DE10201858A1

DE10201858A1 - Separating nucleic acids from a cell lysate, useful for recovering plasmids from bacteria, comprises passing the lysate through a filter material covering the whole inside surface of a holder

Info

Publication number: DE10201858A1
Application number: DE2002101858
Authority: DE
Inventors: Jochen Tittgen
Original assignee: Tittgen Dr Biotechnologie
Current assignee: Tittgen Dr Biotechnologie
Priority date: 2002-01-18
Filing date: 2002-01-18
Publication date: 2003-08-14

Abstract

Separating nucleic acids (NA) from other cell components, comprising: (a) lysis and precipitation of lysate components so that NA remains in solution; and (b) filtering the lysate in a separation device fitted with a filter material which almost entirely covers the internal surfaces of the device, is new. An Independent claim is also included for the separation device, comprising: (a) a column (1); (b) a chromatographic material (3); and (c) a filter material (5), within the column.

Description

Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren zur Trennung von Nukleinsäuren von anderen Zellbestandteilen gemäß Oberbegriff von Patentanspruch 1. Die Erfindung betrifft weiterhin eine Trennvorrichtung zur Durchführung des Verfahrens. The present invention describes a method of separation of nucleic acids from other cell components according to Preamble of claim 1. The invention further relates to a separation device for performing the method.

Die Isolation von Nukleinsäuren aus biologischen Zellen erfolgt durch Lyse der Zellwände. Ein Beispiel ist die alkalische Lyse von Bakterienzellen zur Isolation von Plasmid-DNA. Hierbei werden die Zellen nach der Anzucht in einem geeigneten Nährmedium üblicherweise durch kurze Zentrifugation vom umgebenden Medium abgetrennt, wonach das Zellpellet in einem Niedrigsalzpuffer vollständig resuspendiert wird. Dieser Puffer enthält neben einer im pH-Bereich von 7,0 bis 8,0 abpuffernden Substanz (z. B. Tris) oftmals EDTA, um zelluläre DNAsen zu inhibieren sowie Ribonuklease, um in den nachfolgenden Schritten einen gleichzeitigen Abbau der zellulären RNA's zu erreichen. Nucleic acids are isolated from biological cells by lysis of the cell walls. One example is alkaline lysis of bacterial cells for the isolation of plasmid DNA. in this connection the cells are grown in a suitable nutrient medium usually by brief centrifugation from the surrounding medium separated, after which the cell pellet in a low salt buffer is completely resuspended. This buffer also contains a substance buffering in the pH range from 7.0 to 8.0 (e.g. Tris) often EDTA to inhibit cellular DNAsen as well Ribonuclease to get one in the following steps to achieve simultaneous degradation of the cellular RNAs.

Als nächstes werden die suspendierten Zellen durch Zugabe einer Lösung, die NaOH und das Detergenz SDS (Natriumdodecylsulfat) enthält, lysiert, wobei die intrazellulären Komponenten freigesetzt werden. Die alkalischen Bedingungen zusammen mit SDS bewirken eine weitgehende Denaturierung der Zellkomponenten. Next, the suspended cells are added by adding a Solution, the NaOH and the detergent SDS (sodium dodecyl sulfate) contains, lysed, the intracellular components to be released. The alkaline conditions along with SDS cause extensive denaturation of the cell components.

Als weiterer Schritt wird der pH-Wert durch Zugabe eines Hochsalz-Acetatpuffers (z. B. Kaliumacetat) in den sauren Bereich (ca. pH 5,0) gebracht. Durch diese schnelle pH-Verschiebung, verbunden mit der Zugabe hoher Salzmengen bei gleichzeitiger Fällung von SDS durch Zugabe von Kaliumionen wird ein Großteil der bakteriellen Zellkomponenten, der Proteine und der genomischen DNA ausgefällt, die als flockenartiger Niederschlag im neutralisierten Lysat vorliegen. As a further step, the pH is adjusted by adding a High salt acetate buffer (e.g. potassium acetate) in the acidic range (approx. pH 5.0). Because of this rapid pH shift, combined with the addition of high amounts of salt at the same time Precipitation of SDS by adding potassium ions becomes a large part the bacterial cell components, the proteins and the genomic DNA precipitated, which in the form of a flaky precipitate neutralized lysate.

Die Plasmid-DNA wird bei dieser Vorgehensweise nicht gefällt, sondern sie verbleibt im Überstand. Für eine effiziente Präparation der Plasmid-DNA ist es daher notwendig, die flüssigen von den gefällten festen Bestandteilen des Lysats zu trennen. In der Praxis sind verschiedene Verfahren bekannt, die im großen Ausmaß in den Laboratorien durchgeführt werden. The plasmid DNA is not precipitated using this procedure, it remains in the supernatant. For an efficient Preparation of the plasmid DNA, it is therefore necessary to use the liquid separate from the precipitated solid components of the lysate. In practice, various methods are known, which in large scale in the laboratories.

1. Separation of the lysate components by centrifugation

Es werden die Lysatkomponenten nach Zugabe des Neutralisationspuffers durch eine hochtourige Zentrifugation in einem Zeitraum von 10 bis 45 Minuten getrennt. Die festen Bestandteile sammeln sich zum größten Teil am Boden des Zentrifugationsgefäßes, während flüssige Überstand (cleared lysate) klar ist. Der flüssige Überstand wird abpipettiert und weiterverarbeitet. The lysate components are added after the Neutralization buffer by high-speed centrifugation in one period separated from 10 to 45 minutes. Collect the solid components for the most part at the bottom of the centrifuge tube, while cleared lysate is clear. The liquid The supernatant is pipetted off and processed further.

Die Zentrifugationsabtrennung ist je nach Protokollversion zum Teil sehr zeitintensiv. Außerdem ist das Pellet normalerweise nicht homogen. Es kommt oftmals dazu, dass bestimmte Teile nicht pelletieren, sondern auf dem flüssigen Überstand schwimmen. Die Gefahr, Teile des Pellets mit herauszunehmen, ist nicht unerheblich. Je nach Präparationsmethode kann dieser Cotransfer von partikulärem Material eine hemmende Wirkung bei nachfolgenden Applikationen verursachen. The centrifugation separation is depending on the protocol version Partly very time consuming. In addition, the pellet is usually not homogeneous. It often happens that certain parts do not pellet, but on the liquid supernatant swim. There is a risk of removing parts of the pellet not insignificant. Depending on the preparation method, this can Cotransfer of particulate material has an inhibitory effect subsequent applications.

2. Separation by filtration through a pleated filter

Hierbei werden die Lysatkomponenten durch Filtration getrennt. Die verwendeten Filter, wie Faltenfilter oder Rundfilter, werden in einem vom Anwender zu stellenden Trichter angeordnet, der dann auf beispielsweise eine Chromatographiesäule gesetzt wird. Die festen Bestandteile werden durch den Filter zurückgehalten, während das flüssige Lysat den Filter passiert und in die Chromatographiesäule einläuft. The lysate components are separated by filtration. The filters used, such as pleated filters or round filters, are arranged in a funnel to be set by the user, which is then placed on a chromatography column, for example becomes. The solid components are separated by the filter retained while the liquid lysate passes through the filter and in the chromatography column runs in.

Dieses Trennungsverfahren hat den Vorteil, dass keine Zentrifuge notwendig ist. Allerdings ist es in den meisten Fällen unvermeidlich, dass je nach verwendetem Filtertyp die Flüssigkeit nur langsam durchläuft oder sogar der Filter verstopft wird. Das führt zu Zeitverlusten. Der vom Anwender zu stellende Trichter kann des Weiteren kontaminiert sein und unerwartete bzw. unerwünschte Komponenten in die Präparation einschleppen. Außerdem ist oftmals ein passender Trichter nicht immer verfügbar. This separation process has the advantage that none Centrifuge is necessary. However, in most cases it is inevitable that depending on the type of filter used, the liquid only runs slowly or even the filter becomes blocked. This leads to wasted time. The one to be provided by the user Funnels can also be contaminated and unexpected or carry unwanted components into the preparation. In addition, a suitable funnel is often not always available.

3. Separation by pressure filtration through a porous matrix

Die Trennung der Lysatkomponenten erfolgt durch Filtration. Ein solches Verfahren ist beispielsweise in der WO 93/11218 beschrieben. Hierbei wird das Lysat nach Mischen mit dem Neutra- lisationspuffer in eine am Auslaß verschlossene Spritze geeigneter Größe eingefüllt, die im Bodenbereich eine durch zwei Fritten eingeschlossene Adsorbenzienschicht aufweist. Nach einer 10 Minuten langen Inkubation, bei der sich der flockulente Niederschlag zum größten Teil an der Oberfläche der Flüssigkeit sammelt, wird das Lysat mittels eines geeigneten Stempels durch die Adsorbenzienschicht gedrückt. Die festen Bestandteile werden auf der Filterschicht zurückgehalten, während das erhaltene Filtrat klar ist. The lysate components are separated by filtration. On such a method is for example in WO 93/11218 described. Here the lysate is mixed with the neutra in a syringe closed at the outlet filled in a suitable size, the one by two in the bottom area Frits has enclosed adsorbent layer. To a 10 minute incubation during which the flocculent Precipitation for the most part on the surface of the liquid collects, the lysate is passed through using a suitable stamp pressed the adsorbent layer. The fixed components are retained on the filter layer while the one obtained Filtrate is clear.

Dieses Verfahren hat den Nachteil, dass weitere Kunststoffkomponenten erforderlich sind. Dadurch ist ein größerer Verpackungsaufwand notwendig und es fällt naturgemäß mehr Abfall an. Spritzenfilter sind sehr empfindlich gegenüber Überladung und verstopfen leicht. Daher muss der Anwender seine Kulturen sehr genau einstellen (Ermittlung der Zellzahl), um Überladungen zu vermeiden. Bei Überladungen können Teile von Zelltrümmern durch die Filterschicht hindurchgedrückt werden. Durch die Filtrationsschicht geht immer ein gewisser Anteil an Lysat verloren. This method has the disadvantage that more Plastic components are required. This makes a bigger one Packaging effort necessary and naturally there is more waste. Syringe filters are very sensitive to overloading and clog easily. Therefore, the user needs his cultures very much set precisely (determination of the cell number) to avoid overloading avoid. When overloaded, parts of cell debris can pass through the filter layer are pushed through. Through the Filtration layer always a certain amount of lysate is lost.

Die in bekannter Weise hergestellten klaren Lysate werden dann nach üblichen Verfahren weiter aufgereinigt und schließlich chromatographiert, um die Nukleinsäuren aufzutrennen, d. h. von anderen Bestandteilen, wie RNA, zu trennen. The clear lysates produced in a known manner are then further purified according to usual procedures and finally chromatographed to separate the nucleic acids, d. H. of separate other components such as RNA.

Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, mit dem die Nukleinsäuren aus dem Zelllysat schnell und kostengünstig isoliert werden können, ohne dass eine aufwendige apparative Vorrichtung, wie beispielsweise eine Zentrifuge, notwendig ist. Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Vorrichtung zur Verfügung zu stellen, mit der auf einfache, schnelle und kostengünstige Weise Nukleinsäuren aus Zellen isoliert werden können. It is therefore an object of the present invention to provide a method to make available with which the nucleic acids from the Cell lysate can be isolated quickly and inexpensively without an expensive apparatus, such as for example a centrifuge is necessary. It is another Object of the present invention, a device available to put up with on simple, fast and inexpensive Way nucleic acids can be isolated from cells.

Diese Aufgaben werden mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und der erfindungsgemäßen Trennvorrichtung gelöst. These tasks are accomplished with the method and solved the separation device according to the invention.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Trennung von Nukleinsäuren von anderen Zellbestandteilen durch Lyse der Zellen und Fällung der Lysatkomponenten, wobei die Nukleinsäuren in Lösung bleiben, das dadurch gekennzeichnet ist, dass das Lysat in einer Trennvorrichtung durch ein Filtermaterial filtriert wird, das die Innenfläche der Trennvorrichtung zumindest fast vollständig bedeckt. The present invention relates to a method for separation of nucleic acids from other cell components by lysis of the Cells and precipitation of the lysate components, the Nucleic acids remain in solution, which is characterized in that the Lysate in a separator through a filter material is filtered, the inner surface of the separator at least almost completely covered.

Die Unteransprüche betreffen bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens. The subclaims relate to preferred embodiments of the inventive method.

Die Erfindung betrifft ebenfalls eine Trennvorrichtung, die folgendes aufweist: eine Säule, ein Chromatographiematerial und ein in der Säule vorgesehenes Filtermaterial. The invention also relates to a separating device, the comprises: a column, a chromatography material and a filter material provided in the column.

Die Unteransprüche betreffen bevorzugte Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Trennvorrichtung. The subclaims relate to preferred embodiments of the separation device according to the invention.

Fig. 1 zeigt ein Beispiel für eine erfindungsgemäße Trennvorrichtung. Fig. 1 shows an example for an inventive separation device.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist in der Praxis einfach und zeitsparend durchzuführen. Von besonderem Vorteil ist, dass das Filtermaterial in einer Trennvorrichtung integriert ist. Auf diese Weise erübrigt sich die Notwendigkeit einer Zentrifuge oder eines Trichters für die Aufnahme und Filtration des ungeklärten Lysats. In practice, the method according to the invention is simple and to save time. It is particularly advantageous that the Filter material is integrated in a separation device. On this eliminates the need for a centrifuge or a funnel for the absorption and filtration of the unexplained lysate.

Die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Trennvorrichtung kann praktisch jede Vorrichtung sein, die zur Trennung biologischer Bestandteile geeignet ist. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine zylindrische Vorrichtung in Form einer Trennsäule verwendet. The used in the method according to the invention Separation device can be practically any device used for separation biological components is suitable. In a preferred one An embodiment of the method according to the invention becomes a cylindrical device used in the form of a separation column.

Erfindungsgemäß bedeckt das Filtermaterial zumindest fast vollständig die Innenfläche der in diesem Verfahren verwendeten Trennvorrichtung bzw. der Trennsäule. Es ist wesentlich, dass möglichst viel Filterfläche vorhanden ist, da eine Filterwirkung auch zu den Seiten erfolgt. According to the invention, the filter material at least almost covers it completely the inner surface of those used in this procedure Separation device or the separation column. It is essential that there is as much filter area as possible because Filter effect also takes place on the sides.

Es ist bevorzugt, dass die gesamte Innenfläche der Trennvorrichtung bzw. -säule mit dem Filtermaterial bedeckt ist. Dazu wird günstigerweise das Filtermaterial eng an die Wandungen und am Boden der Trennsäule angelegt. It is preferred that the entire inner surface of the Separating device or column is covered with the filter material. To the filter material is conveniently close to the walls and placed at the bottom of the separation column.

Im Prinzip kann jedes Filtermaterial in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, das in der Lage ist, die ausgefällten Lysatkomponenten zurückzuhalten, und, vor allem, nur einen geringen Verlust an Lysat gewährleistet. Als bevorzugtes Filtermaterial hat sich Filterpapier erwiesen. Als Beispiel kann hier ein handelsübliches Filterpapier für den Laborbedarf genannt werden, wie beispielsweise das Produkt Whatman Grade 5. In principle, any filter material can be used in the method according to the invention, which is able to retain the precipitated lysate components and, above all, ensures only a small loss of lysate. Filter paper has proven to be the preferred filter material. An example is a commercially available filter paper for laboratory use, such as the Whatman Grade 5 product.

Erfindungsgemäß werden die Zellbestandteile, wie Zelltrümmer, Proteine, etc. in den Kopf der Trennvorrichtung eingegeben und am Filtermaterial adsorbiert. Das klare, die Nukleinsäure enthaltende Lysat fließt durch das Filterpapier zum Boden der Trennvorrichtung. According to the invention, the cell components, such as cell debris, Proteins, etc. entered into the head of the separator and adsorbed on the filter material. The clear, the nucleic acid Lysate containing flows through the filter paper to the bottom of the Separator.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des vorliegenden Verfahrens fließt das klare, die Nukleinsäuren enthaltende Lysat am Boden der Trennvorrichtung auf ein Chromatographiematerial. Auf diese Weise kann das klare Lysat chromatographiert werden, d. h. dass praktisch gleichzeitig mit der Abtrennung der Nukleinsäuren von den übrigen Zellbestandteilen die Nukleinsäuren, die in der Regel als Gemisch vorliegen, effektiv aufgetrennt werden können. Das bringt im Vergleich zu den herkömmlichen Verfahren eine beträchtliche Zeitersparnis, da der Zentrifugenschritt oder die Filtration zur Bildung eines isolierten klaren Lysats entfällt. In a particularly preferred embodiment of the present Process flows the clear, containing the nucleic acids Lysate at the bottom of the separator on one Chromatography. In this way the clear lysate can be chromatographed become, d. H. that practically simultaneously with the separation of the Nucleic acids from the other cell components Nucleic acids, which are usually present as a mixture, are effective can be separated. That brings in comparison to the conventional methods a considerable time saving, since the Centrifuge step or filtration to form an isolated clear lysate is eliminated.

Das Chromatographiematerial, das in der Trennvorrichtung vorgesehen sein kann, ist normalerweise ein Trägermaterial, das mit Ionenaustauschergruppen modifiziert ist. Als Trägermaterial kann ein Kieselgel, wie es beispielsweise in der EP 0 744 025 beschrieben ist, verwendet werden. Des Weiteren ist auch ein Mikroglasfasermaterial, das in der DE-OS 199 62 577 beschrieben ist, als Träger geeignet. The chromatography material used in the separation device can be provided, is usually a carrier material with Ion exchange groups is modified. As a carrier material can be a silica gel, as described, for example, in EP 0 744 025 is used. Furthermore there is also a Microglass fiber material described in DE-OS 199 62 577 is suitable as a carrier.

Der Träger kann mit einem Silianisierungsreagenz umgesetzt sein. Als Silanisierungsreagenz kann beispielsweise ein solches verwendet werden, das in der WO 91/05606 beschrieben ist. Ebenfalls können nach bekannten Verfahren an der stationären Phase Anionenaustauschergruppen oder Kationenaustauschergruppen angebracht werden. Ein Beispiel dafür ist in der obigen WO-Schrift beschrieben. The carrier can be reacted with a silianizing reagent his. For example, such a silanization reagent can be used can be used, which is described in WO 91/05606. Likewise, known methods on the stationary phase Anion exchange groups or cation exchange groups be attached. An example of this is in the WO document above described.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich praktisch alle Nukleinsäuren aus biologischen Zellen durch Abtrennung der anderen Zellbestandteile isolieren. In einer besonderen Ausführungsform wird das klare, die Nukleinsäuren enthaltende Lysat direkt in der Trennvorrichtung auf einem entsprechend modifizierten Trägermaterial chromatographiert, so dass eine Trennung von Nukleinsäuregemischen in DNA und RNA vorgenommen werden kann, wobei gleichzeitig die Nukleinsäuregemische hervorragend aufgelöst und in höchster Reinheit isoliert werden können. With the method according to the invention practically all of them can be Nucleic acids from biological cells by separating the isolate other cell components. In a special one The clear lysate containing the nucleic acids is the embodiment directly in the separator on a corresponding modified carrier material chromatographed, so that a separation of nucleic acid mixtures in DNA and RNA can, while the nucleic acid mixtures outstanding can be dissolved and isolated in the highest purity.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann jedes Nukleinsäuregemisch isoliert und ggf. getrennt werden. Beispiele für abzutrennende DNAs sind Phagemid-DNA, Phagen-DNA, Cosmid-DNA, genomische DNA, fragmentierte DNA, tRNA, mRNA, hnRNA, sn-RNA, Virus-DNA oder Viroid-DNA. In einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren ausgezeichnet beispielsweise zur Trennung von Plasmid-DNA aus Bakterienzellen, beispielsweise aus E.coli. With the method according to the invention, any Nucleic acid mixture isolated and, if necessary, separated. examples for DNAs to be separated are phagemid DNA, phage DNA, cosmid DNA, genomic DNA, fragmented DNA, tRNA, mRNA, hnRNA, sn-RNA, Virus DNA or Viroid DNA. In a special embodiment The present invention is suitable for the present invention Process excellent for example for the separation of Plasmid DNA from bacterial cells, for example from E. coli.

Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls eine Trennvorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Verfügung, bei dem isoliert und aufgetrennt wird. In Fig. 1 ist ein Beispiel für eine solche Trennvorrichtung gezeigt. Die wesentlichen Bestandteile dieser Vorrichtung sind eine Säule 1, die eine handelsübliche Kunststoffsäule sein kann, ein Chromatographiematerial 3 und ein in der Säule vorgesehenes Filtermaterial 5. Die Säule weist einen nach unten verjüngenden Ausgang in Form einer Spitze zum Anlegen eines Vakuums auf. Vor dem Ausgang ist eine Unterfritte 2 vorgesehen, die mit dem Ausgang abschließt. Darauf ist das Chromatographiematerial aufgebracht. Zum Abschluss ist darauf eine Oberfritte 4 vorgesehen. Eine derartige Kunststoffsäule ist beispielsweise in der DE-OS 199 62 577 näher beschrieben. Unter Umständen wird noch ein Ring zur Fixierung der Oberfritte 4 über dieser vorgesehen (nicht gezeigt). The present invention also provides a separation device for carrying out the method according to the invention, in which it is isolated and separated. An example of such a separating device is shown in FIG . The essential components of this device are a column 1 , which can be a commercially available plastic column, a chromatography material 3 and a filter material 5 provided in the column. The column has a tapered exit in the form of a tip for applying a vacuum. A bottom frit 2 is provided in front of the exit and ends with the exit. The chromatography material is applied to this. At the end, an upper frit 4 is provided. Such a plastic column is described in more detail, for example, in DE-OS 199 62 577. Under certain circumstances, a ring for fixing the upper frit 4 is also provided above it (not shown).

Das Filtermaterial kann jedes Material sein, das zum Abfiltern der ausgefallenden Zellbestandteile geeignet ist. Bevorzugt ist das Filtermaterial ein Papierfilter, der in der Weise ausgestaltet ist, dass er eng an der Wandung und am Boden der Trennvorrichtung anliegt. The filter material can be any material for filtering the failed cell components are suitable. Is preferred the filter material is a paper filter that in the way is designed so that it is close to the wall and bottom of the Separating device is present.

Geeigneterweise ist der Papierfilter gefaltet. Beispielsweise lässt sich ein derartiger Papierfilter herstellen, indem ausgehend von einem rechteckigen Stück Filterpapier ein am Boden verschlossener zylindrischer Körper gefaltet wird, der exakt in eine Trennsäule hineinpasst. Damit ist der Filter in die Säule einsetzbar und auch nach Gebrauch wieder aus dieser herausnehmbar. Das hat insbesondere den Vorteil, dass nach der Passage des Lysats der Filter einfach aus der Säule herausgezogen werden und im normalen Bioabfall entsorgt werden kann. Somit fallen keine zusätzlichen Plastikkomponenten und kein zusätzliches Verpackungsmaterial an. The paper filter is suitably folded. For example such a paper filter can be produced by starting from a rectangular piece of filter paper on the bottom closed cylindrical body is folded exactly in fits into a separation column. The filter is now in the column usable and out of it even after use removable. This has the particular advantage that after the passage of the lysate the filter is simply pulled out of the column and can be disposed of in normal organic waste. Consequently no additional plastic components fall and no additional Packaging material.

Durch die Wahl eines geeigneten Filterpapiers, wie beispielsweise Whatman Grade 5 ist die Durchlaufzeit des Lysats durch die Säule mit integriertem Filter praktisch identisch mit der Durchlaufzeit eines durch Zentrifugation geklärten Lysats durch die filterlose Säule. Wenn das Lysat im Vakuum abgezogen werden soll, was nach der Säule gemäß Fig. 1 durch Anlegen an der Spitze am Auslaß ohne Weiteres möglich ist, können sehr feinporige Materialien verwendet werden, ohne die Geschwindigkeit herabzusetzen. Es hat sich herausgestellt, dass gerade durch die Saugwirkung und den direkten Transfer das Lysats auf das Chromatographiematerial schnellere Prozeßzeiten und eine bessere Handhabbarkeit erzielt wird. By choosing a suitable filter paper, such as Whatman Grade 5 , the throughput time of the lysate through the column with integrated filter is practically identical to the throughput time of a lysate clarified by centrifugation through the filterless column. If the lysate is to be removed in vacuo, which is easily possible after the column according to FIG. 1 by placing it on the tip at the outlet, very fine-pored materials can be used without reducing the speed. It has been found that the process of suction and the direct transfer of the lysate to the chromatography material result in faster process times and better handling.

Wie bereits oben ausgeführt wurde, kann die erfindungsgemäße Trennvorrichtung 1 ein Chromatographiematerial 3 am Boden der Säule aufweisen. Das Chromatographiematerial unterliegt keinen besonderen Beschränkungen, mit der Maßgabe, dass es dafür geeignet ist, Nukleinsäuremischungen aufzutrennen. Beispielsweise kann das Chromatographiematerial ein Kieselgel sein, das in der EP 0 744 025 beschrieben ist. Alternativ kann auch ein Mikrofasermaterial, wie es aus der DE-OS 199 62 577 bekannt ist, verwendet werden. Das Chromatographiematerial ist jeweils mit beispielsweise Ionenaustauschergruppen modifiziert, die ihrerseits kationisch oder anionisch sein können. Dazu wird auf die vorherigen Ausführungen verwiesen. As already explained above, the separation device 1 according to the invention can have a chromatography material 3 at the bottom of the column. The chromatography material is not subject to any particular restrictions, provided that it is suitable for separating nucleic acid mixtures. For example, the chromatography material can be a silica gel, which is described in EP 0 744 025. Alternatively, a microfiber material as known from DE-OS 199 62 577 can also be used. The chromatography material is modified with, for example, ion exchange groups, which in turn can be cationic or anionic. Please refer to the previous explanations.

Mit der Trennvorrichtung können praktisch alle Nukleinsäuregemische von den übrigen Zellbestandteilen abgetrennt werden und gleichzeitig mit ausgezeichneter Auflösung und Reinheit erhalten werden. Hinsichtlich der Gemische wird auf die vorangegangenen Ausführungen verwiesen. Die Trennvorrichtung ist beispielsweise hervorragend geeignet, um Plasmid-DNA aus Bakterienzellen, wie beispielsweise E.coli zu präparieren. Practically everyone can use the separator Nucleic acid mixtures are separated from the other cell components and at the same time with excellent resolution and purity be preserved. With regard to the mixtures, reference is made to the referenced previous statements. The separator is excellent for example to make plasmid DNA To prepare bacterial cells such as E. coli.

Die erfindungsgemäße Trennvorrichtung lässt sich in vorteilhafter Weise als Kit zusammen mit den für die Chromatographie benötigten Puffern und ggf. anderen Komponenten anbieten. Der Anwender kann somit praktisch in einem Schritt die Lysatbestandteile von den Nukleinsäuren isolieren und die Nukleinsäuren in der gebotenen Reinheit und Auftrennung auftrennen und isolieren. The separating device according to the invention can be seen in advantageously as a kit together with those for chromatography offer the required buffers and other components if necessary. The The user can therefore practically complete the process in one step Isolate the lysate components from the nucleic acids and the nucleic acids in the required purity and separation and isolate.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert. The following examples illustrate the invention explained.

Examples example 1 Cultivation of the bacterial cultures

Für die Plasmidpräparationen werden E.coli-Kulturen entsprechend gängiger mikrobiologischer Praxis angezogen. Am Tag 1 erfolgt ein Vereinzelungsausstrich aus einer tiefgefrorenen Stock-Kultur auf einem selektiven Medium (z. B. LB-Agar mit Ampicillin als Antibiotikum). Nach einer Übernachtinkubation bei 37°C auf dem Schüttler wird am Tag 2 eine gutgewachsene Einzelkolonie auf 50-300 ml Flüssigmedium (z. B. LB), dem das entsprechende Antibiotikum zugesetzt worden ist, inokuliert. Nach einer weiteren Übernachtinkubation bei 37°C auf dem Schüttler bei guter Belüftung (200-300 rpm) wird ggf. auf noch größere Kulturvolumina aufgestockt oder die gewachsene Kultur wird direkt abgeerntet. Im Falle des Aufstockens wird die entsprechende mit Antibiotikum versetzte Menge an frischem Flüssigmedium mit 1% ihres Volumens mit der Kultur des Vortages inokuliert und für eine weitere Übernachtinkubation bei 37°C auf dem Schüttler bei 200-300 rpm inkubiert. For the plasmid preparations, E. coli cultures are grown according to common microbiological practice. On day 1 , a separation smear is carried out from a frozen stock culture on a selective medium (e.g. LB agar with ampicillin as an antibiotic). After an overnight incubation at 37 ° C. on the shaker, a well-grown single colony is inoculated on 50-300 ml of liquid medium (for example LB) to which the appropriate antibiotic has been added on day 2 . After another overnight incubation at 37 ° C on the shaker with good ventilation (200-300 rpm), the culture volume may be increased or the grown culture may be harvested directly. In the case of replenishment, the corresponding amount of fresh liquid medium mixed with antibiotic is inoculated with 1% of its volume with the culture of the previous day and incubated for a further overnight incubation at 37 ° C. on the shaker at 200-300 rpm.

Für eine Minipräparation werden 1-3 ml Menge Kultur mit High- Copy-Plasmid oder 5-20 ml Menge Kultur mit Low-Copy-Plasmid verwendet. Bei Midi- bzw. Maxipräparationen werden entsprechend größere Mengen verwendet. For a mini preparation, 1-3 ml of culture with high Copy plasmid or 5-20 ml of culture with low copy plasmid used. In the case of midi or maxi preparations, correspondingly larger quantities used.

Example 2 Isolation of the DNA from the bacteria

Die in Beispiel 1 angegebene Menge Bakterienkultur für eine Minipräparation wird in einem geeigneten Zentrifugationsgefäß für 3 Minuten bei 13.000 × g abzentrifugiert und das überstehende Medium wird komplett verworfen. Eventuell vom Rand des Zentrifugationsgefässes zurücklaufendes Medium wird mit der Pipette entfernt und ebenfalls verworfen. The amount of bacterial culture given in Example 1 for one Mini preparation is placed in a suitable centrifuge tube for Centrifuged at 13,000 × g for 3 minutes and the supernatant Medium is completely discarded. Possibly from the edge of the The return medium is centrifuged with the pipette removed and also discarded.

Die pelletierten Bakterien werden durch Vortexen in 0,40 ml Puffer aus 50 mM Tris-HCl (pH 8,0)/10 mM EDTA/100 µg/ml RNAse vollständig resuspendiert. Es dürfen keine Zellklumpen oder - aggregate mehr zu erkennen sein. The pelleted bacteria are vortexed in 0.40 ml Buffer from 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) / 10 mM EDTA / 100 µg / ml RNAse completely resuspended. No cell clumps or - aggregates can be seen more.

Die suspendierten Zellen werden durch Zugabe von 0,4 ml Puffer aus 200 mM NaOH/l,0% (w/v) SDS lysiert. Die suspendierten Zellen werden mit dem Lysepuffer durch mehrmaliges Invertieren gemischt bis eine homogene Phase entstanden ist. Diese Phase ist durch die ausgetretene genomische Bakterien-DNA sehr viskos. Es wird für maximal 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. The suspended cells are added by adding 0.4 ml of buffer lysed from 200 mM NaOH / l, 0% (w / v) SDS. The suspended Cells are inverted with the lysis buffer several times mixed until a homogeneous phase has formed. This phase is very viscous due to the leaked genomic bacterial DNA. It is incubated for a maximum of 5 minutes at room temperature.

Das Lysegemisch wird durch Zugabe von 0,4 ml Puffer aus 3,1-3,4 M Kaliumacetat (pH 5,5 mit Essigsäure) neutralisiert. Nach Zugabe des Puffers wird wiederum durch mehrmaliges Invertieren gemischt bis eine homogene Phase entstanden ist. Diese Phase ist jetzt wieder dünnflüssig. Es dürfen keine viskosen Reste des Zylllysates mehr vorhanden sein. The lysis mixture is made up of 3.1-3.4 by adding 0.4 ml of buffer M neutralized potassium acetate (pH 5.5 with acetic acid). To The buffer is again added by inverting several times mixed until a homogeneous phase has formed. This phase is now thin again. No viscous residues are allowed des Zylllysates be more present.

Example 3 Separation of the bacterial DNA

Eine Säule mit Anionentauscher ("Jetstar" von GENOMED), die integriert einen Papierfilter (Whatman Grade 5) aufweist, wird mit dem neutralisierten Lysegemisch aus Beispiel 2 beladen und dieses durch das Anlegen eines Wasserstahl-Vakuums durch die Säule vollständig durchzogen. Die Vakuumpumpe bleibt hierbei so lange eingeschaltet, bis erkennbar keine Flüssigkeit mehr von der Säule abgesaugt wird. Danach wird das Vakuum abgeschaltet und der Filter mit den Zellbestandteilen verworfen. Für die Entfernung unspezifisch gebundener Komponenten wird die Säule mit Puffer aus 100 mM NaAc/HAc (pH 5,0) /800 mM NaCl gewaschen. Dazu wird der Puffer in die Säule pipettiert und durch das Anlegen eines Wasserstrahl-Vakuums durch die Säule vollständig durchzogen. Die Vakuumpumpe bleibt solange eingeschaltet bis erkennbar keine Flüssigkeit mehr von der Matrix abgesaugt wird. Danach wird das Vakuum abgeschaltet. A column with an anion exchanger ("Jetstar" from GENOMED), which has an integrated paper filter (Whatman Grade 5 ), is loaded with the neutralized lysis mixture from Example 2 and this is completely drawn through the column by applying a water-steel vacuum. The vacuum pump remains switched on until no more liquid is sucked from the column. The vacuum is then switched off and the filter with the cell components is discarded. To remove non-specifically bound components, the column is washed with buffer from 100 mM NaAc / HAc (pH 5.0) / 800 mM NaCl. For this purpose, the buffer is pipetted into the column and completely drawn through the column by applying a water jet vacuum. The vacuum pump remains switched on until no more liquid is visibly sucked out of the matrix. The vacuum is then switched off.

Die Säule wird von der Vakuumkammer abgelöst und die an die Membran gebundene Plasmid-DNA durch Zugabe von 0,8 ml Puffer 100 mM Tris-HCl (pH 8,5) /1250 mM NaCl direkt in ein geeignetes Gefäß eluiert. Dazu wird der Puffer in die Säule pipettiert und mit Hilfe eines passenden Stempels durch die Säule manuell durchgedrückt. Hierbei sollte der Elutionspuffer in einer raschen Tropfenfolge, aber keinesfalls als Strahl durchgedrückt werden. Die einzelnen Tropfen müssen mit dem blossen Auge noch zu erkennen sein. The column is detached from the vacuum chamber and the plasmid DNA bound to the membrane is eluted directly into a suitable vessel by adding 0.8 ml of buffer 100 mM Tris-HCl (pH 8.5) / 1250 mM NaCl. To do this, the buffer is pipetted into the column and pushed through the column manually using a suitable stamp. The elution buffer should be pushed through in a rapid succession of drops, but never as a jet. The individual drops must still be visible to the naked eye.

Die Eluate werden mit 0,7 Vol. Isopropanol (Raumtemperatur) versetzt und gut gemischt. Die so präzipitierte Plasmid-DNA wird für mindestens 30 Minuten bei ≥ 13.000 × g und 4°C abzentrifugiert und der Überstand verworfen. Die pelletierte DNA wird einmal mit 80%igem Ethanol gewaschen, wieder abzentrifugiert, anschließend getrocknet (entweder durch Stehenlassen bei Raumtemperatur oder im Vakuum), und die getrocknete DNA wird schließlich in einer geeigneten Menge TE-Puffer oder Wasser für 10 Minuten bei 37°C gelöst. The eluates are washed with 0.7 vol. Isopropanol (room temperature) spiked and mixed well. The plasmid DNA so precipitated is at least 30 minutes at ≥ 13,000 × g and 4 ° C centrifuged and the supernatant discarded. The pelleted DNA is washed once with 80% ethanol, again centrifuged, then dried (either by standing at Room temperature or in vacuum), and the dried DNA finally in a suitable amount of TE buffer or water for Dissolved at 37 ° C for 10 minutes.

Die gelöste Plasmid-DNA wird spektrophotometrisch vermessen und auf einem Agarosegel analysiert. The dissolved plasmid DNA is measured spectrophotometrically and analyzed on an agarose gel.

Man erhält die Plasmid-DNA in einer deutlichen Bande ohne Verunreinigung mit RNA. The plasmid DNA is obtained in a clear band without Contamination with RNA.

Claims

1. A method for separating nucleic acids from other cell components by lysing the cells and precipitating the lysate components, the nucleic acids remaining in solution, characterized in that the lysate is filtered in a separating device through a filter material which at least almost completely covers the inner surface of the separating device ,

2. The method according to claim 1, characterized in that that the separation device is a separation column.

3. The method according to claim 2, characterized in that the filter material is close to the walls and bottom of the Separation column is created.

4. The method according to at least one of claims 1 to 3, characterized in that as a filter material Filter paper is used.

5. The method according to at least one of claims 1 to 4, characterized in that the cell components on Filter material are adsorbed and the clear, the nucleic acids containing lysate through the filter paper to the bottom of the Separator flows.

6. The method according to claim 5, characterized in that the clear lysate containing the nucleic acids on the bottom the separator flows onto a chromatography material.

7. The method according to claim 6, characterized in that that a carrier material is used as the chromatography material which is modified with ion exchange groups.

8. The method according to claim 7, characterized in that that the carrier material is a silica gel or a Micro fiber material is.

9. The method according to at least one of the preceding Claims for the isolation of plasmid DNA from bacterial cells.

10. Separating device for performing the method according to at least one of the preceding claims, which comprises:
a column ( 1 ),
a chromatography material ( 3 ) and
a filter material ( 5 ) provided in the column.

11. Separating device according to claim 10, characterized in that the column ( 1 ) is a plastic column.

12. Separating device according to claim 11, characterized in that the column ( 1 ) is tapered downwards and has an outlet in the form of a tip.

13. Separating device according to at least one of claims 10 to 12, characterized in that the chromatography material ( 3 ) is provided at the bottom of the column.

14. Separating column according to claim 13, characterized in that the chromatography material ( 3 ) is a silica gel or a microglass fiber material, which is modified with ion exchange groups.

15. Separating device according to at least one of claims 10 to 14, characterized in that the filter material ( 5 ) is a paper filter which is designed in such a way that it lies closely against the wall and the bottom of the column ( 1 ) and the inner surface at least almost completely covered.

16. Separating device according to claim 15, characterized marked that the paper filter is folded.

17. Separating device according to claim 16, characterized in that the filter ( 5 ) can be inserted into and removed from the column ( 1 ).

18. Separating device according to at least one of claims 10 to 17, characterized in that it furthermore has an upper frit ( 4 ) and a lower frit ( 2 ).

19. Separating device according to at least one of the claims 10 to 18 for the separation of plasmid DNA from bacterial cells.