DE102016122837A1

DE102016122837A1 - Material für Knochenimplantate

Info

Publication number: DE102016122837A1
Application number: DE102016122837.0A
Authority: DE
Inventors: Dietmar Schaffarczyk; Michael Gießl; Helmut Cölfen
Original assignee: Stimos GmbH
Current assignee: Stimos GmbH
Priority date: 2016-11-26
Filing date: 2016-11-26
Publication date: 2018-05-30

Abstract

Die Erfindung geht aus von einem Material für ein Knochenimplantat, umfassend:eine Trägerstruktur mit einer Oberfläche, die zumindest ein biokompatibles Material umfasst,eine kovalent an diese Oberfläche gebundene Matrix undin diese Matrix eingelagertes Calciumphosphat.Ein medizinisch unbedenkliches, hochverträgliches und vielseitig einsetzbares Material kann bereitgestellt werden, wenn die Matrix zumindest ein Polysaccharid aufweist.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Material für ein Knochenimplantat, umfassend eine Trägerstruktur mit einer Oberfläche, die zumindest ein biokompatibles Material umfasst, eine kovalent an diese Oberfläche gebundene Matrix, sowie in diese Matrix eingelagertes Calciumphosphat. Die vorliegende Erfindung betrifft weiter ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Materials, ein Knochenimplantat auf das das erfindungsgemäße Material aufgebracht ist, sowie dessen Verwendung als Knochenimplantatmaterial.
In den letzten Jahren nahm die Anzahl der Patienten, die an Knochenschäden leiden und/oder ein Knochenimplantat benötigen, tendenziell zu. Dieser Trend betont die Notwendigkeit, hochwertige, stabile und funktionelle Knochenersatzmaterialien zu erforschen.
Die organischen Komponenten im Knochen bestehen zu 95 % aus Collagen und aus 5 % Proteoglykanen und anderen haftvermittelnden Glykoproteinen. Der mineralische Anteil des Knochens besteht fast ausschließlich aus Calciumphosphat in der Modifikation von Hydroxylapatit. Die harten Materialeigenschaften von Hydroxylapatit machen den Knochen in Kombination mit den elastischen Eigenschaften der organischen Komponenten zu einem sehr vielseitigen Kompositmaterial.
Die Anforderungen an hochwertige und funktionsgerechte Knochenimplantate sind vielfältig und es ist schwierig, alle Anforderungen mit einem Material zu erfüllen. Die Funktionalität eines Implantatmaterials ist dabei schwer vorhersehbar, da der natürliche Prozess der Knochenwundheilung und Implantat-Einheilung sehr komplex und zum Teil noch nicht vollständig verstanden ist.
Die Wundheilung von harten oder weichen Geweben nach einem operativen Eingriff, wie beispielsweise einer Knochenimplantation, umfasst viele zelluläre und extrazelluläre Ereignisse. Der Heilungsprozess an der Kontaktfläche zwischen dem Knochenimplantat und dem Knochen umfasst vier Stufen, welche teilweise ineinander überlappend stattfinden. Darunter fallen Entzündungsreaktionen, die Bildung eines weichen Kallus, gefolgt von der Bildung eines harten Kallus und schließlich die Remodellierungsphase.
Nach einem operativen Eingriff adsorbieren zunächst Proteine und andere Moleküle des Bluts und der Gewebsflüssigkeiten an der Oberfläche des Implantats. Wird vaskularisiertem Gewebe eine Wunde zugefügt, führt dies nicht nur zu Entzündungsreaktionen, sondern auch zur Aktivierung einer Vielzahl weiterer körpereigener Schutzsysteme, wie beispielsweise des extrinsischen und intrinsischen Koagulationssystems, des Komplementsystems, des fibrinolytischen Systems und des Kininsystems. Hiernach folgen zwei sequentiell ablaufende Phasen, die ebenfalls ineinander übergehend verlaufen können, nämlich die akute und die chronische Entzündungsreaktion. Das Blut koaguliert zu einem Blutgerinnsel, welches aus Fibrin als Hauptbestandteil aufgebaut ist. Parallel hierzu werden Zytokine und weitere Wachstumsfaktoren freigesetzt, um weiße Blutzellen zur Wunde zu rekrutieren. Hierbei werden in der akuten Entzündungsantwort Neutrophile und mononukleäre Zellen, wie beispielsweise Monozyten, rekrutiert. Mononukleäre Zellen differenzieren sich zu Makrophagen und lagern sich an der Oberfläche des Implantats an. Bei einer normal verlaufenden Wundheilung sind Makrophagen dafür verantwortlich, die Wunde von Bakterien, Zelltrümmern und anderen Verunreinigungen via Phagozytose zu reinigen. Das Implantatmaterial wird dabei vom Körper ebenfalls als Fremdkörper empfunden. Da das Implantat allerdings wesentlich größer als die Makrophagen ist, können diese das Material nicht phagozytieren. Diese Ereignisse führen schließlich zu der Phase der chronischen Entzündung an der Material/Gewebsgrenze. Dabei fusionieren die Makrophagen und bilden mehrkernige Riesenzellen, um den Fremdkörper zu umschließen. Die Makrophagen sorgen ebenfalls für die Rekrutierung weiterer Zellen, wie beispielsweise Fibroblasten, welche fibröse Gewebe an der Oberfläche des Implantats ablagern.
Nach der Entzündungsphase bildet sich ein weicher Kallus. Dieser besteht aus Knochenvorläuferzellen und Fibroblasten, welche sich in einer ungeordneten Matrix aus nicht-kollagenen Proteinen und Kollagen befinden. Diese Matrix wird graduell von besagten Zellen als erste Reaktion gebildet und ist strukturell dem Geflechtknochen ähnlich. Der weiche Kallus wird schließlich graduell von Osteoblasten in geordnete lamellare Knochenstruktur umgebaut. Osteoblasten sekretieren dabei Typ-I-Kollagen, Calciumphosphat und Calciumcarbonat mit einer willkürlichen, zufälligen Orientierung. Die Remodellierungsphase überlappt mit der Bildung des harten Kallus. Dies geschieht durch Resorption der ungeordneten Knochenstrukturen durch Osteoclasten und anschließender Bildung von geordneten Knochenstrukturen durch Osteoblasten.
Damit Stoffe für den Einsatz als Knochenimplantatmaterialien geeignet sind und um eine optimale Heilung der Defektstelle zu ermöglichen, müssen sie einige besondere Eigenschaften aufweisen. Dazu gehören beispielsweise die Biokompatibilität, die Immunogenität, Osseointegration und Osteogenität. Um eine gute Biokompatibilität zu erreichen, dürfen das Material bzw. seine Abbauprodukte weder toxisch, kanzerogen oder teratogen sein. Es dürfen weder in der Implantatumgebung noch im restlichen Körper Entzündungs-, Immun- oder andere negative oder ungünstige Reaktionen ausgelöst werden. Kommt es zu einer Abwehrreaktion des Körpers, wird das Implantat vom Körper durch Bindegewebe vom restlichen Körper abgekapselt. Durch die Isolierung in der Bindegewebskapsel wird eine Osseointegration des Implantats in das benachbarte Knochengewebe verhindert, da das Bindegewebe eine Barriere für die Bildung von Gefäßen und dadurch auch für den notwendigen Sauerstoff- und Nährstofftransport darstellt. Ein Implantat darf auf keinen Fall eine Immunantwort des Körpers auslösen, es darf also keine Immunogenität aufweisen. Besonders wichtig für die Eignung als Implantatmaterial ist ebenfalls eine gute Osseointegration, durch die eine stabile Befestigung des Fremdmaterials im Knochen erreicht wird, welche später auch den Alltagsbelastungen des Patienten gewachsen sein muss.
Wenn sich einzelne Partikel vom Implantat lösen, dürfen diese ebenfalls keine der vorher genannten Reaktionen auslösen und sollten zudem entweder im Körper abbaubar oder sekretierbar sein, um eine permanente Anhäufung und Anlagerung im Körper oder eine aseptische Endoprothesenlockerung zu vermeiden. Potentielle Knochenmaterialien sollten daher eine zuverlässige Stärke, hohe Widerstandsfähigkeit, hohe Abriebfestigkeit, Korrosionsbeständigkeit, sowie eine dem Knochen ähnliche Steifheit besitzen. Letztgenanntes spielt im Speziellen im Kontext des sogenannten „stress shielding“ eine große Rolle. Der Knochen ist ein dynamisches System, welches je nach mechanischer Beanspruchung ab- oder aufgebaut wird. Wird nun ein Knochenimplantatmaterial eingesetzt, das eine im Vergleich zur Knochensubstanz höhere Steifheit besitzt, übernimmt dieses einen Großteil der mechanischen Belastung, wodurch der umgebende Knochen nach und nach abgebaut wird.
Ein weiteres Kriterium ist die sogenannte Biokompatibilität. Ein potentielles Implantatmaterial sollte entweder möglichst bioinert oder bioaktiv sein. Ein bioinertes Material verursacht keinerlei chemische oder biologische Reaktionen im Körper. Das Implantat ist deshalb biokompatibel und baut mit der Knochensubstanz bestenfalls eine formschlüssige Verbindung auf (Kontaktosteogenese). Somit ist nur die Übertragung von Druckbelastung zwischen Implantat und Knochen möglich, was jedoch für viele Anwendungen, wie die Substitution von Schädelknochen, bei Zahnimplantaten und bei Fixierungsstiften bei Knochenbrüchen, völlig ausreicht. Implantate hergestellt aus Titan, Aluminium, Cobalt, Chrom und Polyetheretherketon (PEEK) zählen zu diesem Materialtyp.
Ein bioaktives Material hingegen fördert ein schnelles Einwachsen des Implantats in das umgebende Gewebe und sorgt so für eine schnelle und langanhaltende Fixierung des Implantats im Körper. Dieser Effekt wird als sogenannte „Osseointegration“ bezeichnet. Bioaktive Materialien zeigen deshalb oft osteokonduktive und osteoinduktive Eigenschaften und weisen meistens eine hohe Hydrophilie auf. Häufig werden solche Materialien vom Körper resorbiert. Hydroxylapatit, Tricalciumphospat und einige Biogläser zählen zu den bioaktiven Materialien. Bioaktive Materialien können im Körper im schlechtesten Fall auch eine Immunreaktion auslösen. Diese Fähigkeit eines Biomaterials, die Zelladhäsion und -migration zu fördern ist entscheidend für die frühen Phasen der Wundheilung und die späteren Phasen der Knochenneubildung und hängt stark vom initialen Kontakt zwischen den Zellen und dem Implantatmaterial ab.
Deshalb wurden Knochenimplantatmaterialien im Stand der Technik durch verschiedene chemische oder physikalische Verfahren mit Hydroxylapatit oder Tricalciumphosphat beschichtet. Diese Calciumphosphate werden meist durch einfache chemische Verfahren mittels Präzipitation aus wässrigen Lösungen hergestellt. Das Aufbringen auf die Oberfläche des Implantatmaterials erfolgt dabei entweder direkt aus der Lösung auf die Oberfläche oder mittels physikalischer Methoden, wie „electrospray deposition“. Allerdings ist bei der Beschichtung von Materialien mit Apatit beispielsweise sowohl die geringe Adhäsion der Calciumphosphate auf dem Implantat nachteilig, als auch deren limitierter Zusammenhalt innerhalb der einzelnen Calciumphosphatlagen. Mit diesen Verfahren sollte eine dem Knochen möglichst ähnliche Struktur auf der Oberfläche generiert werden, um das Einheilen des Materials in den Knochen zu begünstigen. Hierbei wird allerdings außer Acht gelassen, dass der Knochen selbst ein stark hierarchisch aufgebautes Kompositmaterial ist, welches aus einer Matrix und einer Mineralphase besteht.
Einige Verfahren zur Beschichtung von Implantatmaterialien mit Kollagen wurden auf ihre in-vivo-Funktionalität untersucht. Häufig wurden hierbei kollagenbeschichtete Titanimplantate, wie Schrauben oder Nägel, in verschiedenen in-vivo-Systemen analysiert. Dabei wurde beispielsweise von positiven Effekten bezüglich des Einwachsens des Materials in den umgebenden Knochen sowie der Knochenneubildung berichtet. Allerdings finden sich im Stand der Technik widersprüchliche Ergebnisse bezüglich kollagenbeschichteter Titanimplantate. So konnte beispielsweise keine verbesserte Osseointegration von kollagenbeschichteten porösen Titanzylindern, welche in die Diaphyse von Schaftibiae implantiert wurden, festgestellt werden.
Ebenfalls wurde im Stand der Technik von Verfahren zur kovalenten oder nicht-kovalenten Immobilisierung diverser Proteine der extrazellulären Matrix, wie beispielsweise Fibronectin oder kurzen Peptiden, auf Oberflächen berichtet. Diese zeigten zum Teil in in-vitro-Testsystemen positive Effekte auf, wie Zelladhäsion und Proliferation.
Häufig wird Kollagen aus Kosten- und Handhabungsgründen durch dessen denaturierte Form Gelatine ersetzt. Die Herstellung der Gelatine geschieht üblicherweise durch physikalischen und chemischen Abbau oder thermische Denaturierung von nativem Kollagen. Im Gegensatz zu nativem Kollagen ist Gelatine bei einem physiologischen pH-Wert wasserlöslich und schmilzt bei einer Sol-Gel-Übergangstemperatur von 25 bis 30°C. Nach Abkühlen entstehen durchsichtige Gele. Im Stand der Technik wird ebenfalls die nicht-kovalente Aufbringung von Gelatine auf Oberflächen von arteriellen Implantatmaterialien berichtet. Ebenso wurde Gelatine kovalent an PEEK angekoppelt und mit Calciumphosphat mineralisiert, um so eine knochenähnliche Schicht zu bilden, die zu sehr guter Proliferation von Osteoblasten führte. Das Problem der Beschichtungen auf Basis von Gelatine ist, dass es sich bei Gelatine um ein tierisches Produkt handelt, welches eine Klasse III Zertifizierung nötig macht. Da Gelatine industriell aus Rinderknochen oder Schweinehaut gewonnen wird kann es aber religiöse Vorbehalte (Schwein) oder medizinische Vorbehalte (Rind, BSE) geben, die den Einsatz eines Gelatinebasierten Coatings beschränken können.
Auf dieser Grundlage liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Material für Knochenimplantate bereitzustellen, welches medizinisch unbedenklich, hochverträglich und vielseitig einsetzbar ist und zudem knochenähnliche Strukturen aufweist. Ferner soll ein entsprechendes Herstellungsverfahren bereitgestellt werden.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Merkmale der unabhängigen Ansprüche gelöst. Günstige Ausgestaltungen und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus den weiteren Ansprüchen und der Beschreibung.
Insbesondere betrifft ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Material für ein Knochenimplantat, umfassend:

(a) eine Trägerstruktur mit einer Oberfläche, die zumindest ein biokompatibles Material umfasst,
(b) eine kovalent an diese Oberfläche gebundene Matrix und
(c) in diese Matrix eingelagertes Calciumphosphat.

Es wird vorgeschlagen, dass die Matrix zumindest ein Polysaccharid aufweist.
Die Begriffe „Material für Knochenimplantate“ und „Knochenimplantatmaterial“ werden hierin synonym gebraucht. Das erfindungsgemäße Material für Knochenimplantate weist bioaktive Eigenschaften auf. Der hierin verwendete Begriff „bioaktiv“ bezeichnet die Eigenschaft des erfindungsgemäßen Materials für Knochenimplantate, ein schnelles Einwachsen in das umgebende Gewebe zu ermöglichen und so für eine schnelle und langanhaltende Fixierung des Implantats im Körper zu sorgen. Diese Eigenschaft ergibt sich aus den in den vorstehenden Unterpunkten (a) bis (c) definierten technischen Merkmalen in Kombination mit dem kennzeichnenden Teil.
Wenn in der Fachliteratur Knochenimplantate diskutiert werden, wird immer versucht, die Oberfläche des Implantates möglichst knochenähnlich zu gestalten. Dies kann im einfachsten Fall durch Plasmabeschichtung mit Hydroxyapatit geschehen. Es ist beispielsweise bekannt ein Gelatine/kollagenbasiertes kovalent angebundenes Coating einzusetzen, welches mit Calciumphosphat mineralisiert wird. Das ist die denkbar knochenähnlichste Beschichtung für Implantate. Damit kann man die Verbindung herstellen, die in der Biomineralisation (Knochen und Dentin in Zähnen) Kollagen bzw. Gelatine als abgebautes Kollagen eine Rolle für die Mineralisation spielt.
Polysaccharide hingegen werden im Zusammenhang mit der Biomineralisation von Calciumphosphat nicht diskutiert - wenn überhaupt nur als Glykoproteine. Polysaccharide spielen aber eine Rolle bei der Biomineralisation von Calciumcarbonat (Eierschalen - Keratansulfat, Coccolith Exoskelette etc.), aber selbst dort werden sie sehr wenig untersucht im Vergleich zu Proteinen, da Polysaccharide notorisch schwierig zu charakterisieren sind.
Der erfindungsgemäße Ansatz kann daher als Abkehr von bekannten Ansätzen angesehen werden. Es ist daher keinesfalls eine naheliegende Idee, beim Aufbau einer knochenähnlichen bioinspirierten Beschichtung für ein Implantat an Polysaccharide zu denken. Das naheliegende wäre, wie gesagt, Kollagen / Gelatine oder zumindest andere Proteine (hier insbesondere saure Proteine) zu verwenden. Es hat sich jedoch überraschenderweise gezeigt, dass Polysaccharide bei dieser Anwendung eine zielführende und vorteilhafte Alternative zu bekannten Substanzen, wie beispielsweise Kollagenen, darstellen.
In diesem Zusammenhang soll unter einer Trägerstruktur mindestens eine Materialschicht verstanden werden, welche aus dem biokompatiblen Material aufgebaut ist und welche mit der Matrix verbindbar ist bzw. kovalent verbunden werden kann. Die Trägerstruktur kann beispielsweise eine äußerste Schicht eines komplett aus dem biokompatiblen Material gefertigten, beispielsweise formgebende, Grundstruktur des Implantats sein. Oder sie kann auf eine Grundstruktur, gefertigt aus einem anderen Material, wie das biokompatible Material, aufgebracht werden. Ferner soll in diesem Zusammenhang unter biokompatibel, die Eigenschaft eines Materials oder Stoffs verstanden werden, in-vivo einsetzbar zu sein und hierbei wenige bis keine negativen Einflüsse auf den Patienten oder den Heilungsprozess zu haben oder ohne Folgeschäden einsetzbar zu sein.
Unter einer Matrix soll hier eine Struktur verstanden werden, die als Hauptbestandteil ein Polysaccharid aufweist, in das Calciumphosphat eingelagert ist. Hierbei kann das Polysaccharid jedes dem Fachmann für einsetzbar erachtete Polysaccharid sein. Ist das Polysaccharid ein tierisches Polysaccharid kann ein Stoff eingesetzt werden, dessen Eigenschaften hinlänglich bekannt und erprobt sind. Vorteilhafterweise ist das Polysaccharid ein pflanzliches Polysaccharid, wodurch ein veganer Stoff zum Einsatz kommen kann, der medizinisch unbedenklich ist. Generell ist es auch möglich „künstliche“ oder nicht in der Natur vorkommende Polysaccharide einzusetzen. Oder es ist möglich Mischungen an Polysacchariden zu verwenden. Diese können gezielt im Labor hergestellt werden. Solche Polysaccharide können durch ihre frei gestaltete Beschichtungschemie sehr flexibel ausgewählt und eingesetzt werden.
In einer bevorzugten Ausgestaltung ist das Polysaccharid ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus Alginsäure, Alginat, Hyaluronsäure, Hyaluronat, Pektin, Carrageenan, Agarose, Amylose und Chitosan. Hierdurch können viele verschiedene Stoffe zum Einsatz kommen, die individuell, bedingt durch ihre speziellen Eigenschaften, ausgewählt werden können.
Hyaluronsäure (Hya) ist ein lineares Polysaccharid, das aus Disaccharid-Wiederholeinheiten aufgebaut ist. Diese setzen sich aus D-Glucuronsäure und N-Acetyl-Glucosamin zusammen, die über β-1,4 und β-1,3 glycosidische Bindungen verknüpft sind (siehe unten).
In physiologischer Umgebung liegen die Carboxylgruppen der Hyaluronsäure zum großen Teil als Natriumsalz vor, sie ist somit negativ geladen und immobilisiert eine Vielzahl von Wassermolekülen, bereits bei sehr geringen Konzentrationen ist eine wässrige Lösung deshalb sehr viskos. Hya wird in der Medizin- und Gesundheitsindustrie vielseitig eingesetzt. Da Hyaluronsäure als weitreichend biokompatibel und sicher gilt, ergeben sich sehr viele Einsatzgebiete. Dies macht sie auch sehr interessant als Ausgangsmaterial für die Oberflächenbeschichtung von Knochenimplantaten.
In der Vergangenheit wurde Hyaluronsäure hauptsächlich aus Hühnerkämmen, die bei der Nahrungsmittelproduktion als Abfall anfallen, extrahiert. Inzwischen erfolgt die Produktion jedoch biotechnologisch durch Kultivierung gentechnisch veränderter Streptokokken-Bakterien, wodurch das Risiko für die Kontamination mit tierischen Pathogenen entfällt.
Bei der Alginsäure handelt es sich um ein Copolymer aus den beiden Uronsäuren D-Mannuronsäure (M) und L-Guluronsäure (G). Alginsäure kann aus Pflanzen, bzw. Algen gewonnen werden, weshalb ihre Zusammensetzung und die Sequenzverteilung der Zuckereinheiten stark vom Herkunftsort der Pflanze/Alge und deren Spezies abhängt. Die G und M sind jeweils über β-1,4 glycosidische Bindungen verknüpft. Die guten Geliereigenschaften verdankt Alginsäure den G-Blöcken, die die Calciumionen komplexieren. Da die Alginsäure aus natürlichen Quellen stammt, muss sichergestellt werden, dass potentielle Verunreinigungen, wie Schwermetalle, Endotoxine, Proteine, etc. entfernt wurden, sonst können durchaus Immunreaktionen auftreten. Sofern sie ausreichend aufgereinigt wurde, verursacht Alginsäure, wie auch Hyaluronsäure, keine Immun- oder Entzündungsreaktion im Körper, hat also eine gute Biokompatibilität.
Im Gegensatz zu Hyaluronsäure ist Alginsäure im menschlichen Körper nicht abbaubar, da keine Alginase vorhanden ist. Wegen der guten Biokompatibilität wird Alginsäure in zahlreichen biomedizinischen Anwendungen eingesetzt, beispielsweise in Wundauflagen und kommt, wenn RGD-Peptid-modifiziert, auch in Betracht als Knochenimplantatmaterial verwendet zu werden. Wird Alginsäure in Kombination mit Hydroxylapatit verwendet, kann die Bildung von Knochengewebe zusätzlich angeregt werden.
Ferner können langkettige Polysaccharide, aber auch verzweigte Polysaccharide, wie beispielsweise Stärke, eingesetzt werden. Somit hat die Matrix eine eher drei-dimensionale Struktur, die der Zielknochenstruktur ähnlich ist, wodurch die Mineralisierung erleichtert werden kann.
Eine Möglichkeit, der Beschichtung / Oberflächenveredelung zusätzlich zur Knochen-identischen Mineralisierung(sfähigkeit) keimabweisende Eigenschaften hinzuzufügen, ist der Einsatz von Chitosan, einem linearen Biopolymer auf Polysaccharidbasis: Mit Chitosan kann auch die hämostatische Wirksamkeit und die antimikrobiellen Eigenschaften des Materials genutzt werden. Chitosan werden folgende Materialeigenschaften ebenfalls zugesprochen nicht-allergen, nicht-toxisch, wundheilend, antibakteriell, blutstillend, bakteriostatisch, fungizide Wirkung, (biologisch abbaubar) und anti-mikrobiell.
Bindet man über die in den meisten Polysacchariden vorhandene Hydroxylgruppe in 6-er Stellung das Polysaccharid über eine Esterbindung an das Implantat an mit Linkern, wie Bernsteinsäureanhydrid, oder direkt an polyacrylsäurebeschichtetes PEEK über Esterbindung (gegebenenfalls mit Aktivierungschemie über 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC) oder ähnliche), dann steht das gesamte Repertoire an Polysacchariden für die kovalente Bindung an das Implantat zur Verfügung. Damit ergibt sich die Möglichkeit auch Mischungen von Polysacchariden oder von Polysacchariden mit synthetischen Polymeren zu verwenden. Damit wird eine völlig freie Komposition der Beschichtung verfügbar. Diese kann von negativ geladenen Polysacchariden, wie Hyaluronsäure, über neutrale, wie Amylose, bis zu positiv geladenen, wie Chitosan, reichen. Damit kann das komplette Spektrum an Ladungsdichten von neutral bis zu stark negativ oder positiv abgedeckt werden. Dies hat natürlich auch Einfluss auf die Struktur der kovalent an das Implantat angebundenen Beschichtung sowie die Mineralisierung des Calciumphosphats. Die Mischung der angebundenen Polymere kann dabei stufenlos variiert werden und somit auch die Eigenschaftsprofile.
Weiterhin kann bei derartigen Mischungen auch die Struktur des Coatings gezielt eingestellt werden, da beispielsweise lineare mit verzweigten Polysacchariden kombiniert werden können. Beispielsweise kann das verzweigte Amylopektin aus pflanzlicher Stärke mit der linearen Amylose kombiniert werden. Chemisch sind beide Moleküle identisch, aber nicht strukturell.
Ein vielversprechendes Paar für chemisch unterschiedliche Polysaccharide wäre beispielsweise die neutrale Amylose mit dem negativ geladenen Alginat zu koppeln, welches zusätzlich noch über Zugabe von Ca²⁺ Ionen quervernetzt werden kann. Über diese Quervernetzung können dann nachträglich auch noch weitere Schichten Alginat angebunden werden über einfache Imprägnierung der Schicht mit Ca²⁺, Waschen und Aufbringen der nächsten Alginatschicht (Layer by Layer Assembly, LBL). Eine extreme Kombination wäre die negative Alginsäure mit dem positiven Chitosan. Diese ionisch stabilisierten „Layer by Layer Assemblies“ können durch geeignete Vernetzungschemie kovalent verbunden werden (mittels EDC o.ä.). Dazwischen sind stufenlos alle Kombinationen von Polysacchariden über eine gemeinsame chemische Anbindung über Esterbindungen verfügbar.
Zudem kann es vorteilhaft sein, wenn das Polysaccharid ein chemisch modifiziertes Polysaccharid ist. Hierbei soll chemisch modifiziert bedeuten, dass am Polysaccharid künstliche, laborchemische Veränderung eines Zuckers des Polysaccharids beispielsweise an einer freien Gruppe, z.B. Hydroxyl-, Aldehyd oder Säuregruppe, vorgenommen wurden. Hierüber kann das Einsatzspektrum erweitert werden. Beispielsweise können inaktive Gruppen gezielt in aktive Gruppen „umgewandelt werden“ oder es kann eine unerwünschte Eigenschaft eliminiert werden. Hierbei kann beispielsweise eine Behandlung mit Hexamethylendiamin (HMDA) oder Adipinsäuredihydrazid (ADH) erfolgen oder eine Deacetylierung. HMDA und ADH sind beides Diamid Linker. Da ADH eine geringere Basizität als HMDA zeigt, ist die Kupplung bereits im sauren pH-Bereich von 4,8 möglich. Beide Linker adressieren also eine Kupplungschemie in verschiedenen pH Bereichen. Je nach der Anforderung für die Anbindung des Polysaccharids kann also ein verschiedener Linker nötig sein. Bei einer Deacetylierung kann das Polysaccharid hydrolyseresistent gemacht werden.
Besteht das biokompatible Material lediglich aus einer oder wenigen Schichten kann das erfindungsgemäße Material für Knochenimplantate auf feste Materialien oder Körper (Grundstruktur) aufgebracht werden, welche als Knochenimplantat Verwendung finden. Diese Körper können jede beliebige gewünschte oder erforderliche dreidimensionale Gestalt aufweisen. Bevorzugt umfasst die gesamte Oberfläche des erfindungsgemäßen Materials für Knochenimplantate das im vorstehenden Unterpunkt (a) definierte Material oder besteht aus diesem. Geeignete Materialien, auf welche das erfindungsgemäße Material aufgebracht werden kann, können hierbei aus im Stand der Technik bekannten Keramikmaterialien, Metallen, Polymeren, Kompositmaterialien oder Kombinationen davon ausgewählt sein. Dies wären beispielsweise als Metalle: Titan / Stainless Steel, als Keramiken: Zirkon(-dioxid), als Polymer: Polyetherketon (PEK) und die gesamte PEK-Familie, insbesondere jedoch: Polyetheretherketon (PEEK), Polyetherketonketon (PEKK), Polyetherketonetherketonketon (PEKEKK); Carbon-Fiber-Reinforced PEEK (CFR-PEEK), PEEK-COMPOSITE, Glasfaserverstärkte Polymere, Polyethylen (PE), Ultra-High-Molecular-Weight Polyethylen (UHMWPE), Polyorthoester, Polymethylmethacrylat (PMMA), Polyethylenterephthalat(PET) oder Polyamide(PA). In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Material PEEK. Dieses Material ist mechanisch nativem Knochenmaterial sehr ähnlich und so als Knochenimplantatmaterial gut geeignet.
Polyetheretherketon (PEEK) mit folgendem Strukturausschnitt
ist ein sehr weit verbreiteter thermoplastischer High-Performance Kunststoff. Der semikristalline Kunststoff ist wegen seiner hohen Lösungsmittelbeständigkeit, dem hohen Schmelzpunkt von 343 °C und dem hohen Glasübergangspunkt von ca. 143 °C sehr beliebt für Anwendungen bei höheren Temperaturen.
Seit 1998 ist PEEK in implantierbarer Qualität auf dem Markt verfügbar. Seitdem hat sich der Marktanteil von PEEK als Implantatmaterial stark erhöht. PEEK wird in der Medizintechnik vielseitig als Knochenersatzmaterial und Implantat eingesetzt, beispielsweise als Fusion-Cage zur Wirbelsäulenversteifung bei Bandscheibenverletzungen. Da PEEK für Röntgenstrahlung durchlässig ist und auch nicht mit Magnetfeldern wechselwirkt, lässt sich der Patient nach einer Operation problemlos mit bildgebenden Verfahren beobachten, um den Heilungsprozess im betroffenen Areal zu verfolgen. Die guten mechanischen Eigenschaften von PEEK, die denen der Kortikalis (Cortical Bone) sehr ähnlich sind, qualifizieren PEEK als ein gut geeignetes Material für den Einsatz als Knochenersatzmaterial und Implantate.
PEEK zählt zu den Materialien die sich fast komplett bioinert verhalten, also keine spezifische Interaktion mit dem Körper eingehen. PEEK wird vom Körper weder abgestoßen noch gut in den Knochen integriert, es kommt deshalb im Idealfall zu einem guten Kontakt des Knochens mit dem Implantat. Teilweise kommt es zur Gewebeeinkapselung, wodurch die mechanische Stabilität verringert wird und es zum Verlust des Implantats kommen kann. Damit PEEK besser in den Knochen integriert wird, sind einige Methoden entwickelt worden, um eine Bioaktivität des Materials zu erreichen, wie beispielsweise die Beschichtung mit Calciumphosphat und auch die Zugabe von Hydroxylapatit-Partikeln in das Polymer. Andere Methoden der Oberflächenmodifikation von PEEK sind möglich und sind beispielsweise wie in den folgenden Abschnitten beschrieben.
Um die Oberflächeneigenschaften eines Knochenimplantates dahingehend zu verbessern, dass es vom Körper besser akzeptiert wird, ist es möglich, sie nach der Herstellung des Implantats zu modifizieren. Oberflächenmodifikationen können physikalischer, wie beispielsweise die Beschichtung mit Hydroxylapatit (HA) und Titan, oder chemischer Natur sein.
Um ein Kunststoffsubstrat, wie PEEK, chemisch zu modifizieren gibt es prinzipiell zwei Möglichkeiten. Die eine Methode ist die direkte Reaktion mit kleinen Molekülen oder eine Plasmabehandlung um die Oberflächeneigenschaften zu verändern und um beispielsweise Linkermoleküle einzuführen, an denen man weitere Reaktionen durchführen kann. Die Konzentration der Linkermoleküle pro Fläche ist hierbei natürlich sehr klein, da die Oberfläche einer makroskopischen PEEK-Folie glatt ist und nur das Material direkt an der Oberfläche zugänglich ist. Bei Polymersubstraten, die in der Festphasensynthese eingesetzt werden, verhält sich dies anders. Diese verfügen über ein gutes Quellverhalten in geeigneten Lösungsmitteln, wodurch im kompletten Volumen des Polymerkörpers Linker eingeführt werden können. Dieses Verhalten ist natürlich bei Kunstoffen, wie PEEK, für Knochenimplantate nicht gewünscht, da sich die Modifikation nur auf die Oberfläche beschränken soll, um die Volumeneigenschaften, wie Härte oder mechanische Stabilität, nicht zu beeinträchtigen.
Um dennoch viele funktionelle Gruppen an der Oberfläche einzuführen, kann das Polymersubstrat mit einem funktionellen Polymer beschichtet werden. Dabei wird in Abhängigkeit des Molekulargewichts des eingeführten Polymers, im Vergleich zur Modifikation mit kleinen Molekülen, ein Vielfaches an funktionellen Gruppen eingeführt.
Zwei Methoden werden hierbei unterschieden. Man spricht von der Grafting-from Methode wenn von der Oberfläche des Substrats aus eine Polymerkette initiiert wird und zunehmend wächst. Bei dieser Variante muss das Substrat dazu in der Lage sein z.B. als Initiatorradikal einer radikalischen Polymerisation zu fungieren, bzw. muss man es über ein Aktivatorreagenz dazu bringen können. Bei der Grafting-from Strategie erreicht man eine höhere Funktionalisierungsdichte, da die Polymerketten sukzessive wachsen und nicht als fertiges Polymer aufgebracht werden. Der umgekehrte Ansatz, das Grafting-to, geht von einem fertigen Polymer aus, das mit einem geeigneten Mechanismus an die Oberfläche aufgepfropft wird. Ein Nachteil dieser Methode ist, dass beim Aufpfropfen fertiger Polymere, benachbarte potentielle Bindungsstellen durch die Makromoleküle stark blockiert werden, dies geschieht beim Grafting-from Ansatz nicht. Eine Kontrolle über die Polymer-Länge und Molekulargewichtsverteilung der aufgebrachten Polymere ist wiederrum nur beim grafting-to Ansatz zu erreichen.
Die direkte Modifikation mit kleinen Molekülen bzw. die Reduktion der Oberflächen-Carbonylgruppen des PEEK ist durch Reduktion mittels Natriumborhydrid in Dimethylsulfoxid (DMSO) bei 120 °C und Ankuppeln von primären Aminen möglich (siehe unten und C. Henneuse; B. Goret; J. Marchand-Brynaert, Polymer 1998, 39, 835-844 und C. Henneuse-Boxus; E. Duliere; J. Marchand-Brynaert, European Polymer Journal 2001, 37, 9-18).
Es ist bekannt an die reduzierte PEEK-Oberfläche verschiedene Moleküle, unter anderem Gelatine, zu kuppeln, wodurch die Hydrophilie erhöht und eine höhere Akzeptanz knochenbildender Zellen erreicht werden konnte. Der Kontaktwinkel der beschichteten Substrate nahm ebenfalls signifikant ab, wodurch die Hydrophilie der Oberfläche und somit die Akzeptanz für knochenbildende Zellen gesteigert werden konnte (siehe J. Knaus, Master Thesis 2013 Universität Konstanz und H. Cölfen; L. F. Tian; J. Knaus, 2016).
Als Grafting-from Ansatz kann beispielsweise eine oberflächeninduzierte Polymerisation in Betracht kommen. Durch Oberflächenmodifikation mittels kleiner Moleküle lassen sich bei einer Vielzahl organischer Polymere Linker einführen, wodurch weitere Modifikationen an der Oberfläche durchgeführt werden können. Es ist beispielsweise gelungen auf der Oberfläche von PEEK mittels nasschemischer Modifikation OH Gruppen einzuführen an die mittels Acrylsäurederivaten wiederum ATRP Initiatoren angekuppelt wurden (siehe B. Yameen; M. Alvarez; O. Azzaroni; U. Jonas; W. Knoll, Langmuir 2009, 25, 6214-6220).
Ferner kommt eine UV-indizierte Polymerisation (UV: Ultraviolett) in Betracht. Anstatt einen Radikalstarter oder andere Initiatoren auf die Oberfläche aufzubringen ist es je nach Substrat möglich, Radikale direkt auf der Oberfläche zu erzeugen. Dies lässt sich z.B. durch Hilfsreagenzien, wie Benzophenon (BP), Benzoylbenzoesäure oder andere Photoinitiatoren, erreichen, die bei UV Anregung Wasserstoffatome von geeigneten Polymeren abstrahieren und dadurch Radikale auf der Polymeroberfläche erzeugen, die einen Kettenstart initiieren können. Polymere, wie PET, bilden nach Argonplasma-Behandlung an Luft Hydroxyl- und Peroxidgruppen an der Oberfläche aus. Diese können unter Anregung mit UV Licht ebenfalls als Radikalstarter dienen. Mit Polyethylen wurde dies unter ähnlichen Bedingungen ebenfalls durchgeführt.
Für den Photoinitiator BP ist bekannt, dass er unter UV-Einwirkung eine Photopinakolreaktion eingeht. Dies resultiert in der Bildung eines Semibenzopinakolradikals, welches als Initiator in Polymerisationen dienen kann. Durch photoinduzierte Spaltung können aus dem angeregten Molekül ebenfalls Radikale entstehen, die Polymerisationen starten. Das Polymer Polyetheretherketon (PEEK) besitzt im Polymerrückgrat BP Einheiten, die sich ähnlich verhalten (siehe auch M. Kyomoto; K. Ishihara, Acs Applied Materials & Interfaces 2009, 1, 537-542). So wurde 2009 von Kyomoto nachgewiesen, dass sich die Oberfläche von unbehandeltem PEEK unter UV Einwirkung dazu eignet, radikalische Polymerisationen verschiedener Acrylsäurederivate zu initiieren. Hierbei handelt es sich, um einen gemischten Grafting-from und Grafting-to Mechanismus, da sowohl wachsende Polymerketten an der Oberfläche gestartet werden, als auch wachsende Polymerketten in Lösung an der Oberfläche terminieren. Auf seiner Arbeit aufbauend, führten weitere Gruppen selbstinitiierende Polymerisationen unter UV Anregung durch, unter anderem mit Acrylsäure. Der direkte Nachweis der Ketylradikale gelang Kyomoto 2013 durch in-situ ESR Spektroskopie.
Die kovalent gebundene Matrix weist typischerweise eine Schichtdicke von 100 bis 150 Nanometer (nm) auf, kann aber auch dicker sein oder dünner sein. Insbesondere kann die kovalent gebundene Matrix eine Schichtdicke von 1 nm bis 10 Mikrometer (µm), bevorzugt von 10 nm bis 1 µm, mehr bevorzugt von 20 nm bis 500 nm, mehr bevorzugt von 30 nm bis 300 nm, mehr bevorzugt von 50 nm bis 200 nm und am meisten bevorzugt von 100 bis 150 nm aufweisen. Weiter bedeckt die kovalent gebundene Matrix bevorzugt die gesamte Oberfläche des erfindungsgemäßen Materials für Knochenimplantate.
Eine interessante Variante der Grafting-to Methode ist das Einfangen von wachsenden radikalischen Polymerketten durch immobilisierte Radikalfänger auf der Oberfläche des Substrats (siehe auch P. Yang; J. Y. Xie; J. Yuan; L. Zhang; W. N. Liu; W. T. Yang, Journal of Polymer Science Part a-Polymer Chemistry 2007, 45, 745-755). Von Yang et al. wurde gezeigt, dass es möglich ist den Polymerisationsinhibitor Hydrochinon zu nutzen um Polymere nach dem Grafting-to Ansatz auf ein Substrat aufzubringen.
Dabei wurde ein Hydrochinon-Derivat an die Oberfläche gekuppelt und eine normale radikalische Polymerisation mit einem thermischen Radikalinitiator durchgeführt. Das immobilisierte Hydrochinon quenched die wachsende Polymerkette durch homolytische Spaltung der OH Bindung, es kommt zum Kettenabbruch. Das langlebige Aryloxylradikal ist nicht in der Lage eine radikalische Polymerisation mit den vorhandenen Monomeren zu starten, kann aber mit einem wachsenden Polymerradikal rekombinieren und somit das Polymer an der Oberfläche einfangen.
Schließlich umfasst das erfindungsgemäße Material für Knochenimplantate in die genannte Matrix eingelagertes Calciumphosphat, bevorzugt Calciumorthophosphat in allen mineralischen Formen, besonders bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus amorphem Calciumorthophosphat (ACP), Dicalciumphophat-Dihydrat (DCPD; Brushit), Octacalciumphosphat und Hydroxylapatit, auch mit partieller Fluorid-, Chlorid- oder Carbonatsubstitution, wobei ACP, Hydroxylapatit und Octacalciumphosphat besonders bevorzugt sind. Verfahren zum Einlagern der genannten Calciumphosphate in eine entsprechende Matrix sind nachfolgend beschrieben.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Polysaccharid über einen Linker an das biokompatible Material gebunden, wobei der Linker ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus: einem Diamin-Linker oder Diamin Linker in Kombination mit einem Bernsteinsäurelinker oder einem (UV-gegrafteten) Polyacrylsäure-Linker. Entsprechende Linker sind im Stand der Technik bekannt. Verfahren für die kovalente Bindung von Polysacchariden an beispielsweise PEEK sind nachfolgend beschrieben.
In anderen Ausführungsformen umfasst das erfindungsgemäße Material für Knochenimplantate oxidische Keramikmaterialien, Titan, Polymermaterialien oder Kompositmaterialien, oder besteht aus diesen, wobei das Polysaccharid der kovalent gebundenen Matrix bei Titan oder oxidischen Keramikmaterialien über einen Silanlinker gebunden ist. Geeignete Silanlinker und entsprechende Verfahren zur Bindung von Polysacchariden sind im Stand der Technik bekannt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Material für Knochenimplantate, umfassend:

(a) das biokompatibles Material PEEK ist,
(b) das Polysaccharid Alginsäure ist und
(c) das in diese Matrix eingelagerte Calciumphosphat Hydroxylapatit, insbesondere kristallines Hydroxylapatit ist.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Materials für Knochenimplantate, umfassend die Schritte:

(a) Bereitstellen einer Trägerstruktur mit einer Oberfläche, umfassend ein biokompatibles Material,
(b) kovalentes Ankoppeln einer Matrix, umfassend zumindest ein Polysaccharid, an diese Oberfläche, und
(c) Mineralisieren der Matrix mit Calciumphosphat.

Für diesen Gegenstand der vorliegenden Erfindung gelten alle relevanten Definitionen, Vorteile und bevorzugten Ausführungsformen, die vorstehend für das erfindungsgemäße Material für ein Knochenimplantat aufgeführt wurden, in analoger Weise.
Verfahren zur kovalenten Ankupplung einer Polysaccharid umfassenden Matrix an eine Oberfläche gemäß Schritt (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens unterliegen keinen besonderen Beschränkungen und sind im Stand der Technik bekannt.
In einer bevorzugten Ausführungsform, insbesondere wenn die Oberfläche PEEK umfasst oder aus diesem besteht, umfasst Schritt (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens die Schritte: (b1) kovalentes Ankoppeln eines Linkermoleküls, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Diamin-Linker oder einem Diamin Linker und einem Bernsteinsäure-Linker oder UV-gegrafteter Polyacrylsäure (PAA), an diese aktivierte Oberfläche, und (b2) kovalentes Ankoppeln des Polysaccharids mit Carbonsäuregruppen an das Diamin Linkermolekül oder des Hexamethylendiamin modifizierten Polysaccharids an den Bernsteinsäure Linker oder des unmodifizierten Polysaccharids über Esterbindungen an den Polyacrysäure-Linker.
Verfahren zur Ankupplung von Linkermolekülen an eine entsprechend aktivierte PEEK-Oberfläche unterliegen ebenfalls keinen besonderen Beschränkungen.
Verfahren zum Mineralisieren einer Polysaccharid enthaltenden Matrix mit Calciumphosphaten gemäß Schritt (c) des erfindungsgemäßen Verfahrens unterliegen keinen besonderen Beschränkungen. Sie umfassen für den Fall, dass amorphes Calciumphosphat (ACP) verwendet wird, beispielsweise das Inkubieren der Oberfläche mit einer Lösung, umfassend Calciumchlorid, Dikaliumhydrogenphosphat und einen Nukleationsinhibitor. Dieser Nukleationsinhibitor ist bevorzugt ein nicht-kollagenes Protein oder Proteinanalogon, besonders bevorzugt poly-Asparaginsäure und/oder Fetuin. Für den Fall, dass Hydroxylapatit verwendet wird, umfassen Sie beispielsweise das Inkubieren der Oberfläche mit einer Lösung, umfassend Calciumchlorid und Dikaliumhydrogenphosphat.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Knochenimplantat auf das das erfindungsgemäße Knochenimplantatmaterial aufgebracht ist.
Für diesen Gegenstand der vorliegenden Erfindung gelten alle relevanten Definitionen, Vorteile und bevorzugten Ausführungsformen, die vorstehend für das erfindungsgemäße Material für Knochenimplantate aufgeführt wurden, in analoger Weise.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung des erfindungsgemäßen Materials für ein Knochenimplantat als Knochenimplantatmaterial. Für diesen Gegenstand der vorliegenden Erfindung gelten alle relevanten Definitionen, Vorteile und bevorzugten Ausführungsformen, die vorstehend für das erfindungsgemäße Material für Knochenimplantate aufgeführt wurden, in analoger Weise.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung des erfindungsgemäßen Materials für ein Knochenimplantat beispielsweise zur Behandlung von Knochenschäden.
Auch für diesen Gegenstand der vorliegenden Erfindung gelten alle relevanten Definitionen, Vorteile und bevorzugten Ausführungsformen, die vorstehend für das erfindungsgemäße Material für Knochenimplantate aufgeführt wurden, in analoger Weise.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung des erfindungsgemäßen Knochenimplantats beispielsweise zur Behandlung von Knochenschäden.
Auch für diesen Gegenstand der vorliegenden Erfindung gelten alle relevanten Definitionen, Vorteile und bevorzugten Ausführungsformen, die vorstehend für das erfindungsgemäße Material für Knochenimplantate aufgeführt wurden, in analoger Weise.
Implantate wachsen in den menschlichen Körper umso besser ein, und werden umso stabiler mit dem Körper verbunden (unter anderem durch vermehrte Anlagerung von Körperzellen), je besser die Implantatoberfläche dem natürlichen Knochen entspricht. Dies ist das Ziel der vorliegenden Erfindung. Weiter soll die Beschichtung kovalent an die Oberfläche der Implantate gebunden werden. Die erfindungsgemäßen Knochenimplantatmaterialien weisen eine höhere Biokompatibilität, bessere Einheilung in den natürlichen Knochen und eine erhöhte mechanische Belastbarkeit auf.
Die Oberflächenmodifikation gemäß der vorliegenden Erfindung zielt darauf ab, knochenähnliche Strukturen kovalent gebunden auf die Oberfläche von Knochenimplantatmaterialien aufzubringen, welche eine organische Polysaccharidmatrix und die Mineralphase des natürlichen Knochens beinhalten. Dies soll die Einheilung des Implantats in den Knochen unterstützen. Diese Strukturen beinhalten eine Matrix aus einem Polysaccharid, welche schließlich mit Calciumphosphat mineralisiert wird. Die Mineralisation erfolgt hierbei mit Hilfe von nicht-kollagenen Proteinen und deren Analoga, welche als Nukleationsinhibitoren fungieren, so dass die Mineralisation kontrolliert verläuft und eine ektopische Mineralisation vermieden wird. Solche Nukleationsinhibitoren sind beispielsweise poly-Asparaginsäure oder Fetuin. Die Mineralisation mit Octacalciumphosphat oder Hydroxylapatit erfolgt durch das Inkubieren der Polysaccharidmatrix in einer Lösung, welche Calciumionen oder Phosphationen beinhaltet. Durch eine langsame und kontrollierte Zugabe einer Lösung der jeweils komplementären Phosphationen oder Calciumionen kann Octacalciumphosphat und/oder Hydroxylapatit innerhalb der Polysaccharidmatrix ausgefällt werden. Durch die relativ ungeordnete Struktur des Polysaccharids besitzt die resultierende Oberflächenmodifikation geflechtknochenartige oder kallusartige Struktur. Die Knochenzellen könnten so bei der Einheilung des Materials weitere ungeordnete Kollagenstrukturen um das Material herum aufbauen bzw. das Material direkt weiter mit dem Knochen verknüpfen. Diese ungeordneten Strukturen können dann schließlich in der natürlichen Remodellierungsphase der Knochenwundheilung zu geordneten Knochenstrukturen umgebaut werden. Hierbei können die Zellen durch die kovalente Anbindung der Polysaccharide bei der Remodellierung allerdings nicht bis zur direkten Oberfläche des Implantatmaterials vordringen und verbleiben so immer in einer gewünschten Matrix aus extrazellulären Proteinen. Das Implantatmaterial wird damit für die Zellen maskiert, um bei der Einheilung von Implantaten unerwünschte Reaktionen zu vermeiden. Da die Modifikationen lediglich die Oberfläche der Implantatmaterialien betrifft, werden Materialeigenschaften nicht verändert.
Die grundlegenden chemischen Reaktionen können leicht für die Modifikation verschiedener Materialien adaptiert werden. So können Metalloxidoberflächen kovalent über etablierte Silanchemie angebunden werden. Dies macht die erfindungsgemäße Oberflächenbeschichtung auch interessant für oxidische Keramikmaterialien. Da weiterhin Metalle beispielsweise durch Plasmabehandlung unschwer an der Oberfläche oxidierbar sind, werden über die Silanchemie auch die gängigen Implantatmaterialien aus Titan der erfindungsgemäßen Oberflächenmodifizierung über Silane zugänglich.
In den vergangenen Jahren wurden viele verschiedene Materialien für die Verwendung als Knochenimplantate entwickelt. Die biologischen, chemischen, wie auch mechanischen Anforderungen für Implantatmaterialien müssen in einem Material vereint werden, um den Eigenschaften des Knochens möglichst nah zu kommen. Die Vielfalt an zugelassenen Materialien spiegelt die großen Anstrengungen in diesem Feld wider. Der Kunststoff Polyetheretherketon (PEEK) hat beispielsweise sehr gute mechanische Eigenschaften die vergleichbar mit natürlichem Knochen sind. Die Nachteile liegen mit der hohen Hydrophobie und damit geringer Bioaktivität aber auf der Hand, weshalb es zahlreiche Bestrebungen gibt, diese Problematik anzugehen.
Es wurde eine Methode entwickelt, in welcher die Gelatinefunktionalisierung des Knochenimplantatkunststoffs PEEK etabliert wurde. In der vorliegenden Erfindung wurde nun eine Methode entwickelt, um an der Oberfläche von PEEK ein Netzwerk aus Polysacchariden aus pflanzlichem oder bakteriellem Ursprung, im Konkreten Hyaluronsäure-, Alginsäurederivate und vollsynthetische Polymere kovalent zu binden, um die Probleme, welche ein Coating auf tierischer Basis hat, wie beispielsweise der Nachweis von Keimfreiheit und der langwierige Zulassungsprozess aufgrund des potentiellen Endotoxingehalts und des Allergenpotentials, zu umgehen. Einige Patienten entscheiden sich aus persönlichen Gründen gegen bestimmte tierische Produkte, sei es aus religiösen oder aus ethischen Gründen. Vegane, bzw. synthetische Funktionalisierungen könnten für diesen Personenkreis interessante Alternativen sein. Um der chemischen Struktur natürlichen Knochenmaterials möglichst nahe zu kommen kann abschließend die aufgebrachte Beschichtung mit Calciumphosphat, im speziellen Hydroxylapatit, mineralisiert werden.
Die bisher gegebene Beschreibung vorteilhafter Ausgestaltungen der Erfindung enthält zahlreiche Merkmale, die in einigen abhängigen Ansprüchen zu mehreren zusammengefasst wiedergegeben sind. Diese Merkmale können jedoch zweckmäßigerweise auch einzeln betrachtet und zu sinnvollen weiteren Kombinationen zusammenfasst werden, insbesondere bei Rückbezügen von Ansprüchen, so dass ein einzelnes Merkmal eines abhängigen Anspruchs mit einem einzelnen, mehreren oder allen Merkmalen eines anderen abhängigen Anspruchs kombinierbar ist. Außerdem sind diese Merkmale jeweils einzeln und in beliebiger geeigneter Kombination sowohl mit dem erfindungsgemäßen Verfahren als auch mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung gemäß den unabhängigen Ansprüchen kombinierbar. So sind Verfahrensmerkmale auch als Eigenschaft der entsprechenden Vorrichtungseinheit gegenständlich formuliert zu sehen und funktionale Vorrichtungsmerkmale auch als entsprechende Verfahrensmerkmale.
Die oben beschriebenen Eigenschaften, Merkmale und Vorteile dieser Erfindung, sowie die Art und Weise, wie diese erreicht werden, werden klarer und deutlicher verständlich im Zusammenhang mit der folgenden Beschreibung der Ausführungsbeispiele, die im Zusammenhang in der folgenden Beschreibung genannten Beispiele beschränken die Erfindung nicht auf die darin angegebene Kombination von Merkmalen, auch nicht in Bezug auf funktionale Merkmale. Außerdem können dazu geeignete Merkmale eines jeden Ausführungsbeispiels auch explizit isoliert betrachtet, aus einem Ausführungsbeispiel entfernt, in ein anderes Ausführungsbeispiel zu dessen Ergänzung eingebracht und/oder mit einem beliebigen der Ansprüche kombiniert werden.
Die im folgenden Text genannten und verwendeten Methoden (ATR-IR Analyse, Rasterelektronenmikroskopie, Konfokale Laser-Scanning Mikroskopie, Fluoreszenzspektrometrie, NMR-Messungen, Thermogravimetrische Analyse (TGA), UV-Untersuchungen, Kontaktwinkelmessung, Kernspinresonenzspektroskopie wurden nach dem Fachmann bekannten Prinzipien und Vorgehensweisen sowie mit bekannten Geräten durchgeführt.
Es ist möglich über eine nasschemische Modifikation der PEEK-Oberfläche, die Reduktion der Carbonylgruppen im PEEK-Grundgerüst durch Behandlung der Folie mit NaBH₄ in DMSO bei 120 °C zu erreichen:
Die Reaktion kann ohne Sauerstoffausschluss unter Rühren in einem 500 Milliliter (mL) Kolben durchgeführt werden. 10 PEEK-Plättchen (je 1 cm² (Quadratzentimeter)) wurden in 20 Milliliter (mL) DMSO gegeben und gerührt. Es wurde auf 120°C erhitzt und nach 20 min wurden 13mmol (490 mg) NaBH₄ zugegeben. Die Reaktionszeit betrug 4 h 30 min. Das PEEK wurde 15 min in 20 mL MeOH, 10 min in 20 ml H₂O und 35 min in 20 mL 1 M HCl gewaschen. Nach Abspülen in EtOH wurde das PEEK im Vakuumtrockenofen für 2 h bei 40°C und 50 mbar getrocknet. Die Reaktion wurde anhand eines ATR-IR-Spektrums verifiziert (ATR-IR: ν 3400 cm^-1 (m) (cm^-1: Wellenzahl), starke Abschwächung der 1647 cm^-1 (w) C=O Valenzschwingung, nicht gezeigt).
Die reduzierten PEEK-Folien können weiter zum Bernsteinsäureester umgesetzt werden. Die Veresterung kann mittels Bernsteinsäureanhydrid in Aceton bei Raumtemperatur durchgeführt werden:
10 PEEK-Plättchen (je 1 cm²) wurden in 30 ml Aceton vorgelegt und auf 40°C erhitzt. Es wurde 1 Gramm (g) (10 mmol) Bernsteinsäureanhydrid zugegeben. Die Reaktionszeit betrug 5 h 35 min. Die Plättchen wurden mit je 20 mL Aceton, H₂O und Ethanol gewaschen und im Vakuumtrockenofen für 2 h bei 40°C und 50 mbar getrocknet. Die Reaktion wurde anhand eines ATR-IR-Spektrums verifiziert. ATR-IR: ν 3400 cm^-1 (m), 2924 cm^-1 (w), 2861 cm^-1 (m) sp³ CH₂ Valenzschwingungen, 1705 (w) COOH Valenzschwingung (nicht gezeigt).
Gereinigte PEEK-Folien konnten in purem Diamin (Ethylendiamin (EDA) und 1,3-Diaminopropan) umgesetzt werden. Es kommt zu einer Bildung von Iminen (Schiffschen Base) auf der PEEK-Oberfläche. Die Reaktion kann 3 h unter Reflux des Diamins und Rühren der Mischung ablaufen:
5 PEEK-Plättchen (je 1 cm²) wurden in 10 mL Ethylendiamin, bzw. 1,3-Diaminopropan vorgelegt. Die Reaktionsmischung wurde unter Rühren 3 h unter Reflux erhitzt. Die Reaktionsmischung wurde auf RT abgekühlt und die PEEK-Plättchen ausgiebig mit Aceton gewaschen. Die modifizierten Folien wurden im Vakuumtrockenofen für 2 h bei 40°C und 50 mbar getrocknet. Die Reaktion wurde anhand eines ATR-IR-Spektrums verifiziert ATR-IR: ν 2925 cm^-1 (m), 2854 cm^-1 (m) sp³ CH₂ Valenzschwingungen, 1620 cm^-1 (w) C=N Valenzschwingung (nicht gezeigt).
Es konnte auch ein Bernsteinsäurelinker an die aminfunktionalisierten PEEK-Proben eingeführt werden: Die PEEK-Folien wurden in 10 mL trockene 10 Millimol (mM) Bernsteinsäureanhydrid DMF-Lösung (DMF: Dimethylformamid) gegeben. Nach 10 h wurden die Folien sorgfältig mit MilliQ (Reinstwasser) gewaschen. Und mittels ATR-IR-Spektroskopie untersucht (nicht gezeigt). ATR-IR: ν 2925 cm^-1 (m), 2854 cm^-1 (m) sp³ CH₂ Valenzschwingungen, 1706 cm^-1 (w) C=O Valenzschwingung.
Die modifizierten PEEK-Folien wurden einer Kontaktwinkelmessung unterzogen. Die modifizierten PEEK-Folien wurden vor der Messung mit Phosphatpuffer behandelt, mit MilliQ abgespült und gut getrocknet. Die Kontaktwinkelmessungen können 5 Sekunden (s) nach Aufbringen des Tropfens erfolgen. Kontaktwinkelmessungen mit Reinstwasser (MilliQ) implizieren beim mit Ethylendiamin modifizierten PEEK eine mit 66° deutlich erhöhte Hydrophilie im Vergleich zu unmodifizierten PEEK-Folien (84,5°). Bei der mit 1,3-Diaminopropan modifizierten Variante ist der Kontaktwinkel mit 70° auch kleiner geworden, da die Oberfläche ebenfalls hydrophiler wurde. Die Erhöhung der Hydrophilie spricht für einen erfolgreichen Reaktionsverlauf bei der Umsetzung von PEEK mit den Diaminen.
Unbehandelte PEEK-Folien können mit einer Grafting-from Polymerisationsmethode mit Polyacrylsäure beschichtet werden (UV-Licht induzierte PEEK-Modifikation):
Die verwendete Experimentalvorschrift kann in einem Schritt durchgeführt werden. Es kann mit entgasten wässrigen Lösungen von destillierter Acrylsäure gearbeitet werden. Als UV Licht Quelle kann eine OSRAM Vitalux 300 ohne weiteren Filter verwendet werden.
4 PEEK-Plättchen (je 1 cm²) wurden in einem Schlenkkolben vorgelegt und mittels 3 Vakuum/Stickstoffcyclen entgast. Die entsprechende Menge entgastes MilliQ Wasser (4 Freeze Pump Thaw Zyklen) wurde zugegeben. Nach Zugabe der entgasten Acrylsäure (30 min Durchleiten von Stickstoff) wurde der Kolben unter Rühren mit der UV-Lampe aus einer Entfernung von 15 cm bestrahlt. Die Reaktionszeit betrug zwischen 15 min und 75 min. Die Konzentration der Acrylsäurelösung betrug zwischen 5 wt% und 25 wt%. ATR-IR: ν 1705 cm^-1 (m) COOH Valenzschwingung.
Die jeweilig möglichen Bedingungen und Ergebnisse sind in Tabelle 1 Tabelle 1aufgeführt. Tabelle 1: Reaktionsansätze des UV-Graftings mit Acrylsäure.

Eintrag Acrylsäure Konzentration [wt%] Reaktionszeit [min] Gelschicht auf Oberfläche

MG10 20 75 Ja

MG11 10 70 Ja

MG13 7,5 70 Ja

MG19 5 30 Ja

MG20 5 45 Ja

MG12 5 60 Ja
Die mit Polyacrylsäure gegrafteten PEEK-Folien wurden im Rasterelektronenmikroskop (REM) untersucht (nicht gezeigt).
Bei jedem Ansatz wurde eine im Wesentlichen homogene Schicht aus Polyacrylsäure gebildet. Je höher die Polyacrylsäurekonzentration und je länger die Reaktionszeit umso mehr Polyacrylsäure wurde auf der Oberfläche im Wesentlichen in Kugelform abgeschieden bzw. umso höher war die Schichtdicke. Hierbei sind die Kügelchen umso kleiner, je geringer die Polyacrylsäurekonzentration war (30 (Mikrometer (µm) bei MG10 gegenüber 3 µm bei MG12).
Zur weiteren Oberflächenfunktionalisierung wurden die Proben verwendet, die für 30 Minuten bei 5 wt% Acrylsäureanteil polymerisiert wurden. Unter diesen Bedingungen war die Beschichtung noch ausreichend dick um von einer homogenen Beschichtung zu sprechen (nicht gezeigt), und gleichzeitig kann man bei dieser Schichtdicke davon ausgehen, dass die mechanischen Eigenschaften des Bulkmaterials nicht negativ beeinflusst werden. Die Polyacrylsäureschichten die bei höheren Acrylsäurekonzentrationen hergestellt wurden, sind aufgrund des dicken Gelkissens von bis zu 5 Millimeter (mm) nicht geeignet für die Zielanwendung als Knochenimplantatmaterial, da ein Gelkissen auf der Oberfläche den mechanischen Kontakt zum umliegenden Gewebe stark verschlechtert.
Bei geringer Vergrößerung erkennt man dass die Polyacrylsäure mit den Kügelchen lineare Strukturen ausgebildet hat. Die Ausbildung dieser Linien könnte der Trocknungsmethode geschuldet sein (Vakuumofen) ist möglicherweise aber auch der Hydrophobie der PEEK-Oberfläche geschuldet. Die an die aktive Stelle diffundierenden Acrylsäuremoleküle haben eine höhere Affinität für eine wachsende Polyacrylsäureschicht, als für die hydrophobe PEEK-Oberfläche. Dies könnte die aus PAA Kugeln bestehenden Linienstrukturen erklären. Die durchschnittliche Kügelchengröße unter diesen Reaktionsbedingungen beträgt 1,7 µm und ist damit nochmal etwa halb so groß als bei 60 min Polymerisation. Die Beschichtungsergebnisse wurden anhand von ATR-IR-Spektren verifiziert (nicht gezeigt).
Als besonders geeignet haben sich die Beschichtungen, die bei 5 wt% Acrylsäure und 30 min UV-Behandlung hergestellt wurden erwiesen. Das PEEK kann unter diesen Bedingungen dünn beschichtet werden, sodass kein zu großes Gelkissen abgeschieden wurde.
Die UV-induzierte grafting-Polymerisation eignet sich also sehr gut für die Beschichtung von PEEK mit Polyacrylsäure, da deutliche Mengen des PAA auf der PEEK-Oberfläche nachgewiesen werden konnten.
Es können auch Polymerisationen in purer Acrylsäure und zum Vergleich in purem Methylacrylat durchgeführt werden, also eine Polymerisation im reinen Monomer. Die Resultate wurden anhand von ATR-IR-Spektren verifiziert (nicht gezeigt). Kupplung von 1,4-Diaminobutan an die mit PAA beschichtete PEEK-Oberfläche:
Die Polyacrylsäure-Schicht kann durch die Ankupplung von Diaminlinkern modifiziert werden, damit später mit organischen Säuren Amidbindungen ausgebildet werden können. Die Kupplung der Diamin Spezies an die Carboxylgruppen kann mittels des modernen Kupplungsreagenzes 4-(4,6-Dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride (DMT-MM) durchgeführt werden. Die Aktivierung und Kupplung kann mit DMT-MM bei einem gepuffertem pH-Wert von 9 erfolgten:
Die Quantifizierung der Aminogruppen auf der Oberfläche der linkerfunktionalisierten PEEK-Folien (Substrat) kann mittels des Fluoreszenzfarbstoff C-Cumarin:
nach dem Fachmann bekannter Weise durchgeführt werden: (Stern = 7-Hydroxicumarin-Fluorophor, Sub = Substrat und siehe S. Shiota; S. Yamamoto; A. Shimomura; A. Ojida; T. Nishino; T. Maruyama, Langmuir 2015, 31, 8824-8829):
Über die Fluoreszenzintensität kann die Konzentration des Farbstoffes in Lösung bestimmt und damit Rückschlüsse auf die Menge der Oberflächen-Aminogruppen gezogen werden. Bei den funktionalisierten PEEK-Proben (mit Ethylendiamin, 1,3-Diaminopropan 4 und Tetramethylendiamin (TMDA)) konnte eine höhere NH₂ Dichte gegenüber einer unfunktionalisierten PEEK-Probe ermittelt werden (Daten nicht gezeigt).
Synthesen der modifizierten Polysaccharide:
Zur Modifikation der PEEK-Folien mit Polysacchariden, können zwei Strategien verfolgt werden: Die Einführung des Linkermoleküls (Diamin) auf der carboxylierten PEEK-Oberfläche und die Einführung der Linker am Polymer. Im ersten Fall würde im Polymer-Kupplungsschritt unmodifiziertes Polysaccharid an freie Aminogruppen am Substrat gekuppelt werden, wohingegen im zweiten Fall aminfunktionalisierte Polysaccharide an Carboxylgruppen am Substrat verankert werden.
In einem Ansatz können unmodifizierte Hyaluronsäure:
oder Alginsäure (gezeigt als Strukturausschnitte von Alginsäure mit den verschiedenen Poly-G, Poly-M und alternierenden Blöcken. Je nach Herkunft der Alginsäure ist das Verhältnis aus G und M unterschiedlich):

mit einem Amin funktionalisiert werden, um danach an Carboxylgruppen auf der PEEK-Oberfläche gekuppelt zu werden. Hierbei kann es nötig sein, vor der Funktionalisierung eine Deacetylierung durchzuführen.
Deacetylierung von Hyaluronsäure:
Unmodifizierte Hyaluronsäure besteht aus einer D-Glucuronsäure und einer N-Acetyl-Glucosamin-Einheit. Sie besitzt deshalb pro Disaccharid-Monomer eine freie Carboxylfunktion und eine acetylierte Aminfunktion. Zwei gängige Methoden um Aminfunktionalitäten einzuführen, können neben Substitutionsreaktionen an den OH-Gruppen, die Funktionalisierung der Carboxylgruppen mit Diamin-Linkern, oder die Entschützung der N-Acetyl-Gruppe zum freien Amin sein.
Die Deacetylierung kann in wässriger Hydrazinlösung unter Hydrazinsulfatkatalyse durchgeführt werden:
Zu 1 g Natriumhyaluronat wurde 50 mL Hydrazinmonohydrat und 0,5 g Hydrazinsulfat gegeben, sodass eine Lösung, bezogen auf das Polymer, von 2 Gewichtsprozent (wt%) erreicht war. Nach 72 h rühren bei 55°C wurde das Polymerprodukt in kaltem Ethanol ausgefällt, filtriert und im Vakuum getrocknet (24 h). Der Rückstand wurde in 20 mL 5 % Essigsäure aufgenommen. Zu dieser Lösung wurde wässrige Iodsäurelösung (10 mL, 0,5 M) gegeben, wobei die Temperatur für 1 h in einem Eisbad auf 4°C gehalten wurde. Wässrige Jodwasserstoff Lösung (57 %, 3 mL) wurde dazugegeben. Nach 15 Minuten wurde die violette Lösung im Scheidetrichter fünfmal mit je 25 mL Diethylether extrahiert bis die wässrige Phase farblos war. Der pH Wert der Lösung wurde mit 0,2 M NaOH Lösung auf 7-7,5 eingestellt. Das Polymer wurde in 1 Volumenäquivalent Ethanol ausgefällt, in H₂O gelöst und gegen entionisiertes Wasser dialysiert. Das Dialysewasser wurde täglich 2-mal gewechselt. Nach dreitägiger Dialyse wurde die Lösung gefriergetrocknet und die deacetylierte Hyaluronsäure als Produkt erhalten.
Die freien Aminogruppen könnten als Ankergruppen für die Kupplung an die Carboxylgruppen der PEEK-PAA Oberfläche verwendet werden. Das Polymer wurde NMR-spektroskopisch untersucht um den Deacetylierungsgrad zu bestimmen (nicht gezeigt).
Modifikation von Hyaluronsäure mittels Hexamethylendiamin und Adipinsäuredihydrazid:
Die freien Carboxylgruppen der Hyaluronsäure können sich für vielfältige Modifikationsmöglichkeiten des Polymers eignen. In der Literatur wurde z.B. von Amidierung, Esterbildung oder Ugi-Kondensation berichtet.
Für die Synthese der amidierten Hyaluronsäure kann Hexamethylendiamin (HMDA) verwendet werden. Die Kupplung des Amins kann über die klassische EDC/NHS-Kupplung (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid/ N-Hydroxysuccinimid -Kupplung) im wässrigen Medium verlaufen. Die Reaktion wird in eine Aktivierungsphase im leicht sauren und eine Kupplungsphase im leicht basischen aufgeteilt. Der pH Wert der Reaktion musste kontinuierlich kontrolliert und nachgestellt werden:
Eine wässrige Natriumhyaluronat Lösung mit $3 \frac{m g}{m L}$
wurde hergestellt (500 Milligramm (mg) in 167 mL MilliQ). Bezogen auf die Menge der Carboxylgruppen im Polymer wurden 30 äq. Hexamethylendiamin (HMDA, 30äq, 39,6 mmol, 4,6 g) zugegeben. Der pH Wert der Lösung wurde auf 7,5 eingestellt (0,1 M NaOH, bzw. 0,1 M HCl). EDC (4 äq., 5,28 mmol, 0,9 g) und NHS (4 äq., 5,28 mmol, 0,607 g) wurden in 10 mL Wasser gelöst und dann zu der Reaktionslösung gegeben. Der pH Wert der Mischung wurde mittels Zugabe von 0,1 M NaOH bei 7,5 gehalten. Die Reaktion wurde über Nacht gerührt. Der pH Wert wurde auf 7 eingestellt und das Polymer in Ethanol (3 Volumenäquivalente) ausgefällt. Das Polymer wurde in MilliQ gelöst $(5 \frac{m g}{m L})$
und 6 Tage gegen VE-Wasser (Vollentsalztes Wasser) dialysiert. Das VE-Wasser wurde täglich 2 Mal gewechselt. Das gereinigte Produkt wurde 4 Tage gefriergetrocknet. Der Grad der HMDA-Funktionalisierung wurde mittels ¹H-NMR Spektroskopie bestimmt. 46 % HMDA Funktionalisierung.
Die Reaktion erfolgte unter sehr großem Überschuss an Diamin (30-fach, bezogen auf die Menge der Carboxylgruppen im Polymer) um die Quervernetzung der Hyaluronsäure zu verhindern. Durch ¹H-NMR-Spektren konnte die erfolgreiche Kupplung des HMDA Linkers und durch ATR-IR-Spektren die erfolgreiche Funktionalisierung der Carboxylgruppen durch Ausbildung von Amidbindungen mit den HMDA-Linkern nachgewiesen werden (nicht gezeigt).
Modifikation von Hyaluronsäure mit Adipinsäurediazid:
Zur Synthese des Adipinsäuredihydrazid (ADH) Derivats wurde die Synthesevorschrift abgewandelt. Da ADH eine geringere Basizität als HMDA zeigt, ist die Kupplung bereits im sauren pH-Bereich von 4,8 möglich. Deshalb konnte auf die Zugabe von NHS verzichtet werden:
Eine Natriumhyaluronatlösung mit $3 \frac{m g}{m L}$
wurde hergestellt durch lösen von 500 mg Natriumhyaluronat in 170 mL H₂O. Bezogen auf die Menge der Carboxylgruppen im Polymer wurde ein 40-fach molarer Überschuss an Adipinsäuredihydrazid (ADH, 52,8 mmol, 9,2 g) zugegeben. Es wurde gewartet bis das ADH vollständig gelöst war (15 min). Der pH Wert der Reaktionsmischung wurde mittels 1 M HCl Lösung auf 4 eingestellt. Es wurde Ethanol (50 mL, 50 Volumenprozent (Vol%)) zugegeben und 30 Minuten gerührt. Es wurden 4 äq. EDC-HCl (5,3 mmol, 0,9 g) zugegeben.
Der pH Wert wurde für 2 h mittels 1 M HCl auf ca. 4,8 gehalten. Nach 2 h wurde die Reaktion gestoppt Neutralisation der Lösung mittels 1 M NaOH (pH = 7). Die Reaktionslösung wurde in vorgewaschene Dialysemembranschläuche gegeben $(MWCO = 3500 \frac{g}{m o l})$
und für 9 Tage dialysiert. 1 Tag wurde gegen 100 mM NaCl Lösung dialysiert und danach abwechselnd einen Tag gegen 25 Vol% Ethanollösung und einen Tag gegen VE Wasser. Der Ethanol/VE Wasser Zyklus wurde 4 Mal wiederholt. Die Polymerlösung wurde schließlich 3 Tage gefriergetrocknet. Der Grad der ADH Funktionalisierung wurde mittels ¹H-NMR Spektroskopie bestimmt. 53 % ADH Funktionalisierung.
Die Synthese kann unter großem Überschuss an ADH um hier ebenfalls die Vernetzung der Hyaluronsäure zu verhindern erfolgen. Bei beiden Synthesen musste das Produkt ausgiebig dialysiert werden, um den großen Überschuss des HMDA bzw. ADH zu entfernen. Durch ¹H-NMR-Spektren konnte die erfolgreiche Synthese der ADH-modifizierten Hyaluronsäure und durch ATR-IR-Spektren die erfolgreiche Funktionalisierung der Carboxylgruppen durch Ausbildung von Amidbindungen mit dem ADH nachgewiesen werden (nicht gezeigt).
HMDA modifizierte Alginsäure:
Analog zur Hyaluronsäure kann auch die Alginsäure mit HMDA funktionalisiert werden. Die Kupplung kann nach einer Vorschrift zur Octylaminfunktionalisierung von Alginsäure erfolgten:
30 mL wässrige Natriumalginat mit 3 wt% (1 g Natriumalginat) wurde in einem Kolben vorgelegt und der pH Wert mittels 0,1 M HCl auf 3,4 eingestellt. Die Polymerlösung wurde dadurch auf 50 mL verdünnt (2 wt%). In 4 mL H₂O wurden 797,5 mg (4, 16 mmol) EDC-HCl gelöst und zu der Polymerlösung gegeben. Das Verhältnis der EDC Menge zu den Carboxylfunktionalitäten betrug somit 0,7. Die Konzentration des EDC wurde durch die molare Häufigkeit der Natriumalginat Monomere $(M = 168,11 \frac{g}{m o l})$
im Polymer. Nach 5 min Reaktionszeit wurden 10 äq. Hexamethylendiamin (7, 05 g) zugegeben. Die Lösung wurde 24 h bei Raumtemperatur gerührt. Das Polymer wurde in Aceton ausgefällt, nach Trocknung in H₂O gelöst und gegen H₂O dialysiert. Das Wasser wurde 2 Mal täglich gewechselt. Nach 9-tägiger Dialyse wurde die Polymerlösung 4 Tage gefriergetrocknet. Es wurde 938 mg Produkt erhalten. Der Grad der HMDA Funktionalisierung wurde mittels ¹H-NMR Spektroskopie bestimmt. 31,5 % HMDA Funktionalisierung.
Die Synthese kann unter großem Überschuss von HMDA erfolgten, um die Vernetzung der Alginsäure zu verhindern. Das Produkt kann ausgiebig dialysiert werden, um es vom überschüssigen HMDA zu befreien. Durch ¹H-NMR-Spektren konnte die erfolgreiche Kupplung des HMDA Linkers und durch ATR-IR-Spektren die erfolgreiche Funktionalisierung der Carboxylgruppen durch Ausbildung von Amidbindungen mit den HMDA-Linkern nachgewiesen werden (nicht gezeigt).
Funktionalisierung der PEEK-Oberfläche mit Polysacchariden: Für die weitere Funktionalisierung der PEEK-Oberfläche können unterschiedliche Strategien verfolgt werden. Zum einen können verschieden modifizierte Polysaccharide mit Aminfunktionalitäten versehen und im nächsten Schritt an die Carboxylgruppen auf der PEEK-Oberfläche gekuppelt werden. Der andere Ansatz geht von der Modifikation der Carboxylgruppen auf der Oberfläche durch Diamine aus, um im nächsten Schritt unmodifizierte Polysaccharide ankuppeln zu können.
Kupplung aminfunktionalisierter Polysaccharide:
Um die Polysaccharide auf das Polymersubstrat aufbringen zu können, sollte eine Peptidbindung aufgebaut werden. Es kann einerseits die klassische EDC/NHS Kupplungschemie verwendet werden. Andererseits kann auch mit dem modernen Kupplungsreagenz DMT-MM gearbeitet werden. Die klassische EDC/NHS Kupplung kann zweistufig durchgeführt werden. Nach 20-minütiger Aktivierung der PEEK-Folie im leicht sauren MES Puffer kann die Kupplung mit den modifizierten Polysacchariden im leicht basischen Phosphat-Puffer über Nacht durchgeführt werden:
Als alternative Kupplungsreaktion kann die einstufige Kupplung mit dem modernen Kupplungsreagenz 4-(4,6-Dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride (DMT-MM) gewählt werden. Der Aktivierungsmechanismus und die anschließende Ausbildung der Peptidbindung können so erfolgen:
Sie hat den Vorteil, dass die Reaktion bei einem konstanten pH Wert von 9 durchgeführt werden kann und das Reaktionsgefäß zwischen Aktivierung und Kupplung nicht gewechselt werden muss. Die Kupplung bei pH 9 ist im Vergleich zur Kupplung an den NHS Ester bei pH 7,3 deutlich schneller, da die Amine bei pH 9 größtenteils als freies Amin vorliegen, was wichtig für den nukleophilen Angriff auf das aktivierte Carbonylzentrum ist. Die NHS Kupplung kann bei so hohen pH-Werten nicht durchgeführt werden, da der NHS Ester in der wässrigen Lösung sonst zu schnell hydrolysiert wird:
Modifikation der iminfunktionalisierten PEEK-Oberfläche:
Die iminfunktionalisierte PEEK-Oberfläche kann unter identischen Reaktionsbedingungen mit nativer Hyaluronsäure und Alginsäure umgesetzt werden.
Direkte Modifikation der iminierten PEEK-Oberfläche mit nativer Hyaluronsäure. Die Kupplung erfolgte mittels DMT-MM in wässiger Phosphatpufferlösung bei pH =8:
Direkte Modifikation der iminierten PEEK-Oberfläche mit nativer Alginsäure. Die Kupplung erfolgte mittels DMT-MM in wässiger Phosphatpufferlösung bei pH =8 (Aminierte PEEK Folie wurde mit Polysaccharid in PBS Puffer (PBS: Phosphate Buffer Saline) bei pH=8 (67 mM) in 1 mM DMT-MM Lösung über Nacht geschüttelt. Konzentration von Hyaluronsäure: 0,1 mg/mL; Alginsäure: 0,05 mg/mL. Es wurde dreimal mit MilliQ Wasser gewaschen):
Modifikation der mit Polyacrylsäure beschichteten-PEEK-Oberfläche:
Die Beschichtung der PEEK-Substrate mit Polyacrylsäure war, wie oben beschrieben wurde, sehr erfolgreich. Die sehr große Menge an Carboxylgruppen die dadurch auf der PEEK-Oberfläche eingeführt werden konnte, sollte nun als Angriffspunkt für die weitere Funktionalisierung mit verschiedenen Polysaccharidderivaten dienen. So wurden Kupplungsreaktionen mit ADH-Hyaluronsäure, HMDA-Hyaluronsäure, deacetylierter Hyaluronsäure und HMDA-Alginsäure durchgeführt.
Modifikation der mit Polyacrylsäure beschichteten PEEK-Oberfläche mit ADH-Hyaluronsäure. Die Kupplung erfolgte mittels DMT-MM in wässriger Phosphatpufferlösung bei pH =8:
Die Reaktion erfolgte unter denselben Bedingungen wie die vorherigen Kupplungen.
Modifikation der mit Polyacrylsäure beschichteten PEEK-Oberfläche mit HMDA-Hyaluronsäure. Die Kupplung erfolgte mittels DMT-MM in wässriger Phosphatpufferlösung bei pH =8:
Modifikation der mit Polyacrylsäure beschichteten PEEK-Oberfläche mit HMDA-Alginsäure. Die Kupplung erfolgte mittels DMT-MM in wässriger Phosphatpufferlösung bei pH =8:
Modifikation der mit Polyacrylsäure beschichteten PEEK-Oberfläche mit deacetylierter Hyaluronsäure. Die Kupplung erfolgte mittels DMT-MM in wässriger Phosphatpufferlösung bei pH =8:
Insgesamt wurden noch bedeutend mehr Kupplungsversuche an das PEEK-Substrat durchgeführt. Der Überblick über die Reaktionen ist in Tabelle 2Tabelle 2 dargestellt. Die mit einem X markierten Kupplungen wurden durchgeführt. Alle Reaktionen wurden unter denselben basischen Bedingungen mit Hilfe von DMT-MM als Kupplungsreagenz durchgeführt. Tabelle 2: Übersicht über die erfolgten Polysaccharidkupplungen an PEEK-Substrate.

Hya Alg Deac.-Hya ADH-Hya HMDA-Hya HMDA-Alg

PEEK-Imin X X

PEEK-Imin-COOH X X X X

PEEK-PAA X X X X

PEEK-PAA-Amin X X
Die den einzelnen Reaktionen zugehörigen Reaktionsschemata sind wie folgt: Durch ATR-IR-Spektren wurde die erfolgreiche Funktionalisierung nachgewiesen (nicht gezeigt).
Direkte Modifikation der iminierten PEEK-Oberfläche mit nativer Alginsäure. Die Kupplung erfolgte mittels DMT-MM in wässiger Phosphatpufferlösung bei pH =8:
Modifikation der iminierten und carboxylierten PEEK-Oberfläche mit ADH-Hyaluronsäure. Die Kupplung erfolgte mittels DMT-MM in wässriger Phosphatpufferlösung bei pH =8:
Modifikation der iminierten und carboxylierten PEEK-Oberfläche mit HMDA-Hyaluronsäure. Die Kupplung erfolgte mittels DMT-MM in wässriger Phosphatpufferlösung bei pH =8:
Modifikation der iminierten und carboxylierten (Bernsteinsäure) PEEK-Oberfläche mit HMDA-Alginsäure. Die Kupplung erfolgte mittels DMT-MM in wässriger Phosphatpufferlösung bei pH =8:
Modifikation der iminierten und carboxylierten PEEK-Oberfläche mit deacetylierter Hyaluronsäure. Die Kupplung erfolgte mittels DMT-MM in wässriger Phosphatpufferlösung bei pH =8:
Modifikation der mit Polyacrylsäure beschichteten PEEK-Oberfläche mit ADH-Hyaluronsäure. Die Kupplung erfolgte mittels DMT-MM in wässriger Phosphatpufferlösung bei pH =8:
Modifikation der mit Polyacrylsäure beschichteten PEEK-Oberfläche mit HMDA-Hyaluronsäure. Die Kupplung erfolgte mittels DMT-MM in wässriger Phosphatpufferlösung bei pH =8:
Modifikation der mit Polyacrylsäure beschichteten PEEK-Oberfläche mit HMDA-Alginsäure. Die Kupplung erfolgte mittels DMT-MM in wässriger Phosphatpufferlösung bei pH =8:
Modifikation der mit Polyacrylsäure beschichteten PEEK-Oberfläche mit deacetylierter Hyaluronsäure. Die Kupplung erfolgte mittels DMT-MM in wässriger Phosphatpufferlösung bei pH =8:
Modifikation der mit Polyacrylsäure beschichteten und anschließend mit Tetramethylendiamin behandelten PEEK-Oberfläche mit nativer Hyaluronsäure. Die Kupplung erfolgte mittels DMT-MM in wässriger Phosphatpufferlösung bei pH = 8:
Modifikation der mit Polyacrylsäure beschichteten und anschließend mit Tetramethylendiamin behandelten PEEK-Oberfläche mit nativer Alginsäure. Die Kupplung erfolgte mittels DMT-MM in wässriger Phosphatpufferlösung bei pH = 8:
Modifikation der iminierten PEEK-Oberfläche mit angekuppelter Bernsteinsäure mit nativer Alginsäure. Die Kupplung erfolgte mittels DMT-MM in wässriger Phosphatpufferlösung bei pH =8:
Mineralisierungsversuche mit Hydroxylapatit:

Zudem können drei unterschiedliche Ansätze zur Mineralisierung von Hydroxylapatit in per PEEK-PAA Probe durchgeführt werden.
Zum einen können zwei Versuche mit Calciumprästrukturierung unternommen werden und einer mit Phosphat-Prästrukturierung.

Hier wäre die folgende Ca-Prästrukturierung möglich:
Eine etablierte Syntheseroute für Hydroxylapatit kann abgewandelt und für die Mineralisierung von PEEK-PA Folien verwendet werden. Die PEEK-PA Folie kann in 0,3 M Calciumchlorid-Lösung bei einem gepufferten pH-Wert von 9 vorgelegt und für 30 Minuten gerührt werden. Nun wurde eine ebenfalls bei pH = 9 gepufferte Dinatriumhydrogenphosphat-Lösung mit einer Rate von $3 \frac{m L}{m i n}$
zugegeben. Nach vollständiger Zugabe wurde die Mischung über Nacht gerührt.
Es könnte zudem eine Ca-Prästrukturierung und Phosphatprästrukturierung durchgeführt werden:
Es können ebenfalls simplere Varianten der Mineralisierung durchgeführt werden. PEEK-PAA Proben wurden 72 h in Diammoniumhydrogenphosphat (Phosphatprästrukturierung, 6 mL Gläschen mit 1 M wässriger (NH₄)₂HPO₄-Lösung), respektive Calciumnitrat Cal (6 mL Gläschen mit 1 M wässriger Ca(NO₃)₂-Lösung) gegeben. Nach dieser Ruhezeit wurden die Proben in die jeweils andere Lösung (0,6 M (NH₄)₂HPO₄ bzw. 0,6 M Ca (NO₃)₂-Lösung) gegeben und für eine Woche darin belassen, um den Gegenionen zu ermöglichen ebenfalls ins Gel zu diffundieren.
Zusammenfassung
Es wurde an der Oberflächenfunktionalisierung des Knochenimplantatkunststoffs Polyetheretherketon gearbeitet, um einen besseren Einbau in das behandelte Knochenareal zu ermöglichen. Es wurden Polyetheretherketon-Oberflächen erfolgreich mit verschiedenen Methoden chemisch modifiziert. Dabei wurden die Oberflächeneigenschaften mit Hilfe kleiner Moleküle verändert und Hydroxyl-, Carboxyl- und Iminfunktionalitäten auf der Oberfläche erhalten. Die modifizierte Oberfläche wurde mittels ATR-IR-Spektroskopie analysiert und charakterisiert (nicht gezeigt). Des Weiteren wurden auf der Polyetheretherketon-Oberfläche mittels UV-induzierter grafting-Polymerisation funktionelle Polymere, wie Polyacrylsäure, aber auch Polymethylacrylat (PMA), abgeschieden. Die Polyacrylsäureschicht wurde mit unterschiedlichen Oberflächen-Analytikmethoden, wie ATR-Infrarotspektroskopie, Rasterelektronenmikroskopie und Konfokaler Laser-Scanning Mikroskopie untersucht, um spektroskopische Informationen über die Oberfläche zu bekommen und um ein genaues Bild von deren Topographie zu erhalten (nicht gezeigt). Es wurde die Polyacrylsäure-Schicht durch die Ankupplung von Diaminlinkern modifiziert, damit später mit organischen Säuren Amidbindungen ausgebildet werden können. Um quantitative Aussagen über den Grad der Oberflächenfunktionalisierung mit Aminogruppen treffen zu können, wurde der spaltbare Fluoreszenzfarbstoff C-Cumarin synthetisiert mit dem sich die zugänglichen Aminogruppen auf der Oberfläche indirekt quantifizierten ließen. Die Quantifizierung gelang bei den Proben, die direkt mit Diaminen iminfunktionalisiert wurden.
Es wurde Hyaluronsäure mit Adipinsäuredihydrazid und Hexamethylendiamin und Alginsäure nur mit dem Diamin modifiziert um Amin-Linker für spätere Verankerungen an den verschiedenen Polyetheretherketon-Substraten anzukuppeln. Ebenso wurde Hyaluronsäure deacetyliert, um auf diese Weise Aminfunktionalitäten am Polysaccharid einzuführen. Die modifizierten Polysaccharide wurden mittels NMR- und ATR-infrarot-spektroskopischen Methoden charakterisiert (nicht gezeigt).
Es wurden die zahlreichen modifizierten und nichtmodifizierten Polysaccharide an die komplementären PEEK-Substrate gekuppelt. Die gekuppelten Proben wurden mittels ATR-Infrarot-Spektroskopie, Rasterelektronenmikroskopie und teils mit Thermogravimetrie untersucht (nicht gezeigt).
Ausblick
Da die oberflächeninduzierte radikalische Polymerisation sehr erfolgreich war, ergeben sich besonders in diesem Bereich einige Ansätze auf denen man weitere Arbeiten aufbauen könnte. Da sich die Einführung von Polysaccharidstrukturen auf der Polyetheretherketon-Oberfläche nicht als trivial erwies, die Polymerisation mit Acrylsäure aber sehr gut funktionierte, wäre es ein vielversprechender Ansatz die PEEK-Oberfläche direkt mit Polymeren aus modifizierten Acrylsäurederivaten zu beschichten. Als alternative Monomereinheiten auf Acrylsäure-Basis kämen beispielsweise mit Zuckermolekülen modifizierte Acrylsäurederivate in Betracht, für die bekannt ist, dass sie bei der Zelladhäsion von Osteoblasten eine wichtige Rolle spielen. Ebenso wäre es interessant wenn die Monomereinheiten Oligosaccharide der Hyaluronsäure, oder auch kurze haftvermittelnde RGD-Peptidsequenzen, etc. tragen würden:
Eine sehr empfindliche Oberflächenanalytikmethode ist die Röntgenphotoelektronenspektroskopie. Auf diese Weise ließen sich eventuell doch Polysaccharide auf den Oberflächen der hergestellten Substrate nachweisen.
Die Untersuchung des Quellverhaltens der Polyacrylsäurelayer auf dem Polyetheretherketon-Substrat könnte ein Ansatz sein, die Kupplungsbedingungen zu optimieren, sodass auch mit einfachen Analytikmethoden Polysaccharidnachweise gelingen würden. Kupplungen in nicht wässrigen Medien wären auch denkbar, sind jedoch wegen der schlechten Löslichkeit der Polysaccharide mit Sicherheit ebenfalls problematisch.
Weitere Versuche Hydroxylapatit in der Polyacrylsäureschicht abzuscheiden sollten ebenfalls unternommen werden, da die Hydroxylapatit-Beschichtung erwiesenermaßen positive Auswirkungen auf die Akzeptanz im Organismus haben.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur

C. Henneuse; B. Goret; J. Marchand-Brynaert, Polymer 1998, 39, 835-844 und C. Henneuse-Boxus; E. Duliere; J. Marchand-Brynaert, European Polymer Journal 2001, 37, 9-18) [0046]
siehe J. Knaus, Master Thesis 2013 Universität Konstanz und H. Cölfen; L. F. Tian; J. Knaus, 2016 [0047]
B. Yameen; M. Alvarez; O. Azzaroni; U. Jonas; W. Knoll, Langmuir 2009, 25, 6214-6220 [0048]
W. T. Yang, Journal of Polymer Science Part a-Polymer Chemistry 2007, 45, 745-755 [0052]
7-Hydroxicumarin-Fluorophor, Sub = Substrat und siehe S. Shiota; S. Yamamoto; A. Shimomura; A. Ojida; T. Nishino; T. Maruyama, Langmuir 2015, 31, 8824-8829) [0098]

Claims

Material für ein Knochenimplantat, umfassend: (a) eine Trägerstruktur mit einer Oberfläche, die zumindest ein biokompatibles Material umfasst, (b) eine kovalent an diese Oberfläche gebundene Matrix und (c) in diese Matrix eingelagertes Calciumphosphat, dadurch gekennzeichnet, dass die Matrix zumindest ein Polysaccharid aufweist.
Material nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Polysaccharid ein pflanzliches Polysaccharid oder tierisches Polysaccharid ist.
Material nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Polysaccharid ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus Alginsäure, Alginat, Hyaluronsäure, Pektin, Carrageenan, Agarose, Amylose und Chitosan.
Material nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Polysaccharid ein chemisch modifiziertes Polysaccharid ist.
Material nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das biokompatible Material ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus einem oxidischen Keramikmaterial, einem Polymermaterial, einem Kompositmaterial und Titan.
Material nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das biokompatible Material Polyetheretherketon (PEEK) ist.
Material nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Polysaccharid über einen Linker an das biokompatible Material gebunden ist, wobei der Linker ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus einem Diamin-Linker, einem Diamin und Bernsteinsäure-Linker und einem Polyacrylsäure-Linker.
Material nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass (a) das biokompatibles Material PEEK ist, (b) das Polysaccharid Alginsäure ist und (c) das in diese Matrix eingelagerte Calciumphosphat Hydroxylapatit, insbesondere kristallines Hydroxylapatit ist.
Material nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die kovalent gebundene Matrix eine Schichtdicke von 100 bis 150 nm aufweist.
Material nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Matrix die gesamte Oberfläche der Trägerstruktur bedeckt.
Verfahren zur Herstellung eines Materials für ein Knochenimplantat, insbesondere nach einem der Ansprüche 1 bis 10, umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen einer Trägerstruktur mit einer Oberfläche, umfassend ein biokompatibles Material, (b) kovalentes Ankoppeln einer Matrix, umfassend zumindest ein Polysaccharid, an diese Oberfläche, und (c) Mineralisieren der Matrix mit Calciumphosphat.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Schritt (b) die folgenden Schritte umfasst: (b1) kovalentes Ankoppeln eines Linkermoleküls, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Diamin-Linker oder einem Diamin Linker und einem Bernsteinsäure-Linker oder UVgegrafteter Polyacrylsäure, an die aktivierte Oberfläche, und (b2) kovalentes Ankoppeln des Polysaccharids mit Carbonsäuregruppen an das Diamin Linkermolekül oder des Hexamethylendiamin modifizierten Polysaccharids an den Bernsteinsäure Linker oder des unmodifizierten Polysaccharids über Esterbindungen an den Polyacrysäure-Linker.
Knochenimplantat auf das ein Knochenimplantatmaterial nach zumindest einem der Ansprüche 1 bis 10 aufgebracht ist.
Verwendung des Materials nach zumindest einem der Ansprüche 1 bis 10 als Knochenimplantatmaterial.