DE102014206444A1 - A method for molecular diagnostics for enriching a nucleic acid from a biological sample - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft Verfahren für die Molekulardiagnostik, zum Anreichern von Nukleinsäuren (11) aus Mikroorganismen (12) aus einer biologischen Probe (10) eines Organismus, bei dem ein Markieren (S1) von zumindest einem Anteil der Mikroorganismen (12) durch Opsonine (16) erfolgt, welche jeweils an einen Marker (18) gekoppelt sind, gefolgt von einem Abtrennen (S3) der markierten Mikroorganismen (12) aus der biologischen Probe (10) mittels einer Zellsortiervorrichtung (34), wodurch ein Anreichern der markierten Mikroorganismen (12) und damit ein Anreichern der Nukleinsäuren (11) der Mikroorganismen (12) erfolgt, um eine schnelle und einfach durchzuführende Routine für eine patientennahe Labordiagnostik, insbesondere für eine Sepsisdiagnostik, zur Verfügung zu stellen.The invention relates to methods for molecular diagnostics for enriching nucleic acids (11) from microorganisms (12) from a biological sample (10) of an organism, in which labeling (S1) of at least a proportion of the microorganisms (12) by opsonins (16 ), which are each coupled to a marker (18), followed by separation (S3) of the labeled microorganisms (12) from the biological sample (10) by means of a cell sorting device (34), thereby enriching the labeled microorganisms (12) and enrichment of the nucleic acids (11) of the microorganisms (12) takes place in order to provide a quick and easy routine for near-patient laboratory diagnostics, in particular for sepsis diagnostics.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren für die Molekulardiagnostik zum Anreichern einer Nukleinsäure aus einer biologischen Probe. The invention relates to a method for molecular diagnostics for enriching a nucleic acid from a biological sample.
In der Molekulardiagnostik werden bisher wenn wenig Zeit zur Verfügung steht vor allem zwei Methoden für eine Nukleinsäurediagnostik genutzt. Einerseits kann mit dem Produkt Septifast von Roche eine Nukleinsäure direkt aus zumindest 1,5 Milliliter Vollblut mittels eines initialen Zellaufschlusses, also einer initialen Zelllyse, extrahiert werden. Zum anderen kann mittels eines Produktes von Molzym über eine selektive Lyse Nukleinsäureextraktion durchgeführt werden. Dort findet zunächst eine milde Lyse gefolgt von einer Zentrifugation statt. Darauf folgen eine harte Lyse und ein Aufreinigen der Nukleinsäure. So far, in molecular diagnostics, when there is little time available, two methods for nucleic acid diagnostics are used. On the one hand, Roche's Septifast product can be used to extract a nucleic acid directly from at least 1.5 milliliters of whole blood by means of an initial cell disruption, ie an initial cell lysis. On the other hand, nucleic acid extraction can be carried out by means of a product of Molzym via selective lysis. There, mild lysis followed by centrifugation takes place. This is followed by hard lysis and purification of the nucleic acid.
Für eine besonders schnelle Diagnostik, insbesondere eine patientennahe Labordiagnostik, die auch von gewöhnlichem medizinischem Personal ohne Laborausbildung durchgeführt werden kann, gibt es gegenwärtig kein geeignetes Verfahren. Dies gilt insbesondere für eine schnelle Sepsisdiagnostik, bei der Bakterien oder Resistenzen zu diagnostizieren sind. For a particularly rapid diagnosis, in particular a near-patient laboratory diagnostics, which can also be performed by ordinary medical staff without laboratory training, there is currently no suitable method. This applies in particular to rapid sepsis diagnostics, in which bacteria or resistances are to be diagnosed.
Eine der vorliegenden Erfindung zu Grunde liegende Aufgabe ist es, ein Verfahren für die Molekulardiagnostik zum Anreichern von Nukleinsäure aus einer biologischen Probe bereitzustellen, welches besonders schnell und einfach durchzuführen ist, so dass es als Routinediagnostik einer patientennahen Labordiagnostik von Personal ohne Laborausbildung durchgeführt werden kann. One object of the present invention is to provide a method for molecular diagnostics for enriching nucleic acid from a biological sample, which is particularly quick and easy to perform, so that it can be performed as a routine diagnostic of patient-related laboratory diagnostics by personnel without laboratory training.
Diese Aufgabe wird von dem Verfahren gemäß dem unabhängigen Patentanspruch gelöst. Weitere vorteilhafte Ausführungsformen ergeben sich aus den abhängigen Patentansprüchen, der Beschreibung und der Figur. This object is achieved by the method according to the independent claim. Further advantageous embodiments will become apparent from the dependent claims, the description and the figure.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren für die Molekulardiagnostik, zum Anreichern, insbesondere zum Aufkonzentrieren, von Nukleinsäuren aus Mikroorganismen aus einer biologischen Probe eines Organismus. Bei den Mikroorganismen handelt es sich insbesondere um organismusfremde, z.B. den Organismus schädigende Mikroorganismen. Unter einem Organismus ist hier bevorzugt ein Mensch oder ein Tier, aber auch eine Pflanze, und insbesondere ein lebender Organismus zu verstehen. Insbesondere kann es sich bei dem Organismus auch um ein Lebensmittel, bspw. ein Getränk mit lebenden Mikroorganismen wie z.B. Bier mit Hefe oder Milch mit Pilz handeln. Insbesondere kann es sich bei den Nukleinsäuren um eine Vielzahl von Exemplaren mit einer identischen Nukleinsäurestruktur handeln. Es können damit dann beispielsweise Nukleinsäuren aus z.B. pathogenen Zellen angereichert werden. Bei der biologischen Probe kann es sich insbesondere um eine unlysierte biologische Probe handeln, mit der nach einer Entnahme aus dem Organismus noch kein Lyse durchgeführt wurde. Insbesondere kann es sich hier auch um eine chemisch unbehandelte biologische Probe handeln. The invention relates to a method for molecular diagnostics, for enriching, in particular for concentrating, nucleic acids from microorganisms from a biological sample of an organism. The microorganisms are in particular organism-foreign, e.g. organism damaging microorganisms. An organism is preferably to be understood here as meaning a human or an animal, but also a plant, and in particular a living organism. In particular, the organism can also be a foodstuff, for example a beverage containing living microorganisms, such as e.g. Beer with yeast or milk with mushroom act. In particular, the nucleic acids can be a multiplicity of specimens with an identical nucleic acid structure. It can then be used, for example, nucleic acids from e.g. Enriched pathogenic cells. The biological sample may in particular be an unlysed biological sample with which lysis has not yet been carried out after removal from the organism. In particular, this may also be a chemically untreated biological sample.
Damit das Verfahren einfach und schnell durchgeführt werden kann, erfolgt zunächst ein Markieren von zumindest einem Anteil der Mikroorganismen der biologischen Probe durch Opsonine, wobei die Opsonine jeweils an einen Marker gekoppelt sind. Da nur zumindest ein Anteil der Mikroorganismen markiert ist, können auch, beispielsweise aus statistischen Gründen, in der biologischen Probe nach dem Markieren noch unmarkierte Mikroorganismen vorliegen. Auf das Markieren folgt ein Abtrennen, also ein Separieren, der markierten Mikroorganismen aus der biologischen Probe mittels einer eine Zellsortiervorrichtung, wodurch ein Anreichern der markierten Mikroorganismen und damit ein Anreichern der Nukleinsäuren der Mikroorganismen erfolgt. Um die Nukleinsäuren der Mikroorganismen anzureichern werden also nicht die Nukleinsäuren selbst markiert. Es erfolgt vielmehr ein unspezifisches Markieren der Mikroorganismen, bei dem ein Koppeln der Opsonine an Zellstrukturen, welche insbesondere in einer Vielzahl unterschiedlicher Typen von Mikroorganismen vorkommen. Bei den Mikroorganismen kann es sich beispielsweise um frei in der biologischen Probe schwimmende Mikroorganisen handeln und/oder auch um ehemals phagozytierte Mikroorganismen. Bei der Zellsortiervorrichtung kann es sich beispielsweise um einen Flusssortierer handeln, welcher z.B. Zellen und/oder Mikroorganismen mit unterschiedlicher optischer Markierung in unterschiedliche Gefäße sortiert. Solche Flusssortierer sind auch als „FACS“-Geräte bekannt, wobei FACS für „fluorescenceactivated cell sorting“ steht. Die Zellen und/oder Mikroorganismen können beispielsweise mechanisch oder über eine elektrostatische Kraft abgetrennt werden. Die Nukleinsäuren können insbesondere einzel- oder doppelsträngige Desoxyribonukleinsäuren (DNA) oder Ribonukleinsäuren der phagozytierten Zellen umfassen. Das Verfahren ist also insbesondere als Präanalyseverfahren zu bezeichnen. In order for the process to be carried out simply and quickly, labeling of at least a portion of the microorganisms of the biological sample by opsonin is first carried out, with the opsonins each being coupled to a marker. Since only at least a proportion of the microorganisms is labeled, it is also possible, for statistical reasons, for example, to leave unmarked microorganisms in the biological sample after labeling. Marking is followed by separation, ie separation, of the labeled microorganisms from the biological sample by means of a cell sorting device, which enriches the labeled microorganisms and thus enriches the nucleic acids of the microorganisms. In order to enrich the nucleic acids of the microorganisms, therefore, not the nucleic acids themselves are labeled. Rather, there is a nonspecific marking of the microorganisms, in which a coupling of opsonins to cell structures, which occur in particular in a variety of different types of microorganisms. The microorganisms may be, for example, microorganisms floating freely in the biological sample and / or formerly phagocytosed microorganisms. For example, the cell sorter may be a flow sorter, which may be e.g. Cells and / or microorganisms with different optical marking sorted into different vessels. Such flow sorters are also known as "FACS" devices, where FACS stands for "fluorescenceactivated cell sorting". The cells and / or microorganisms can be separated, for example mechanically or via an electrostatic force. The nucleic acids may in particular comprise single- or double-stranded deoxyribonucleic acids (DNA) or ribonucleic acids of the phagocytosed cells. The method is thus to be described in particular as a pre-analysis method.
Das Verfahren hat den Vorteil, dass das Anreichern ohne eine initiale, also vorherige, aufwendige Lyse erfolgt, so dass eine erhebliche Zeitersparnis eintritt. Des Weiteren liegt durch das Abtrennen der markierten Mikroorganismen von der biologischen Probe für nachfolgende weitere Verfahrensschritte ein im Vergleich zu herkömmlichen Methoden reduzierter störender Hintergrund vor, da vor allem Hämoglobin, freie DNA und weitere Zellen der biologischen Probe frühzeitig von den die Nukleinsäuren enthaltenden Teilen der biologischen Probe, also den markierten Mikroorganismen, abgetrennt werden. The method has the advantage that the enrichment takes place without an initial, that is to say previous, complicated lysis, so that considerable time savings occur. Furthermore, by separating the labeled microorganisms from the biological sample for subsequent further process steps a reduced background compared to conventional methods before, especially since hemoglobin, free DNA and other cells of the biological sample early on of the nucleic acids containing parts of the biological sample, ie the labeled microorganisms are separated.
In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Opsonine jeweils an zumindest einen magnetischen Marker, insbesondere an zumindest einen para- oder superparamagnetischen Marker, gekoppelt sind und das Abtrennen mittels eines durch die Zellsortiervorrichtung angelegten Magnetfeldes erfolgt. Die Verwendung der magnetischen Marker ermöglicht eine Kombination des Anreicherungsprozesses mit einem qualitativen Nachweis oder einem Quantifizierungsschritt für die Mikroorganismen. Dies ermöglicht eine arbeits- und zeitsparende Mehrfachverwendung der Marker. Dementsprechend wird besonders einfach ein Erfassen der markierten Zellen ermöglicht, vorzugsweise zwischen dem Markieren und dem Abtrennen. In a particularly advantageous embodiment it is provided that the opsonins are each coupled to at least one magnetic marker, in particular to at least one para- or superparamagnetic marker, and the separation is effected by means of a magnetic field applied by the cell sorting device. The use of the magnetic markers enables a combination of the enrichment process with a qualitative detection or quantification step for the microorganisms. This allows a labor and time-saving multiple use of markers. Accordingly, it is particularly easy to detect the marked cells, preferably between the marking and the separation.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform ist vorgesehen, dass vor dem Abtrennen ein Erfassen der markierten Mikroorganismen durch eine Erfassungsvorrichtung, insbesondere ein magnetisches und/oder optisches Durchflusszytometer, erfolgt. Dabei umfasst das Erfassen insbesondere ein Quantifizieren der Mikroorganismen, welches wiederum insbesondere ein Bestimmen oder Ermitteln einer Anzahl der markierten Mikroorganismen umfasst, insbesondere pro durch das Durchflusszytometer strömende Probevolumen als eine Konzentration der jeweiligen markierten Mikroorganismen, und/oder ein Bestimmen eines Durchmessers der jeweiligen markierten Mikroorganismen und/oder eines Volumens der jeweiligen markierten Mikroorganismen und/oder einer Fließgeschwindigkeit der jeweiligen markierten Mikroorganismen umfasst, insbesondere einer Durchmesserverteilung der Mikroorganismen. Das hat den Vorteil, dass so durch die Mehrfachverwendung der Marker ein Kombinieren von dem Anreicherungs- und dem Nachweisverfahren erfolgt, so dass hier erneut Zeit und zusätzliche Arbeitsschritte, welche gegebenenfalls eine Schulung einer das Verfahren durchführenden Person erfordern, eingespart werden. In a further advantageous embodiment it is provided that, prior to separation, detection of the marked microorganisms is effected by a detection device, in particular a magnetic and / or optical flow cytometer. In particular, the detection comprises quantifying the microorganisms, which in turn comprises in particular determining or determining a number of the labeled microorganisms, in particular per sample volume flowing through the flow cytometer as a concentration of the respective labeled microorganisms, and / or determining a diameter of the respective marked microorganisms and / or a volume of the respective labeled microorganisms and / or a flow rate of the respective labeled microorganisms, in particular a diameter distribution of the microorganisms. This has the advantage that the multiple use of the markers results in a combination of the enrichment and the detection method, so that time and additional work steps, which may require training of a person carrying out the method, are again saved here.
Durch das Quantifizieren ist zum Beispiel über die erfassten Durchmesser der Mikroorganismen auch ein spezifisches Detektieren möglich, beispielsweise ob Mikroorganismen eines bekannten Durchmessers überhaupt in der biologischen Probe enthalten sind. Über beispielsweise eine einfache Volumenmessung mit einer, insbesondere magnetischen, Laufzeitmessung kann hier beispielsweise eine Konzentration der markierten Mikroorganismen bestimmt werden. Dies kann sehr schnell erfolgen und innerhalb weniger Minuten abgeschlossen sein. Ergebnis ist eine sehr reine, definierte Probe mit bekannten Eigenschaften, anhand derer bereits überprüft werden kann, ob die Probe für weitere und gegebenenfalls zeitaufwendige und teure Diagnostikverfahren geeignet ist. Quantification also makes it possible, for example via the detected diameters of the microorganisms, to detect specifically, for example whether microorganisms of a known diameter are present in the biological sample at all. By way of example, a simple volume measurement with a, in particular magnetic, transit time measurement, a concentration of the labeled microorganisms can be determined here, for example. This can be done very quickly and completed within a few minutes. The result is a very pure, defined sample with known properties, by means of which it can already be checked whether the sample is suitable for further and possibly time-consuming and expensive diagnostic methods.
Unter einer definierten Probe ist hier und im Folgenden eine Probe zu verstehen, deren Zusammensetzung bekannt ist. Insbesondere ist also bekannt, welche Typen von Mikroorganismen und/oder sonstige Bestandteilen in welchen jeweiligen Anteilen und/oder in welcher jeweiligen Anzahl in der Probe vorhanden sind, und welche Genauigkeit diese Informationen jeweils aufweisen. A defined sample is to be understood here and below as meaning a sample whose composition is known. In particular, it is thus known which types of microorganisms and / or other constituents are present in which respective proportions and / or in which particular number in the sample, and which accuracy this information has in each case.
In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass das Abtrennen der markierten Mikroorganismen von einem Volumenstrom der biologischen Probe in einer Zellsortiereinrichtung, insbesondere mittels eines, vorzugsweise eines bereits in den vorhergehenden Verfahrensschritten verwendeten, angelegten Magnetfeldes, in einen Sortiertopf der Zellsortiereinrichtung erfolgt und/oder ein Waschen oder Reinigen der abgetrennten Mikroorganismen in dem Sortiertopf mittels einer durch die Zellsortiereinrichtung strömenden Pufferlösung auf das Abtrennen folgt, insbesondere unter Vorliegen eines, vorzugsweise eines bereits in den vorhergehenden Verfahrensschritten verwendeten, angelegten Magnetfeldes. Das hat den Vorteil, dass ein besonders effizientes Entfernen der nicht markierten Probenkomponenten, wie beispielsweise im Falle einer Vollblutprobe Erythrozyten, freies Hämoglobin oder sonstige Bestandteile des Blutes, erfolgt. Die gereinigten abgetrennten Mikroorganismen können dann aus dem Sortiertopf auf einfache Art und Weise entnommen werden, beispielweise durch ein Herauspipettieren. Zudem wird in diesem Fall im Vergleich zu bekannten Aufreinigungsmethoden ein effizientes oder nahezu vollständiges Reduzieren störender, für das Anreichern der Nukleinsäuren unbenötigter Komponenten der biologischen Probe erzielt. Diese unbenötigten Komponenten bilden sonst insbesondere für ein später gegebenenfalls erfolgendes Amplifizieren der Nukleinsäuren mittels beispielsweise einer Polymerase-Kettenreaktion einen störenden Hintergrund. Auch wird so eine sehr genau definierte Probe erzeugt, die hochkonzentriert ist und von der bereits wenige Mikroliter für eine weitere Diagnostik ausreichend sind. Solch eine Probe kann beispielsweise für neuere und teure Next Generation Sequencing(NGS)-Technologien erforderlich sein. In a further embodiment, it is provided that the separation of the marked microorganisms from a volume flow of the biological sample in a cell sorting device, in particular by means of an applied, preferably already used in the preceding method steps, applied magnetic field, in a sorting pot of the cell sorting and / or washing or cleaning the separated microorganisms in the sorting pot by means of a flowing through the cell sorting buffer solution following the separation, in particular in the presence of a, preferably already used in the preceding method steps, applied magnetic field. This has the advantage that a particularly efficient removal of the non-labeled sample components, such as in the case of a whole blood sample erythrocytes, free hemoglobin or other constituents of the blood, takes place. The purified separated microorganisms can then be removed from the sorting pot in a simple manner, for example by pipetting out. In addition, in this case, in comparison with known purification methods, an efficient or almost complete reduction of interfering components of the biological sample which are unnecessary for accumulating the nucleic acids is achieved. Otherwise, these unneeded components form a disturbing background, in particular for later amplification of the nucleic acids, if necessary, by means of, for example, a polymerase chain reaction. Also, a very well-defined sample is generated, which is highly concentrated and of which only a few microliters are sufficient for further diagnostics. Such a sample may be required for, for example, newer and more expensive Next Generation Sequencing (NGS) technologies.
Die Zellsortiereinrichtung kann beispielsweise eine Kartusche oder ein Cartridge umfassen, in welche die jeweilige Probe eingebracht, insbesondere eingespritzt, werden kann. Die Kartusche kann insbesondere eine auswechselbare Kartusche für eine Haltevorrichtung und/oder für eine Zellsortiervorrichtung und/oder für eine Erfassungsvorrichtung, insbesondere einen magnetischen und/oder optischen Durchflusszytometer, sein. In der jeweiligen Vorrichtung kann insbesondere ein Magnetfeld mit einer vorbestimmten Ausrichtung und Stärke auf die in der Kartusche enthaltene, und insbesondere durch die Kartusche strömende, jeweilige Probe wirken. The cell sorting device can comprise, for example, a cartridge or a cartridge into which the respective sample can be introduced, in particular injected. The cartridge may in particular be a replaceable cartridge for a holding device and / or for a cell sorting device and / or for a detection device, in particular a magnetic and / or optical flow cytometer. In particular, a magnetic field with a predetermined orientation and strength on the contained in the cartridge, and in particular through the cartridge flowing, respective sample act.
In einer vorteilhaften Ausführungsform ist vorgesehen, dass ein Lysieren, insbesondere ein spezifisches Lysieren, zumindest eines Anteils der abgetrennten Mikroorganismen nach dem Abtrennen und insbesondere nach dem Waschen der Mikroorganismen erfolgt. Der Anteil, welcher lysiert wird, kann beispielsweise aus den zuvor abgetrennten Mikroorganismen herauspipettiert werden. Das Lysieren kann insbesondere nach einem Waschen gemäß einem der vorhergehenden Verfahrensschritte erfolgen. Dies bringt den Vorteil einer sehr genau definierten Probe, nämlich hoher Titer und aufgereinigte Nukleinsäuren, von Mikroorganismen für eine Molekulardiagnostik. Diese definierte Probe wurde dabei erzeugt, ohne dass ein aufwendiges Lysieren von Zellen aller Zelltypen in der biologischen Probe erforderlich gewesen wäre. Die genau definierte Probe kann schnell mit wenigen einfachen Verfahrensschritten erzeugt werden. Das macht das Verfahren geeignet für Molekulardiagnostik in zeitkritischen Szenarien, zum Beispiel in einem Schockraum eines Krankenhauses. In an advantageous embodiment it is provided that a lysing, in particular a specific lysing, of at least a portion of the separated microorganisms takes place after the separation and in particular after the washing of the microorganisms. For example, the portion which is lysed may be pipetted out of the previously separated microorganisms. The lysing can be carried out in particular after a washing according to one of the preceding method steps. This has the advantage of a very well-defined sample, namely high titer and purified nucleic acids, of microorganisms for molecular diagnostics. This defined sample was generated without the need for expensive lysing of cells of all cell types in the biological sample. The precisely defined sample can be generated quickly with just a few simple process steps. This makes the method suitable for molecular diagnostics in time-critical scenarios, for example in a trauma room of a hospital.
In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass insbesondere im Anschluss an das Lysieren, so dies erfolgt ist, ein Amplifizieren der Nukleinsäuren der Mikroorganismen durchgeführt wird, insbesondere mittels einer Polymerase-Kettenreaktion. Das hat den Vorteil, dass die Menge der Nukleinsäuren erhöht wird, wodurch ein Nachweis einfacher wird. In a further embodiment, it is provided that, in particular following the lysing, if this has taken place, an amplification of the nucleic acids of the microorganisms is carried out, in particular by means of a polymerase chain reaction. This has the advantage of increasing the amount of nucleic acids, making detection easier.
Die biologische Probe kann eine Urinprobe und/oder Lymphprobe und/oder eine Liquorprobe, also insbesondere eine Probe einer Hirn- oder Rückenmarksflüssigkeit, und/oder pflanzliches Extrakt und/oder eine Lebensmittelprobe und/oder eine Blutprobe, insbesondere eine Vollblutprobe, umfassen. Bei der Lebensmittelprobe kann es sich insbesondere um die Probe eines flüssigen Lebensmittels wie z.B. Bier mit einer Hefe oder Milch mit einem Pilz handeln. Das hat den Vorteil, dass die Probe direkt von einem Organismus, insbesondere von einem Patienten, abgenommen werden kann, wie es für eine patientennahe Labordiagnostik wünschenswert ist. Blut, insbesondere Vollblut, bringt den Vorteil mit sich, dass sehr direkt erkannt werden kann, ob eine gefährliche Erkrankung oder Infektion vorliegt. Hier bringt die Verwendung von Vollblut den besonderen Vorteil mit sich, dass keine Verdünnung erforderlich ist, was nicht nur Zeit spart, sondern auch erforderliche labortechnische Kenntnisse des Bedienpersonals reduziert. The biological sample may comprise a urine sample and / or lymph sample and / or a CSF sample, ie in particular a sample of a cerebrospinal fluid, and / or plant extract and / or a food sample and / or a blood sample, in particular a whole blood sample. The food sample may be, in particular, the sample of a liquid food, e.g. Beer with a yeast or milk with a mushroom. This has the advantage that the sample can be taken directly from an organism, in particular from a patient, as is desirable for near-patient laboratory diagnostics. Blood, especially whole blood, has the advantage that it can be very directly recognized whether a dangerous disease or infection exists. Here, the use of whole blood has the particular advantage that no dilution is required, which not only saves time, but also reduces required laboratory knowledge of the operating staff.
In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Opsonine unspezifisch an bezüglich des Organismus fremde, also organismusfremde, Zellen binden und es sich insbesondere bei den Opsoninen um Komplementfaktoren und/oder eine Mischung von einer Mehrzahl voneinander verschiedener Antikörper, insbesondere mit Komplementfaktoren, handelt. Die verschiedenen Antikörper gehören dann also unterschiedlichen Typen von Antikörpern an. Es kann sich insbesondere bei den Opsoninen auch um Immunoglobolin G kovalent gebunden auf je einem Molekül, superparamagnetische Beads je kovalent gebunden an Immunoglobolin G oder Mischungen daraus handeln. Das hat den Vorteil, dass jeglicher organismusfremde Mikroorganismus markiert wird und in Folge aus der Probe abgetrennt werden kann. In a further embodiment, it is provided that the opsonins bind nonspecifically to cells foreign to the organism, that is to say foreign to the organism, and in particular the opsonins are complement factors and / or a mixture of a plurality of mutually different antibodies, in particular complement factors. The different antibodies then belong to different types of antibodies. In particular, in the case of opsonins, immunoglobulin G can also be covalently bound to one molecule each, superparamagnetic beads can each be covalently bound to immunoglobulin G or mixtures thereof. This has the advantage that any organism-foreign microorganism is labeled and can be separated from the sample in succession.
Es ist insbesondere vorgesehen, dass es sich bei den Mikroorganismen um Pathogene, insbesondere Bakterien und/oder Pilze handelt, und insbesondere es sich bei den Nukleinsäuren, die angereichert werden, um Anteile eines Genoms der Mikroorganismen oder gesamte Genome der Mikroorganismen handelt. Das hat den Vorteil, dass ein schnelles Verfahren zum Anreichern von Nukleinsäuren von Pathogenen zur Verfügung gestellt wird, was bei einem infizierten menschlichen Patienten wünschenswert ist. Gerade bei einer Sepsis ist eine schnelle Identifizierung und somit auch Anreicherung hoch relevant, da die Mortalität von Sepsispatienten schnell steigt. Eine schnelle Erkennung der Sepsis oder der Sepsis zu Grunde liegender Pathogene ermöglicht somit lebensrettende Sofortmaßnahmen. Das Anreichern teilweiser oder gesamter Pathogengenome ist vorteilhaft, um das Pathogen zu identifizieren und eine Resistenztestung durchzuführen. It is especially envisaged that the microorganisms are pathogens, in particular bacteria and / or fungi, and in particular the nucleic acids which are enriched are fractions of a genome of the microorganisms or entire genomes of the microorganisms. This has the advantage of providing a rapid method for accumulating nucleic acids from pathogens, which is desirable in an infected human patient. Especially in the case of sepsis, rapid identification and therefore also enrichment is highly relevant because the mortality of sepsis patients increases rapidly. Rapid detection of sepsis or sepsis of underlying pathogens thus provides life-saving emergency measures. Enriching partial or total pathogen genomes is beneficial in identifying the pathogen and performing resistance testing.
Weitere Merkmale ergeben sich aus der Beschreibung einer bevorzugten Ausführungsvariante gemäß der Figur. Dabei zeigt Further features will become apparent from the description of a preferred embodiment according to the figure. It shows
In dem in der
In dem in
Es erfolgt hier nach dem Markieren (Verfahrensschritt S1) ein Quantifizieren (Verfahrensschritt S2), beispielsweise über eine spezifische Detektion der markierten Mikroorganismen
Es folgt hier ein Abtrennen (Verfahrensschritt S3), bei dem die angereicherten und quantifizierten Mikroorganismen
Mit dem Abtrennen (Verfahrensschritt S3) und Waschen erreicht man, dass ein Polymerase-Kettenreaktion störendes Hämoglobin, freie DNA und sonstige nicht markierte Blutkomponenten
Ein Anteil der aufgereinigten Mikroorganismen
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