DE102017111578A1

DE102017111578A1 - Method for distinguishing individual fluorescent marker molecules in SPDM localization microscopy by their temporal long-term emission behavior over 10 ms

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Publication number: DE102017111578A1
Application number: DE102017111578.1A
Authority: DE
Inventors: wird später genannt werden Erfinder
Original assignee: Individual
Current assignee: Schaufler Wladimir De
Priority date: 2017-05-29
Filing date: 2017-05-29
Publication date: 2018-11-29

Abstract

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Unterscheidung verschiedener fluoreszierender Markierungsstoffe in der SPDM-Lokalisationsmikrokopie fixierter Proben durch deren Langzeit-Emissionsverhalten nach einer Aussetzung mit einem zirkular polarisierten Photonenfluss von 1 KW/cm^2 bis zu 1 MW/cm^2 in der Zeitspanne zwischen 10 Millisekunden und 10 Minuten.

The present invention relates to a method of discriminating various fluorescent labels in the SPDM localization microscopy of fixed samples by their long-term emission behavior after exposure to a circularly polarized photon flux of 1 KW / cm 2 to 1 MW / cm 2 in FIG Time span between 10 milliseconds and 10 minutes.

Description

Das vorliegende neuentwickelte Verfahren wird dem Fachgebiet der höchstauflösenden optischen Lokalisationsmikroskopie zugeordnet.The present newly developed method is assigned to the field of high resolution optical localization microscopy.

Aufgrund der Wellennatur des Lichtes ist die klassische optische Auflösung auf etwa 200 nm lateral und etwa 600 nm axial begrenzt. Die bereits bekannten Methoden der Lokalisationsmikroskopie (SPDM, PALM, dSTORM, STORM, GSDIM), welche auf der zeitlichen optischen Isolation der einzelnen fluoreszierend markierten Moleküle basieren, überwinden diese Auflösungsgrenzen und ermöglichen Positionsbestimmungen bis zu wenigen Nanometern.
Weitere Informationen dazu sind in der Begründung des Chemienobelpreises 2014 aufgeführt [1].Due to the wave nature of the light, the classical optical resolution is limited to about 200 nm lateral and about 600 nm axially. The already known methods of localization microscopy (SPDM, PALM, dSTORM, STORM, GSDIM), which are based on the temporal optical isolation of the individual fluorescently labeled molecules, overcome these resolution limits and enable position determination down to a few nanometers.
Further information can be found in the explanatory memorandum of the 2014 Nobel Prize for Chemistry [ 1 ].

Die optische Isolation zwecks Auflösungsverbesserung erfolgt bei der Lokalisationsmikroskopie durch ein sich zeitlich änderndes Emissionsverhalten einzelner fluoreszierender Moleküle. Dieses sich zeitlich ändernde Emissionsverhalten kann durch mehrere Laserwellenlängen mit Laserleistungsdichten unter 1KW/cm^2 (PALM, STORM, GSDIM: US7535012 B2 & WO2009085218 A1 ) oder durch die Nutzung einer Wellenlänge mit einer Laserleistungsdichte zwischen 1 KW/cm² und 1 MW/cm² (SPDM: DE 112009000698 ) hervorgerufen werden. Die zeitlichen Abstände zwischen den leuchtenden und den dunklen Zuständen liegen im Bereich von wenigen Millisekunden und mehreren Minuten. Die kollektive Steuerung der Dunkelzeitdauer aller in einem Experiment eingesetzten Molekülsorten kann über gezielte Konzentrationvariationen von Reduktions- und Oxidationsmittel im Mikromilieu innerhalb einer Probe erfolgen [2].The optical isolation for the purpose of dissolution enhancement occurs in localization microscopy by a time-varying emission behavior of individual fluorescent molecules. This time-varying emission behavior can be achieved by several laser wavelengths with laser power densities below 1KW / cm 2 (PALM, STORM, GSDIM: US7535012 B2 & WO2009085218 A1 ) or by using a wavelength with a laser power density between 1 KW / cm ² and 1 MW / cm ² (SPDM: DE 112009000698 ). The time intervals between the luminous and the dark states are in the range of a few milliseconds and several minutes. The collective control of the dark time duration of all molecular types used in an experiment can be achieved by targeted concentration variations of reducing and oxidizing agents in the microenvironment within a sample [ 2 ].

Für die spätere Rekonstruktion eines hochaufgelösten Lokalisationsbildes werden typischerweise über eine Zeitspanne von wenigen Sekunden bis zu mehreren Minuten viele tausend Weitfeldaufnahmen derselben Zellenregion (ROI) mit einer EM-CCD oder CMOS Kamera dokumentiert. Dadurch wird der zeitliche Wechsel zwischen den fluoreszierenden und den nicht-fluoreszierenden Zuständen einzelner Moleküle festgehalten.For the subsequent reconstruction of a high-resolution localization image, many thousand wide-field images of the same cell region (ROI) are typically documented over a period of a few seconds to several minutes with an EM-CCD or CMOS camera. This captures the temporal change between the fluorescent and non-fluorescent states of individual molecules.

Die einzelnen Bilder des Bildstapels enthalten räumlich verteilte optisch isolierte Punktspreizfunktionen bzw. Punkt-Bild-Verwaschungsfunktionen (PSFs) der Moleküle.
Zur Positionsbestimmung (Lokalisation) der Moleküle aus den geometrisch voneinander getrennten Punktspreizfunktionen wird nach dem heutigen Stand der Technik eine Vielzahl von Positionsbestimmungsalgorithmen verwendet [3], die entweder auf der Anpassung einer zweidimensionalen Gaußfunktion oder durch die Maximum-Likelihood-Methode basieren.The individual images of the image stack contain spatially distributed optically isolated point spreading functions or point-image-bleaching functions (PSFs) of the molecules.
In order to determine the position (localization) of the molecules from the geometrically separated point spread functions, a large number of position determination algorithms are used according to the current state of the art [ 3 ] based either on fitting a two-dimensional Gaussian function or on the maximum likelihood method.

Die gefundenen Positionen werden anschließend mittels mehrerer Visualisierungsmethoden in einem neuen Bild mit erhöhter Auflösung dargestellt [4].The found positions are then displayed in a new image with increased resolution using several visualization methods [ 4 ].

Somit wird nach dem heutigen Stand der Technik das sich zeitlich ändernde Emissionsverhalten der Moleküle ausschließlich zur Erhöhung der Auflösung in allen drei Raumrichtungen in fixierten und lebenden Präparaten benutzt.Thus, according to the current state of the art, the time-varying emission behavior of the molecules is used exclusively for increasing the resolution in all three spatial directions in fixed and living preparations.

Die getrennte Detektion einzelner fluoreszierender Molekülarten erfolgt nach dem heutigen Stand der Technik durch unterschiedliche Anregungs- und Emissionsspektren oder Fluoreszenzlebensdauern innerhalb der 0,1 bis 100 Nanosekunden-Zeitspannen unter Verwendung von gepulsten Lasern mit Picosekundendetektoren.Separate detection of individual fluorescent species is accomplished according to the current state of the art by different excitation and emission spectra or fluorescence lifetimes within the 0.1 to 100 nanosecond time periods using pulsed lasers with picosecond detectors.

Die Trennung unterschiedlicher fluoreszierender Substanzen durch deren in der biomedizinischen Forschungspraxis üblichen spektralen Peak-to-Peak Abstanden von 20 bis 60 nm im sichtbaren Spektralbereich (400-700 nm) ist aufgrund der spektralen Überlappungen auf typischerweise 7 Substanzen begrenzt.
Eine weitere Auftrennung der sich überlappenden Spektren kann fehlerbehaftet durch aufwendige Mehrfarbengeräte und spectral-unmixing-Algorithmen [5] zur Unterscheidung von mehr als 10 fluoreszierender Substanzen, typischerweise jedoch nicht in der Weitfeld-Lokalisationsmikroskopie sondern vorwiegend in der Durchflusszytometrie [6] oder vereinzelt in der konfokalen Mikroskopie [7], erfolgen.The separation of different fluorescent substances by their usual in biomedical research practice spectral peak-to-peak distances of 20 to 60 nm in the visible spectral range (400-700 nm) is due to the spectral overlaps on typically 7 Limited substances.
Further separation of the overlapping spectra can be faulty due to complex multicolor devices and spectral unmixing algorithms. 5 ] to distinguish more than 10 fluorescent substances, but typically not in far-field localization microscopy but predominantly in flow cytometry [ 6 ] or occasionally in confocal microscopy [ 7 ], respectively.

Durch die Nutzung von unterschiedlichen Emissionsspektren entstehen chromatische Aberrationen. Diese können aufgrund des zum Untersuchungszeitpunkt unbekannten sich räumlich ändernden Dispersionsverhaltens innerhalb vieler biologischer Proben weder vorhergesagt noch korrigiert werden. Nutzt man den ganzen sichtbaren Spektralbereich (400-700nm) aus, so verursachen die Aberrationen in über 30 µm dicken Proben nicht korrigierbare chromatische Verschiebungen im Bereich zwischen 10 und 20 nm. Bei der Nutzung von Gewebeproben steigen die chromatischen Aberrationen auf über 20 nm an.The use of different emission spectra produces chromatic aberrations. These can neither be predicted nor corrected within many biological samples because of the spatially changing dispersion behavior unknown at the time of the examination. Using the entire visible spectral range (400-700nm), the aberrations in over 30 μm thick samples cause uncorrectable chromatic shifts in the range between 10 and 20 nm. When using tissue samples, the chromatic aberrations increase to more than 20 nm.

Bei steigender Anzahl der zur unterscheidenden Emissionsspektren steigt bei einer simultanen multispektralen Aufnahme auch die Anzahl der teilweise lichtabsorbierenden dichroitischen Strahlteiler/diffrakteren Gitter oder akusto-optischer Strahlteiler (AOBS). Dadurch verringert sich die Zahl der detektierten Photonen, während sich die Werte der Zernike-Koeffizienten (Maßeinheit für die optischen Abbildungsfehler) mit jedem zusätzlichen Strahlteiler erhöhen. Beides verschlechtert die maximal erreichbare Auflösung in der Lokalisationsmikrokopie.As the number of distinct emission spectra increases, the number of partially light-absorbing dichroic beam splitters / more diffractive gratings or acousto-optic beam splitters (AOBS) also increases with a simultaneous multispectral recording. This reduces the number of photons detected while increasing the values of the Zernike coefficients (unit of optical aberration) with each additional beam splitter. Both degrades the maximum achievable resolution in the localization microscopy.

Nimmt man als Alternative unterschiedliche Spektren (Anregung und Emission) mit einer sequentiellen Aufnahme auf, so steigt die Gesamtaufnahmedauer eines multispektralen Lokalisationsbildstapels auf ein Vielfaches an. Die Erhöhung der Gesamtaufnahmedauer verschlechtert in diesem Fall zusätzlich zu den chromatischen und strahlteilerbedingten Aberrationen die Bildqualität wegen der thermischen und mechanischen Drifte. Taking as an alternative different spectra (excitation and emission) with a sequential recording, the total recording time of a multispectral localization image stack increases to a multiple. Increasing the total recording time in this case, in addition to the chromatic and beam splitter aberrations, degrades the image quality due to the thermal and mechanical drifts.

Durch die im Hauptanspruch vorgeschlagene Methode der getrennten Detektion aufgrund vom zeitlichen Emissionsverhalten kann bei Verwendung mehrerer fluoreszierender Substanzen die Aufnahmedauer verkürzt und die thermischen und mechanischen Drifte verringert werden. Dazu werden durch Wegfall mehrere optischer Elemente die Abbildungsfehler vermindert und die Detektionseffizienz gesteigert. Die chromatischen Aberrationen werden bei Auswahl von spektral ähnlichen fluoreszierenden Substanzen stark verringert.
Benutzt man die Methode nach Anspruch 1 als Zusatz zur spektralen Trennung sowie in Kombination mit Trennung durch Fluoreszenzlebensdauer zusätzlich zu der Kombination mit fehlerbehafteten Spectral-Unmixing-Alghorithmen [5], so kann die Anzahl der trennbaren Markierungsstoffe bis auf ein mehrfaches der heute in der Lokalisationsmikroskope genutzten Anzahl erhöht werden.By the proposed in the main claim method of separate detection due to the temporal emission behavior can be shortened when using multiple fluorescent substances, the recording time and the thermal and mechanical drifts are reduced. For this purpose, by eliminating several optical elements, the aberrations are reduced and the detection efficiency is increased. The chromatic aberrations are greatly reduced by selecting spectrally similar fluorescent substances.
If one uses the method according to claim 1 as an addition to the spectral separation and in combination with separation by fluorescence lifetime in addition to the combination with error-prone spectral unmixing algorithms 5 ], the number of separable markers can be increased to a multiple of the number used today in localization microscopes.

Die mit der Erfindung erzielten Vorteile bestehen neben der Reduzierung von chromatischen Aberrationen und Verkürzung der Aufnahmedauer insbesondere darin, dass unter Einsparung einer Vielzahl optomechanischer Komponenten wie Laser, Strahlteiler und Befestigungsmaterial, die bisher für Mehrfarbenaufnahmen erforderlich sind, nun eine kostengünstige Anordnung für die Lokalisationsmikrokopie multiplex-markierter Proben ausreicht.The advantages achieved with the invention are, in addition to the reduction of chromatic aberrations and shortening of the recording time, in particular that while saving a large number of optomechanical components such as laser, beam splitter and mounting material, which were previously required for multicolor recordings, now a cost-effective arrangement for the Lokalisationsmikrokopie multiplex Marked samples is sufficient.

Die zeigt ein Ausführungsbeispiel eines optischen Aufbaus, welches nach dem Hauptanspruch zur gleichzeitigen Aufnahme und Trennung von wenigstens zwei fluoreszierenden Substanzen ausreicht. Ein mindestens 100 mW starker Dauerstrichlaser aus dem sichtbaren Spektralbereich (10) erhöht in Kombination mit einer Einfokussierlinse (7) und einem Objektiv (2) die Laserleistungsdichte auf ein Niveau zwischen 1 KW/cm^2 und 1 MW/cm^2 im Probenraum, wobei die Laserleistungsdichten entweder durch Verschiebung der Einfokussierlinse (7) entlang des optischen Pfades zur Anregung (9) oder durch eine Vorrichtung zur Laserleistungsteuerung (typischerweise ein Filterrad oder ein Akustooptischer Modulator) (8) modifiziert werden können. Das dadurch hervorgerufene sich zeitlich änderndes Emissionsverhalten fluoreszierender Substanzen wird anschließend in dem optischen Pfad zur Detektion (5), bestehend aus einer Objektivlinse (2), einer Tubuslinse (4) und einer Kamera (6) detektiert und durch ein dichroitisches Element (3) vom Anregungslicht getrennt.The shows an embodiment of an optical structure, which is sufficient according to the main claim for the simultaneous recording and separation of at least two fluorescent substances. A continuous wave laser of at least 100 mW in the visible spectral range ( 10 ) in combination with a focuser ( 7 ) and a lens ( 2 ) the laser power density to a level between 1 KW / cm ^ 2 and 1 MW / cm ^ 2 in the sample space, wherein the laser power densities either by displacement of the focusing lens ( 7 ) along the optical path for excitation ( 9 ) or by a laser power control device (typically a filter wheel or an acousto-optic modulator) ( 8th ) can be modified. The resulting time-varying emission behavior of fluorescent substances is subsequently determined in the optical path for detection (FIG. 5 ), consisting of an objective lens ( 2 ), a tube lens ( 4 ) and a camera ( 6 ) and detected by a dichroic element ( 3 ) separated from the excitation light.

Die Detektion der Fluoreszenz erfolgt in der Regel mit einem EMCCD oder einem CMOS Sensor.The detection of the fluorescence is usually done with an EMCCD or a CMOS sensor.

Das Boxplot-Diagramm in der zeigt ein Ausführungsbeispiel der Separation zweier fluoreszierender Substanzen anhand von der Gesamtdauer der Hellperioden einzelner optisch isolierter Einzelmoleküle während einer 40-Sekunden Aufnahme.The boxplot diagram in the shows an embodiment of the separation of two fluorescent substances based on the total duration of the light periods of individual optically isolated single molecules during a 40-second recording.

Bei der Verwendung von Kohlenstoff-Punkten (C-Dots, vgl. und DE102014108166 ) in Kombination mit dem Fluoreszenzfarbstoff Alexa Fluor 647 [8] werden die fluoreszierenden Substanzen mit der Laserlinie 642 nm und einer Laserleistungsdichte von 1 KW/cm^2 angeregt.
Sowohl C-Dots wie auch einzelne Moleküle des Fluoreszenzfarbstoffs Alexa Fluor 647 sind auf einer Glasoberfläche immobilisiert und befinden sich in der für die biomedizinischen Forschungspraxis üblichen Mikroumgebung einer phosphatgepufferten Salzlösung (PBS).When using carbon dots (C-dots, cf. and DE102014108166 ) in combination with the fluorescent dye Alexa Fluor 647 8th ], the fluorescent substances are excited with the laser line 642 nm and a laser power density of 1 KW / cm ^ 2.
Both C-Dots and individual molecules of the fluorescent dye Alexa Fluor 647 are immobilized on a glass surface and are in the usual micro-environment of phosphate buffered saline (PBS) for biomedical research practice.

Die Emissionsspektren der Markierungsstoffe werden ohne gegenseitige chromatische Aberrationen in einem spektralen Bereich zwischen 660 und 690 nm detektiert.
Die Zuordnung der jeweiligen fluoreszierenden Substanzen erfolgt durch Setzung eines Schwellwerts für die Gesamtdauer der Hellperioden einzelner Moleküle.
Fluoreszierende Einzelmoleküle mit einer Gesamtdauer der Hellperioden kleiner als 3 Sekunden werden den C-Dots zugeordnet.
Fluoreszierende Einzelmoleküle mit einer Gesamtdauer der Hellperioden größer als 3 Sekunden werden den Alexa Fluor 647 Molekülen zugeordnet.
Die Wahrscheinlichkeiten der Überschneidung liegen hier unterhalb von 10%.

[1] The Nobel Prize in Chemistry 2014 n.d. http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2014 (accessed October 11, 2015).
[2] Heilemann M, van de Linde S, Sauer M, Mukherjee A. Hochaufloesende Mikroskopie mit kleinen organischen Farbstoffen. Angew Chemie 2009;121:7036-41 . doi:10.1002/ange.200902073.
[3] Small A, Stahlheber S. Fluorophore localization algorithms for super-resolution microscopy. Nat Methods 2014;11:267-79 . doi:10.1038/nmeth.2844.
[4] Baddeley D, Cannell MB, Soeller C. Visualization of localization microscopy data. Microsc Microanal 2010;16:64-72 . doi:10.1017/S143192760999122X.
[5] Zimmermann T, Rietdorf J, Pepperkok R. Spectral imaging and its applications in live cell microscopy. FEBS Lett 2003;546:87-92 . doi:10.1016/S0014-5793(03)00521-0.
[6] Baumgarth N, Roederer M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J Immunol Methods 2000;243:77-97 .
[7] Do D, Chun W, Gweon D-G. Design and analysis of multi-color confocal microscopy with a wavelength scanning detector. Rev Sci Instrum 2012;83:53704. doi:10.1063/1.4717679 .
[8] Goat Anti-Mouse-IgG (H+L) Alexa Fluor 647 Conjugated, Bestellnummer A-21236. Thermo Fish Sci Waltham, Massachusetts, USA

The emission spectra of the labels are detected without mutual chromatic aberrations in a spectral range between 660 and 690 nm.
The assignment of the respective fluorescent substances takes place by setting a threshold value for the total duration of the light periods of individual molecules.
Fluorescent single molecules with a total duration of light periods less than 3 seconds are assigned to the C-Dots.
Fluorescent single molecules with a total duration of light periods greater than 3 seconds are assigned to the Alexa Fluor 647 molecules.
The probabilities of overlap here are below 10%.

[1] The Nobel Prize in Chemistry 2014 and http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2014 (accessed October 11, 2015).
[2] Heilemann M, van de Linde S, Sauer M, Mukherjee A. High-resolution microscopy with small organic dyes. Angew Chemistry 2009; 121: 7036-41 , doi: 10.1002 / ange.200902073.
[3] Small A, steel lifter S. Fluorophoric localization algorithms for super-resolution microscopy. Nat Methods 2014; 11: 267-79 , doi: 10.1038 / nmeth.2844.
[4] Baddeley D, Cannell MB, Soeller C. Visualization of localization microscopy data. Microsc Microanal 2010; 16: 64-72 , doi: 10.1017 / S143192760999122X.
[5] Zimmermann T, Rietdorf J, Pepperkok R. Spectral imaging and its applications in live cell microscopy. FEBS Lett 2003; 546: 87-92 , doi: 10.1016 / S0014-5793 (03) 00521-0.
[6] Baumgarth N, Roederer M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J Immunol Methods 2000; 243: 77-97 ,
[7] Do D, Chun W, Gweon DG. Design and analysis of multi-color confocal microscopy with a scanning laser scanner. Rev Sci Instrum 2012; 83: 53704. doi: 10.1063 / 1.4717679 ,
[8] Goat Anti-Mouse IgG (H + L) Alexa Fluor 647 Conjugated, Order Number A-21236. Thermo Fish Sci Waltham, Massachusetts, USA

BezugszeichenlisteLIST OF REFERENCE NUMBERS

1.1.: axial und lateral verschiebbare piezo-elektrische Bühneaxially and laterally displaceable piezoelectric stage
2.Second: Objektivlinseobjective lens
3.Third: dichroitisches Elementdichroic element
4.4th: Tubuslinsetube lens
5.5th: optischer Pfad zur Detektionoptical path for detection
6.6th: CCD oder CMOS KameraCCD or CMOS camera
7.7th: bewegbare Einfokussierlinsemovable focussing lens
8.8th.: Vorrichtung zur LaserleistungsteuerungDevice for laser power control
9.9th: optischer Pfad zur Anregungoptical path for excitation
10.10th: monochromatischer Dauerstrichlasermonochromatic continuous wave laser

Bezugszeichenliste für die Abbildung 2List of reference numerals for the Figure 2

Die Molekülstruktur eines Kohlenstoff-Punktes (C-Dots)The molecular structure of a carbon dot (C-dots)

Bezugszeichenliste für die Abbildung 3List of reference numerals for the Figure 3

Die logarithmische Boxplot-Darstellung der Gesamtdauer der Hellperioden einzelner Lichtemissionen eines Moleküls der Sorten Alexa Fluor 647 und C-Dots. Die Versuchsdauer der ca. 1.000 ausgewerteten Messungen beträgt 40 SekundenThe logarithmic box plot of the total duration of the light periods of individual light emissions of a molecule of the varieties Alexa Fluor 647 and C-Dots. The test duration of the approx. 1,000 evaluated measurements is 40 seconds

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG QUOTES INCLUDE IN THE DESCRIPTION

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Zitierte PatentliteraturCited patent literature

US 7535012 B2 [0003]
WO 2009085218 A1 [0003]
DE 112009000698 [0003]
DE 102014108166 [0018]

Zitierte Nicht-PatentliteraturCited non-patent literature

Heilemann M, van de Linde S, Sauer M, Mukherjee A. High-resolution microscopy with small organic dyes. Angew Chemistry 2009; 121: 7036-41 [0019]
Small A, steel lifter S. Fluorophoric localization algorithms for super-resolution microscopy. Nat Methods 2014; 11: 267-79 [0019]
Baddeley D, Cannell MB, Soeller C. Visualization of localization microscopy data. Microsc Microanal 2010; 16: 64-72 [0019]
Zimmermann T, Rietdorf J, Pepperkok R. Spectral imaging and its applications in live cell microscopy. FEBS Lett 2003; 546: 87-92 [0019]
Baumgarth N, Roederer M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J Immunol Methods 2000; 243: 77-97 [0019]
Do D, Chun W, Gweon D-G. Design and analysis of multi-color confocal microscopy with a scanning laser scanner. Rev Sci Instrum 2012; 83: 53704. doi: 10.1063 / 1.4717679 [0019]

Claims

(Main claim) A method for distinguishing different fluorescent markers in the SPDM Lokalisationsmikrokopie fixed samples is characterized in that their long-term emission behavior after exposure to a circularly polarized photon flux of 1 KW / cm ^ 2 up to 1 MW / cm ^ 2 [DE112009000698T5 ] is used in the period between 10 milliseconds and 10 minutes for differentiation.

Method according to Claim 1 wherein the fluorescent substance is a fluorescent molecule of the dye groups of the acridine dyes, the cyanine dyes, the fluorone dyes, the oxazine dyes, the phenanthridine dyes of the rhodamine dyes or a fluorescent protein of the groups GFP, YFP, RFP.

Method according to Claim 1 wherein the marker is a fluorescent nanoparticle of the groups of the carbon nanocrystals, the diamonds, the noble metal nanocrystals, the lanthanide nanocrystals or the semiconductor material nanocrystals.

Method according to Claim 1 , wherein various fluorescent molecules ( Claim 2 ) and fluorescent nanoparticles ( Claim 3 ) are distinguished from each other.

Method according to Claim 1 , 2, 3 and 4, wherein the different fluorescent labels emit light of different wavelengths with a typical spectral peak to peak distance of 20 to 60 nm.

Method for avoiding aberrations resulting from chromatic aberrations of the imaging optics, according to Claim 1 . 2 and 3 the different fluorescent tags emit the light at the same wavelengths.

Method according to the Claims 1 , 2,3,4,5 and 6, wherein to distinguish the temporal emission behavior, the fluorescent markers by a circularly polarized photon flux of 1 KW / cm ^ 2 to 1 MW / cm ^ 2 [DE112009000698T5] first in a non-fluorescent state and then the latency is measured until the fluorescence fades. Both the time to fade and the time to fluorescence reoccurrence and all subsequent times of extinction and reoccurrence are used for discrimination.

Method according to Claim 7 in which the total duration of the dark periods and the light periods expressed by the ratio which is calculated from product, difference, sum of the least squares or quotient is used as a distinguishing feature.

Method according to Claim 7 in which the frequency spectrums of the bright and dark times are determined by a Fourier analysis, Laplace transformation or wavelet analysis and used as distinguishing features.

Method according to Claim 1 wherein the separation of at least two fluorescent substances on an optical structure consisting of a displaceable piezoelectric stage, an objective lens, a dichroic element, a tube lens, a CMOS or EMCCD camera and a monochromatic continuous wave laser is feasible.