbeilage und/oder der Verpackung des Kits oder der Komponenten davon zugeordnet sein können.
  • Die Erfindung wird weiter durch die folgenden nicht einschränkenden Beispiele veranschaulicht.
  • Beispiel 1
  • Siebzehn Primer- und Sondenkombinationen, wie in Tabelle 2 gezeigt, wurden in vitro auf Streptococcus agalactiae (GBS) untersucht. Tabelle 2: Primer- und Sondenkombinationen
    Kombination Vorwärtsprimer Rückwärtsprimer Sonde
    1 SIP fwd 2 (SEQ ID NO:3) SIP rev2 (SEQ ID NO:4) SIP Sonde 2 (SEQ ID NO:9)
    2 SIP fwd 3 (SEQ ID NO:5) SIP rev3 (SEQ ID NO:6) SIP Sonde 3 (SEQ ID NO:10)
    3 SIP fwd 8 (SEQ ID NO:7) SIP rev8 bis (SEQ ID NO:8) SIP-Sonde 8 (SEQ ID NO: 11)
    4 CFB fwd1 (SEQ ID NO:12) CFB rev1 (SEQ ID NO:13) CFB-Sonde 1 (SEQ ID NO:22)
    5 CFB fwd1 (SEQ ID NO:12) CFB rev1 (SEQ ID NO:13) CFB-Sonde 1bis (SEQ ID NO:23)
    6 CFB fwd1 (SEQ ID NO:12) CFB rev2bis (SEQ ID NO:15) CFB-Sonde 1 (SEQ ID NO:22)
    7 CFB fwd1 (SEQ ID NO:12) CFB rev2bis (SEQ ID NO:15) CFB-Sonde 1bis (SEQ ID NO:23)
    8 CFB FWD2 (SEQ ID NO:14) CFB rev2bis (SEQ ID NO:15) CFB-Sonde 1 (SEQ ID NO:22)
    9 CFB fwd2 (SEQ ID NO:14) CFB rev2bis (SEQ ID NO:15) CFB-Sonde 1bis (SEQ ID NO:23)
    10 CFB fwd2 (SEQ ID NO:14) CFB rev1 (SEQ ID NO:13) CFB-Sonde 1 (SEQ ID NO:22)
    11 CFB fwd2 (SEQ ID NO:14) CFB rev1 (SEQ ID NO:13) CFB-Sonde 1bis (SEQ ID NO:23)
    12 CFB fwd3 (SEQ ID NO:16) CFB rev3 (SEQ ID NO:17) CFB-Sonde 3 (SEQ ID NO:24)
    13 CFB fwd4 (SEQ ID NO:18) CFB rev1 (SEQ ID NO:13) CFB-Sonde 1 (SEQ ID NO:22)
    14 CFB fwd4 (SEQ ID NO:18) CFB rev1 (SEQ ID NO:13) CFB-Sonde 1bis (SEQ ID NO:23)
    15 CFB fwd4 (SEQ ID NO:18) CFB rev2bis (SEQ ID NO:15) CFB-Sonde 1 (SEQ ID NO:22)
    16 CFB fwd4 (SEQ ID NO:18) CFB rev2bis (SEQ ID NO:15) CFB-Sonde 1bis (SEQ ID NO:23)
    17 CFB fwd5 (SEQ ID NO:20) CFB rev5 (SEQ ID NO:21) CFB-Sonde 5 (SEQ ID NO:25)
  • Materialien und Verfahren. Als Einsatzmaterial wurde ein undefinierter GBS-Serotyp aus einer klinischen Kultur verwendet. Dieser wurde in mehreren Wiederholungen unter Verwendung des MagNA Pure 96-Systems (Roche) extrahiert. Nach der Extraktion wurde die DNA-Konzentration durch OD 260/280-Messung bestimmt. PCR wurde auf dem Applied Biosystems® (ABI) 7500 FAST Echtzeit-PCR-System durchgeführt. Das verwendete PCR-Profil war wie folgt: Tabelle 3: PCR-Profil
    4 Minuten 95°C
    8 Sekunden 95°C 45 Zyklen
    25 Sekunden 60°C
  • Alle Proben wurden ohne Zugabe einer internen Kontrolle zu den Proben getestet. Eine Konzentration der GBS-Zielnukleinsäure (1000 Kopien/µl in der PCR) wurde verwendet und in vier Wiederholungen getestet. Die Konzentration der Primer wurde auf 600 nM festgelegt und die Sondenkonzentration betrug 200 nM.
  • Ergebnisse. Die Cts und die Anzahl der positiven Reaktionen für die verschiedenen Primer/Sonden-Kombinationen sind in Tabelle 4 gezeigt. Der angezeigte Ct ist der Zyklus, in dem das Signal der relativen Fluoreszenzeinheit (RFU) einen festgelegten RFU-Schwellenwert überschreitet. Tabelle 4
    Komb. Ct (Durchschnittswert) Anz. positiv
    1 24,81 4/4
    2 / 0/4
    3 25,66 4/4
    4 25,69 4/4
    5 27,51 4/4
    6 24,72 4/4
    7 26,79 3/4
    8 24,96 4/4
    9 27,62 4/4
    10 25,25 4/4
    11 27,60 3/4
    12 25,50 4/4
    13 19,92 3/4
    14 27,65 4/4
    15 26,03 3/4
    16 25,62 4/4
    17 24,95 4/4
  • Für jedes Zielgen wurden basierend auf diesen Daten zwei Kombinationen von Primern und Sonden zur weiteren Bewertung ausgewählt. Bei CFB zeigten die Kombinationen 12 und 17 die niedrigsten Cts in Kombination mit der höchsten RFU. Für SIP wurden die Kombinationen 1 und 3 ausgewählt. Diese Kombinationen wurden an niedrigeren Konzentrationen der GBS-Zielnukleinsäure getestet, um eine bessere Unterscheidung zu ermöglichen. Die in Tabelle 5 gezeigten Ergebnisse wurden erhalten, wenn 1, 10 und 100 Kopien/µl in der PCR getestet wurden. Tabelle 5
    Komb. Ct (Durchschnittswert) 1 Kopie/µl Ct (Durchschnittswert) 10 Kopien/µl Ct (Durchschnittswert) 100 Kopien/µl
    1 39,19 35,22 31,77
    3 37,41 33,61 30,36
    12 38,34 35,02 32,41
    17 38,44 35,10 31,70
  • Die Kombinationen 1, 3, 12 und 17 wurden auch mit 1 und 10 Kopien/µl mit verschiedenen Primer/Sonden-Konzentrationen (600/200 nM, 400/150 nM und 300/100 nM) getestet. Tabelle 6 zeigt die Ergebnisse, die unter Verwendung dieser verschiedenen Konzentrationen erhalten wurden. Tabelle 6
    Ko mb. 600/200 nM 400/150 nM 300/100 nM
    Ct (Durchschnit tswert) 1 Kopie/µl Ct (Durchschnit tswert) 10 Kopien/µl Ct (Durchsc hnitt) 1 Kopie/µl Ct (Durchschnit tswert) 10 Kopien/µl Ct (Durchschnit tswert) 1 Kopie/µl Ct (Durchschnit tswert) 10 Kopien/µl
    1 38,51 34,91 40,09 36,26 39,65 36,98
    3 36,85 33,73 38,89 34,44 38,84 35,54
    12 38,31 35,00 38,89 35,34 39,02 35,68
    17 37,10 34,44 38,29 35,13 39,53 35,76
  • Schlussfolgerung. Basierend auf den oben zusammengefassten Ergebnissen wurden die Primer/Sonden-Kombinationen 3 und 17 (für die SIP- bzw. CFB-Zielgene) zur weiteren Bewertung hinsichtlich Empfindlichkeit und Spezifität ausgewählt. Diese Primerkombinationen konnten fünf (5) theoretische Kopien pro PCR-Reaktion bei einem Ct von 36-37 nachweisen.
  • Beispiel 2
  • Zum Nachweis der internen Kontrolle wurden zwei Primer- und Sondenkombinationen bewertet: die SD-PLP/GIC-Kombination und die New-GIC-Kombination mit den in Tabelle 7 gezeigten Primer- und Sondensequenzen. Der erste Schritt bestand darin, zu überprüfen, welches Oligo-Set bei Verwendung von Cy5 als Fluorophor und in welcher Konzentration die besten Ergebnisse lieferte. Der zweite Schritt konzentrierte sich auf die Auswahl der Konzentration mit dem Farbstoff QUASAR® 705. Beim automatisierten PANTHER FUSION®-System gibt der Cy5-Farbstoff niedrige Signale ab und sollte mit einem QUASAR705-Farbstoff nachgewiesen werden. Da sich das Signal des Cy5 von dem von QUASAR705 erzeugten Signal unterscheidet, wurde die Konzentration der Primer und Sonden neu bewertet. Tabelle 7: Primer und Sonden für die interne Kontrolle
    Name Sequenz (5'-3')
    SD-PLP-Fwd ACAGACAATGGCAGCAATTTCACCAG (SEQ ID NO:29)
    SD-PLP-Rev CTCTTCTTTGTCTCTAATTGACC (SEQ ID NO:30)
    GIC Sonde AAACATCGCAAGTGCCACAAGCTT (SEQ ID NO:31)
    New-GIC-3_F TGGTAGCAGTTCATGTAGCCA (SEQ ID NO:32)
    New-GIC-3_R CTGGCCATCTTCCTGCTAAT (SEQ ID NO:33)
    New-GIC-3_P TTCCTGCCCTGTTTCTGCTGGA (SEQ ID NO:34)
  • Die ersten Tests der Primer und Sonden wurden auf dem ABI 7500 FAST Echtzeit-PCR-System nach KINGFISHER™-Extraktion durchgeführt. Es wurden drei verschiedene Primer/Sonden-Konzentrationen verwendet: 600/200 nM, 400/150 nM und 300/100 nM. Zusätzlich wurden die IC-Oligos in Kombination mit den SIP-Oligos getestet, wenn ein GBS-Ziel vorhanden war (Serotyp II und IV: Stämme, die von der CHU de Liège erhalten wurden). Der zweite Schritt des IC-Tests wurde mit dem BioRad CFX-96 qPCR-Gerät durchgeführt, das sowohl Cy5 als auch QUASAR705 nachweisen kann. Zunächst wurde die QUASAR705-Kombination im Vergleich zur Cy5-Kombination getestet, um die Endkonzentration der Primer und Sonden zu bestimmen.
  • Daten aus den ersten Tests zeigten, dass die New-GIC-Kombination höhere Signale als die SD-PLP/GIC-Kombination lieferte. Die New-GIC-Kombination (300/100 nM) wurde in Gegenwart von SIP-Primern (600/200 nM) und verschiedenen GBS-Typen (Serotyp II und IV in 10^6, 10^5, 10^4 Verdünnungen) weiter getestet. Die Daten aus diesem Test zeigten, dass das Vorhandensein der IC-Primer und -Sonden keinen signifikanten Einfluss auf den GBS-Nachweis hat. In gleicher Weise wurden die IC-Signale nicht durch das Vorhandensein einer höheren Konzentration von GBS beeinflusst. Basierend auf den Daten wurde die SIP-Kombination bei 600/200 nM (FAM) in Kombination mit der IC-New-GIC-Kombination bei 300/100 nM (Cy5) ausgewählt.
  • Ein Vergleich zwischen dem Cy5- und QUSAR705-Farbstoff wurde mit dem BioRad CFX-96 durchgeführt. Diese Daten zeigten eine gute Übereinstimmung zwischen beiden Bedingungen. Die Kombination New-GIC QUASAR705 bei 400/150 nM wurde für weitere Tests an GBS-Stämmen verwendet.
  • Im folgenden Experiment wurden die Oligos SIP (600/200 nM) und New-GIC (400/150 nM) mit Serienverdünnungen der verschiedenen GBS-Serotypen getestet (klinische Kulturen, die im Universitätsklinikum Lüttich, Universitätsviertel Sart Tilman, Gebäude B 35, B-4000 Lüttich, Belgien gesammelt wurden). Die nachstehende Tabelle 8 gibt die Ct-Werte an und zeigt die insgesamt geringen Standardabweichungen zwischen den verschiedenen Serotypen und den verschiedenen Verdünnungen sowohl für das SIP-Ziel als auch für das New-GIC-Ziel. Tabelle 8
    Stamm Analyse Verdünnung 10^6 Verdünnung 10^5 Verdünnung 10^4
    QUASAR705 FAM QUSASR705 FAM QUASAR705 FAM
    Ia Mittelwert 31,20 37,01 28,21 32,58 30,12 28,86
    STDAbw 0,95 1,19 0,20 0,49 1,62 1,28
    Ib Mittelwert 30,76 37,71 28,39 32,89 32,62 30,13
    STDAbw 0,90 0,85 0,27 0,36 1,02 0,29
    II Mittelwert 30,13 37,16 28,37 32,59 31,09 30,03
    STDAbw 0,77 0,85 0,30 0,18 0,22 0,27
    III Mittelwert 30,05 37,45 28,70 33,60 30,01 30,16
    STDAbw 0,92 0,59 0,25 0,36 0,59 1,09
    IV Mittelwert 30,00 36,84 28,44 33,02 29,38 28,92
    STDAbw 0,62 0,40 0,09 0,18 0,53 1,57
    V Mittelwert 30,26 37,34 28,86 33,26 29,53 29,12
    STDAbw 0,55 0,03 0,33 0,18 0,44 0,88
    VI Mittelwert 29,84 37,83 28,51 34,63 30,62 32,15
    STDAbw 0,55 0,52 0,30 0,34 0,47 0,54
    VII Mittelwert 30,36 38,05 28,41 33,38 30,40 30,48
    STDAbw 0,43 0,36 0,37 0,36 1,35 0,98
    VIII Mittelwert 30,82 37,77 28,20 32,77 29,86 29,45
    STDAbw 1,02 0,34 0,72 0,55 1,00 1,54
    IX Mittelwert 30,77 38,69 28,67 35,04 29,62 30,63
    STDAbw 0,44 0,09 0,42 0,30 1,08 1.26
    Insgesamt Mittelwert 30,42 37,58 28,48 33,38 30,32 29,99
    STDAbw 0,22 0,36 0,17 0,13 0,45 0,48
  • Beispiel 3
  • Dieses Beispiel beschreibt die Bewertung der Spezifität und Empfindlichkeit der Primer/Sonde-Kombination 3, die auf das GBS-SIP-Gen zielt.
  • Das SIP+New-GIC (Cy5) Gemisch wurde verwendet, um verschiedene Proben auf dem ABI 7500 FAST Real-Time PCR-System nach der Extraktion in dem KINGFISHER™-System zu testen. Es wurde das PCR-Profil verwendet, das in Tabelle 3, oben, gezeigt wurde.
  • Für die Spezifität wurden die in Tabelle 9 gezeigten Stämme auf Kreuzreaktivität bewertet. Tabelle 9
    Stamm ID Name ATCC # Probenformat Stammkonzentration
    1 Acinetobacter lwoffii 15309 Lysat 1E+08 KBE/ml
    2 Actinomyces israelii 12102 Lysat 1E+08 KBE/ml
    3 Alcaligenes faecalis ssp. faecalis 8750 Lysat 1E+08 KBE/ml
    4 Atopobium vaginae BAA-55 Lysat 5E+11 Kopien rRNA/ml
    5 Bacteroides fragilis 25285 Lysat 5E+08 KBE/ml
    6 Bifidobacterium adolescentis 15703 Lysat 1E+08 KBE/ml
    7 Campylobacter jejuni ssp. jejuni 33560 Lysat 1E+08 KBE/ml
    8 Candida albicans 18804 Lysat 1E+08 KBE/ml
    9 Chlamydia trachomatis VR-878 Lysat 9,3E+06 IFU/ml
    10 Clostridium difficile 9689 Lysat 1E+08 KBE/ml
    11 Corynebacterium genitalium 33030 Lysat 1E+08 KBE/ml
    12 Cryptococcus neoformans 32045 Lysat 1E+08 KBE/ml
    13 Enterobacter cloacae 13047 Lysat 1E+08 KBE/ml
    14 Enterococcus faecalis 19433 Lysat 1E+08 KBE/ml
    15 Escherichia coli 11775 Lysat 1E+08 KBE/ml
    16 Fusobacterium nucleatum ssp. Nukleatum 25586 Lysat 1E+08 KBE/ml
    17 Gardnerella vaginalis 14018 Lysat 1E+08 KBE/ml
    18 Haemophilus ducreyi 33940 Lysat 1E+08 KBE/ml
    19 Klebsiella pneumoniae 23357 Lysat 1E+08 KBE/ml
    20 Lactobacillus acidophilus 4356 Lysat 1E+08 KBE/ml
    21 Lactobacillus crispatus 33820 Lysat 1E+08 KBE/ml
    22 Listeria monocytogenes 15313 Lysat 1E+08 KBE/ml
    23 Mobiluncus curtisii 35241 Lysat 5E+11 Kopien rRNA/ml
    24 Mycoplasma hominis 23114 Lysat 5E+11 Kopien rRNA/ml
    25 Neisseria gonorrhoeae 19424 Lysat 1E+08 KBE/ml
    26 Pentatrichomonas hominis 30000 Lysat 2,5E+07 Zellen/ml
    27 Peptostreptococcus magnus (Finegoldia magna) 29328 Lysat 1E+08 KBE/ml
    28 Prevotella bivia 29303 Lysat 1E+08 KBE/ml
    29 Propionibacterium acnes 6919 Lysat 1E+08 KBE/ml
    30 Proteus vulgaris 8427 Lysat 1E+08 KBE/ml
    31 Pseudomonas aeruginosa 10145 Lysat 1E+08 KBE/ml
    32 Staphylococcus aureus ssp. Aureus 12600 Lysat 1E+08 KBE/ml
    33 Staphylococcus epidermidis 14990 Lysat 1E+08 KBE/ml
    34 Streptococcus agalactiae 13813 Lysat 5E+08 KBE/ml
    35 Streptococcus pyogenes 12344 Lysat 1E+08 KBE/ml
    36 Trichomonas tenax 30207 Lysat 4,6E+07 Zellen/ml
    37 Ureaplasma urealyticum 27618 Lysat 4,1E+11 Kopien rRNA/ml
  • Die in Tabelle 10 gezeigten GBS-Serotypen wurden auf Inklusivität getestet. Tabelle 10
    Stamm ID Name ATCC # Stammkonzentration
    38 Streptococcus agalactiae Serotyp Ia 12400 1E+08 KBE/ml
    39 Streptococcus agalactiae Serotyp Ib BAA-1174 1E+08 KBE/ml
    40 Streptococcus agalactiae Serotyp Ic 27591 1E+08 KBE/ml
    41 Streptococcus agalactiae Serotyp III 12403 1E+08 KBE/ml
    42 Streptococcus agalactiae Serotyp IV 49446 5E+08 KBE/ml
    43 Streptococcus agalactiae Typ Stamm 13813 5E+08 KBE/ml
    44 Streptococcus anginosus 33397 1E+08 KBE/ml
    45 Streptococcus bovis 33317 1E+08 KBE/ml
    46 Streptococcus gordonii 33399 1E+08 KBE/ml
    47 Streptococcus mitis 49456 1E+08 KBE/ml
    48 Streptococcus mutans 25175 1E+08 KBE/ml
    49 Streptococcus oralis 10557 1E+08 KBE/ml
    50 Streptococcus parasanguinis 15911 1E+08 KBE/ml
    51 Streptococcus pneumoniae 33400 1E+08 KBE/ml
    52 Streptococcus pyogenes 12344 1E+08 KBE/ml
    53 Streptococcus agalactiae Serotyp II 12973 1E+08 KBE/ml
    54 Streptococcus agalactiae Serotyp V BAA-611 1E+08 KBE/ml
    55 Streptococcus agalactiae Serotyp VI BAA-2671 IE+08 KBE/ml
    56 Streptococcus agalactiae Serotyp VII BAA-2670 1E+08 KBE/ml
    57 Streptococcus agalactiae Serotyp VIII BAA-2669 1E+08 KBE/ml
    58 Streptococcus agalactiae Serotyp IX BAA-2668 1E+08 KBE/ml
    59 Streptococcus acidominimus 51725 1E+08 KBE/ml
    60 Streptococcus canis 43496 1E+08 KBE/ml
    61 Streptococcus cricetus 19642 1E+08 KBE/ml
    62 Streptococcus cristatus 51100 1E+08 KBE/ml
    63 Streptococcus downei 33748 1E+08 KBE/ml
    64 Streptococcus dysagalactiae 43078 1E+08 KBE/ml
    65 Streptococcus equi subsp equi 33398 1E+08 KBE/ml
    66 Streptococcus ratti 19645 1E+08 KBE/ml
    67 Streptococcus constellatus DSM 20575 1E+08 KBE/ml
    68 Streptococcus pseudoporcinus DSM 18513 1E+08 KBE/ml
  • Alle nachzuweisenden GBS-Serotypen wurden zunächst bei der angegebenen Stammkonzentration getestet. Danach wurden die Stämme auch bei niedrigeren Konzentrationen (so niedrig wie 100 KBE/ml) getestet.
  • Die folgende Tabelle 11 zeigt Spezifitätsdaten, die mit dem ABI 7500 FAST-System erhalten wurden. Alle getesteten Bakterien zeigten keine Wechselwirkung mit den SIP-Primern und -Sonden. Die Wirksamkeit der PCR wurde durch eine positive Kontrolle bewertet, die positive Signale lieferte. Tabelle 11
    Stamm Ct Mittelwert Std Abw Stamm Ct Mittelwert Std Abw
    Acinetobacter lwoffii - - Propionibacterium acnes - -
    Actinomyces israelii - - Proteus vulgaris - -
    Alcaligenes faecalis ssp. faecalis - - Pseudomonas aeruginosa - -
    Atopobium vaginae - - Staphylococcus aureus ssp. aureus - -
    Bacteroides fragilis - - Staphylococcus epidermidis - -
    Bifidobacterium adolescentis - - Streptococcus pyogenes - -
    Campylobacter jejuni ssp. jejuni - - Trichomonas tenax - -
    Candida albicans - - Ureaplasma urealyticum - -
    Chlamydia trachomatis - - Streptococcus anginosus - -
    Clostridium difficile - - Streptococcus bovis - -
    Corynebacterium genitalium - - Streptococcus gordonii - -
    Cryptococcus neoformans - - Streptococcus mitis - -
    Enterobacter cloacae - - Streptococcus mutans - -
    Enterococcus faecalis - - Streptococcus oralis - -
    Escherichia coli - - Streptococcus parasanguinis - -
    Fusobacterium nucleatum ssp. Nukleatum - - Streptococcus pneumoniae - -
    Gardnerella vaginalis - - Streptococucs pyogenes - -
    Haemophilus ducreyi - - Negative Kontrolle - -
    Klebsiella pneumoniae - - Positive Kontrolle 31,875 0,318
    Lactobacillus acidophilus - - Positive Kontrolle 30,840 0,184
    Lactobacillus crispatus - -
    Listeria monocytogenes - -
    Mobiluncus curtisii - -
    Mycoplasma hominis - -
    Neisseria gonorrhoeae - -
    Pentatrichomonas hominis - -
    Peptostreptococcus magnus (Finegoldia magna) - -
    Prevotella bivia - -
  • Ein anfänglicher Satz, der bei hohen Konzentrationen auf dem ABI 7500 FAST-System getestet wurde, ergab die in Tabelle 12 gezeigten Ergebnisse. Tabelle 12
    Stamm Ct Mittelwert Std Abw
    Streptococcus agalactiae Serotyp Ia 16,705 0,007
    Streptococcus agalactiae Serotyp Ib 17,655 0,120
    Streptococcus agalactiae Serotyp Ic 17,715 0,332
    Streptococcus agalactiae Serotyp III 18,240 0,141
    Streptococcus agalactiae Serotyp IV 15,740 0,014
    Streptococcus agalactiae Typ Stamm 15,550 0,057
  • Die folgende Tabelle 13 zeigt Daten, die erhalten wurden, wenn GBS-Stämme bei niedrigeren Konzentrationen (100 KBE/ml in der Probe) getestet wurden. Tabelle 13
    Serotyp Konzentration Mittelwert Ct +/-Std Abw
    Serotyp Ia 100 KBE/ml in der Probe 38,6 +/-1,9
    Serotyp Ib 100 KBE/ml in der Probe 38,1 +/-1,4
    Serotyp Ic 100 KBE/ml in der Probe 37,7 +/-0,4
    Serotyp III 100 KBE/ml in der Probe 37,9 +/-0,6
    Serotyp IV 100 KBE/ml in der Probe 38,1 +/-1,6
  • Diese Serotypen (Ia, Ib, Ic, III, IV) wurden weiter verwendet, um die PCR-Effizienz zu testen. Zu diesem Zweck wurde eine serielle Verdünnung dieser Serotypen hergestellt (im Bereich von 10^6 KBE/ml bis 10^1 KBE/ml) und auf dem MagNA Pure 96-System (Roche) extrahiert und eine PCR auf dem ABI 7500 FAST-System durchgeführt. Die Daten zeigten die erwartete Steigung bei ungefähr -3,3 und eine Effizienz zwischen 92 und 98% zwischen den verschiedenen Serotypen. Weiterhin bestätigten die Daten den Nachweis aller Serotypen bei 100 KBE/ml in der Probe.
  • Beispiel 4
  • Dieses Beispiel beschreibt die Bewertung der Spezifität von Primer/Sonde-Kombination 3, die auf das GBS-SIP-Gen abzielt, auf dem automatisierten PANTHER FUSION® System.
  • Um die Spezifität zu bewerten, wurden die in Tabelle 15 gezeigten GBS-Stämme direkt auf dem PANTHER FUSION-System ohne die Zugabe von zusätzlichem STM oder Lim-Brühe getestet. Die verwendeten Kartuschen enthielten SIP-Oligos und Cy5-Oligos für die IC-Nachweis. Tabelle 15
    Stamm ID Stammname ATCC # Probenformat Konzentration
    53 Streptococcus agalactiae Serotyp II 12973 Lysat 1E+08 KBE/ml
    54 Streptococcus agalactiae Serotyp V BAA-611 Lysat 1E+08 KBE/ml
    55 Streptococcus agalactiae Serotyp VI BAA-2671 Lysat 1E+08 KBE/ml
    56 Streptococcus agalactiae Serotyp VII BAA-2670 Lysat 1E+08 KBE/ml
    57 Streptococcus agalactiae Serotyp VIII BAA-2669 Lysat 1E+08 KBE/ml
    58 Streptococcus agalactiae Serotyp IX BAA-2668 Lysat 1E+08 KBE/ml
    59 Streptococcus acidominimus 51725 Lysat 1E+08 KBE/ml
    60 Streptococcus canis 43496 Lysat 1E+08 KBE/ml
    61 Streptococcus cricetus 19642 Lysat 1E+08 KBE/ml
    62 Streptococcus cristatus 51100 Lysat 1E+08 KBE/ml
    63 Streptococcus downei 33748 Lysat 1E+08 KBE/ml
    64 Streptococcus dysagalactiae 43078 Lysat 1E+08 KBE/ml
    65 Streptococcus equi subsp equi 33398 Lysat 1E+08 KBE/ml
    66 Streptococcus ratti 19645 Lysat 1E+08 KBE/ml
  • Alle GBS-Serotypen (53 bis 58) wurden im FAM-Kanal nachgewiesen, während die anderen Stämme (59 bis 66) negativ waren und nur IC-Signale im RED647-Kanal lieferten. Dies bestätigte die Spezifität der SIP-Oligos für die getesteten Stämme.
  • Zusätzlich wurden unter Verwendung der gleichen Patronen (SIP+IC (Cy5)) und Testen des PANTHER FUSION-Systems andere potenzielle kreuzreaktive Bakterien und die verbleibenden GBS-Serotypen, wie in Tabelle 16 gezeigt, ebenfalls getestet. Tabelle 16
    Stamm ID Stammname ATCC # Probenformat Konzentration
    1 Acinetobacter lwoffii 15309 Lysat 1E+08 KBE/ml
    2 Actinomyces israelii 12102 Lysat 1E+08 KBE/ml
    3 Alcaligenes faecalis ssp. Fäkalien 8750 Lysat 1E+08 KBE/ml
    4 Atopobium vaginae BAA-55 Lysat 5E+11 Kopien rRNA/ml
    5 Bacteroides fragilis 25285 Lysat 5E+08 KBE/ml
    6 Bifidobacterium adolescentis 15703 Lysat 1E+08 KBE/ml
    7 Campylobacter jejuni ssp. jejuni 33560 Lysat 1E+08 KBE/ml
    8 Candida albicans 18804 Lysat 1E+08 KBE/ml
    9 Chlamydia trachomatis VR-878 Lysat 9,3E+06 IFU/ml
    10 Clostridium difficile 9689 Lysat 1E+08 KBE/ml
    11 Corynebacterium genitalium 33030 Lysat 1E+08 KBE/ml
    12 Cryptococcus neoformans 32045 Lysat 1E+08 KBE/ml
    13 Enterobacter cloacae 13047 Lysat 1E+08 KBE/ml
    14 Enterococcus faecalis 19433 Lysat 1E+08 KBE/ml
    15 Escherichia coli 11775 Lysat 1E+08 KBE/ml
    16 Fusobacterium nucleatum ssp. nucleatum 25586 Lysat 1E+08 KBE/ml
    17 Gardnerella vaginalis 14018 Lysat 1E+08 KBE/ml
    18 Haemophilus ducreyi 33940 Lysat 1E+08 KBE/ml
    19 Klebsiella pneumoniae 23357 Lysat 1E+08 KBE/ml
    20 Lactobacillus acidophilus 4356 Lysat 1E+08 KBE/ml
    21 Lactobacillus crispatus 33820 Lysat 1E+08 KBE/ml
    22 Listeria monocytogenes 15313 Lysat 1E+08 KBE/ml
    23 Mobiluncus curtisii 35241 Lysat 5E+11 Kopien rRNA/ml
    24 Mycoplasma hominis 23114 Lysat 5E+11 Kopien rRNA/ml
    25 Neisseria gonorrhoeae 19424 Lysat 1E+08 KBE/ml
    26 Pentatrichomonas hominis 30000 Lysat 2,5E+07 Zellen/ml
    27 Peptostreptococcus magnus (Finegoldia magna) 29328 Lysat 1E+08 KBE/ml
    28 Prevotella bivia 29303 Lysat 1E+08 KBE/ml
    29 Propionibacterium acnes 6919 Lysat 1E+08 KBE/ml
    30 Proteus vulgaris 8427 Lysat 1E+08 KBE/ml
    31 Pseudomonas aeruginosa 10145 Lysat 1E+08 KBE/ml
    32 Staphylococcus aureus ssp. aureus 12600 Lysat 1E+08 KBE/ml
    33 Staphylococcus epidermidis 14990 Lysat 1E+08 KBE/ml
    34 Streptococcus agalactiae 13813 Lysat 5E+08 KBE/ml
    35 Streptococcus pyogenes 12344 Lysat 1E+08 KBE/ml
    36 Trichomonas tenax 30207 Lysat 4,6E+07 Zellen/ml
    37 Ureaplasma urealyticum 27618 Lysat 4,1E+11 Kopien rRNA/ml
    38 Streptococcus agalactiae Serotyp Ia 12400 Lysat 1E+08 KBE/ml
    39 Streptococcus agalactiae Serotyp Ib BAA-1174 Lysat 1E+08 KBE/ml
    40 Streptococcus agalactiae Serotyp Ic 27591 Lysat 1E+08 KBE/ml
    41 Streptococcus agalactiae Serotyp III 12403 Lysat 1E+08 KBE/ml
    42 Streptococcus agalactiae Serotyp IV 49446 Lysat 5E+08 KBE/ml
    43 Streptococcus agalactiae Typ Stamm 13813 Lysat 5E+08 KBE/ml
    44 Streptococcus anginosus 33397 Lysat 1E+08 KBE/ml
    45 Streptococcus bovis 33317 Lysat 1E+08 KBE/ml
    46 Streptococcus gordonii 33399 Lysat 1E+08 KBE/ml
    47 Streptococcus mitis 49456 Lysat 1E+08 KBE/ml
    48 Streptococcus mutans 25175 Lysat 1E+08 KBE/ml
    49 Streptococcus oralis 10557 Lysat 1E+08 KBE/ml
    50 Streptococcus parasanguinis 15911 Lysat 1E+08 KBE/ml
    51 Streptococcus pneumoniae 33400 Lysat 1E+08 KBE/ml
    52 Streptococcus pyogenes 12344 Lysat 1E+08 KBE/ml
  • Die Stämme 38 bis 43 lieferten positive Signale im FAM-Kanal, während die anderen Stämme nur IC-Signale im RED Kanal lieferten.
  • Beispiel 5
  • Die Leistung der Primer/Sonden-Kombination 3, die nur auf das GBS-SIP-Gen abzielt, wurde mit der Leistung der beiden Primer/Sonden-Kombinationen 3 und 17 (als Multiplex-Reaktion) verglichen, die sowohl auf das SIP-als auch das CFB-Gen abzielen. Verschiedene Konzentrationen von GBS-Primer/Sonde wurden an einem GBS-Stamm, der mit Probentransportmedium (STM) dotiert war, bei 3000 KBE/PCR unter Verwendung des ABI 7500 FAST-Echtzeit-PCR-Systems nach Extraktion im KINGFISHER™-System getestet. Die Nukleinsäureisolierungs-, Amplifikations- und Nachweisreaktionen wurden allgemein wie oben beschrieben durchgeführt. Es wurde kein signifikanter Unterschied in den Ct-Werten zwischen dem SIP-only-Primer/Sonden-Set und dem SIP/CFB-Primer/Sonden-Set beobachtet, wohingegen der Endpunktfluoreszenzpegel unter Verwendung des gemultiplexten SIP/CFB-Primer/Sonden-Set relativ zum SIP-only-Primer/Sonden-Set höher war.
  • Beispiel 6
  • Eine vorläufige Studie wurde durchgeführt, um die Nachweisgrenze (LoD) von multiplexierten SIPICFB-PrimerISonden-Kombinationen 3 und 17 auf GBS-Serotyp III (von ATCC) unter Verwendung einer Probit-Analyse (Minitab® 17-Software) zu bestimmen.
  • Der GBS-Stamm Serotyp III wurde ausgehend von einer früheren GBS-Kultur (Stammlösung in der Probe) in Lim-Brühe in acht Konzentrationen (basierend auf dem Plattieren) seriell verdünnt: 20.000,0, 10.000,0, 5.000,0, 2.500,0, 1.250,0, 625,0, 312,5 und 156,3 KBE/ml Probentransportmedium (STM)).
  • Diese acht Verdünnungen wurden wie folgt in entsprechende Probenröhrchen gegeben: 250,0 µl Probe in 750,0 µl Transferlösung (die Transferlösung ist ein Gemisch aus STM+Ziel-Einfangs-Oligo (TCO) (bei 1667 pmol/750 µl STM). Aufgrund der endgültigen 1:4-Verdünnung im Probenröhrchen betrugen die Endkonzentrationen 5.000,0, 2.500,0, 1.250,0, 625,0, 312,5, 156,3, 78,1 und 39,1 KBE/ml.
  • Jede Verdünnung wurde in 20 Extraktionen und einem PCR-Replikat über zwei Läufe mit dem PANTHER FUSION®-System getestet. Eine Positivkontrolle (Mischung aus GBS-SIP- und CFB-Plasmiden bei 141 und 781 c/µl in STM) und eine Negativkontrolle (Lim-Brühe) wurden ebenfalls in einer oder zwei Extraktions- bzw. einer PCR-Wiederholung getestet.
  • Die Probit-Analyse wurde basierend auf den getesteten Konzentrationen, der Anzahl der positiven Ergebnisse und der Anzahl der Versuche durchgeführt, die pro Konzentration mit der Minitab® 17-Software durchgeführt wurden.
  • Es wurden drei Verteilungsmodi verglichen (LogNormal, Weibull und LogLogistic) und derjenige, der die besten P-Werte ergab, d.h. nahe 0,000 für die Regressionstabelle und nahe 1.000 für die Anpassungsgütetests, wurde ausgewählt, wie in der folgenden Tabelle 17 zusammengefasst. Basierend auf dieser Tabelle wurde der Weibull-Verteilungsmodus zur Bestimmung des LoD verwendet.
    Figure DE102019009219B4_0001
  • Die mit dem PANTHER FUSION-System erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 18 zusammengefasst. Die letzte Verdünnung wurde aus der statistischen Analyse entfernt. Tabelle 18
    KBE/ml Mittlerer Ct-Wert (FAM) SD % Positive Ergebnisse Mittelwert Ct (Red677) SD % Gültige Ergebnisse
    20.000,0 33,3 0,8 100 31,5 0,4 100
    10.000,0 34,1 0,5 100 31,5 0,3 100
    5.000,0 34,8 0,7 100 31,6 0,4 100
    2.500,0 35,7 1,2 100 31,5 0,4 100
    1.250,0 37,6 1,0 95 31,5 0,4 100
    625,0 37,6 1,6 65 31,4 0,3 100
    312,5 38,9 0,8 40 31,4 0,3 100
  • Die LoD95% für GBS-Serotyp III wurde bei 1,294 KBE/ml in LB gefunden, d.h. 324 KBE/ml in der Testprobe.
  • Beispiel 7
  • Die analytische Empfindlichkeit und Inklusivität unter Verwendung von SIP-Primer/Sonden-Kombination 3, multiplexiert mit der CFB-Primer/Sonden-Kombination 17 wurde durch Testen von Reihenverdünnungen von Zelllysaten in einer negativen klinischen Lim-Brühe-Matrix auf GBS-Serotypen (Ia, Ib, Ic, II, III, IV, V, VI, VII, VIII und IX) bewertet. Zusätzlich wurde ein nicht hämolytischer (NH) Stamm bewertet. Die 95 %ige Nachweisgrenze des PANTHER FUSION® GBS-Assays für jeden Serotyp wurde unter Verwendung einer Probit-Regressionsanalyse bestimmt, und die vorhergesagten Nachweisgrenzen wurden über die 12 GBS-Serotypen bestätigt. Die Kreuzreaktivität und Interferenz der Mikroorganismen wurde mit 45 Bakterien- oder Pilzspezies mit und ohne Anwesenheit von GBS-Serotyp III bei 3-facher LoD bewertet. Eine Methodenvergleichsstudie wurde durchgeführt, um mit Lim-Brühe angereicherte Proben (n = 255) zu testen, die von Frauen vor der Geburt entnommen wurden, die ein GBS-Kulturscreening mit Standardbehandlung von zwei verschiedenen Krankenhäusern erhielten. Die Empfindlichkeit und Spezifität gegenüber der Kultur wurde für den PANTHER FUSION GBS-Assay bestimmt. Proben mit nicht übereinstimmenden Ergebnissen wurden mit dem BDMax GBS-Assay getestet. Alle Tests wurden mit dem PANTHER FUSION-System durchgeführt.
  • Analytische Empfindlichkeit und Inklusivität. Die Gruppen wurden durch Einbringen von Lysatbeständen mit bekannten KBE/ml-Konzentrationen in die Lim-Brühe-Anreicherungsmatrix hergestellt. Jede Gruppe wurde in Replikaten von 30 mit jeweils drei Assay-Reagenzchargen unter Verwendung von drei PANTHER FUSION-Systemen getestet. Die 50 % und 95 % vorhergesagten LoDs wurden für jeden Stamm und jede Reagenzcharge durch Probit-Analyse geschätzt (siehe Tabelle 19 unten). LoDs sind in Tabelle 19 als KBE/ml in der Lim Brühe-Probe angegeben (rückgerechnet aus KBE/ml in der PANTHER FUSION-Testprobe, die 1:4-Verdünnungen von Lim Brühe in Probentransportmedium (STM) waren). Bestätigungstests der vorhergesagten Nachweisgrenzen wurden durchgeführt und für alle Serotypen wurde eine 95% ige Positivität beobachtet. Tabelle 19
    GBS Reagenziencharge 1 Reagenziencharge 2 Reagenziencharge 3
    50 % LoD (95 % CI) in KBE/ml 95 % LoD (95 % CI) in KBE/ml 50 % LoD (95 % CI) in KBE/ml 95 % LoD (95 % CI) in KBE/ml 50 % LoD (95 % CI) in KBE/ml 95 % LoD (95 % CI) in KBE/ml
    Ia 36,50 (28,67-44,79) 137,37 (103,68-209,68) 26,36 (19,74-33,39) 123,33 (89,18-202,93) 35,63 (28,67-43,02) 109, 16 (84,84-149,26)
    Ib 27,67 (20,47-35,27) 140,47 (100,59-234,73) 28,51 (22,08-35,26) 104,35 (78,89-158,81) 25,24 (18,81-32,05) 116,49 (84,69-189,07)
    Ic 48,16 (40,74-55,65) 103,90 (85,36-143,01) 36,45 (29,27-44,21) 119,52 (91,78-177,29) 29,60 (22,45-37,26) 136,31 (99,20-220,52)
    II 49,95 (40,31-60,41) 179,02 (135,06-276,19) 37,71 (29,45-46,50) 152,98 (113,83-239,70) 41,91 (33,35-51,08) 154,27 (116,64-214,66)
    III 42,71 (33,94-52,32) 168,00 (125,20-261,50) 34,51 (26,60-43,19) 162,49 (117,01-268,11) 33,28 (26,54-40,53) 109,63 (84,15-162,56)
    IV 26,35 83,97 21,61 72,93 23,38 70,13
    (18,89-32,96) (63,02-130,42) (16,66-26,88) (54,81-113,53) (18,44-28,67) (53,84-105,00)
    V 32,80 (25,70-40,38) 122,33 (92,24-186,80) 31,85 (25,75-38,13) 84,13 (66,53-121,30) 28,89 (17,34-28,71) 88,18 (65,55-138,81)
    VI 63,46 (50,73-78,03) 281,95 (201,92-475,82) 56,34 (44,56-69,76) 265,87 (189,40-449,57) 49,18 (38,97-60,64) 216,19 (157,14-351,40)
    VII 57,96 (46,30-71,06) 250,80 (180,16-424,80) 41,29 (32,01-51,16) 182,99 (133,94-295,79) 29,36 (21,38-37,65) 160,87 (113,94-275,73)
    VIII 44,28 (34,14-55,34) 220,54 (157,50-370,98) 51,86 (41,06-63,93) 231,27 (167,30-380,88) 38,63 (29,62-48,47) 192,88 (137,94-322,17)
    IX 46,72 (35,16-59,69) 300,99 (202,02-567,73) 35,36 (26,76-44,70) 186,19 (131,87-316,56) 29,29 (21,95-37,01) 137,93 (100,34-223,89)
    NH 63,97 (50,75-78,99) 300,17 (211,99-522,99) 57,05 (45,71-69,43) 227,01 (167,33-366,40) 54,15 (43,74-65,30) 192,88 (145,53-299,61)
  • Mikroorganismus-Kreuzreaktivität und -Interferenz. Die in der nachstehenden Tabelle 20 aufgeführten Bakterien- und Pilzarten wurden in einer Konzentration von le6 KBE/ml in der Testprobe in die negative Lim-Brühe-Matrix eingebracht. Die Gruppen wurden mit und ohne GBS-Serotyp III bei 3-facher geschätzter LoD getestet. Jede Gruppe wurde dreifach mit einer Assay-Reagenzcharge getestet. In den Gruppen ohne GBS-Ziel wurde keine Kreuzreaktivität beobachtet. In den Gruppen, die ein GBS-Ziel enthielten, wurde keine Interferenz beobachtet. Tabelle 20: Getestete Organismen
    Acinetobacter iwoffii Proteus vulgaris
    Actinomycesisraelii Pseudomonas aeruginosa
    Alcaligenesfaecalis Staphylococcus aureus
    Bifidobacterium adolescentis Staphylococcus epidermidis
    Campylobacter jejuni Streptococcus pyogenes
    Candida albicans Streptococcus anginosus
    Clostridium difficile Streptococcus bovis
    Corynebacterium genitalium Streptococcus gordonii
    Cryptococcus neoformans Streptococcus mitis
    Enterobacter cloacae Streptococcus mutans
    Enterococcusfaecalis Streptococcus oralis
    Escherichia coli Streptococcus parasanguinis
    Fusobacterium necleatum Streptococcus pneumoniae
    Gardnerellavaginalis Streptococcus acidominimus
    Haemophilusducreyi Streptococcus canis
    Klebsiellapneumoniae Streptococcus cricetus
    Lactobacillus acidophilus Streptococcus cristatus
    Lactobacilluscrispatus Streptococcus downei
    Listeria monocytogenes Streptococcus dysagalactiae
    Neisseria gonorrhoeae Streptococcus equi
    Peptostreptococcusmagnus Streptococcus ratti
    Prevolellabivia Streptococcus costellatus
    Propionibacterium acnes
  • Verfahrensvergleich. Insgesamt 255 Vaginal-Rektal-Abstriche wurden von Frauen vor der Geburt gemäß den von der CDC empfohlenen Richtlinien gesammelt. Jede Probe wurde 18 bis 24 Stunden bei 35-37 °C in Lim-Brühe-Medium angereichert. Jede Probe wurde unter Verwendung einer Referenzkultur bewertet und im PANTHER FUSION GBS-Assay getestet. Die klinische Empfindlichkeit und Spezifität wurde gemäß dem Referenzkulturergebnis bestimmt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 21 zusammengefasst. Empfindlichkeit und Spezifität des PANTHER FUSION GBS-Assays betrugen 100 % bzw. 98,6 %. Es gab drei kulturnegative, PANTHER FUSION GBS-Assay-positive Proben, bei denen alle wiederholten PANTHER FUSION GBS-Assay-Tests zu positiven Ergebnissen führten. Ein zweites molekulares Testverfahren, der BDMax GBSassay, wurde verwendet, um die nicht übereinstimmenden Proben zu analysieren, und GBS wurde in allen drei Proben nachgewiesen. Tabelle 21
    Referenzkultur
    + -
    PANTHER FUSION GBS-Assay + 43 3
    - 0 209
    Empfindlichkeit (95% CI): 100% (91,8 -100)
    Spezifität (95% CI): 98,6% (95,9-99,5)
    Kulturprävalenz: 16,9%
    Panther-Fusionsprävalenz: 18,0%
  • Schlussfolgerungen. Die vorläufigen analytischen Studien zeigten, dass der Assay über evaluierte Serotypen hinweg einen konsistenten Nachweis von GBS aufwies, und der Vergleich mit Kulturverfahren zeigte, dass der Assay eine hohe Empfindlichkeit und Spezifität aufwies.
  • Beispiel 8
  • Dieses Beispiel beschreibt die Bewertung der analytischen Spezifität der mit der CFB-Primer/Sonden-Kombination 17 multiplexierten SIP-Primer/Sonden-Kombination 3 auf dem automatisierten PANTHER FUSION®-System.
  • Eine Gruppe von 124 Organismen, bestehend aus 104 Bakterien-, 12 Viren-, 4 Hefe-/Pilz- und 4 Protozoen-/Parasitenstämmen, die Mikroorganismen darstellen, die üblicherweise in der Vaginal-/Analflora vorkommen oder die der gleichen Familie/Gattung wie GBS angehören, wurde für analytische Spezifitätstests ausgewählt. Das analytische Spezifitätspanel ist in Tabelle 22 aufgeführt. Von den 124 ausgewählten Organismen standen 14 zum Zeitpunkt der Studie nicht für Tests zur Verfügung. Die potenzielle Kreuzreaktivität mit den GBS-Testprimern und -sonden für diese 14 nicht verfügbaren Organismen wurde durch BLAST-Analyse ohne identifizierte Alignments bewertet.
  • Die analytische Spezifität wurde unter Verwendung der folgenden zwei Ansätze bewertet:
    • (1) Kreuzreaktivität (Exklusivität): Prüfung, ob diese Organismen mit den GBS-Testprimern und -sonden kreuzreagieren und in den bestätigten GBS-negativen Proben ein falsch positives Ergebnis hervorrufen;
    • (2) Mikrobielle Interferenz: Prüfung, ob diese Organismen den normalen GBS-Nachweis in GBS-positiven Proben bei einer Konzentration in der Nähe von LoD stören könnten.
  • Aus fünf (5) Mikroorganismen bestehende Pools wurden in hohen Konzentrationen (mindestens 106 KBE/ml für Bakterien und Hefen und 105 KBE/ml für Viren oder Äquivalent) in Probentransportmedium (STM) verdünnt. Die Zusammensetzung des Pools ist in Tabelle 22 aufgeführt. Zur Beurteilung der Kreuzreaktivität (Exklusivität) wurden diese Pools von Mikroorganismen zu klinisch negativen Lim Brühe-Matrixproben (GBS-negative Proben) gegeben. Für die Beurteilung der mikrobiellen Interferenz wurden diese Pools von Mikroorganismen zu klinisch negativen Lim-Brühe-Matrixproben gegeben, die mit GBS-Serotyp III bei 3 × LOD (GBS-positive Proben) dotiert waren.
  • Für jeden zu bewertenden Pool von Mikroorganismen wurden drei Wiederholungen von GBS-positiven und GBS-negativen Proben für den PANTHER FUSION GBS-Assay getestet, und es wurden Daten angegeben.
  • Akzeptanzkriterium:
    • (1) Damit ein (Pool von) Mikroorganismen als nicht kreuzreaktiv eingestuft wird, müssen die drei Wiederholungen der klinisch negativen Lim-Brühe-Matrixproben (GBS-negative Proben) als negativ gemeldet werden.
    • (2) Damit ein (Pool von) Mikroorganismen als nicht interferierend eingestuft wird, müssen die drei Wiederholungen der GBS-Serotyp-III-positiven Probe (GBS-positive Proben) als positiv gemeldet werden.
    Tabelle 22: Analytisches Spezifitätspanel
    Mikroorganismus Konz. (KBE/ml oder PBE/ml*) Pool Mikroorganismus Konz. (KBE/ml oder PBE/ml*) Pool
    Bacillus cereus 1×106 I Streptococcus anginosus 1×106 XII
    Yersinia enterocolitica subsp. enterocolitica 1×106 Prevotella oralis 1×106
    Anaerococcus prevotii 1×106 Streptococcus canis 1×106
    Propionibacterium acnes 1×106 Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis 1×106
    Clostridium difficile 1×106 Corynebacterium sp (Genital) 1×106
    Fusobacterium nucleatum 1×106 II Neisseria gonorrhoeae 1×106 XIII
    Bifidobacterium adolescentis Reuter 1×106 Streptococcus pneumoniae (orale Gruppe) 1×106
    Candida albicans (NIH 3147) 1×106 Streptococcus mutans (orale Gruppe) 1x106
    Candida glabrata (CBS 138) 1×106 Corynebacterium urealyticum 1×106
    Candida tropicalis 1×106 Lactobacillus reuteri 1×106
    Cryptococcus neoformans 1×105* III Lactobacillus sp. 1×106 XIV
    Klebsiella pneumoniae 1×106 Lactobacillus casei 1×106
    Proteus mirabilis 1×106 Lactobacillus acidophilus 1×106
    Alcaligenes faecalis 1×106 Streptococcus gordonii (orale Gruppe) 1×106
    Enterobacter aerogenes 1×106 Bulkholderia cepacia 1×106
    Stenotrophomonas maltophilia 1×106 IV Aeromonas hydrophila 1×106 XV
    Campylobacter jejuni 1×106 Moraxella atlantae 1×106
    Providencia stuartii 1×106 Prevotella bivia 1×106
    Micrococcus luteus 1×106 Pasteurella aerogenes 1×106
    Staphylococcus haemolyticus 1×106 Rhodococcus equi 1×106
    Mikroorganismus Konz. (KBE/ml oder PBE/ml*) Pool Mikroorganismus Konz. (KBE/ml oder PBE/ml*) Pool
    Enterococcus faecalis 1×106 V Listeria monocytogenes 1×106 XVI
    Pseudomonas fluorescens 1×106 Lactobacillus gasseri 1×106
    Staphylococcus saprophyticus 1×106 Peptoniphilus asaccharolyticus 1×106
    Proteus vulgaris 1×106 Atopobium vaginae 1×106
    Toxoplasma gondii 1×105* Bifidobacterium brevis 1×106
    Enterococcus faecium 1×106 VI Abiotropha defectiva 1×106 XVII
    Escherichia coli 1×106 Anaerococcus tetradius 1×106
    Enterobacter cloacae 1×106 Finegoldia magna 1×106
    Morganella morganii 1×106 Peptostreptococcus anaerobius 1×106
    Shigella flexneri 1×106 Anaerococcus lactolyticus 1×106
    Streptococcus pyogenes (Gruppe A) 1×106 VII Humanes Herpesvirus 4 (EBV) 1×105* XVII I
    Streptococcus ratti 1×106 Bacteroides fragilis 1×106
    Staphylococcus lugdunensis 1×106 Bordetella pertussis 1×106
    Acinetobacter baumannii 1×106 Chlamydia trachomatis 1×106
    Staphylococcus aureus 1×106 Humanes Herpesvirus 5 (CMV) 1×105*
    Staphylococcus epidermidis 1×106 VIII Hafnia alvei 1×106 XIX
    Shigella sonnei 1×106 Trichomonas vaginalis 1×105*
    Citrobacter freundii 1×106 Humanes Immunschwächevirus-1 (HIV-1) 1×105*
    Enterococcus gallinarum 1×106 Moraxella catarrhalis 1×106
    Acinetobacter lwoffii 1×106 Mycoplasma genitalium 1×106
    Pseudomonas aeruginosa 1×106 Prevotella melaninogenica 1×106
    Streptococcus criceti 1×106 Röteln-Virus 1×105*
    Haemophilus influenzae 1×106 Serratia marcescens 1×106
    Mikroorganismus Konz. (KBE/ml oder PBE/ml*) Pool Mikroorganismus Konz. (KBE/ml oder PBE/ml*) Pool
    Klebsiella oxytoca 1×106 IX Streptococcus intermedius 1×106 XX
    Streptococcus bovis (Gruppe D) 1×106 Humanes Papillomvirus Typ 16 (HPV16) 1×105*
    Streptococcus parasanguinis 1×106 X Hepatitis-B-Virus 1×105* XXI
    Streptococcus equi subsp. equi (Gruppe D) 1×106 Hepatitis-C-Virus 1×105*
    Enterococcus durans 1×106 Herpes Simplex Virus-1 (HSV-1) 1×105*
    Lactobacillus plantarum 1×106 Herpes Simplex Virus-2 (HSV-2) 1×105*
    Streptococcus dysgalactiae 1×106 Humanes Herpesvirus 3 (VZV) 1×105*
    Streptococcus constellatus 1×106 XI Arcanobacterium pyogenes 1×106 XXII
    Streptococcus oralis (orale Gruppe) 1×106 Mobiluncus curtisii subsp curtisii 1×106
    Bacillus coagulans 1×106 Gardnerella vaginalis 1×106
    Streptococcus pseudoporcinus 1×106 Salmonella enterica subsp.enterica ser. Dublin (Gruppe D) 1×106
    Streptococcus mitis (orale Gruppe) 1×106 Streptococcus acidominus 1×106
    *genomische Extrakte, Konzentration in c/ml
    Durch BLAST-Analyse bewertete Mikroorganismen
    Actinomyces israelii Pantoea agglomerans Humanes Immunschwäche-Virus-2 (HIV-2)
    Actinobacillus pleuropneumoniae Staphylococcus simulans Parvovirus B19
    Haemophilus ducreyi Streptococcus cristatus Pentatrichomonas hominis
    Lactobacillus crispatus Streptococcus downei Trichomonas tenax
    Mycoplasma hominis Ureaplasma urealyticum
  • Studienergebnisse. Der Durchlauf war gültig und die interne Kontrolle (IC) wurde in jeder Reaktion nachgewiesen, was zu einer ungültigen Durchlaufrate von 0% bzw. einer ungültigen IC-Rate von 0% führte. Alle für die Kreuzreaktivitätsbewertung getesteten GBS-negativen Proben ergaben mit den GBS-Primern und -Sonden des PANTHER FUSION-Systems negative, gültige Ergebnisse, während alle für die Bewertung der mikrobiellen Interferenz getesteten GBS-positiven Proben mit dem PANTHER FUSION-GBS-Assay GBS-positive Ergebnisse ergaben. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 23 angegeben. Tabelle 23: Ergebnisse der analytischen Spezifität
    % Positive/gültige Ergebnisse (Replikation erkannt/gültige Reaktion)
    Kein GBS GBS bei 3x LoD
    Poolnummer GBS IC GBS IC
    Kein Mikroorganismus versetzt 0% (0/3) 100 % (3/3) 100 % (3/3) 100% (3/3)
    I 0% (0/3) 100 % (3/3) 100 % (3/3) 100 % (3/3)
    II 0 % (0/3) 100 % (3/3) 100 % (3/3) 100 % (3/3)
    III 0 % (0/3) 100 % (3/3) 100 % (3/3) 100 % (3/3)
    IV 0% (0/3) 100 % (3/3) 100 % (3/3) 100 % (3/3)
    V 0% (0/3) 100 % (3/3) 100 % (3/3) 100 % (3/3)
    VI 0% (0/3) 100 % (3/3) 100 % (3/3) 100 % (3/3)
    VII 0 % (0/3) 100 % (3/3) 100 % (3/3) 100 % (3/3)
    VIII 0 % (0/3) 100 % (3/3) 100 % (3/3) 100 % (3/3)
    IX 0 % (0/3) 100 % (3/3) 100 % (3/3) 100 % (3/3)
    X 0 % (0/3) 100 % (3/3) 100 % (3/3) 100 % (3/3)
    XI 0% (0/3) 100 % (3/3) 100% (3/3) 100 % (3/3)
    XII 0 % (0/3) 100 % (3/3) 100 % (3/3) 100 % (3/3)
    XIII 0 % (0/3) 100 % (3/3) 100 % (3/3) 100 % (3/3)
    XIV 0 % (0/3) 100 % (3/3) 100 % (3/3) 100 % (3/3)
    XV 0 % (0/3) 100 % (3/3) 100 % (3/3) 100 % (3/3)
    XVI 0 % (0/3) 100 % (3/3) 100 % (3/3) 100 % (3/3)
    XVII 0% (0/3) 100 % (3/3) 100 % (3/3) 100 % (3/3)
    XVIII 0% (0/3) 100 % (3/3) 100 % (3/3) 100 % (3/3)
    XIX 0% (0/3) 100 % (3/3) 100 % (3/3) 100 % (3/3)
    XX 0 % (0/3) 100 % (3/3) 100 % (3/3) 100 % (3/3)
    XXI 0% (0/3) 100 % (3/3) 100 % (3/3) 100 % (3/3)
    XXII 0 % (0/3) 100 % (3/3) 100 % (3/3) 100 % (3/3)
  • SEQUENZEN
  • Figure DE102019009219B4_0002
    Figure DE102019009219B4_0003
    Figure DE102019009219B4_0004
    Figure DE102019009219B4_0005
  • Aus dem Vorstehenden ist ersichtlich, dass, obwohl hier zum Zwecke der Veranschaulichung spezifische Ausführungsformen der Erfindung beschrieben wurden, verschiedene Modifikationen vorgenommen werden können, ohne vom Geist und Umfang der Erfindung abzuweichen. Dementsprechend ist die Erfindung nur durch die beigefügten Ansprüche beschränkt. Alle hier zitierten Veröffentlichungen, Patente und Patentanmeldungen werden hiermit in ihrer Gesamtheit für alle Zwecke durch Bezugnahme aufgenommen.
  • AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Die vorliegende Anmeldung bezieht sich auch auf die nachfolgenden nummerierten Gegenstände:
    • 1. Zusammensetzung zur Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit von Gruppe-B-Streptococcus (GBS) in einer Probe, wobei die Zusammensetzung umfasst:
      • eine erste Amplifikationsoligomeren-Kombination und/oder eine zweite Amplifikationsoligomeren-Kombination, wobei
        • (I) die erste Amplifikationsoligomeren-Kombination erste und zweite SIP-spezifische Amplifikationsoligomere umfasst, die in der Lage sind, eine Zielregion einer GBS-SIP-Zielnukleinsäure zu amplifizieren, wobei die ersten und zweiten SIP-spezifischen Amplifikationsoligomere jeweils erste (A) und zweite (B) SIP-spezifische Zielhybridisierungssequenzen umfassen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
          1. (a) (A) SEQ ID NO:3 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B) SEQ ID NO:4 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und
          2. (b) (A) SEQ ID NO:7 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B) SEQ ID NO:8 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und
        • (II) die zweite Amplifikationsoligomeren-Kombination erste und zweite CFB-spezifische Amplifikationsoligomere umfasst, die in der Lage sind, eine Zielregion einer GBS-CFB-Zielnukleinsäure zu amplifizieren, wobei die ersten und zweiten CFB-spezifischen Amplifikationsoligomere jeweils erste (A') und zweite (B') CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenzen umfassen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
          1. (a) (A') einer Sequenz, die aus ungefähr 17 bis ungefähr 24 zusammenhängenden Nukleotiden besteht, die in der Sequenz von SEQ ID NO:26 oder in einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon enthalten sind, und (B') SEQ ID NO: 13 oder SEQ ID NO: 15 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon;
          2. (b) (A') SEQ ID NO: 16 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B') SEQ ID NO: 17 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon;
          3. (c) (A') SEQ ID NO:18 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B') SEQ ID NO:15 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und
          4. (d) (A') SEQ ID NO:20 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B') SEQ ID NO:21 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon.
    • 2. Zusammensetzung nach Gegenstand 1, wobei die erste und die zweite SIP-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (I)(a) sind.
    • 3. Zusammensetzung nach Gegenstand 1, wobei die erste und die zweite SIP-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (I)(b) sind.
    • 4. Zusammensetzung nach einem der Gegenstände 1-3, wobei wenn die Zusammensetzung die erste Amplifikationsoligomeren-Kombination umfasst, die Zusammensetzung weiterhin ein SIP-spezifisches Nachweissondenoligomer umfasst, das eine SIP-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz umfasst, die von ungefähr 15 bis ungefähr 35 Nukleotide lang ist und konfiguriert ist, um mit einer Zielsequenz zu hybridisieren, die in einem SIP-Amplikon enthalten ist, das durch das erste und zweite SIP-spezifische Amplifikationsoligomer amplifizierbar ist.
    • 5. Zusammensetzung nach Gegenstgand 4, wobei die erste und die zweite SIP-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (I)(a) sind, und die SIP-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz SEQ ID NO:9 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon ist.
    • 6. Zusammensetzung nach Gegenstand 4, wobei die erste und die zweite SIP-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (I)(b) sind und die SIP-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz SEQ ID NO:11 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon ist.
    • 7. Zusammensetzung nach einem der Gegenstände 4 bis 6, wobei das SIP-spezifische Nachweissondenoligomer ferner eine nachweisbare Markierung umfasst.
    • 8. Zusammensetzung nach Gegenstand 7, wobei die nachweisbare Markierung eine fluoreszierende oder chemilumineszierende Markierung ist.
    • 9. Zusammensetzung nach Gegentand 7, wobei die nachweisbare Markierung eine fluoreszierende Markierung ist und das SIP-spezifische Nachweissondenoligomer ferner einen nicht fluoreszierenden Quencher umfasst.
    • 10. Zusammensetzung nach einem der Gegenstände 1-9, wobei die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (II)(b) sind.
    • 11. Zusammensetzung nach einem der Gegenstände 1-9, wobei die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (II)(d) sind.
    • 12. Zusammensetzung nach einem der Gegenstände 1-9, wobei die CFB-spezifischen Zielhybridisierungssequenzen die Zielhybridisierungssequenzen von (II)(a) sind.
    • 13. Zusammensetzung nach Gegenstand 12, wobei die erste CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz von (II)(a) mindestens die Sequenz von SEQ ID NO:28 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon umfasst.
    • 14. Zusammensetzung nach Gegenstand 13, wobei die erste CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz von (II)(a) in der Sequenz von SEQ ID NO:27 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon enthalten ist.
    • 15. Zusammensetzung nach Gegenstand 14, wobei die erste CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz von (II)(a) SEQ ID NO:12 oder SEQ ID NO:14 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon ist.
    • 16. Zusammensetzung nach Gegenstand 12, wobei die erste CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz von (II)(a) SEQ ID NO:18 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon ist.
    • 17. Zusammensetzung nach Gegenstand 12, wobei die ersten (A') und zweiten (B') CFB-spezifischen Zielhybridisierungssequenzen von (II)(a) ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus
      • (i) (A') SEQ ID NO:12 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B') SEQ ID NO:13 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon;
      • (ii) (A') SEQ ID NO:12 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B') SEQ ID NO:15 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon;
      • (iii) (A') SEQ ID NO:14 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B') SEQ ID NO:15 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und
      • (iv) (A') SEQ ID NO:18 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B') SEQ ID NO:15 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon.
    • 18. Zusammensetzung nach einem der Gegenstände 1-9, wobei die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (II)(c) sind.
    • 19. Zusammensetzung nach einem der Gegenstände 1 bis 18, wobei wenn die Zusammensetzung die zweite Amplifikationsoligomeren-Kombination umfasst, die Zusammensetzung ferner ein CFB-spezifisches Nachweissondenoligomer umfasst, das eine CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz umfasst, die ungefähr 15 bis ungefähr 35 Nukleotide lang ist und konfiguriert ist, um mit einer Zielsequenz zu hybridisieren, die in einem CFB-Amplikon enthalten ist, das durch das erste und zweite CFB-spezifische Amplifikationsoligomer amplifizierbar ist.
    • 20. Zusammensetzung nach Gegenstand 19, wobei die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (II)(b) sind und die CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz SEQ ID NO:24 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon ist.
    • 21. Zusammensetzung nach Gegenstand 19, wobei die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz sind die Zielhybridisierungssequenzen von (II)(d), und die CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz SEQ ID NO:25 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon ist.
    • 22. Zusammensetzung nach Gegenstand 19, wobei die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (II)(a) sind und die CFB-spezifische Nachweissonde die Zielhybridisierungssequenz von SEQ ID NO:22 oder SEQ ID NO:23 oder eine RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon ist.
    • 23. Zusammensetzung nach Gegenstand 19, wobei die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (II)(c) sind und die CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz SEQ ID NO:23 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon ist.
    • 24. Zusammensetzung nach einem der Gegenstände 19 bis 23, wobei das CFB-spezifische Nachweissondenoligomer ferner eine nachweisbare Markierung umfasst.
    • 25. Zusammensetzung nach Gegenstand 24, wobei die nachweisbare Markierung eine fluoreszierende oder chemilumineszierende Markierung ist.
    • 26. Zusammensetzung nach Gegenstand 24, wobei die nachweisbare Markierung eine fluoreszierende Markierung ist und das Nachweissondenoligomer ferner einen nicht fluoreszierenden Quencher umfasst.
    • 27. Zusammensetzung nach einem der Gegenstände 1-26, wobei die Zusammensetzung sowohl die erste als auch die zweite Amplifikationsoligomeren-Kombination umfasst.
    • 28. Zusammensetzung zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit von Gruppe-B-Streptococcus (GBS) in einer Probe, wobei die Zusammensetzung umfasst:
      • eine Amplifikationsoligomeren-Kombination mit ersten und zweiten SIP-spezifischen Amplifikationsoligomeren, welche in der Lage sind, eine Zielregion einer GBS-SIP-Zielnukleinsäure zu amplifizieren, wobei die ersten und zweiten SIP-spezifischen Amplifikationsoligomere jeweils erste (A) und zweite (B) SIP-spezifische Zielhybridisierungssequenzen umfassen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
        • (a) (A) SEQ ID NO:3 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B) SEQ ID NO:4 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und
        • (b) (A) SEQ ID NO:7 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B) SEQ ID NO:8 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon.
    • 29. Zusammensetzung nach Gegenstand 28, wobei die erste und zweite SIP-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (a) sind.
    • 30. Zusammensetzung nach Gegenstand 28, wobei die erste und die zweite SIP-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (b) sind.
    • 31. Zusammensetzung nach einem der Gegenstände 28-30, wobei die Zusammensetzung ferner ein SIP-spezifisches Nachweissondenoligomer umfasst, das eine SIP-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz umfasst, die ungefähr 15 bis ungefähr 35 Nukleotide lang ist und konfiguriert ist, um zu einer Zielsequenz zu hybridisieren, die in einem SIP-Amplikon enthalten ist, das durch die ersten und zweiten SIP-spezifischen Amplifikationsoligomere amplifizierbar ist.
    • 32. Zusammensetzung nach Gegenstand 31, wobei die erste und die zweite SIP-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (a) sind und die Zielhybridisierungssequenz der SIP-spezifischen Nachweissonde SEQ ID NO:9 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon ist.
    • 33. Zusammensetzung nach Gegenstand 32, wobei die erste und zweite SIP-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (b) sind und die Zielhybridisierungssequenz der SIP-spezifischen Nachweissonde SEQ ID NO:11 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon ist.
    • 34. Zusammensetzung nach einem der Gegenstände 31 bis 33, wobei das Nachweissondenoligomer ferner eine nachweisbare Markierung umfasst.
    • 35. Zusammensetzung nach Gegenstand 34, wobei die nachweisbare Markierung eine fluoreszierende oder chemilumineszierende Markierung ist.
    • 36. Zusammensetzung nach Gegenstand 34, wobei die nachweisbare Markierung eine fluoreszierende Markierung ist und das Nachweissondenoligomer ferner einen nicht fluoreszierenden Quencher umfasst.
    • 37. Zusammensetzung nach einem der Gegenstände 28 bis 36, ferner umfassend eine zweite Amplifikationsoligomeren-Kombination, die in der Lage ist, eine Zielregion einer GBS-CFB-Zielnukleinsäure zu amplifizieren.
    • 38. Zusammensetzung zur Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit von Gruppe-B-Streptococcus (GBS) in einer Probe, wobei die Zusammensetzung umfasst:
      • eine Amplifikationsoligomeren-Kombination, die erste und zweite CFB-spezifische Amplifikationsoligomere umfasst, die in der Lage ist, eine Zielregion einer GBS-CFB-Zielnukleinsäure zu amplifizieren, wobei die ersten und zweiten CFB-spezifischen Amplifikationsoligomere jeweils erste (A) und zweite (B) CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenzen umfassen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
        • (a) (A) einer Sequenz, die aus ungefähr 17 bis ungefähr 24 zusammenhängenden Nukleotiden besteht, die in der Sequenz von SEQ ID NO:26 enthalten sind, oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon, und (B) SEQ ID NO:13 oder SEQ ID NO:15 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon;
        • (b) (A) SEQ ID NO: 16 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B) SEQ ID NO:17 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon;
        • (c) (A) SEQ ID NO:18 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B) SEQ ID NO:15 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und
        • (d) (A) SEQ ID NO:20 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B) SEQ ID NO:21 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon.
    • 39. Zusammensetzung nach Gegenstand 38, wobei die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (b) sind.
    • 40. Zusammensetzung nach Gegenstand 38, wobei die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (d) sind.
    • 41. Zusammensetzung nach Gegenstand 38, wobei die CFB-spezifischen Zielhybridisierungssequenzen die Zielhybridisierungssequenzen von (a) sind.
    • 42. Zusammensetzung nach Gegenstand 41, wobei die erste CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz von (a) mindestens die Sequenz von SEQ ID NO:28 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon umfasst.
    • 43. Zusammensetzung nach Gegenstand 42, wobei die erste CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz von (a) in der Sequenz von SEQ ID NO:27 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon enthalten ist.
    • 44. Zusammensetzung nach Gegenstand 43, wobei die erste CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz von (a) SEQ ID NO:12 oder SEQ ID NO:14 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon ist.
    • 45. Zusammensetzung nach Gegenstand 41, wobei die erste CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz von (a) SEQ ID NO:18 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon ist.
    • 46. Zusammensetzung nach Gegenstand 41, wobei die ersten (A) und zweiten (B) CFB-spezifischen Zielhybridisierungssequenzen von (a) ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus
      • (i) (A) SEQ ID NO:12 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B) SEQ ID NO:13 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon;
      • (ii) (A) SEQ ID NO:12 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B) SEQ ID NO:15 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon;
      • (iii) (A) SEQ ID NO:14 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B) SEQ ID NO:15 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und
      • (iv) (A) SEQ ID NO:18 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B) SEQ ID NO:15 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon.
    • 47. Zusammensetzung nach Gegenstand 38, wobei die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (c) sind.
    • 48. Zusammensetzung nach einem der Gegenstände 38 bis 47, wobei die Zusammensetzung ferner ein CFB-spezifisches Nachweissondenoligomer umfasst, das eine CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz umfasst, die ungefähr 15 bis ungefähr 35 Nukleotide lang ist und konfiguriert ist, um mit einer Zielsequenz zu hybridisieren, die in einem CFB-Amplikon enthalten ist, das durch die ersten und zweiten CFB-spezifischen Amplifikationsoligomere amplifizierbar ist.
    • 49. Zusammensetzung nach Gegenstand 48, wobei die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (b) sind und die CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz SEQ ID NO:24 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon ist.
    • 50. Zusammensetzung nach Gegenstand 48, wobei die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (d) sind und die CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz SEQ ID NO:25 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon ist.
    • 51. Zusammensetzung nach Gegenstand 48, wobei die erste und zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (a) sind und die CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz SEQ ID NO:22 oder SEQ ID NO:23 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon ist.
    • 52. Zusammensetzung nach Gegenstand 48, wobei die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (c) sind und die CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz SEQ ID NO:23 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon ist.
    • 53. Zusammensetzung nach einem der Gegenstände 48 bis 52, wobei das Nachweissondenoligomer ferner eine nachweisbare Markierung umfasst.
    • 54. Zusammensetzung nach Gegenstand 53, wobei die nachweisbare Markierung eine fluoreszierende oder chemilumineszierende Markierung ist.
    • 55. Zusammensetzung nach Gegenstand 53, wobei die nachweisbare Markierung eine fluoreszierende Markierung ist und das Nachweissondenoligomer ferner einen nicht fluoreszierenden Quencher umfasst.
    • 56. Zusammensetzung nach einem der Gegenstände 38 bis 55, ferner umfassend eine zweite Amplifikationsoligomeren-Kombination, die in der Lage ist, eine Zielregion einer GBS-SIP-Zielnukleinsäure zu amplifizieren.
    • 57. Kit zur Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit von Gruppe--Streptococcus (GBS) in einer Probe, wobei der Kit umfasst:
      • eine erste Amplifikationsoligomeren-Kombination und/oder eine zweite Amplifikationsoligomeren-Kombination, wobei
        • (I) die erste Amplifikationsoligomeren-Kombination erste und zweite SIP-spezifische Amplifikationsoligomere umfasst, die in der Lage sind, eine Zielregion einer GBS-SIP-Zielnukleinsäure zu amplifizieren, wobei die ersten und zweiten SIP-spezifischen Amplifikationsoligomere jeweils erste (A) und zweite (B) SIP-spezifische Zielhybridisierungssequenzen umfassen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
          1. (a) (A) SEQ ID NO:3 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B) SEQ ID NO:4 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und
          2. (b) (A) SEQ ID NO:7 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B) SEQ ID NO:8 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und
        • (II) die zweite Amplifikationsoligomeren-Kombination erste und zweite CFB-spezifische Amplifikationsoligomere umfasst, die in der Lage sind, eine Zielregion einer GBS-CFB-Zielnukleinsäure zu amplifizieren, wobei die ersten und zweiten CFB-spezifischen Amplifikationsoligomere jeweils erste (A') und zweite (B') CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenzen umfassen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
          1. (a) (A') einer Sequenz, die aus ungefähr 17 bis ungefähr 24 zusammenhängenden Nukleotiden besteht, die in der Sequenz von SEQ ID NO:26 enthalten sind, oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon, und (B') SEQ ID NO: 13 oder SEQ ID NO:15 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon;
          2. (b) (A') SEQ ID NO:16 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B') SEQ ID NO:17 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon;
          3. (c) (A') SEQ ID NO:18 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B') SEQ ID NO:15 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und
          4. (d) (A') SEQ ID NO:20 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B') SEQ ID NO:21 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon.
    • 58. Kit nach Gegenstand 57, wobei die erste und die zweite SIP-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (I)(a) sind.
    • 59. Kit nach Gegenstand 57, wobei die erste und die zweite SIP-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (I)(b) sind.
    • 60. Kit nach einem der Gegenstände 57 bis 59, wobei wenn der Kit die erste Amplifikationsoligomeren-Kombination umfasst, der Kit ferner ein SIP-spezifisches Nachweissondenoligomer umfasst, das eine SIP-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz umfasst, die ungefähr 15 bis ungefähr 35 Nukleotide lang ist und konfiguriert ist, um mit einer Zielsequenz zu hybridisieren, die in einem SIP-Amplikon enthalten ist, das durch das erste und zweite SIP-spezifische Amplifikationsoligomer amplifizierbar ist.
    • 61. Kit nach Gegenstand 60, wobei die erste und die zweite SIP-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (I)(a) sind und die SIP-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz SEQ ID NO:9 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon ist.
    • 62. Kit nach Gegenstand 60, wobei die erste und die zweite SIP-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (I)(b) sind und die Zielhybridisierungssequenz der SIP-spezifischen Nachweissonde SEQ ID NO:11 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon ist.
    • 63. Kit nach einem der Gegenstände 60 bis 62, wobei das SIP-spezifische Nachweissondenoligomer ferner eine nachweisbare Markierung umfasst.
    • 64. Kit nach Gegenstand 63, wobei die nachweisbare Markierung eine fluoreszierende oder chemilumineszierende Markierung ist.
    • 65. Kit nach Gegenstand 63, wobei die nachweisbare Markierung eine fluoreszierende Markierung ist und das SIP-spezifische Nachweissondenoligomer ferner einen nicht fluoreszierenden Quencher umfasst.
    • 66. Kit nach einem der Gegenstände 57 bis 65, wobei die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenz von (II)(b) sind.
    • 67. Kit nach einem der Gegenstände 57 bis 65, wobei die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (II)(d) sind.
    • 68. Kit nach einem der Gegenstände 57 bis 65, wobei die CFB-spezifischen Zielhybridisierungssequenzen die Zielhybridisierungssequenzen von (II)(a) sind.
    • 69. Kit nach Gegenstand 68, wobei die erste CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz von (II)(a) mindestens die Sequenz von SEQ ID NO:28 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon umfasst.
    • 70. Kit nach Gegenstand 69, wobei die erste CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz von (II)(a) in der Sequenz von SEQ ID NO:27 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon enthalten ist.
    • 71. Kit nach Gegenstand 70, wobei die erste CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz von (II)(a) SEQ ID NO:12 oder SEQ ID NO:14 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon ist.
    • 72. Kit nach Gegenstand 68, wobei die erste CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz von (II)(a) SEQ ID NO:18 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon ist.
    • 73. Kit nach Gegenstand 68, wobei die ersten (A') und zweiten (B') CFB-spezifischen Zielhybridisierungssequenzen von (II)(a) ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus
      • (i) (A') SEQ ID NO:12 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B') SEQ ID NO:13 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon;
      • (ii) (A') SEQ ID NO:12 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B') SEQ ID NO:15 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon;
      • (iii) (A') SEQ ID NO:14 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B') SEQ ID NO:15 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und
      • (iv) (A') SEQ ID NO:18 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B') SEQ ID NO:15 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon.
    • 74. Kit nach einem der Gegenstände 57 bis 65, wobei die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenz von (II)(c) sind.
    • 75. Kit nach einem der Gegenstände 57-74, wobei wenn der Kit die zweite Amplifikationsoligomeren-Kombination umfasst, der Kit ferner ein CFB-spezifisches Nachweissondenoligomer umfasst, das eine CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz umfasst, die ungefähr 15 bis ungefähr 35 Nukleotide lang ist und konfiguriert ist, um mit einer Zielsequenz zu hybridisieren, die in einem CFB-Amplikon enthalten ist, das durch das erste und zweite CFB-spezifische Amplifikationsoligomer amplifizierbar ist.
    • 76. Kit nach Gegenstand 75, wobei die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (II)(b) sind und die CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz SEQ ID NO:24 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon ist.
    • 77. Kit nach Gegenstand 75, wobei die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (II)(d) sind und die CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz SEQ ID NO:25 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon ist.
    • 78. Kit nach Gegenstand 75, wobei die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (II)(a) sind und die CFB-spezifische Nachweissonde die Zielhybridisierungssequenz von SEQ ID NO:22 oder SEQ ID NO:23 oder eine RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon ist.
    • 79. Kit nach Gegenstand 75, wobei die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (II)(c) sind und die CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz SEQ ID NO:23 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon ist.
    • 80. Kit nach einem der Gegenstände 75 bis 79, wobei das CFB-spezifische Nachweissondenoligomer ferner eine nachweisbare Markierung umfasst.
    • 81. Kit nach Gegenstand 80, wobei die nachweisbare Markierung eine fluoreszierende oder chemilumineszierende Markierung ist.
    • 82. Kit nach Gegenstand 80, wobei die nachweisbare Markierung eine fluoreszierende Markierung ist und das Nachweissondenoligomer ferner einen nicht fluoreszierenden Quencher umfasst.
    • 83. Kit nach einem der Gegenstände 57-82, wobei der Kit sowohl die erste als auch die zweite Amplifikationsoligomeren-Kombination umfasst.
    • 84. Kit zur Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit von Gruppe-B-Streptococcus (GBS) in einer Probe, wobei der Kit umfasst:
      • eine Amplifikationsoligomeren-Kombination mit ersten und zweiten SIP-spezifischen Amplifikationsoligomeren, die in der Lage sind, eine Zielregion einer GBS-SIP Zielnukleinsäure zu amplifizieren, wobei die ersten und zweiten SIP-spezifischen Amplifikationsoligomere jeweils erste (A) und zweite (B) SIP-spezifische Zielhybridisierungssequenzen umfassen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
        1. (a) (A) SEQ ID NO:3 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B) SEQ ID NO:4 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und
        2. (b) (A) SEQ ID NO:7 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B) SEQ ID NO:8 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon.
    • 85. Kit nach Gegenstand 84, wobei die erste und die zweite SIP-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (a) sind.
    • 86. Kit nach Gegenstand 84, wobei die erste und die zweite SIP-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (b) sind.
    • 87. Kit nach einem der Gegenstände 84-86, wobei der Kit ferner ein SIP-spezifisches Nachweissondenoligomer umfasst, das eine SIP-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz umfasst, die ungefähr 15 bis ungefähr 35 Nukleotide lang ist und konfiguriert ist, um mit einer Zielsequenz zu hybridisieren, die in einem SIP-Amplikon enthalten ist, das durch die ersten und zweiten SIP-spezifischen Amplifikationsoligomeren amplifizierbar ist.
    • 88. Kit nach Gegenstand 87, wobei die erste und die zweite SIP-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (a) sind und die SIP-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz SEQ ID NO:9 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon ist.
    • 89. Kit nach Gegenstand 88, wobei die erste und zweite SIP-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (b) sind und die SIP-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz SEQ ID NO:11 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon ist.
    • 90. Kit nach einem der Gegenstände 87 bis 89, wobei das Nachweissondenoligomer ferner eine nachweisbare Markierung umfasst.
    • 91. Kit nach Gegenstand 90, wobei die nachweisbare Markierung eine fluoreszierende oder chemilumineszierende Markierung ist.
    • 92. Kit nach Gegenstand 90, wobei die nachweisbare Markierung eine fluoreszierende Markierung ist und das Nachweissondenoligomer ferner einen nicht fluoreszierenden Quencher umfasst.
    • 93. Kit nach einem der Gegenstände 84 bis 92, ferner umfassend eine zweite Amplifikationsoligomeren-Kombination, die in der Lage ist, eine Zielregion einer GBS-CFB-Zielnukleinsäure zu amplifizieren.
    • 94. Kit zur Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit von Gruppe-B-Streptococcus (GBS) in einer Probe, wobei der Kit umfasst:
      • eine Amplifikationsoligomeren-Kombination, die erste und zweite CFB-spezifische Amplifikationsoligomere umfasst, die eine Zielregion einer GBS-CFB-Zielnukleinsäure amplifizieren, wobei die ersten und zweiten CFB-spezifischen Amplifikationsoligomere jeweils erste (A) und zweite (B) CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenzen umfassen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
        1. (a) (A) einer Sequenz, die aus ungefähr 17 bis ungefähr 24 zusammenhängenden Nukleotiden besteht, die in der Sequenz von SEQ ID NO:26 enthalten sind, oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon, und (B) SEQ ID NO:13 oder SEQ ID NO:15 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon;
        2. (b) (A) SEQ ID NO:16 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B) SEQ ID NO:17 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon;
        3. (c) (A) SEQ ID NO:18 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B) SEQ ID NO:15 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und
        4. (d) (A) SEQ ID NO:20 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B) SEQ ID NO:21 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon.
    • 95. Kit nach Gegenstand 94, wobei die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenz von (b) sind.
    • 96. Kit nach Gegenstand 94, wobei die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (d) sind.
    • 97. Kit nach Gegenstand 94, wobei die CFB-spezifischen Zielhybridisierungssequenzen die Zielhybridisierungssequenzen von (a) sind.
    • 98. Der Kit nach Gegenstand 97, wobei die erste CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz von (a) mindestens die Sequenz von SEQ ID NO:28 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon umfasst.
    • 99. Kit nach Gegenstand 98, wobei die erste CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz von (a) in der Sequenz von SEQ ID NO:27 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon enthalten ist.
    • 100. Kit nach Gegenstand 99, wobei die erste CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz von (a) SEQ ID NO:12 oder SEQ ID NO:14 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon ist.
    • 101. Kit nach Gegenstand 97, wobei die erste CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz von (a) SEQ ID NO:18 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon ist.
    • 102. Kit nach Gegenstand 97, wobei die ersten (A) und zweiten (B) CFB-spezifischen Zielhybridisierungssequenzen von (a) ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus
      • (i) (A) SEQ ID NO:12 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B) SEQ ID NO:13 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon;
      • (ii) (A) SEQ ID NO:12 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und (B) SEQ ID NO:15 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon;
      • (iii) (A) SEQ ID NO:14 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und (B) SEQ ID NO:15 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und
      • (iv) (A) SEQ ID NO:18 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und (B) SEQ ID NO:15 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon.
    • 103. Kit nach Gegenstand 94, wobei die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenz von (c) sind.
    • 104. Kit nach einem der Gegenstände 94-103, wobei der Kit ferner ein CFB-spezifisches Nachweissondenoligomer umfasst, das eine CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz umfasst, die ungefähr 15 bis ungefähr 35 Nukleotide lang ist und konfiguriert ist, um mit einer Zielsequenz zu hybridisieren, die in einem CFB-Amplikon enthalten ist, das durch die ersten und zweiten CFB-spezifischen Amplifikationsoligomeren amplifizierbar ist.
    • 105. Kit nach Gegenstand 104, wobei die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (b) sind und die CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz SEQ ID NO:24 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon ist.
    • 106. Kit nach Gegenstand 104, wobei die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (d) sind und die CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz SEQ ID NO:25 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon ist.
    • 107. Kit nach Gegenstand 104, wobei die erste und zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (a) sind und die CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz SEQ ID NO:22 oder SEQ ID NO:23 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon ist.
    • 108. Kit nach Gegenstand 104, wobei die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (c) sind und die CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz SEQ ID NO:23 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon ist.
    • 109. Kit nach einem der Gegenstände 104-108, wobei das Nachweissondenoligomer ferner eine nachweisbare Markierung umfasst.
    • 110. Kit nach Gegenstand 109, wobei die nachweisbare Markierung eine fluoreszierende oder chemilumineszierende Markierung ist.
    • 111. Kit nach Gegenstand 109, wobei die nachweisbare Markierung eine fluoreszierende Markierung ist und das Nachweissondenoligomer ferner einen nicht fluoreszierenden Quencher umfasst.
    • 112. Kit nach einem der Gegenstände 94-111, ferner umfassend eine zweite Amplifikationsoligomeren-Kombination, die in der Lage ist, eine Zielregion einer GBS-SIP-Zielnukleinsäure zu amplifizieren.
    • 113. Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit von Gruppe-B-Streptococcus (GBS) in einer Probe, wobei das Verfahren umfasst:
      • (1) Inkontaktbringen einer Probe, von der vermutet wird, dass sie GBS enthält, mit einer ersten Amplifikationsoligomeren-Kombination und/oder einer zweiten Amplifikationsoligomeren-Kombination, wobei
        • (I) die erste Amplifikationsoligomeren-Kombination erste und zweite SIP-spezifische Amplifikationsoligomere zur Amplifikation einer Zielregion einer GBS-SIP-Zielnukleinsäure umfasst, wobei die ersten und zweiten SIP-spezifischen Amplifikationsoligomere jeweils erste (A) und zweite (B) SIP-spezifische Zielhybridisierungssequenzen umfassen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
          1. (a) (A) SEQ ID NO:3 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B) SEQ ID NO:4 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und
          2. (b) (A) SEQ ID NO:7 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B) SEQ ID NO:8 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und
        • (II) die zweite Amplifikationsoligomeren-Kombination erste und zweite CFB-spezifische Amplifikationsoligomere zur Amplifikation einer Zielregion einer GBS-CFB-Zielnukleinsäure umfasst, wobei das erste und zweite CFB-spezifische Amplifikationsoligomer jeweils erste (A') und zweite (B') CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenzen umfassen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
          1. (a) (A') einer Sequenz, die aus ungefähr 17 bis ungefähr 24 zusammenhängenden Nukleotiden besteht, die in der Sequenz von SEQ ID NO:26 enthalten sind, oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon, und (B') SEQ ID NO: 13 oder SEQ ID NO: 15 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon;
          2. (b) (A') SEQ ID NO: 16 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B') SEQ ID NO: 17 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon;
          3. (c) (A') SEQ ID NO: 18 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B') SEQ ID NO: 15 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und
          4. (d) (A') SEQ ID NO:20 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B') SEQ ID NO:21 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon;
      • (2) Durchführen einer Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion in vitro, wobei jede GBS-SIP und/oder CFB-Zielnukleinsäure, falls in der Probe vorhanden, als eine Matrize verwendet wird zum Erzeugen eines oder mehrerer Amplikons, die mindestens einer der entsprechenden SIP- und CFB-Zielregionen entsprechen; und
      • (3) Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit des einen oder der mehreren Amplikons, wodurch die Anwesenheit oder Abwesenheit von GBS in der Probe bestimmt wird.
    • 114. Verfahren nach Gegenstand 113, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen der Probe mit sowohl der ersten als auch der zweiten Amplifikationsoligomeren-Kombination umfasst.
    • 115. Verfahren nach Gegenstand 114, wobei das Verfahren ein Multiplexverfahren ist, bei dem die Probe sowohl mit der ersten als auch mit der zweiten Amplifikationsoligomeren-Kombination innerhalb des gleichen Reaktionsgemisches in Kontakt gebracht wird.
    • 116. Verfahren nach einem der Gegenstände 113-115, wobei die erste und die zweite SIP-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (I)(a) sind.
    • 117. Verfahren nach Gegenstand 113-115, wobei die erste und die zweite SIP-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (I)(b) sind.
    • 118. Verfahren nach einem der Gegenstände 113-117, wobei wenn das Verfahren das Inkontaktbringen der Probe mit der ersten Amplifikationsoligomeren-Kombination umfasst, der Nachweisschritt das Inkontaktbringen der Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion in vitro mit einem SIP-spezifischen Nachweissondenoligomer umfasst, das eine SIP-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz umfasst, welche ungefähr 15 bis ungefähr 35 Nukleotide lang und konfiguriert ist, um mit einer Zielsequenz zu hybridisieren, die in einem SIP-Amplikon enthalten ist, das durch die ersten und zweiten SIP-spezifischen Amplifikationsoligomeren amplifizierbar ist.
    • 119. Verfahren nach Gegenstand 118, wobei die erste und die zweite SIP-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (I)(a) sind, und die SIP-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz SEQ ID NO:9 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon ist.
    • 120. Verfahren nach Gegenstand 118, wobei die erste und die zweite SIP-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (I)(b) sind und die Zielhybridisierungssequenz der SIP-spezifischen Nachweissonde SEQ ID NO:11 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon ist.
    • 121. Verfahren nach einem der Gegenstände 118 bis 120, wobei das SIP-spezifische Nachweissondenoligomer ferner eine nachweisbare Markierung umfasst.
    • 122. Verfahren nach Gegenstand 121, wobei die nachweisbare Markierung eine fluoreszierende oder chemilumineszierende Markierung ist.
    • 123. Verfahren nach Gegenstand 121, wobei die nachweisbare Markierung eine fluoreszierende Markierung ist und das SIP-spezifische Nachweissondenoligomer ferner einen nicht fluoreszierenden Quencher umfasst.
    • 124. Verfahren nach einem der Gegenstände 113-123, wobei die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (II)(b) sind.
    • 125. Verfahren nach einem der Gegenstände 113-123, wobei die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (II)(d) sind.
    • 126. Verfahren nach einem der Gegenstände 113-123, wobei die CFB-spezifischen Zielhybridisierungssequenzen die Zielhybridisierungssequenzen von (II)(a) sind.
    • 127. Verfahren nach Gegenstand 126, wobei die erste CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz von (II)(a) mindestens die Sequenz von SEQ ID NO:28 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon umfasst.
    • 128. Verfahren nach Gegenstand 127, wobei die erste CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz von (II)(a) in der Sequenz von SEQ ID NO:27 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon enthalten ist.
    • 129. Verfahren nach Gegenstand 128, wobei die erste CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz von (II)(a) SEQ ID NO:12 oder SEQ ID NO:14 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon ist.
    • 130. Verfahren nach Gegenstand 126, wobei die erste CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz von (II)(a) SEQ ID NO:18 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon ist.
    • 131. Verfahren nach Gegenstand 126, wobei die ersten (A') und zweiten (B') CFB-spezifischen Zielhybridisierungssequenzen von (II)(a) ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus
      • (i) (A') SEQ ID NO:12 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B') SEQ ID NO:13 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon;
      • (ii) (A') SEQ ID NO:12 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B') SEQ ID NO:15 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon;
      • (iii) (A') SEQ ID NO:14 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B') SEQ ID NO:15 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und
      • (iv) (A') SEQ ID NO:18 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B') SEQ ID NO:15 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon.
    • 132. Verfahren nach einem der Gegenstände 113-123, wobei die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (II)(c) sind.
    • 133. Verfahren nach einem der Gegenstände 113-132, wobei wenn das Verfahren das Inkontaktbringen der Probe mit der zweiten Amplifikationsoligomeren-Kombination umfasst, der Nachweisschritt das Inkontaktbringen der Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion in vitro mit einem CFB-spezifischen Nachweissondenoligomer umfasst, das eine CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz umfasst, die ungefähr 15 bis ungefähr 35 Nukleotide lang ist und konfiguriert ist, dum mit einer Zielsequenz zu hybridisieren, die in einem CFB-Amplikon enthalten ist, das durch die ersten und zweiten CFB-spezifischen Amplifikationsoligomeren amplifizierbar ist.
    • 134. Verfahren nach Gegenstand 133, wobei die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (II)(b) sind und die CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz SEQ ID NO:24 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon ist.
    • 135. Verfahren nach Gegenstand 133, wobei die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (II)(d) sind und die CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz SEQ ID NO:25 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon ist.
    • 136. Verfahren nach Gegenstand 133, wobei die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (II)(a) sind und die CFB-spezifische Nachweissonde die Zielhybridisierungssequenz von SEQ ID NO:22 oder SEQ ID NO:23 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon ist.
    • 137. Verfahren nach Gegenstand 133, wobei die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (II)(c) sind und die CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz SEQ ID NO:23 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon ist.
    • 138. Verfahren nach einem der Gegenstände 133-137, wobei das CFB-spezifische Nachweissondenoligomer ferner eine nachweisbare Markierung umfasst.
    • 139. Verfahren nach Gegenstand 138, wobei die nachweisbare Markierung eine fluoreszierende oder chemilumineszierende Markierung ist.
    • 140. Verfahren nach Gegenstand 138, wobei die nachweisbare Markierung eine Fluoreszenzmarkierung ist und das CFB-spezifische Nachweissondenoligomer ferner einen nicht fluoreszierenden Quencher umfasst.
    • 141. Verfahren nach einem der Gegenstände 188 bis 120 und 133 bis 137, wobei der Nachweisschritt in Echtzeit ausgeführt wird.
    • 142. Verfahren nach einem der Gegenstände 113 bis 141, wobei die Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion in vitro eine PCR-Amplifikationsreaktion ist.
    • 143. Verfahren nach Gegenstand 114 oder 115, wobei der Nachweisschritt das Inkontaktbringen der Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion in vitro mit
      • (i) einem SIP-spezifischen Nachweissondenoligomer, umfassend eine SIP-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz, die ungefähr 15 bis ungefähr 35 Nukleotide lang ist und konfiguriert ist, um mit einer Zielsequenz zu hybridisieren, die in einem durch die ersten und zweiten SIP-spezifischen Amplifikationsoligomere amplifizierbaren SIP-Amplikon enthalten ist, und
      • (ii) einem CFB-spezifischen Nachweissondenoligomer, umfassend eine CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz, die ungefähr 15 bis ungefähr 35 Nukleotide lang ist und konfiguriert ist, um mit einer Zielsequenz zu hybridisieren, die in einem durch die ersten und zweiten CFB-spezifischen Amplifikationsoligomere amplifizierbaren CFB-Amplikon enthalten ist, umfasst,
      wobei jedes der SIP-spezifischen und CFB-spezifischen Nachweissondenoligomere eine fluoreszierende Markierung und einen nicht fluoreszierenden Quencher umfasst.
    • 144. Verfahren nach Gegenstand 143, wobei die Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion in vitro eine Echtzeit-PCR-Amplifikationsreaktion ist.
    • 145. Verfahren zum Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit von Gruppe-B-Streptococcus (GBS) in einer Probe, wobei das Verfahren umfasst:
      • (1) Inkontaktbringen einer Probe, die vermutlich GBS enthält, mit einer Amplifikationsoligomeren-Kombination mit ersten und zweiten SIP-spezifischen Amplifikationsoligomeren, um eine Zielregion einer GBS-SIP-Zielnukleinsäure zu amplifizieren, wobei die ersten und zweiten SIP-spezifischen Amplifikationsoligomere jeweils erste (A) und zweite (B) SIP-spezifische Zielhybridisierungssequenzen umfassen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
        1. (a) (A) SEQ ID NO:3 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und (B) SEQ ID NO:4 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und
        2. (b) (A) SEQ ID NO:7 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und (B) SEQ ID NO:8 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon;
      • (2) Durchführen einer Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion in vitro, wobei eine beliebige GBS-SIP-Zielnukleinsäure, falls in der Probe vorhanden, als Matrize zum Erzeugen eines Amplikons verwendet wird, das der SIP-Zielregion entspricht; und
      • (3) Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit des Amplikons, wodurch die Anwesenheit oder Abwesenheit von GBS in der Probe bestimmt wird.
    • 146. Verfahren nach Gegenstand 145, wobei die erste und die zweite SIP-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (a) sind.
    • 147. Verfahren nach Gegenstand145, wobei die erste und die zweite SIP-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (b) sind.
    • 148. Verfahren nach einem der Gegenstände 145 bis 147, wobei der Nachweisschritt das Inkontaktbringen der Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion in vitro mit einem SIP-spezifischen Nachweissondenoligomer, welches eine SIP-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz umfasst, die ungefähr 15 bis ungefähr 35 Nukleotide lang ist und konfiguriert ist, um mit einer Zielsequenz zu hybridisieren, die in einem SIP-Amplikon enthalten ist, das durch die ersten und zweiten SIP-spezifischen Amplifikationsoligomer amplifizierbar ist.
    • 149. Verfahren nach Gegenstand 148, wobei die erste und die zweite SIP-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (a) sind und die SIP-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz SEQ ID NO:9 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon ist.
    • 150. Verfahren nach Gegenstand 148, wobei die erste und zweite SIP-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (b) sind und die SIP-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz SEQ ID NO:11 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon ist.
    • 151. Verfahren nach einem der Gegenstände 145-150, wobei das Nachweissondenoligomer ferner eine nachweisbare Markierung umfasst.
    • 152. Verfahren nach Gegenstand 151, wobei die nachweisbare Markierung eine fluoreszierende oder chemilumineszierende Markierung ist.
    • 153. Verfahren nach Gegenstand 151, wobei die nachweisbare Markierung eine fluoreszierende Markierung ist und das Nachweissondenoligomer ferner einen nicht fluoreszierenden Quencher umfasst.
    • 154. Verfahren nach einem der Gegenstände 145-150, wobei der Nachweisschritt in Echtzeit ausgeführt wird.
    • 155. Verfahren nach einem der Gegenstände 145-154, wobei die Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion in vitro eine PCR-Amplifikationsreaktion ist.
    • 156. Verfahren nach Gegenstand 153, wobei die Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion in vitro eine Echtzeit-PCR-Amplifikationsreaktion ist.
    • 157. Verfahren nach einem der Gegenstände 145-156, ferner umfassend das Inkontaktbringen der Probe mit einer zweiten Amplifikationsoligomeren-Kombination, die erste und zweite CFB-spezifische Amplifikationsoligomere umfasst, zum Amplifizieren einer Zielregion einer GBS-CFB-Zielnukleinsäure, wobei im Amplifikationsschritt eine beliebige GBS-CFB-Zielnukleinsäure, falls in der Probe vorhanden, als Matrize zur Erzeugung eines Amplikons verwendet wird, das der CFB-Zielregion entspricht, und wobei der Nachweisschritt den Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit des Amplikons umfasst, das der CFB-Zielregion entspricht.
    • 158. Verfahren zur Bestimmung des Anwesenheit oder Abwesenheit von Gruppe-B-Streptococcus (GBS) in einer Probe, wobei das Verfahren umfasst:
      • (1) Inkontaktbringen einer Probe, von der vermutet wird, dass sie GBS enthält, mit einer Amplifikationsoligomeren-Kombination, die ein erstes und ein zweites CFB-spezifisches Amplifikationsoligomer umfasst, zur Amplifikation einer Zielregion einer GBS-CFB-Zielnukleinsäure, wobei das erste und das zweite SIP-spezifische Amplifikationsoligomer jeweils erste (A) und zweite (B) SIP-spezifische Zielhybridisierungssequenzen umfassen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
        1. (a) (A) einer Sequenz, die aus ungefähr 17 bis ungefähr 24 zusammenhängenden Nukleotiden besteht, die in der Sequenz von SEQ ID NO:26 enthalten sind, oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon, und (B) SEQ ID NO: 13 oder SEQ ID NO: 15 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon;
        2. (b) (A) SEQ ID NO: 16 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B) SEQ ID NO: 17 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon;
        3. (c) (A) SEQ ID NO: 18 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und (B) SEQ ID NO: 15 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und
        4. (d) (A) SEQ ID NO:20 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und (B) SEQ ID NO:21 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon;
      • (2) Durchführen einer Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion in vitro, wobei eine beliebige GBS-CFB-Zielnukleinsäure, falls in der Probe vorhanden, als Matrize zum Erzeugen eines Amplikons verwendet wird, das der CFB-Zielregion entspricht; und
      • (3) Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit des Amplikons, wodurch die Anwesenheit oder Abwesenheit von GBS in der Probe bestimmt wird.
    • 159. Verfahren nach Gegenstand 158, wobei die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenz von (b) sind.
    • 160. Verfahren nach Gegenstand 158, wobei die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (d) sind.
    • 161. Verfahren nach Gegenstand 158, wobei die CFB-spezifischen Zielhybridisierungssequenzen die Zielhybridisierungssequenzen von (a) sind.
    • 162. Verfahren nach Gegenstand 161, wobei die erste CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz von (a) mindestens die Sequenz von SEQ ID NO:28 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon umfasst.
    • 163. Verfahren nach Gegenstand 162, wobei die erste CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz von (a) in der Sequenz von SEQ ID NO:27 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon enthalten ist.
    • 164. Verfahren nach Gegenstand 163, wobei die erste CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz von (a) SEQ ID NO:12 oder SEQ ID NO:14 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon ist.
    • 165. Verfahren nach Gegenstand 161, wobei die erste CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz von (a) SEQ ID NO:18 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon ist.
    • 166. Verfahren nach Gegenstand 161, wobei die ersten (A) und zweiten (B) CFB-spezifischen Zielhybridisierungssequenzen von (a) ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus
      • (i) (A) SEQ ID NO:12 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und (B) SEQ ID NO:13 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon;
      • (ii) (A) SEQ ID NO:12 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und (B) SEQ ID NO:15 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon;
      • (iii) (A) SEQ ID NO:14 oder ein RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und (B) SEQ ID NO:15 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und
      • (iv) (A) SEQ ID NO:18 oder ein RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und (B) SEQ ID NO:15 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon.
    • 167. Verfahren nach Gegenstand 158, wobei die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenz von (c) sind.
    • 168. Verfahren nach einem der Gegenstände 158-167, wobei der Nachweisschritt das Inkontaktbringen der Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion in vitro mit einer CFB-spezifischen Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz umfasst, die etwa 15 bis etwa 35 Nukleotide lang ist und konfiguriert ist, um mit einer Zielsequenz zu hybridisieren, die in einem durch erste und zweite CFB-spezifische Amplifikationsoligomer amplifizierbaren CFB-Amplikon enthalten ist.
    • 169. Verfahren nach Gegenstand 168, wobei die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (b) sind und die CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz SEQ ID NO:24 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon ist.
    • 170. Verfahren nach Gegenstand 168, wobei die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (d) sind und die CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz SEQ ID NO:25 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon ist.
    • 171. Verfahren nach Gegenstand 168, wobei die erste und zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (a) sind und die CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz SEQ ID NO:22 oder SEQ ID NO:23 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon ist.
    • 172. Verfahren nach Gegenstand 168, wobei die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz sind die Zielhybridisierungssequenzen von (c) und die CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz SEQ ID NO:23 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon ist.
    • 173. Verfahren nach einem der Gegenstände 168 bis 172, wobei das Nachweissondenoligomer ferner eine nachweisbare Markierung umfasst.
    • 174. Verfahren nach Gegenstand 173, wobei die nachweisbare Markierung eine fluoreszierende oder chemilumineszierende Markierung ist.
    • 175. Verfahren nach Gegenstand 173, wobei die nachweisbare Markierung eine fluoreszierende Markierung ist und das Nachweissondenoligomer ferner einen nicht fluoreszierenden Quencher umfasst.
    • 176. Verfahren nach einem der Gegenstände 168 bis 172, wobei der Nachweisschritt in Echtzeit ausgeführt wird.
    • 177. Verfahren nach einem der Gegenstände 168-176, wobei die Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion in vitro eine PCR-Amplifikationsreaktion ist.
    • 178. Verfahren nach Gegenstand 175, wobei die Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion in vitro eine Echtzeit-PCR-Amplifikationsreaktion ist.
    • 179. Verfahren nach einem der Gegenstände 168-178, ferner umfassend das Inkontaktbringen der Probe mit einer zweiten Amplifikationsoligomeren-Kombination, welche erste und zweite SIP-spezifische Amplifikationsoligomere umfasst, zum Amplifizieren einer Zielregion einer GBS-SIP-Zielnukleinsäure, wobei im Amplifikationsschritt eine beliebige GBS-SIP-Zielnukleinsäure, falls in der Probe vorhanden, als Matrize zur Erzeugung eines Amplikons verwendet wird, das der SIP-Zielregion entspricht, und wobei der Nachweisschritt den Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit des Amplikons umfasst, das der SIP-Zielregion entspricht.
    • 180. Verfahren nach einem der Gegenstände 113-179, wobei das Verfahren die Anwesenheit oder Abwesenheit von einem der GBS-Serotypen Ia, Ib, Ic, II, III, IV, V, VI, VII, VIII und IX bestimmt.
    • 181. Verfahren nach Gegenstand 181, wobei das Verfahren ferner die Anwesenheit oder Abwesenheit eines nicht hämolytischen Stammes von GBS bestimmt.
    • 182. Nachweissondenoligomer, umfassend:
      • Eine SIP-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz, die eine Länge von ungefähr 15 bis ungefähr 35 Nukleotiden aufweist und konfiguriert ist, um mit einer Zielsequenz zu hybridisieren, die in einem SIP-Amplikon enthalten ist, das durch eine erste Amplifikationsoligomeren-Kombination amplifizierbar ist, umfassend erste und zweite SIP-spezifische Amplifikationsoligomere, die in der Lage sind, eine Zielregion einer SIP-Zielnukleinsäure von Gruppe-B-Streptococcus (GBS) zu amplifizieren, wobei das erste und zweite SIP-spezifische Amplifikationsoligomer jeweils erste (A) und zweite (B) SIP-spezifische Zielhybridisierungssequenzen umfassen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
        • (a) (A) SEQ ID NO:3 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und (B) SEQ ID NO:4 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und
        • (b) (A) SEQ ID NO:7 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon und (B) SEQ ID NO:8 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon.
    • 183. Nachweissondenoligomer umfassend:
      • ein CFB-spezifisches Nachweissondenoligomer, umfassend eine CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz, die ungefähr 15 bis ungefähr 35 Nukleotide lang ist und konfiguriert ist, um zu einer Zielsequenz zu hybridisieren, die in einem CFB-Amplikon enthalten ist, das durch eine zweite Amplifikationsoligomeren-Kombination amplifizierbar ist, die erste und zweite CFB-spezifische Amplifikationsoligomere umfasst, die in der Lage sind, eine Zielregion einer CFB-Zielnukleinsäure von Gruppe-B-Streptococcus (GBS) zu amplifizieren, wobei die ersten und zweiten CFB-spezifischen Amplifikationsoligomere jeweils erste (A') und zweite (B') CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenzen umfassen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
        1. (a) (A) einer Sequenz, die aus ungefähr 17 bis ungefähr 24 zusammenhängenden Nukleotiden besteht, die in der Sequenz von SEQ ID NO:26 enthalten sind, oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und (B') SEQ ID NO: 13 oder SEQ ID NO:15 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon;
        2. (b) (A') SEQ ID NO: 16 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und (B') SEQ ID NO: 17 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon;
        3. (c) (A') SEQ ID NO:18 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und (B') SEQ ID NO: 15 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und
        4. (d) (A') SEQ ID NO:20 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und (B') SEQ ID NO:21 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon.
    • 184. Nachweissondenoligomer nach Gegenstand 182 oder 183, wobei das Nachweissondenoligomer ferner eine nachweisbare Markierung umfasst.
    • 185. Nachweissondenoligomer nach Gegenstand 184, wobei die nachweisbare Markierung eine fluoreszierende oder chemilumineszierende Markierung ist.
    • 186. Zusammensetzung umfassend:
      • (1) ein SIP-spezifisches Nachweissondenoligomer mit einer SIP-spezifischen Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz, die etwa 15 bis etwa 35 Nukleotiden lang ist und konfiguriert ist, um mit einer Zielsequenz innerhalb eines SIP-Amplikons zu hybridisieren, das durch eine erste Amplifikationsoligomeren-Kombination amplifizierbar ist, die erste und zweite SIP-spezifische Amplifikationsoligomere umfasst, die in der Lage sind, eine Zielregion einer SIP-Zielnukleinsäure von Gruppe-B-Streptococcus (GBS) zu amplifizieren, wobei die ersten und zweiten SIP-spezifischen Amplifikationsoligomere jeweils erste (A) und zweite (B) SIP-spezifische Zielhybridisierungssequenzen umfassen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
        • (a) (A) SEQ ID NO:3 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und (B) SEQ ID NO:4 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und
        • (b) (A) SEQ ID NO:7 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und (B) SEQ ID NO:8 oder einem RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon; und
      • (2) ein CFB-spezifisches Nachweissondenoligomer, das eine CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz umfasst, die etwa 15 bis etwa 35 Nukleotiden lang ist und konfiguriert ist, um mit einer Zielsequenz zu hybridisieren, die innerhalb eines CFB-Amplikons enthalten ist, das durch eine zweite Amplifikationsoligomeren-Kombination amplifizierbar ist, umfassend erste und zweite CFB-spezifische Amplifikationsoligomere, die in der Lage sind, eine Zielregion einer CFB-Zielnukleinsäure von Gruppe-B-Streptococcus (GBS) zu amplifizieren, wobei die ersten und zweiten CFB-spezifischen Amplifikationsoligomere jeweils erste (A') und zweite (B') CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenzen umfassen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
        1. (a) (A') einer Sequenz, die aus ungefähr 17 bis ungefähr 24 zusammenhängenden Nukleotiden besteht, die in der Sequenz von SEQ ID NO:26 enthalten sind, oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon, und (B') SEQ ID NO:13 oder SEQ ID NO:15 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon;
        2. (b) (A') SEQ ID NO:16 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und (B') SEQ ID NO:17 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon;
        3. (c) (A') SEQ ID NO:18 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und (B') SEQ ID NO:15 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und
        4. (d) (A') SEQ ID NO:20, oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und (B') SEQ ID NO:21, oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon.
    • 187. Zusammensetzung nach Gegenstand 186, wobei das SIP-spezifische Nachweissondenoligomer ferner eine nachweisbare Markierung umfasst.
    • 188. Zusammensetzung nach Gegenstand 186 oder 187, wobei das CFB-spezifische Nachweissondenoligomer ferner eine nachweisbare Markierung umfasst.
    • 189. Zusammensetzung nach Gegenstand 187 oder 188, wobei die nachweisbare Markierung eine fluoreszierende oder chemilumineszierende Markierung ist.
    • 190. Wässrige Formulierung zur Amplifikation der Nukleinsäure von Gruppe-B-Streptococcus (GBS), wobei die wässrige Formulierung umfasst:
      • eine Zusammensetzung nach einem der Gegenstände 1 bis 56 und
      • einen organischen Puffer.
    • 191. Wässrige Formulierung nach Gegenstand 190, die ferner ein DNA-Polymerase-Enzym umfasst.
    • 192. Wässrige Formulierung nach Gegenstand 190 oder 191, ferner umfassend ein Reverse-Transkriptase-Enzym.
    • 193. Wässrige Formulierung nach einem der Gegenstände 190-192, ferner umfassend ein Nachweissondenoligomer.
    • 194. Wässrige Formulierung nach einem der Gegenstände 190-193, ferner umfassend einen Füllstoff ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Trehalose, Raffinose, und einer Kombination davon.
    • 195. Wässrige Formulierung nach einem der Gegenstände 190 bis 194, wobei die Formulierung ein anorganisches Salz in einer Konzentration von 4 mM oder weniger enthält.
    • 196. Getrocknete Formulierung zur Amplifikation der Nukleinsäure von Gruppe-B-Streptococcus (GBS), wobei die wässrige Formulierung umfasst:
      • eine Zusammensetzung nach einem der Gegenstände 1 bis 56 und
      • einen Füllstoff.
    • 197. Getrocknete Formulierung nach Gegenstand 196, wobei der Füllstoff aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Trehalose, Raffinose und einer Kombination davon.
    • 198. Getrocknete Formulierung nach Gegenstand 196 oder 197, ferner umfassend ein anorganisches Salz, wobei die prozentuale Masse des anorganischen Salzes auf die Masse der getrockneten Formulierung 0,249 % oder weniger beträgt.
    • 199. Getrocknete Formulierung nach einem der Gegenstände 196 bis 198, ferner umfassend ein DNA-Polymeraseenzym.
    • 200. Getrocknete Formulierung nach einem der Gegenstände 196 bis 199, ferner umfassend ein Reverse-Transkriptase-Enzym.
    • 201, Getrocknete Formulierung nach einem der Gegenstände 196 bis 200, ferner umfassend ein Nachweissondenoligomer.
    • 202. Getrocknete Formulierung nach einem der Gegenstände 196 bis 201, wobei die Formulierung eine lyophilisierte Formulierung ist.
    • 203. Wässrige Formulierung zum Nachweis der Nukleinsäure von Gruppe-B-Streptococcus (GBS), wobei die wässrige Formulierung umfasst:
      • ein Nachweissondenoligomer nach einem der Gegenstände 182 bis 185 oder eine Zusammensetzung nach einem Gegenstände 186 bis 189 und
      • einen organischen Puffer.
    • 204. Wässrige Formulierung nach Gegenstand 203, ferner umfassend ein Tensid.
    • 205. Wässrige Formulierung nach Gegenstand 204, wobei das Tensid ein nicht lineares Tensid ist.
    • 206. Wässrige Formulierung nach Gegenstand 204, wobei das Tensid aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus
      • Polyethylenglykolmono [4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)phenyl]ether,
      • Polysorbat 20 und
      • einer Kombination davon.
    • 207. Wässrige Formulierung nach einem der Gegenstände 204 bis 206, ferner umfassend ein DNA-Polymeraseenzym.
    • 208. Wässrige Formulierung nach einem der Gegenstände 204 bis 207, ferner umfassend ein Reverse-Transkriptase-Enzym.
    • 209. Wässrige Formulierung nach einem der Gegenstände 204 bis 208, ferner umfassend mindestens ein Amplifikationsoligomer.
    • 210. Wässrige Formulierung nach einem der Gegenstände 204-209, ferner umfassend einen Füllstoff ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Trehalose, Raffinose, und einer Kombination davon.
    • 211. Wässrige Formulierung nach einem der Gegenstände 204 bis 210, wobei die Formulierung ein anorganisches Salz in einer Konzentration von 4 mM oder weniger enthält.
    • 212. Getrocknete Formulierung zum Nachweis der Nukleinsäure von Gruppe-B-Streptococcus (GBS), wobei die getrocknete Formulierung umfasst:
      • ein Nachweissondenoligomer nach einem der Gegenstände 182 bis 185 oder eine Zusammensetzung nach einem der Gegenstände 186 bis 189 und
      • einen Füllstoff.
    • 213. Getrocknete Formulierung nach Gegenstand 212, wobei der Füllstoff aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Trehalose, Raffinose und einer Kombination davon.
    • 214. Getrocknete Formulierung nach Gegenstand 212 oder 213, die ferner ein anorganisches Salz umfasst, wobei die prozentuale Masse des anorganischen Salzes auf die Masse der getrockneten Formulierung 0,249 % oder weniger beträgt.
    • 215. Getrocknete Formulierung nach einem der Gegenstände212 bis 214, ferner umfassend ein DNA-Polymeraseenzym.
    • 216. Getrocknete Formulierung nach einem der Gegenstände 212 bis 215, ferner umfassend ein Reverse-Transkriptase-Enzym.
    • 217. Getrocknete Formulierung nach einem der Gegenstände 212 bis 216, ferner umfassend mindestens ein Amplifikationsoligomer.
    • 218. Getrocknete Formulierung nach einem der Gegenstände212 bis 217, ferner umfassend ein Tensid.
    • 219. Getrocknete Formulierung nach Gegenstand 218, wobei das Tensid ein nicht lineares Tensid ist.
    • 220. Getrocknete Formulierung nach Gegenstand 218, wobei das Tensid aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus
      • Polyethylenglykolmono[4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)phenyl]ether,
      • Polysorbat 20 und
      • einer Kombination davon.
    • 221. Getrocknete Formulierung nach einem der Gegenstände 212 bis 220, wobei die Formulierung eine lyophilisierte Formulierung ist.
    • 222. Reaktionsgemisch zur Amplifikation der Nukleinsäure von Gruppe-B-Streptococcus (GBS), wobei das Reaktionsgemisch eine wässrige Formulierung nach einem der Gegenstände 190 bis 195 umfasst.
    • 223. Reaktionsgemisch zur Amplifikation der Nukleinsäure von Gruppe-B-Streptococcus (GBS), wobei das Reaktionsgemisch mit Wasser oder einem organischen Puffer aus einer getrockneten Formulierung nach einem der Gegenstände 196 bis 202 rekonstituiert wird.
    • 224. Reaktionsgemisch nach Gegenstand 223, wobei das Reaktionsgemisch ein anorganisches Salz enthält.
    • 225. Reaktionsgemisch nach Gegenstand 224, wobei das anorganische Salz aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Magnesium, Kalium und Natrium.
    • 226. Reaktionsgemisch nach Gegenstand 224 oder 225, wobei die Konzentration des anorganischen Salzes 4 mM oder weniger beträgt.
    • 227. Reaktionsgemisch zum Nachweis der Nukleinsäure von Gruppe-B-Streptococcus (GBS), wobei das Reaktionsgemisch eine wässrige Formulierung nach einem der Gegenstände 203 bis 211 umfasst.
    • 228. Reaktionsgemisch zum Nachweis der Nukleinsäure von Gruppe-B-Streptococcus (GBS), wobei das Reaktionsgemisch mit Wasser oder einem organischen Puffer aus einer getrockneten Formulierung nach einem der Gegenstände 212 bis 221 rekonstituiert wird.
    • 229. Reaktionsgemisch nach Gegenstand 228, wobei das Reaktionsgemisch ein anorganisches Salz enthält.
    • 230. Reaktionsgemisch nach Gegenstand 229, wobei das anorganische Salz aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Magnesium, Kalium und Natrium.
    • 231. Reaktionsgemisch nach Gegenstand 229 oder 230, wobei die Konzentration des anorganischen Salzes 4 mM oder weniger beträgt.
    • 232. Zusammensetzung zur Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit von Gruppe-B-Streptococcus (GBS) in einer Probe, wobei die Zusammensetzung umfasst:
      • eine erste Amplifikationsoligomeren-Kombination und/oder eine zweite Amplifikationsoligomeren-Kombination, wobei
        • (I) die erste Amplifikationsoligomeren-Kombination erste und zweite SIP-spezifische Amplifikationsoligomere umfasst, die in der Lage sind, eine Zielregion einer GBS-SIP-Zielnukleinsäure zu amplifizieren, wobei die ersten und zweiten SIP-spezifischen Amplifikationsoligomere jeweils erste (A) und zweite (B) SIP-spezifische Zielhybridisierungssequenzen umfassen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
          1. (a) (A) SEQ ID NO:3 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B) SEQ ID NO:4 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und
          2. (b) (A) SEQ ID NO:7 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon und (B) SEQ ID NO:8 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon;
          und
        • (II) die zweite Amplifikationsoligomeren-Kombination erste und zweite CFB-spezifische Amplifikationsoligomere umfasst, die in der Lage sind, eine Zielregion einer GBS-CFB-Zielnukleinsäure zu amplifizieren, wobei die ersten und zweiten CFB-spezifischen Amplifikationsoligomere jeweils erste (A') und zweite (B') CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenzen umfassen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
          1. (a) (A') einer Sequenz, die aus ungefähr 17 bis ungefähr 24 zusammenhängenden Nukleotiden besteht, die in der Sequenz von SEQ ID NO:26 enthalten sind, oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und (B') SEQ ID NO: 13 oder SEQ ID NO: 15 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon;
          2. (b) (A') SEQ ID NO: 16 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und (B') SEQ ID NO: 17 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon;
          3. (c) (A') SEQ ID NO: 18 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und (B') SEQ ID NO: 15 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und
          4. (d) (A') SEQ ID NO:20 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und (B') SEQ ID NO:21 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon.
    • 233. Zusammensetzung nach Gegenstand 232, wobei wenn die Zusammensetzung die erste Amplifikationsoligomeren-Kombination umfasst, die Zusammensetzung dann ferner ein SIP-spezifisches Nachweissondenoligomer umfasst, das eine SIP-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz umfasst, die ungefähr 15 bis ungefähr 35 Nukleotide lang ist und konfiguriert ist, um mit einer Zielsequenz zu hybridisieren, die in einem SIP-Amplikon enthalten ist, das durch das erste und zweite SIP-spezifische Amplifikationsoligomer amplifizierbar ist, vorzugsweise wobei die erste und die zweite SIP-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (I)(b) sind, und die SIP-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz SEQ ID NO:9 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon ist oder wobei die erste und die zweite SIP-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (I)(b) sind und die SIP-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz SEQ ID NO:11 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon ist, bevorzugter wobei das SIP-spezifische Nachweissondenoligomer ferner eine nachweisbare Markierung umfasst, noch bevorzugter wobei die nachweisbare Markierung eine fluoreszierende oder chemilumineszierende Markierung ist oder wobei die nachweisbare Markierung eine fluoreszierende Markierung ist und das SIP-spezifische Nachweissondenoligomer ferner einen nicht fluoreszierenden Quencher umfasst.
    • 234. Zusammensetzung nach einem der Gegenstände 232 und 233, wobei wenn die Zusammensetzung die zweite Amplifikationsoligomeren-Kombination umfasst, die Zusammensetzung dann ferner ein CFB-spezifisches Nachweissondenoligomer umfasst, das eine CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz umfasst, die ungefähr 15 bis ungefähr 35 Nukleotide lang ist und konfiguriert ist, um mit einer Zielsequenz zu hybridisieren, die in einem CFB-Amplikon enthalten ist, das durch das erste und zweite CFB-spezifische Amplifikationsoligomer amplifizierbar ist, vorzugsweise wobei die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (II)(b) sind und die CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz SEQ ID NO:24 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon ist, oder wobei die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (II)(d) sind und die CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz SEQ ID NO:25 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon ist, oder wobei die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (II)(a) sind und die CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz SEQ ID NO:22 oder SEQ ID NO.23 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon ist, oder wobei die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (II)(c) sind und die CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz SEQ ID NO:23 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon ist, bevorzugter wobei das CFB-spezifische Nachweissondenoligomer ferner eine nachweisbare Markierung umfasst, noch bevorzugter wobei die nachweisbare Markierung eine fluoreszierende oder chemilumineszierende Markierung ist oder wobei die nachweisbare Markierung eine fluoreszierende Markierung ist und das Nachweissondenoligomer ferner einen nicht fluoreszierenden Quencher umfasst.
    • 235. Nachweissondenoligomer umfassend:
      • Eine SIP-spezifische Nachweissonde, die eine SIP-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz umfasst, die ungefähr 15 bis ungefähr 35 Nukleotide lang ist und konfiguriert ist, um mit einer Zielsequenz zu hybridisieren, die in einem SIP-Amplikon enthalten ist, das durch eine erste Amplifikationsoligomeren-Kombination amplifizierbar ist, die erste und zweite SIP-Amplifikationsoligomere umfasst, die in der Lage sind, eine Zielregion einer SIP-Zielnukleinsäure eines Gruppe-B-Streptococcus (GBS) zu amplifizieren, wenn das erste und das zweite Amplifikationsoligomer jeweils erste (A) und zweite (B) SIP-spezifische Zielhybridisierungssequenz umfassen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
        1. (a) (A) SEQ ID NO:3 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und (B) SEQ ID NO:4 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und
        2. (b) (A) SEQ ID NO:7 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und (B) SEQ ID NO:8 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; oder
      • ein CFB-spezifisches Nachweissondenoligomer, umfassend eine CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz, die ungefähr 15 bis ungefähr 35 Nukleotide lang ist und konfiguriert ist, um mit einer Zielsequenz zu hybridisieren, die in einem CFB-Amplikon enthalten ist, das durch eine zweite Amplifiaktionsoligomeren-Kombination amplifizierbar ist, die erstes und zweites CFB-spezifisches Amplifikationsoligomer umfasst, die in der Lage sind, eine Zielregion einer CFB-Zielnukleinsäure eines Gruppe-B-Streptococcus (GBS) zu amplifizieren, wobei das erste und das zweite CFB-spezifische Amplifikationsoligomer jeweils erste (A') und zweite (B') CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz umfassen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
        1. (a) (A') einer Sequenz, die aus ungefähr 17 bis ungefähr 24 zusammenhängenden Nukleotiden besteht, die in der Sequenz von SEQ ID NO:26 enthalten sind, oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und (B') SEQ ID NO: 13 oder SEQ ID NO: 15 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und
        2. (b) (A') SEQ ID NO: 16 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und (B') SEQ ID NO: 17 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und
        3. (c) (A') SEQ ID NO: 18 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und (B') SEQ ID NO:15 einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und
        4. (d) (A') SEQ ID NO:20 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und (B') SEQ ID NO:21 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon,
        wobei das Nachweissondenoligomer ferner eine nachweisbare Markierung umfasst, vorzugsweise wobei die nachweisbare Markierung eine fluoreszierende oder chemilumineszierende Markierung ist.
    • 236. Zusammensetzung umfassend:
      • (1) ein SIP-spezifisches Nachweissondenoligomer, umfassend eine SIP-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz, die ungefähr 15 bis ungefähr 35 Nukleotide lang ist und konfiguriert ist, um mit einer Zielsequenz zu hybridisieren, die in einem SIP-Amplikon enthalten ist, das durch eine erste Amplifikationsoligomeren-Kombination amplifizierbar ist, die erste und zweite SIP-spezifische Amplifikationsoligomere umfasst, die in der Lage sind, eine Zielregion einer SIP-Zielnukleinsäure eines Gruppe-B-Streptococcus zu amplifizieren, wobei das erste und zweite SIP-spezifische Amplifikationsoligomer jeweils erste (A) und zweite (B) SIP-spezifische Zielhybridisierungssequenzen umfassen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
        • (a) (A) SEQ ID NO:3 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und (B) SEQ ID NO:4 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon;
        • (b) (A) SEQ ID NO:7 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und (B) SEQ ID NO:8 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und
      • (2) ein CFB-spezifisches Nachweissondenoligomer, umfassend eine CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz, die ungefähr 15 bis ungefähr 35 Nukleotide lang ist und konfiguriert ist, um mit einer Zielsequenz zu hybridisieren, die in einem CFB-Amplikon enthalten ist, das durch eine zweite Amplifikationsoligomeren-Kombination amplifizierbar ist, die erste und zweite CFB-spezifische Amplifikationsoligomere umfasst, die in der Lage sind, eine Zielregion einer CFB-Zielnukleinsäure eines Gruppe-B-Streptococcus (GBS) zu amplifizieren, wobei das erste und zweite CFB-spezifische Amplifikationsoligomer jeweils erste (A') und zweite (B') CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenzen umfassen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
        1. (a) (A') einer Sequenz, die aus ungefähr 17 bis ungefähr 24 zusammenhängenden Nukleotiden besteht, die in der Sequenz von SEQ ID NO:26 enthalten sind, oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und (B') SEQ ID NO: 13 oder SEQ ID NO: 15 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon;
        2. (b) (A') SEQ ID NO: 16 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und (B') SEQ ID NO: 17 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon;
        3. (c) (A') SEQ ID NO:18 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und (B') SEQ ID NO: 15 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und
        4. (d) (A') SEQ ID NO:20 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und (B') SEQ ID NO:21 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon;
        wobei das SIP-spezifische Nachweissondenoligomer ferner eine nachweisbare Markierung umfasst, vorzugsweise wobei die nachweisbare Markierung eine fluoreszierende oder chemilumineszierende Markierung ist, und/oder wobei das CFB-spezifische Nachweissondenoligomer ferner eine nachweisbare Markierung umfasst, vorzugsweise wobei die nachweisbare Markierung eine fluoreszierende oder chemilumineszierende Markierung ist.
    • 237. Kit zur Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit von Gruppe-B-Streptococcus (GBS) in einer Probe, wobei der Kit umfasst: mindestens eine von einer ersten Amplifikationsoligomeren-Kombination und einer zweiten Amplifikationsoligomeren-Kombination nach einem der Gegenstände 232 bis 234.
    • 238. Kit nach Gegenstand 237, wobei wenn der Kit die erste Amplifikationsoligomeren-Kombination umfasst, der Kit ferner ein SIP-spezifisches Nachweissondenoligomer umfasst, das eine SIP-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz umfasst, die ungefähr 15 bis ungefähr 35 Nukleotide lang ist und konfiguriert ist, um mit einer Zielsequenz zu hybridisieren, die in einem SIP-Amplikon enthalten ist, das durch das erste und zweite SIP-spezifische Amplifikationsoligomer amplifizierbar ist, vorzugsweise wobei die erste und die zweite SIP-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (I)(a) sind und die SIP-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz SEQ ID NO:9 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon ist, oder wobei die erste und die zweite SIP-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (I)(b) sind und die SIP-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz SEQ ID NO:11 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon ist, bevorzugter wobei das SIP-spezifische Nachweissondenoligomer ferner eine nachweisbare Markierung umfasst, noch bevorzugter wobei die nachweisbare Markierung eine fluoreszierende oder chemilumineszierende Markierung ist oder wobei die nachweisbare Markierung eine fluoreszierende Markierung ist und das SIP-spezifische Nachweissondenoligomer ferner einen nicht fluoreszierenden Quencher umfasst.
    • 239. Kit nach einem der Gegenstände 237 und 238, wobei wenn der Kit die zweite Amplifikationsoligomeren-Kombination umfasst, der Kit ferner ein CFB-spezifisches Nachweissondenoligomer umfasst, das eine CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz umfasst, die ungefähr 15 bis ungefähr 35 Nukleotide lang ist und konfiguriert ist, um mit einer Zielsequenz zu hybridisieren, die in einem CFB-Amplikon enthalten ist, das durch das erste und zweite CFB-spezifische Amplifikationsoligomer amplifizierbar ist, vorzugsweise wobei die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (II)(b) sind und die CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz SEQ ID NO:24 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon ist oder wobei die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (II)(d) sind und die CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz SEQ ID NO:25 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon ist oder wobei die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (II)(a) sind und die CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz SEQ ID NO:22 oder SEQ ID NO:23 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon ist oder wobei die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (II)(c) sind und die CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz SEQ ID NO:23 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon ist, bevorzugter wobei das CFB-spezifische Nachweissondenoligomer ferner eine nachweisbare Markierung umfasst, noch bevorzugter wobei die nachweisbare Markierung eine fluoreszierende oder chemilumineszierende Markierung ist oder wobei die nachweisbare Markierung eine fluoreszierende Markierung ist und das Nachweissondenoligomer ferner einen nicht fluoreszierenden Quencher umfasst.
    • 240. Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit von Gruppe-B-Streptoccocus in einer Probe, wobei das Verfahren umfasst:
      • (1) Inkontaktbringen einer Probe, von der vermutet wird, dass sie GBS enthält, mit mindestens einer von einer ersten Amplifikationsoligomeren-Kombination und einer zweiten Amplifikationsoligomeren-Kombination aus einem der Gegenstände 232 bis 234
      • (2) Durchführen einer Nukleinsäureamplifikationsreaktion in vitro, wobei eine beliebige GBS-SIP- und/oder CFB-Zielnukleinsäure, falls in der Probe vorhanden, als eine Matritze verwendet wird, um ein oder mehrere Amplikon(s) zu erzeugen, die mindestens einer der SIP- und CFB-Regionen entsprechen; und
      • (3) Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit des einen oder mehrerer Amplikons, wodurch die Anwesenheit oder Abwesenheit von GBS in der Probe bestimmt wird.
    • 241. Verfahren nach Gegenstand 240, wobei wenn das Verfahren das Inkontaktbringen der Probe mit der ersten Amplifikationsoligomeren-Kombination umfasst, der Nachweisschritt dann das Inkontaktbringen der Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion in vitro mit einem SIP-spezifischen Nachweissondenoligomer umfasst, das eine SIP-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz umfasst, welche ungefähr 15 bis ungefähr 35 Nukleotide lang ist und konfiguriert ist, um mit einer Zielsequenz zu hybridisieren, die in einem SIP-Amplikon enthalten ist, das durch die ersten und zweiten SIP-spezifischen Amplifikationsoligomere amplifizierbar ist, vorzugsweise wobei die erste und die zweite SIP-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (I)(a) sind, und die SIP-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz SEQ ID NO:9 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon ist, oder wobei die erste und die zweite SIP-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (I)(b) sind und die Zielhybridisierungssequenz der SIP-spezifischen Nachweissonde SEQ ID NO:11 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon ist, bevorzugter wobei das SIP-spezifische Nachweissondenoligomer ferner eine nachweisbare Markierung umfasst, noch bevorzugter wobei die nachweisbare Markierung eine fluoreszierende oder chemilumineszierende Markierung ist oder wobei die nachweisbare Markierung eine fluoreszierende Markierung ist und das SIP-spezifische Nachweissondenoligomer ferner einen nicht fluoreszierenden Quencher umfasst.
    • 242. Verfahren nach einem der Gegenstände 240 und 241, wobei wenn das Verfahren das Inkontaktbringen der Probe mit der zweiten Amplifikationsoligomeren-Kombination umfasst, der Nachweisschritt dann das Inkontaktbringen der Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion in vitro mit einem CFB-spezifischen Nachweissondenoligomer umfasst, das eine CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz umfasst, die ungefähr 15 bis ungefähr 35 Nukleotide lang ist und konfiguriert ist, um mit einer Zielsequenz zu hybridisieren, die in einem CFB-Amplikon enthalten ist, das durch das erste und zweite CFB-spezifische Amplifikationsoligomer amplifizierbar ist, vorzugsweise wobei die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (II)(b) sind und die CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz SEQ ID NO:24 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon ist, oder wobei die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (II)(d) sind und die CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz SEQ ID NO:25 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon ist, oder wobei die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (II)(a) sind und die CFB-spezifische Nachweissonde die Zielhybridisierungssequenz von SEQ ID NO:22 oder SEQ ID NO:23 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon ist oder wobei die erste und die zweite CFB-spezifische Zielhybridisierungssequenz die Zielhybridisierungssequenzen von (II)(c) sind und die CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz SEQ ID NO:23 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon ist, bevorzugter wobei das CFB-spezifische Nachweissondenoligomer ferner eine nachweisbare Markierung umfasst, noch bevorzugter wobei die nachweisbare Markierung eine fluoreszierende oder chemilumineszierende Markierung ist oder wobei nachweisbare Markierung eine fluoreszierende Markierung ist und das CFB-spezifische Nachweissondenoligomer ferner einen nicht fluoreszierenden Quencher umfasst.
    • 243. Verfahren nach einem der Gegenstände 240 bis 242, wobei der Nachweisschritt in Echtzeit durchgeführt wird.
    • 244. Verfahren nach einem der Gegenstände 240 bis 243, wobei die Nukleinsäureamplifikationsreaktion eine PCR-Amplifikationsreaktion ist.
    • 245. Wässrige Formulierung zur Amplifikation der Nukleinsäure von Gruppe-B-Streptococcus (GBS), wobei die wässrige Formulierung umfasst:
      • eine Zusammensetzung nach einem der Gegenstände 232 bis 234 und
      • einen organischen Puffer,
      • vorzugsweise umfasst die wässrige Formulierung ferner ein DNA-Polymerase-Enzym und/oder ein Reverse-Transkriptase-Enzym und/oder ein Nachweissondenoligomer und/oder einen Füllstoff ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Trehalose, Raffinose und einer Kombination davon.
    • 246. Wässrige Formulierung nach Gegenstand 245, wobei die Formulierung ein anorganisches Salz in einer Konzentration von 4 mM oder weniger enthält.
    • 247. Getrocknete Formulierung zur Amplifikation der Nukleinsäure von Gruppe-B-Streptococcus (GBS), wobei die getrocknete Formulierung eine aus der wässrigen Formulierung von Gegenstand 245 oder 246 lyophilisierte Formulierung ist.
    • 248. Wässrige Formulierung zum Nachweis der Nukleinsäure von Gruppe-B-Streptococcus (GBS), wobei die wässrige Formulierung umfasst:
      • ein Nachweissondenoligomer nach einem der Gegenstände 235 und 236 und
      • einen organischen Puffer,
      • vorzugsweise ferner ein Tensid, vorzugsweise ein nicht lineares Tensid oder ein Tensid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
      • Polyethylenglykolmono[4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)phenyl]ether,
      • Polysorbat 20 und
      • einer Kombination davon und/oder ein DNA-Polymeraseenzym und/oder ein Reverse-Transkriptase-Enzym oder mindestens ein Amplifikationsoligomer und/oder einen Füllstoff ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Trehalose, Raffinose und einer Kombination davon.
    • 249. Wässrige Formulierung nach Gegenstand 248, wobei die Formulierung ein anorganisches Salz in einer Konzentration von 4 mM oder weniger enthält.
    • 250. Getrocknete Formulierung zum Nachweis der Nukleinsäure von Gruppe-B-Streptococcus (GBS), wobei die getrocknete Formulierung eine aus der wässrigen Formulierung von Gegenstand 248 oder 249 lyophilisierte Formulierung ist.
    • 251. Reaktionsgemisch zur Amplifikation der Nukleinsäure von Gruppe-B-Streptococcus (GBS), wobei das Reaktionsgemisch mit Wasser oder einem organischen Puffer aus einer getrockneten Formulierung wie in Gegenstand 247 rekonstituiert wird.
    • 252. Reaktionsgemisch von Gegenstand 251, wobei das Reaktionsgemisch ein anorganisches Salz enthält, vorzugsweise ein anorganisches Salz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Magnesium, Kalium und Natrium, wobei die Konzentration des anorgansichen Salzes 4 mM oder weniger beträgt.
    • 253. Reaktionsgemisch zum Nachweis der Nukleinsäure von Gruppe-B-Streptococcus (GBS), wobei das Reaktionsgemisch mit Wasser oder einem organischen Puffer aus einer getrockneten Formulierung wie in Gegenstand 250 rekonstituiert wird.
    • 254. Reaktionsgemisch von Gegenstand 253, wobei das Reaktionsgemisch ein anorganisches Salz enthält, vorzugsweise ein anorganisches Salz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Magnesium, Kalium und Natrium, wobei die Konzentration des anorganischen Salzes 4 mM oder weniger beträgt.
  • Es folgt ein Sequenzprotokoll als elektronisches Dokument. Dieses kann sowohl in DEPATISnet als auch im DPMAregister aufgerufen werden.

Claims (10)

  1. Verwendung einer SIP-Primer/Sonden-Kombination zusammen mit einer CFB-Primer/Sonden-Kombination zur Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit von Streptokokken der Gruppe B (GBS) in einer Probe, wobei die SIP-Primer/Sonden-Kombination umfasst: eine erste Amplifikationsoligomer-Kombination, umfassend erste und zweite SIP-spezifische Amplifikationsoligomere, die in der Lage sind, eine Zielregion einer GBS-SIP-Zielnukleinsäure zu amplifizieren, wobei die ersten und zweiten SIP-spezifischen Amplifikationsoligomere jeweils erste (A) und zweite (B) SIP-spezifische Ziel-Hybridisierungssequenzen umfassen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (I)(a) (A) SEQ ID NO:3, oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon, und ( B) SEQ ID NO:4, oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und (I)(b) (A) SEQ ID NO:7, oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon, und ( B) SEQ ID NO:8, oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und ein SIP-spezifisches Nachweissonden-Oligomer, umfassend eine SIP-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz, die etwa 15 bis etwa 35 Nukleotide lang ist und so konfiguriert ist, dass sie mit einer Zielsequenz hybridisiert, die in einem SIP-Amplikon enthalten ist, das durch das erste und zweite SIP-spezifische AmplifikationsOligomer amplifizierbar ist; und wobei die CFB-Primer/Sonden-Kombination umfasst: eine zweite Amplifikationsoligomer-Kombination, umfassend erste und zweite CFB-spezifische Amplifikationsoligomere, die in der Lage sind, eine Zielregion einer GBS-CFB-Zielnukleinsäure zu amplifizieren, wobei die ersten und zweiten CFB-spezifischen Amplifikationsoligomere jeweils erste (A') und zweite (B') CFB-spezifische Ziel-Hybridisierungssequenzen umfassen, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus (II)(a) (A') einer Sequenz, die aus etwa 17 bis etwa 24 zusammenhängenden Nukleotiden besteht, die in der Sequenz von SEQ ID NO:26 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon enthalten sind, und (B') SEQ ID NO:13 oder SEQ ID NO:15 oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; (II)(b) (A') SEQ ID NO:16, oder ein RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon, und (B') SEQ ID NO:17, oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; (II)(c) (A') SEQ ID NO:18, oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon, und (B') SEQ ID NO:15, oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und (II)(d) (A') SEQ ID NO:20, oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon, und (B') SEQ ID NO:21, oder einem RNA-Äquivalent oder einer DNA/RNA-Chimäre davon; und ein CFB-spezifisches Nachweissonden-Oligomer, umfassend eine CFB-spezifische Nachweissonden-Zielhybridisierungssequenz, die etwa 15 bis etwa 35 Nukleotide lang ist und so konfiguriert ist, dass sie an eine Zielsequenz hybridisiert, die in einem CFB-Amplikon enthalten ist, das durch das erste und zweite CFB-spezifische AmplifikationsOligomer amplifizierbar ist.
  2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die ersten und zweiten SIP-spezifischen Zielhybridisierungssequenzen die Zielhybridisierungssequenzen von (I)(b) sind.
  3. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die ersten und zweiten SIP-spezifischen Ziel-Hybridisierungssequenzen die Ziel-Hybridisierungssequenzen von (I)(b) sind und die SIP-spezifische Nachweissonden-Ziel-Hybridisierungssequenz SEQ ID NO:11 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon ist.
  4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das SIP-spezifische Nachweissonden-Oligomer ferner eine nachweisbare Markierung umfasst, vorzugsweise wobei die nachweisbare Markierung eine fluoreszierende oder chemilumineszierende Markierung ist, oder wobei die nachweisbare Markierung eine fluoreszierende Markierung ist und das SIP-spezifische Detektionssonden-Oligomer ferner einen nicht-fluoreszierenden Quencher umfasst.
  5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die ersten und zweiten CFB-spezifischen Ziel-Hybridisierungssequenzen die Ziel-Hybridisierungssequenzen von (II)(d) sind.
  6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die erste und die zweite CFB-spezifische Ziel-Hybridisierungssequenz die Ziel-Hybridisierungssequenzen von (II)(d) sind und die CFB-spezifische Nachweissonden-Ziel-Hybridisierungssequenz SEQ ID NO:25 oder ein RNA-Äquivalent oder eine DNA/RNA-Chimäre davon ist.
  7. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das CFB-spezifische Nachweissonden-Oligomer ferner eine nachweisbare Markierung aufweist, vorzugsweise wobei die nachweisbare Markierung eine fluoreszierende oder chemilumineszierende Markierung ist, oder wobei die nachweisbare Markierung eine fluoreszierende Markierung ist und das Nachweissonden-Oligomer ferner einen nicht-fluoreszierenden Quencher umfasst.
  8. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Kombination in einer in vitro-Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion, vorzugsweise einer PCR-Amplifikationsreaktion und noch bevorzugter einer Real-Time PCR-Amplifikationsreaktion, verwendet wird.
  9. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Kombination zur Bestimmung des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins eines der GBS-Serotypen Ia, Ib, Ic, II, III, IV, V, VI, VII, VIII und IX verwendet wird.
  10. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Kombination zur Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit eines nicht-hämolytischen Stammes von GBS verwendet wird.
DE102019009219.8A 2018-06-13 2019-08-13 Zusammensetzungen und Verfahren zum Nachweis der Nukleinsäure von Gruppe-B-Streptococcus Active DE102019009219B4 (de)

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