DE102014205098B4

DE102014205098B4 - Verfahren und Verwendungen von Mitteln zum Nachweis einer Denguevirus-Infektion

Info

Publication number: DE102014205098B4
Application number: DE102014205098.7A
Authority: DE
Inventors: Sven Reiche; Awadalkareem Ali Mohammed Adam; Christian Jassoy
Original assignee: Universitaet Leipzig
Current assignee: Universitaet Leipzig
Priority date: 2014-03-19
Filing date: 2014-03-19
Publication date: 2016-02-04
Anticipated expiration: 2034-03-20
Also published as: DE102014205098A1

Abstract

Verfahren zum spezifischen Nachweis einer Denguevirus-Infektion, umfassend den Nachweis von Antikörpern gegen Nichtstrukturprotein 2A aus Denguevirus aus einer biologischen Probe.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und Verwendungen von Mitteln zum spezifischen Nachweis einer Denguevirus-Infektion. Die Erfindung findet Anwendung in der medizinischen Diagnostik.
Dengue ist eine durch Stechmücken übertragene tropische Krankheit, die durch ein 1951 isoliertes Virus verursacht wird. Das Denguevirus wurde in vier unterschiedliche antigene Typen eingeteilt, die als Typen 1 bis 4 bezeichnet werden. Das Denguevirus gehört zur Familie der Flaviviridae, Gattung Flavivirus. Eine Infektion mit Denguevirus verursacht eine fieberhafte Erkrankung mit Abgeschlagenheit, Gliederschmerzen und anderen Symptomen, das sogenannte Denguefieber. Gelegentlich kommt es zu schweren hämorrhagischen Verläufen mit Blutungen auf Haut und Schleimhäuten sowie in inneren Organen, die tödlich verlaufen können. Eine Infektion mit einem der Virustypen erzeugt eine lebenslange Immunität gegen diesen Virustyp. Es ist jedoch eine mehrmalige Erkrankung aufgrund unterschiedlicher Virustypen möglich.
Das Denguefieber hat keine typische Symptomatik. Neben dem Denguevirus gibt es mehrere verwandte Viren, die ähnliche Krankheitssymptome hervorrufen können, ebenfalls durch Stechmücken übertragen werden und deren Verbreitungsgebiete mit dem des Denguevirus überlappen [1, 2]. Hierzu zählen andere Viren der Gattung Flavivirus, wie u.a. das Japanische-Enzephalitis-Virus, das Gelbfiebervirus und das West-Nil-Virus.
Es ist somit aufgrund von Symptomen und klinischen Untersuchungen nicht möglich, eine eindeutige Diagnose einer Denguevirus-Infektion zu stellen. Dafür ist eine labordiagnostische Untersuchung erforderlich. In den ersten fünf Tagen nach Infektion ist die verlässlichste Methode der Nachweis von Denguevirus-Nukleinsäuren mit der Polymerase-Kettenreaktion oder von Denguevirus-Antigenen in immunologischen Tests. In den folgenden Krankheitstagen nimmt die Diagnosemöglichkeit mit diesen Tests ab, weil die Konzentration an Virus im Körper der Erkrankten abnimmt. Gleichzeitig nimmt die Konzentration von IgM und IgG-Antikörpern gegen das Virus im Blut zu.
In Blutproben von Patienten werden daher als diagnostische Marker im frühen Stadium einer akuten Denguevirus-Infektion entweder Denguevirus-Nukleinsäuren in der Polymerase-Kettenreaktion oder Denguevirusantigene getestet, im späteren Stadium werden IgM-Antikörper gegen das Denguevirus in einfachen immunologischen Tests untersucht. Im Rahmen epidemiologischer Untersuchungen zur Erfassung von Bevölkerungsteilen, die bereits eine Denguevirus-Infektion durchlaufen haben, werden IgG-Antikörper gegen das Denguevirus in Blutproben des Patienten untersucht.
In etablierten Tests auf Antikörper gegen das Denguevirus werden Lysate des Denguevirus als Testantigen eingesetzt und die im Blut befindlichen Antikörper gegen das Dengevirus mit einem ELISA-Verfahren nachgewiesen. Zur Herstellung von Dengueviruslysaten wird das Virus im Speziallabor unter S3-Bedingungen herangezogen. Aufgrund des hohen Aufwands dieser Herstellungsmethode ist es wünschenswert, Viruslysate durch günstiger herzustellende Antigene zu ersetzen. Wichtiger ist noch, dass aufgrund der engen strukturellen Verwandtschaft des Denguevirus zu anderen Flaviviren unspezifische Reaktionen häufig sind, so dass eine Unterscheidung zwischen einer Erkrankung mit dem Denguevirus oder einem verwandten Virus in Fällen, in denen Viruslysat eingesetzt wird, nicht möglich ist.
Weitere Tests zum Nachweis einer Denguevirus-Infektion basieren auf dem Einsatz einzelner Proteine des Denguevirus als Testantigen. Es sind Verfahren bekannt, in denen das Hüllglykoprotein des Denguevirus (envelope-Glykoprotein, E), das Nichtstrukturprotein 1 des Denguevirus (NS1) oder auch eine Kombination aus Hüllglykoprotein, Nichtstrukturprotein 1 und Nichtstrukturprotein 3 des Denguevirus (E, NS1, NS3) zum Nachweis des Denguevirus eingesetzt werden ( EP 1 190 257 B1 , [3, 4, 5]). Die Nichtstrukturproteine können dabei mit anti human IgG Antikörpern nachgewiesen werden. [7]. Problematisch ist dabei, dass nicht alle Seren mit den Testantigenen reagieren und dadurch im Rahmen der Tests falsch negative Ergebnise zu erwarten sind. In einer Denguevirus-Studie [6] wurde beobachtet, dass das Hüllglykoprotein des Denguevirus in 94 % der Fälle erkannt wurde, das Nichtstrukturprotein 1 des Denguevirus in 40 % der Fälle, das Nichtstrukturprotein 3 lediglich in 26 % der Fälle.
Es besteht somit weiterhin Bedarf, Testverfahren und Mittel zum Nachweis einer Denguevirus-Infektion bereitzustellen, mit denen spezifisch eine Denguevirus-Infektion von einer Infektion mit anderen Flaviviren unterschieden werden kann. Gleichzeitig sollte die Denguevirus-Infektion bei hoher Sensitiviät und geringstmöglicher Falsch-Negativ- sowie Falsch-Positiv-Rate in einem einfachen Testverfahren nachgewiesen werden.
Die Aufgabe der Erfindung liegt daher in der Bereitstellung von verbesserten Verfahren zum Nachweis einer Denguevirus-Infektion in Patientenproben.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zum spezifischen Nachweis einer Denguevirus-Infektion, umfassend den Nachweis von Antikörpern gegen Nichtstrukturprotein 2A aus Denguevirus aus einer biologischen Probe.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Verwendung eines diagnostischen Kit zum Nachweis einer Denguevirus-Infektion aus einer biologischen Probe. Der erfindungsgemäß verwendete diagnostische Kit umfasst:

– Nichtstrukturprotein 2A aus Denguevirus oder Proteinfragmente davon und
– Mittel zum Nachweis von IgG oder IgM Antikörpern aus einer biologischen Probe.

Die Erfindung umfasst auch die Verwendung von Mitteln zum Nachweis von Antikörpern gegen Nichtstrukturprotein 2A aus Denguevirus zum spezifischen Nachweis einer Denguevirus-Infektion in dem erfindungsgemäßen Verfahren.
Ferner umfasst die Erfindung die Verwendung von Nichtstrukturprotein 2A aus Denguevirus zum spezifischen Nachweis einer Denguevirus-Infektion.
Die Erfindung beruht auf der Beobachtung der Erfinder, dass der Nachweis einer Denguevirus-Infektion aufgrund von Antikörpern gegen Nichtstrukturprotein 2A (hierin auch als „NS2A“ bezeichnet) eine sehr gute Unterscheidung des Denguevirus von anderen Flaviviren ermöglicht. Dies ist damit zu begründen, dass von allen Proteinen des Denguevirus Nichtstrukturprotein 2A die meisten strukturellen Unterschiede zu Proteinen anderer Flaviviren, insbesondere zu Proteinen aus Japanischem-Enzephalitis-Virus, Gelbfiebervirus und West-Nil-Virus, aufweist (vgl. Tabelle 2 in Ausführungsbeispiel 2). Damit werden mit der Erfindung unspezifische Reaktionen mit Seren von Patienten, die mit einem der vorgenannten anderen Flaviviren infiziert sind, im Vergleich zu bisherigen Nachweisverfahren, in denen andere Denguevirus-Proteine als Testantigen eingesetzt werden, minimiert. Aufgrund der Verwendung von NS2A als Testantigen im Vergleich zu anderen Denguevirus-Proteinen kann somit eine höhere Spezifität des Testverfahrens erzielt werden.
Für einen zuverlässigen Nachweis der Denguevirus-Infektion ist nicht nur erforderlich, dass unspezifische Reaktionen mit Seren von Patienten vermieden werden, die Infektionen mit anderen Flaviviren haben. Es ist zudem wichtig, unspezifische Reaktionen zwischen dem Testantigen und Antikörpern aus Proben von Nichtinfizierten zu vermeiden, um keine falsch positiven Ergebnisse zu erhalten. Die Erfinder konnten demonstrieren, dass NS2A als Testantigen zu keinen unspezifischen Reaktionen mit Seren von Personen führt, die nicht akut mit Denguevirus infiziert sind bzw. die Infektion bereits durchlaufen haben. Dadurch wird mit der Erfindung eine geringe Falsch-Positiv-Rate ermöglicht (2).
Ferner wurde überraschend festgestellt, dass in allen von den Erfindern getesteten Blutproben von Dengevirus-Infizierten Antikörper gegen NS2A nachweisbar waren. Dies war nicht zu erwarten, da für andere Denguevirus-Proteine (insbesondere das Hüllglykoprotein und die Nichtstrukturproteine 1 und 3) bekannt ist, dass nicht alle Infizierten Antikörper gegen das jeweilige Protein ausbilden [6]. Dadurch wird mit der Erfindung der Nachweis der Denguevirus-Infektion mit besonders geringer Falsch-Negativ-Rate möglich.
Nichtstrukturprotein 2A wird in der Literatur auch als nichtstrukturelles Glykoprotein 2A bezeichnet. Nichtstrukturproteine 2A der einzelnen Virustypen 1 bis 4 von Denguevirus unterscheiden sich in ihrer Aminosäuresequenz. Bekannte Aminosäuresequenzen für Nichtstrukturprotein 2A aus den Denguevirustypen 1 bis 4 (DENV1 bis DENV4) sind in der folgenden Tabelle 1 dargestellt: Tabelle 1
Innerhalb verschiedener Dengueviren der Virustypen 1 bis 4 variiert die Aminosäuresequenz von NS2A geringfügig. NS2A aus DENV1 weist bevorzugt eine Aminosäuresequenz auf, die mindestens 90 %, bevorzugt mindestens 95 %, Aminosäuresequenzidentität zu SEQ ID Nr. 1 besitzt. NS2A aus DENV2 weist bevorzugt eine Aminosäuresequenz auf, die mindestens 90 %, bevorzugt mindestens 95 %, Aminosäuresequenzidentität zu SEQ ID Nr. 2 besitzt. NS2A aus DENV3 weist bevorzugt eine Aminosäuresequenz auf, die mindestens 90 %, bevorzugt mindestens 95 %, Aminosäuresequenzidentität zu SEQ ID Nr. 3 besitzt. NS2A aus DENV4 weist bevorzugt eine Aminosäuresequenz auf, die mindestens 90 %, bevorzugt mindestens 95 %, Aminosäuresequenzidentität zu SEQ ID Nr. 4 besitzt. Besonders bevorzugt ist die Aminosäuresequenz von NS2A aus DENV1 bis DENV4 jeweils identisch zu SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 4, wie in Tabelle 1 dargestellt.
Nichtstrukturproteine 2A der unterschiedlichen Virustypen von Denguevirus (DENV1 bis DENV4) weisen zueinander nur eine geringe Aminosäuresequenzidentität auf. Wie aus dem in Ausführungsbeispiel 1 und der zugehörigen 1 dargestellten Alignment hervorgeht, weisen die in Tabelle 1 genannten Nichtstrukturproteine 2A aus DENV1 bis DENV4 zueinander eine Aminosäuresequenzidentität im Bereich von 34–45 % auf.
In einem erfindungsgemäßen Verfahren zum spezifischen Nachweis einer Denguevirus-Infektion wird eine biologischen Probe, vorzugsweise eines Menschen, auf das Vorhandensein von Antikörpern gegen NS2A (hierin auch als „anti-NS2A Antikörper“ bezeichnet) untersucht. Ergibt die Untersuchung, dass gegen NS2A gerichtete Antikörper in der biologischen Probe vorliegen, so zeigt dies spezifisch eine Denguevirus-Infektion an.
Unter Antikörpern gegen NS2A werden dabei im Sinne der Erfindung Antikörper verstanden, die spezifisch NS2A aus Denguevirus binden. Dies sind alle Antikörper, die spezifisch ein Nichtstrukturprotein 2A aus einem der Denguevirustypen 1 bis 4 binden.
Werden mit dem erfindungsgemäßen Verfahren in der biologischen Probe anti-NS2A Antikörper des Isotypen IgM nachgewiesen, so zeigt dies eine akute Denguevirus-Infektion an. Werden mit dem erfindungsgemäßen Verfahren in der biologischen Probe anti-NS2A Antikörper des Isotypen IgG nachgewiesen, so zeigt dies an, dass die biologische Probe von einem Individuum stammt, welches bereits eine Denguevirus-Infektion durchlaufen hat.
Bei der biologischen Probe, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren analysiert wird, handelt es sich bevorzugt um eine flüssige Probe, insbesondere eine Blutprobe.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst bevorzugt das Inkontaktbringen der biologischen Probe mit Nichtstrukturprotein 2A aus Denguevirus oder dessen Proteinfragmenten.
Dabei wird Nichtstrukturprotein 2A einer der vier Serotypen von Denguevirus (DENV1 bis DENV4) eingesetzt. Dabei ist jedes der Nichtstrukturproteine 2A aus den vier Serotypen von Denguevirus (DENV1 bis DENV4) geeignet, um eine Denguevirus-Infektion nachzuweisen. Es ist daher mit der Erfindung vorteilhaft möglich, mit dem Einsatz eines Nichtstrukturproteins 2A aus einem der vier Serotypen von Denguevirus eine Infektion mit jedem der Denguevirustypen (DENV1 bis DENV4) nachzuweisen. So wird beispielhaft beim Einsatz von NS2A aus DENV1 vorteilhaft neben einer Infektion mit Denguevirus Typ 1 auch eine Infektion mit Denguevirus Typ 2, Denguevirus Typ 3 oder Denguevirus Typ 4 angezeigt. Entsprechendes gilt für den Einsatz von NS2A aus DENV2, DENV3 oder DENV4. Bevorzugt wird bei der Erfindung NS2A aus Denguevirus Typ 2 eingesetzt.
Bevorzugt wird zum Nachweis einer Denguevirus-Infektion aus einer biologischen Probe eine Mischung verschiedener NS2A Proteine aus mehreren (mindestens zwei) Serotypen von Denguevirus eingesetzt. Dadurch kann vorteilhaft eine stärkere Reaktion herbeigeführt werden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsvariante der Erfindung wird zum Nachweis einer Denguevirus-Infektion aus einer biologischen Probe eine Mischung von NS2A-Proteinen aus Denguevirus Typ 1, Denguevirus Typ 2, Denguevirus Typ 3 und Denguevirus Typ 4 (oder Proteinfragmenten der jeweiligen NS2A-Proteine) eingesetzt. Dadurch wird besonders gut sichergestellt, dass Seren von Patienten mit Denguevirusinfektion von jedem der vier Serotypen des Denguevirus eine zuverlässige und deutlich nachweisbare Reaktion im erfindungsgemäßen Nachweis erzeugen. Da die einzelnen Denguevirustypen in unterschiedlichen Regionen der Welt in unterschiedlicher Häufigkeit vorkommen, wird mit dieser Ausführungsvariante ein Nachweis bereitgestellt, der überall in gleichermaßen zuverlässiger Weise eingesetzt werden kann.
In einer weiter bevorzugten Ausfürgungsvariante der Erfindung wird zum Nachweis einer Infektion mit einem bestimmten Serotyp des Denguevirus (DENV1, DENV2, DENV4 oder DENV4) als Testantigen jeweils ein NS2A aus Denguevirus Typ 1, Denguevirus Typ 2, Denguevirus Typ 3 und Denguevirus Typ 4 in einem Vergleichstest eingesetzt. Dabei wird die biologische Probe in mindestens vier separaten Testverfahren jeweils mit einem Testantigen, im Speziellen jeweils NS2A aus Denguevirus Typ 1, NS2A aus Denguevirus Typ 2, NS2A aus Denguevirus Typ 3 und NS2A aus Denguevirus Typ 4 (oder dessen jeweiligen Proteinfragmenten), in Kontakt gebracht. Dadurch wird vorteilhaft eine Typisierung des Denguevirustyps, der die Infektion bei dem Patienten verursacht hat, möglich. Dabei deutet die im Vergleich zu den anderen Testantigenen (NS2A aus den verschiedenen Dengueviruszypen) stärkste Reaktion auf den die Infektion verursachenden Denguevirustyp hin.
NS2A oder dessen Proteinfragmente werden bevorzugt in oberflächengebundener Form eingesetzt.
Die biologische Probe wird bevorzugt in verdünnter Form eingesetzt. Zum Verdünnen wird dabei beispielsweise gepufferte Salzlösung, z.B. PBS, eingesetzt, die ggf. mit einem inertem Protein, wie z.B. bovinem Serumalbumin, oder einem Gemisch inerter Proteine, wie z.B. Milchpulver, angereichert ist.
Die biologische Probe wird mit NS2A aus Denguevirus oder dessen Proteinfragmenten kontaktiert (inkubiert). Unter Proteinfragmenten von NS2A sind dabei im Sinne der Erfindung Fragmente von NS2A einer der vier Serotypen von Denguevirus (DENV1 bis DENV4) zu verstehen. Die Proteinfragmente haben bevorzugt eine Größe von mindestens 20, bevorzugt mindestens 30, besonders bevorzugt mindestens 40, ganz besonders bevorzugt mindestens 50 Aminosäureresten. Die Proteinfragmente von NS2A weisen bevorzugt eine Aminosäuresequenz auf, die eine Aminosäuresequenzidentität zu einer gleich großen Teilsequenz der Aminosäuresequenz des entsprechenden Nichtstrukturproteins 2A (NS2A aus DENV1, DENV2, DENV3 oder DENV4) von mindestens 90 % besitzt. Bevorzugt weist ein Proteinfragment von NS2A eine Aminosäuresequenz auf, die eine Aminosäuresequenzidentität zu einer gleich großen Teilsequenz von NS2A aus DENV1, DENV2, DENV3 oder DENV4, wie gemäß Tabelle 1 durch SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 3 und SEQ ID Nr. 4 definiert, von mindestens 90 %, besonders bevorzugt mindestens 95 %, ganz besonders bevorzugt von mindestens 98 % besitzt. Weiter bevorzugt weist ein Proteinfragment eine identische Aminosäuresequenz zu einer gleich großen Teilsequenz von SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 4 auf.
Bei dem eingesetzten NS2A handelt es sich um entweder natives NS2A, welches aus nativem Denguevirus-Lysat isoliert wurde, oder um rekombinantes NS2A. Aufgrund der einfachen, kostengünstigen und vergleichsweise ungefährlichen Herstellung wird rekombinantes NS2A bevorzugt. Dieses wird vorzugsweise durch rekombinante Expression in Bakterienzellen oder Säugerzellen gewonnen. Besonders bevorzugt ist NS2A, welches durch rekombinante Expression in Bakterienzellen, insbesondere Escherichia coli, gewonnen wurde.
Im Anschluss an das Inkontaktbringen der biologischen Probe mit Nichtstrukturprotein 2A aus Denguevirus oder dessen Proteinfragmenten erfolgt in einem erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt eine anschließende Sichtbarmachung der Bindung der anti NS2A-Antikörper aus der biologischen Probe an NS2A oder dessen Proteinfragmente durch eine enzymatische Reaktion. Dabei erfolgt die die Bindung (der anti-NS2A Antikörper aus der biologischen Probe an NS2A oder dessen Proteinfragmente) nachweisende enzymatische Reaktion durch ein Enzym, welches an einen Antikörper gekoppelt ist, der die anti-NS2A Antikörper aus der biologischen Probe spezifisch bindet.
Bevorzugt wird zur spezifischen Bindung der an NS2A oder dessen Proteinfragmente gebundenen anti-NS2A Antikörper aus der biologischen Probe ein anti-IgM oder anti-IgG Antikörper eingesetzt. Für den Nachweis von anti-NS2A Antikörpern aus einer menschlichen Probe, vorzugsweise einer Blutprobe, werden anti-human IgM oder anti-human IgG eingesetzt. Die Antikörper sind bevorzugt mit einem Enzym (einem sogenannten Reporterenzym) konjugiert, bevorzugt mit Meerettichperoxidase, alkalischer Phosphatase oder Glukose-Oxidase. Durch Kontaktieren des Enzyms mit einem Chromogen wird eine Farbreaktion erzeugt, anhand derer die Bindung der anti-NS2A Antikörper an NS2A nachgewiesen werden kann. Alternativ zur Konjugation mit einem Reporterenzym sind die anti-IgM oder anti-IgG Antikörper bevorzugt mit einem Fluorochrom konjugiert.
Der Nachweis der anti-NS2A Antikörper in der biologischen Probe erfolgt bevorzugt durch ein immunologisches Verfahren (Immunassay). Bevorzugt ist das immunologische Verfahren ausgewählt aus Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), Western-Blot und proteinbasierten Multiplex-Techniken (vorzugsweise beadbasierte Multiplex-Techniken, bevorzugt auf dem Luminex-Prinzip basierte beadbasierte Multiplex-Techniken).
Besonders bevorzugt ist das immunologische Verfahren ein ELISA.
Ein beispielhaftes erfindungsgemäßes ELISA-Verfahren umfasst folgende Schritte:
– Beschichtung:
Mikrotiterplatten werden mit NS2A oder Proteinfragmenten davon beschichtet. Dabei werden NS2A oder dessen Proteinfragmente bevorzugt in einer Konzentration von 1 bis 10 μg/ml eingesetzt (Beschichtungslösung). Als Lösungsmittel wird bevorzugt eine Salzlösung eingesetzt, besonders bevorzugt PBS oder 0,2 M Natriumhydrogencarbonatlösung pH 9. Die Beschichtung erfolgt bevorzugt mit einem Volumen von 50–250 μl je Vertiefung der Mikrotiterplatte (Well), bevorzugt 50–100 μl. Die Beschichtung erfolgt bevorzugt für einen Zeitraum von mindestens einer Stunde.
– Blockierung:
Die Beschichtungslösung wird entfernt und es erfolgt die Zugabe einer Blocklösung. Als Blocklösung wird eine mit einem inerten Protein angereichte Salzlösung eingesetzt. Bevorzugt wird als Salzlösung PBS eingesetzt. Als inertes Protein wird bevorzugt bovines Serumalbumin oder ein Proteingemisch, vorzugsweise Milchpulver, eingesetzt. Die Blockierung erfolgt bevorzugt mit einem Volumen von 50–300 μl je Well, bevorzugt 150–300 μl, wobei das Volumen der Blocklösung größer ist als das Volumen der zur Beschichtung der Mikrotiterplatten eingesetzten Beschichtungslösung. Die Blockierung erfolgt bevorzugt für einen Zeitraum von mindestens einer Stunde. Die Blockierung wird bevorzugt bei einer Temperatur von 30 bis 40 °C durchgeführt.
– Inkubation mit der biologischen Probe:
Die Blocklösung wird entfernt und es erfolgt die Zugabe der, vorzugsweise verdünnten, biologischen Probe. Als Verdünnungsmittel wird vorzugsweise eine mit einem inerten Protein angereichte Salzlösung eingesetzt, besonders bevorzugt die zur Blockierung eingesetzte Blocklösung. Die biologische Probe ist zweckmäßig verdünnt. Ist die biologische Probe eine menschliche Blutprobe, so ist diese vorzugsweise in einem Verhältnis von 1:100 bis 1:5000 (Anteil biologische Probe: Anteil Verdünnungslösung), bevorzugt mindestens 1:1000, verdünnt. Die Inkubation erfolgt bevorzugt mit einem Volumen von 50–250 μl je Well, bevorzugt 50–100 μl, wobei das Volumen der biologischen Probe gleich oder kleiner ist als das Volumen der zur Beschichtung der Mikrotiterplatten eingesetzten Beschichtungslösung. Die Inkubation mit der biologischen Probe erfolgt bevorzugt für einen Zeitraum von mindestens einer Stunde. Die Inkubation mit der biologischen Probe wird bevorzugt bei einer Temperatur von 30 bis 40 °C durchgeführt.
– Inkubation mit Nachweisantikörper:
Die Lösung mit der biologischen Probe wird verworfen und anschließend werden die Wells der Mikrotiterplatte ausgewaschen. Bevorzugt wird Wasser oder Salzlösung als Waschlösung eingesetzt. Anschließend erfolgt die Zugabe des verdünnten Nachweisantikörpers. Bevorzugt ist der Nachweisantikörper enzymkonjugiert, vorzugsweise mit Meerettichperoxidase, alkalischer Phosphatase oder Glukose-Oxidase. Als Nachweisantikörper werden vorzugweise anti-human IgM oder anti-human IgG Antikörper eingesetzt. Als Verdünnungsmittel wird vorzugsweise eine mit einem inerten Protein angereichte Salzlösung eingesetzt, besonders bevorzugt die zur Blockierung eingesetzte Blocklösung. Der Nachweisantikörper ist zweckmäßig verdünnt. Die Inkubation erfolgt bevorzugt mit einem Volumen von 50–250 μl je Well, bevorzugt 50–100 μl, wobei das Volumen des Nachweisantikörpers gleich oder kleiner ist als das Volumen der zur Beschichtung der Mikrotiterplatten eingesetzten Beschichtungslösung. Die Inkubation mit dem Nachweisantikörper erfolgt bevorzugt für einen Zeitraum von mindestens einer Stunde. Die Inkubation mit dem Nachweisantikörper wird bevorzugt bei einer Temperatur von 30 bis 40 °C durchgeführt.
– Sichtbarmachung der Bindung des Nachweisantikörpers an die anti-NS2A Antikörper aus der biologischen Probe durch enzymatische Reaktion:
Die Lösung mit dem Nachweisantikörper wird entfernt und anschließend werden die Wells der Mikrotiterplatte ausgewaschen. Bevorzugt wird Wasser oder Salzlösung als Waschlösung eingesetzt. Es erfolgt die Zugabe eines Chromogens, welches bei Kontakt mit dem Enzym, welches an den Nachweisantikörper gekoppelt ist, in einer Farbumschlagreaktion reagiert. Das Chromogen wird in einem Volumen von 50–250 μl je Vertiefung der Mikrotiterplatte (Well), bevorzugt 50–100 μl, eingesetzt. Dabei entspricht das Volumen des Chromogens bevorzugt dem Volumen der zur Beschichtung der Mikrotiterplatten eingesetzten Beschichtungslösung. Die Kontaktierung mit dem Chromogen erfolgt bevorzugt im Dunkeln. Das Chromogen wird vorzugsweise so lang inkubiert, bis in einer Positivkontrolle eine Farbreaktion sichtbar ist. Die enzymatische Reaktion wird anschließend vorzugsweise abgestoppt, bevorzugt durch Säurezugabe (beispielsweise durch Schwefelsäure). Anschließend erfolgt eine photometrische Analyse.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Verwendung eines diagnostischen Kit zum Nachweis einer Denguevirus-Infektion aus einer biologischen Probe. Erfindungsgemäß umfasst der Kit NS2A aus Denguevirus oder Proteinfragmente davon sowie Mittel zum Nachweis der Bindung von anti-NS2A Antikörpern aus einer biologischen Probe an NS2A oder dessen Proteinfragmente. In der Anwendung wird mit einem erfindungsgemäß verwendeten diagnostischen Kit ein oben beschriebenes erfindungsgemäßes Verfahren durchgeführt.
Bei dem erfindungsgemäß verwendeten Kit sind die einzelnen Komponenten bevorzugt separat verpackt. Die einzelnen Komponenten des erfindungsgemäß verwendeten Kits sind bevorzugt bei Temperaturen zwischen 1 und 25 °C über mindestens mehrere Wochen lagerstabil.
In einem erfindungsgemäß verwendeten Kit liegen NS2A oder dessen Proteinfragmente vorzugsweise als Lyophilisat oder oberflächengebunden auf einem Träger vor. Bevorzugte Träger sind ausgewählt aus Mikrotiterplatten oder Beads. NS2A oder dessen Proteinfragmente werden wie oben zum erfindungsgemäßen Verfahren definiert eingesetzt. Bevorzugt kommt rekombinantes NS2A oder Proteinfragmente davon zum Einsatz, da diese besonders einfach, kostengünstig und vergleichsweise ungefährlich hergestellt werden können.
Bevorzugt ist in einem erfindungsgemäß verwendeten Kit NS2A aus mindestens einem der Serotypen des Denguevirus (DENV1, DENV2, DENV3, DENV4) enthalten. Besonders bevorzugt enthält ein erfindungsgemäß verwendeter Kit mindestens NS2A aus Denguevirus Typ 2. Weiter besonders bevorzugt sind mindestens zwei verschiedene NS2A Proteine aus unterschiedlichen Serotypen des Denguevirus enthalten. Vorzugsweise handelt es sich dabei bei einem der NS2A Proteine um NS2A aus Denguevirus Typ 2.
In einem weiter bevorzugten erfindungsgemäß verwendeten Kit ist NS2A aus allen der vier Serotypen des Denguevirus (DENV1, DENV2, DENV3, DENV4) enthalten. Dies ermöglicht einerseits einen einzelnen Nachweistest mit den vier NS2A-Proteinen der unterschiedlichen Denguevirustypen als Testantigene und damit vorteilhaft einen universellen Einsatz des diagnostischen Kits. Andererseits ermöglicht diese Ausgestaltung einer Typisierung der biologischen Probe hinsichtlich eines bestimmten Denguevirustyps. Dafür werden in der Anwendung die vier NS2A-Proteine separat in einzelnen Tests als Testantigen eingesetzt.
Die einzelnen NS2A Proteine liegen im erfindungsgemäß verwendeten Kit entweder als Proteingemisch oder separat voneinander verpackt vor. Davon bevorzugt ist eine separate Bereitstellung der NS2A Proteine.
In einem bevorzugten erfindungsgemäß verwendeten Kit sind als Mittel zum Nachweis der Bindung von anti-NS2A Antikörpern aus einer biologischen Probe an NS2A oder dessen Proteinfragmente anti-IgM oder anti-IgG Antikörper enthalten. Diese liegen in einem diagnostischen Kit bevorzugt als Lyophilisat oder in gepufferter Lösung vor. Bevorzugt sind die im diagnostischen Kit enthaltenen Antikörper als Lyophilisat enthalten. Dieses wird in der Anwendung durch den Nutzer in Lösung gebracht. Auf diese Weise ist der diagnostische Kit vor der Anwendung besonders lang lagerstabil. Die anti-IgM oder anti-IgG Antikörper sind bevorzugt mit einem Enzym, vorzugsweise einem Reporterenzym, konjugiert. Besonders bevorzugte Reporterenzyme sind ausgewählt aus Meerettichperoxidase, alkalischer Phosphatase oder Glukose-Oxidase. Alternativ dazu sind die anti-IgM oder anti-IgG Antikörper bevorzugt mit einem Fluorochrom konjugiert.
In weiteren Ausgestaltungen eines erfindungsgemäß verwendeten diagnostischen Kits sind weitere Bestandteile enthalten, die zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens benötigt werden. In besonders bevorzugten Ausgestaltungen des erfindungsgemäß verwendeten diagnostischen Kits sind Pufferlösungen oder Salzgemische enthalten. In einer bevorzugten Ausgestaltung eines erfindungsgemäß verwendeten diagnostischen Kits sind Salzgemische enthalten, die nach Zugabe einer definierten Menge (vorzugsweise sterilen) Wassers eine gepufferte Salzlösung ergeben. Ggf. ist den Salzgemischen ein inertes Protein oder Proteingemisch beigemengt.
In einer weiteren Ausgestaltung eines erfindungsgemäß verwendeten diagnostischen Kits ist als weitere Komponente ein Chromogen, vorzugsweise in gelöster Form, enthalten.
Ein besonders bevorzugter diagnostischer Kit enthält Bestandteile zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens als ELISA. Dabei enthält das Kit die folgenden Bestandteile:

– als Testantigen: NS2A oder Proteinfragmente davon, vorzugsweise in oberflächengebundener Form in den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte,
– mindestens eine Mikrotiterplatte,
– als Nachweisantikörper: mit einem Reporterenzym gekoppelter anti-IgG oder anti-IgM Antikörper, vorzugsweise anti-human IgG oder anti-human IgM Antikörper, vorzugsweise als Lyophilisat,
– bevorzugt Pufferlösungen oder Salzgemische zur Herstellung von Pufferlösungen,
– bevorzugt ein Chromogen, welches von dem Reporerenzym umgesetzt wird.

Liegt der Antikörper als Lyophilisat vor, enthält das Kit vorzugsweise eine Salzlösung, vorzugsweise PBS, als Lösungsmittel. Das Reporterenzym, mit dem der Nachweisantikörper gekoppelt ist, ist bevorzugt ausgewählt aus Meerettichperoxidase, alkalischer Phosphatase oder Glukose-Oxidase.
Als Pufferlösungen sind bevorzugt zumindest eine Blocklösung, wie oben definiert, enthalten. Alternativ dazu ist ein Salz-Protein-Gemisch enthalten, mit dem durch Zugabe einer definierten Menge Wasser eine Blocklösung, wie oben definiert, erhalten werden kann. Weiterhin ist in einem erfindungsgemäß verwendeten diagnostischen Kit als Waschlösung (zum Auswaschen der Vertiefungen der Mikrotiterplatte) bevorzugt steriles, destilliertes Wasser oder eine gepufferte Salzlösung (vorzugsweise PBS) enthalten. Zum Abstoppen der enzymatischen Reaktion ist in einem diagnostischen Kit bevorzugt eine Säure, besonders bevorzugt Schwefelsäure, enthalten.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Verwendung von Mitteln zum Nachweis von Antikörpern gegen Nichtstrukturprotein 2A aus Denguevirus, bevorzugt aus einer biologischen Probe, zum spezifischen Nachweis einer Denguevirus-Infektion in erfindungsgemäßen Verfahren. Dabei werden bevorzugt Mittel zur Durchführung von Immunassays, insbesondere zur Durchführung von ELISA, Western-Blot und proteinbasierten Multiplex-Techniken (vorzugsweise beadbasierte Multiplex-Techniken, bevorzugt auf dem Luminex-Prinzip basierte beadbasierte Multiplex-Techniken), zum spezifischen Nachweis einer Denguevirus-Infektion verwendet. Bevorzugt umfasst die Verwendung eines erfindungsgemäßen Verfahrens den Nachweis von spezifischen Antikörpern, insbesondere der Isotypen IgM oder IgG, gegen NS2A aus Denguevirus aus einer biologischen Probe. Das Vorliegen von anti-NS2A Antikörpern dient als Indikator für das Vorliegen einer Denguevirus-Infektion.
Bevorzugt erfolgt die erfindungsgemäße Verwendung unter Einsatz eines diagnostischen Kits, der NS2A aus Denguevirus oder dessen Proteinfragmente sowie Mittel zum Nachweis von IgG oder IgM Antikörpern aus einer biologischen Probe enthält. Vorzugsweise wird ein erfindungsgemäßer diagnostischer Kit, wie oben definiert, eingesetzt.
Ein weiterer Aspekt ist die Verwendung eines Verfahrens zum Nachweis von Antikörpern gegen das NS2A aus Denguevirus zum spezifischen Nachweis einer Denguevirus-Infektion. Bevorzugt kommt dabei ein erfindungsgemäßes Verfahren, wie oben beschrieben, zum Einsatz.
Mit der Erfindung ist es auch möglich, das Vorliegen einer Infektion mit einem der verschiedenen Denguevirustypen (DENV1 bis DENV4) nachzuweisen. Dies eignet sich besonders im Rahmen epidemiologischer Analysen, um das Vorkommen von Infektionen mit Denguevirus der jeweiligen Typen in der Bevölkerung zu analysieren und zu überwachen.
Um das Vorliegen einer Infektion mit einem der verschiedenen Denguevirustypen (DENV1 bis DENV4) nachzuweisen, erfolgt im Rahmen der Erfindung der Nachweis von Antikörpern gegen NS2A aus jedem der vier Denguevirustypen in einem Vergleichsversuch. Somit werden im Rahmen der Erfindung in einzelnen Tests Antikörper gegen NS2A aus jedem der Denguevirustypen (DENV1 bis DENV4) aus einer biologischen Probe nachgewiesen. Dies erfolgt, indem – beispielsweise in einem erfindungsgemäßen Verfahren – zumindest vier Analysen mit NS2A aus jedem der Denguevirustypen, bevorzugt parallel, durchgeführt werden und die Ergebnisse anschließend miteinander verglichen werden. Die im Vergleich zu den anderen Testantigenen (NS2A aus den verschiedenen Dengueviruszypen) stärkste Reaktion deutet auf den die Infektion verursachenden Denguevirustyp hin. So zeigt beispielsweise eine stärkere Bindung von anti-NS2A Antikörpern aus der biologischen Probe bei dem Versuch mit NS2A aus DENV1 als Testantigen im Vergleich zu den jeweiligen Versuchen mit NS2A aus DENV2, DENV3 und DENV4 als Testantigen auf das Vorliegen einer Infektion mit Denguevirus Typ 1 hin. Analoges gilt, wenn die stärkere Bindung von anti-NS2A Antikörpern aus der biologischen Probe bei dem Versuch mit NS2A aus DENV2, DENV3 oder DENV4 als Testantigen im Vergleich zu den jeweils anderen Versuchen nachgewiesen wird. Dies zeigt dann entsprechend das Vorliegen einer Infektion mit Denguevirus Typ 2, Typ 3 oder Typ 4 an.
Mit der Erfindung werden Verfahren und Verwendungen von Mitteln zum Nachweis einer Denguevirus-Infektion bereitgestellt, die eine sehr gute Unterscheidung einer Denguevirus-Infektion von Infektionen mit anderen Flaviviren ermöglichen. Es werden im Vergleich zu bisherigen Verfahren, in denen andere Denguevirus-Proteine als Testantigen eingesetzt werden, unspezifische Reaktionen vermindert. Dadurch bietet die Erfindung ein Testverfahren mit höherer Spezifität. Gleichzeitig werden unspezifische Reaktionen mit biologischen Proben von Nichtinfizierten vermieden, so dass mit der Erfindung eine verminderte Falsch-Positiv-Rate erzielt wird. Gleichzeitig erfolgt mit der Erfindung der Nachweis der Denguevirus-Infektion mit besonders geringer Falsch-Negativ-Rate, da alle getesteten Blutproben anti-NS2A Antikörper aufwiesen. Die Kombination dieser Vorteile hebt die Erfindung von allen bisher bekannten Testverfahren vorteilhaft ab.
Folgendes Ausführungsbeispiel soll die Erfindung näher erläutern, ohne diese auf das Beispiel zu beschränken.
1 Aminosäuresequenzvergleich zwischen NS2A aus einem der Denguevirustypen 1 bis 4 (DENV1 bis DENV4) als Referenz mit den NS2A der jeweils anderen Denguevirustypen. a) Alignment der Aminosäuresequenzen von NS2A aus DENV2, DENV3 und DENV4 zu NS2A aus DENV1. b) Alignment der Aminosäuresequenzen von NS2A aus DENV1, DENV3 und DENV4 zu NS2A aus DENV2. c) Alignment der Aminosäuresequenzen von NS2A aus DENV1, DENV2 und DENV4 zu NS2A aus DENV3. d) Alignment der Aminosäuresequenzen von NS2A aus DENV1, DENV2 und DENV3 zu NS2A aus DENV4.
2 Ergebnis einer ELISA-Untersuchung von Seren von Denguefieber-Patienten (A–I) und von Nichtinfizierten (J–S, als Vergleich), wie in Beispiel 1 beschrieben. Die waagerechte Linie kennzeichnet den Mittelwert plus 3 Standardabweichungen der negativen Seren.
Ausführungsbeispiel 1: Vergleich der Aminosäuresequenzen von Nichtstrukturproteinen 2A aus Denguevirus der Typen 1 bis 4
Es wurde ein Alignment der Aminosäuresequenzen der verschiedenen Nichtstrukturproteine 2A aus Dengevirus Typ 1 bis 4 durchgeführt. Die Ergebnisse sind in 1 dargestellt.
Ausführungsbeispiel 2: Übersicht der Aminosäuresequenzidentiät zwischen Proteinen aus Dengevirus und korrespondierenden Proteinen anderer Flaviviren (West-Nil-Virus, Gelbfiebervirus, Japanisches Enzephalitis-Virus)
Es wurde jeweils einzeln ein Alignment von je fünf Aminosäuresequenzen der Proteine (Capsidprotein, Membranprotein, Hüllprotein, Nichtstrukturproteine 1, 2A, 2B) pro Denguevirus Typ (DENV1, DENV2, DENV3, DENV4) mit je fünf korrespondierenden Proteinsequenzen aus West-Nil-Virus, Japanischem-Enzephalitis-Virus und Gelbfiebervirus durchgeführt.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2:

Protein	Darstellung der Aminosäuresequenzidentität (%) als Mittelwerte der einzeln für die vier Denguevirus-Typen (DENV1, DENV2, DENV3, DENV4) durchgeführten Sequenzvergleiche mit korrespondierenden Proteinen von
Protein	West-Nil-Virus	Japanischem-Enzephalitis-Virus	Gelbfiebervirus
Capsid (C)	29.0	30.4	19.5
Membran (M)	33.6	35.1	37.3
Hüllprotein, (envelope) E	37.5	39.3	35.9
NS1	50.7	50.5	40.9
NS2A	21.8	18.3	21.7
NS2B	37.4	35.6	33.6

Wie aus Tabelle 2 ersichtlich ist, weist Nichtstrukturprotein 2A die geringste Sequenzidentität zu den korrespondierenden Proteinen aus anderen Flaviviren auf.
Ausführungsbeispiel 3: Nachweis von anti-NS2A Antikörpern aus humanen Blutproben im ELISA
Als Testantigen wird rekombinantes NS2A aus Denguevirus gemäß SEQ ID Nr. 2 eingesetzt. Die rekombinante Expression erfolgt in E. coli. Anschließend erfolgte eine Aufreinigung von NS2A mittels Affinitätschromatographie.
In einem erfindungsgemäßen Verfahren werden Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit jeweils 50 μl einer Lösung des rekombinanten NS2A in einer Konzentration von 4 μg/ml in 0,2 M Natriumhydrogencarbonat pH 9,0 befüllt. Nach mehrstündiger Inkubation wird die Beschichtungslösung verworfen und die Vertiefungen der Mikrotiterplatte werden mit PBS/0,1% Tween 20 mehrfach gespült. Anschließend werden 250 μl einer Blocklösung (5 Gew.-% Milchpulver in PBS) in die Vertiefungen gefüllt. Nach 90minütiger Inkubation bei 37 °C wird die Blocklösung verworfen.
Seren von Donoren mit (Proben A–I in 2) bzw. ohne (Proben J–S in 2) akute Denguevirus-Infektion werden in Blocklösung 1:2000 verdünnt. Jeweils 50 μl des verdünnten Serums wird in die Vertiefungen der Mikrotiterplatten gefüllt. Nach 90minütiger Inkubation bei 37 °C werden die Proben aus der Mikrotiterplatte entfernt. Die Vertiefungen werden mehrfach mit Wasser und abschließend mit PBS/0,1% Tween 20 gespült.
Als Nachweisantikörper werden mit Meerrettichperoxidase-gekoppelte polyklonale Ziege anti-human IgM Antikörper eingesetzt, welche in Blocklösung aufgenommen werden. Jeweils 50 μl des verdünnten Antikörpers wird in die Vertiefungen der Mikrotiterplatten gefüllt. Nach 90minütiger Inkubation bei 37 °C werden die Antikörper aus der Mikrotiterplatte entfernt. Die Vertiefungen werden mehrfach mit Wasser und abschließend mit PBS/0,1% Tween 20 gespült. Es erfolgt eine anschließende Farbumschlagreaktion unter Verwendung von o-Phenylendiamin als Chromogen. Die Farbreaktion wird mit Schwefelsäure abgestoppt. Es erfolgt eine photometrische Messung bei 450 nm.
Die Ergebnisse sind in 2 dargestellt. Die neun Seren A–I von Donoren mit Denguevirus-Infektion weisen sämtlich Antikörper gegen NS2A auf, wie an der höheren Lichtabsorption bei 450 nm abgelesen werden kann. Die zehn Seren J–S von Nichtinfizierten wurden in dem erfindungsgemäßen Verfahren negativ getestet.
Zitierte Nichtpatentliteratur

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Claims

Verfahren zum spezifischen Nachweis einer Denguevirus-Infektion, umfassend den Nachweis von Antikörpern gegen Nichtstrukturprotein 2A aus Denguevirus aus einer biologischen Probe.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die biologische Probe eine Blutprobe eines Menschen ist.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei der Nachweis der Antikörper gegen NS2A aus der biologischen Probe durch ein immunologisches Verfahren erfolgt.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, umfassend das Inkontaktbringen einer biologischen Probe mit Nichtstrukturprotein 2A aus Denguevirus oder Proteinfragmenten davon.
Verfahren nach Anspruch 4, umfassend eine anschließende Sichtbarmachung der Bindung der Antikörper aus der biologischen Probe an Nichtstrukturprotein 2A aus Denguevirus oder dessen Proteinfragmente durch eine enzymatische Reaktion.
Verwendung eines diagnostischen Kit, umfassend: – Nichtstrukturprotein 2A aus Denguevirus oder Proteinfragmente davon und – Mittel zum Nachweis von IgG oder IgM Antikörpern aus einer biologischen Probe, zum Nachweis einer Denguevirus-Infektion aus einer biologischen Probe.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei Nichtstrukturprotein 2A aus Denguevirus oder dessen Proteinfragmente in oberflächengebundener Form eingesetzt werden.
Verwendung nach Anspruch 6 oder 7, wobei als Mittel zum Nachweis von IgG oder IgM Antikörpern aus einer biologischen Probe ein spezifischer Antikörper gegen IgG oder IgM zum Nachweis eingesetzt wird.
Verwendung von Mitteln zum Nachweis von Antikörpern gegen Nichtstrukturprotein 2A aus Denguevirus zum spezifischen Nachweis einer Denguevirus-Infektion in einem Verfahren der Ansprüche 1 bis 5.
Verwendung von Nichtstrukturprotein 2A aus Denguevirus zum spezifischen Nachweis einer Denguevirus-Infektion.