DE102009058169A1 - Protein or polypeptide for binding to tubulin and / or microtubule structures - Google Patents
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Abstract
Dargestellt und beschrieben ist ein Protein oder Polypeptid umfassend eine Aminosäuresequenz umfassend mindestens einen lysinreichen Sequenzbereich, wobei das Protein oder Polypeptid an Tubulin bindet.Shown and described is a protein or polypeptide comprising an amino acid sequence comprising at least one lysine-rich sequence region, wherein the protein or polypeptide binds to tubulin.
Description
Die Erfindung betrifft ein Protein oder Polypeptid umfassend eine Aminosäuresequenz umfassend mindestens einen lysinreichen Sequenzbereich, wobei das Protein oder Polypeptid an Tubulin bindet. Vorzugsweise bezieht sich die Erfindung auf einen Biomarker für Tubulin, sowie auf einen Mikrotransporter zur Einbringung von Wirkstoffen in Zellen, umfassend das Protein oder Polypeptid gemäß Anspruch 1.The invention relates to a protein or polypeptide comprising an amino acid sequence comprising at least one lysine-rich sequence region, wherein the protein or polypeptide binds to tubulin. Preferably, the invention relates to a biomarker for tubulin, as well as to a microtransporter for delivery of drugs into cells, comprising the protein or polypeptide according to
Mikrotubuli sind neben Mikrofilamenten und Intermediärfilamenten ein wichtiger Bestandteil der Zytoskelettstruktur eukaryontischer Zellen. Das Zytoskelett erfüllt nicht nur statische, strukturelle Aufgaben, es ist auch an der Entwicklung und der Funktion einzelner Zelltypen maßgeblich beteiligt. Grundbaustein der hohlzylindrisch aufgebauten Mikrotubuli sind Protofilamente, welche vornehmlich aus α- und β-Tubulin Heterodimeren gebildet werden. Im Zentrosom der Zelle wird zudem auch γ-Tubulin exprimiert, welches an der Bildung neuer Mikrotubuli im Zentrosombereich beteiligt ist. Mikrotubuli bilden das Gerüst für intrazelluläre Transportprozesse und sind an der Bildung des Spindelapparats während der Zellteilung maßgeblich beteiligt. Der Auf- und Abbauprozess der Mikrotubuli ist sehr dynamisch und wird durch das MTOC (microtubule organizing center) zentral gesteuert.In addition to microfilaments and intermediary filaments, microtubules are an important part of the cytoskeleton structure of eukaryotic cells. The cytoskeleton not only performs static, structural tasks, it is also involved in the development and function of individual cell types. The basic building block of the hollow-cylindrical microtubules are protofilaments, which are predominantly formed from α- and β-tubulin heterodimers. In the centrosome of the cell also γ-tubulin is expressed, which is involved in the formation of new microtubules in the centrosome region. Microtubules form the framework for intracellular transport processes and are involved in the formation of the spindle apparatus during cell division. The microtubule assembly and disassembly process is very dynamic and centrally controlled by the MTOC (microtubule organizing center).
Ein intaktes Zytoskelett, insbesondere eine intakte Mikrotubulistruktur ist physiologisch von großer Bedeutung, um den korrekten Transport und eine gleichmäßige Verteilung verschiedener wichtiger Proteine und Zellorganellen zu gewährleisten. Defekte in der Funktionalität der Mikrotubulistrukturen oder deren assoziierten Proteinen können zu schwere Krankheiten wie beispielsweise Alzheimer führen. Zudem werden Chemotherapeutika, wie Vinblastin oder Paclitaxel gezielt eingesetzt, um den korrekten Aufbau von Mikrotubuli in Krebszellen zu stören. Eine unkontrollierte Zellteilung wird dadurch gehemmt. Für das bessere Verständnis der Zytoskelettstrukturen und dem möglichen Einfluss von Medikamenten auf Mikrotubuli ist es von erheblicher Bedeutung, Zytoskelettstrukturen, insbesondere Mikrotubulistrukturen und ihre Veränderungen in Zellen nachzuweisen.An intact cytoskeleton, especially an intact microtubule structure, is physiologically important in order to ensure the correct transport and uniform distribution of various important proteins and cell organelles. Defects in the functionality of the microtubule structures or their associated proteins can lead to serious diseases such as Alzheimer's disease. In addition, chemotherapeutic agents such as vinblastine or paclitaxel are used selectively to disrupt the correct assembly of microtubules in cancer cells. An uncontrolled cell division is thereby inhibited. For a better understanding of the cytoskeletal structures and the possible influence of drugs on microtubules, it is of considerable importance to detect cytoskeletal structures, especially microtubule structures, and their changes in cells.
Im Stand der Technik sind bereits spezifische Antikörper bekannt, die zum Nachweis von Tubulin in vitro oder in vivo verwendet werden können.
Es besteht daher die Notwendigkeit, ein schnelleres, jedoch auch hinsichtlich des Kostenaufwands und der Nachweisgenauigkeit optimiertes Nachweismittel für Tubulin, bzw. Mikrotubulistrukturen bereitzustellen.There is therefore a need to provide a faster, but also in terms of cost and accuracy of detection optimized detection means for tubulin, or Mikrotubulistrukturen.
Gelöst wird die obenstehende Aufgabe durch die Bereitstellung des erfindungsgemäßen Proteins oder Polypeptids nach Anspruch 1, welches eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens einen lysinreichen Sequenzbereich aufweist, wobei das Protein oder Polypeptid an Tubulin bindet. Unter einem lysinreichen Sequenzbereich ist ein Sequenzbereich zu verstehen, der mindestens einen Lysinrest, bevorzugt jedoch mehrere, in unmittelbarer Nähe angeordnete Lysinreste aufweist. Erfindungsgemäß handelt es sich um ein künstlich hergestelltes Polypeptid oder um ein isoliertes Protein oder einen daraus isolierten Unterabschnitt. Überraschenderweise wurde in Laboruntersuchungen festgestellt, dass der peroxisomale Biogenesefaktor PEX14 mit hoher Affinität an Tubulin bindet. Die Untersuchungen zeigten, dass der Bindungsbereich des Proteins an Tubulin mindestens einen Sequenzabschnitt aufweist, der lysinhaltig ist. Dieser Sequenzabschnitt ist entscheidend an der Bindung des peroxisomalen Biogenesefaktors PEX14 an Tubulin beteiligt. Das erfindungsgemäße Protein oder Polypeptid umfasst mindestens einen solchen lysinreichen Sequenzabschnitt. Vorteilhafterweise kann das erfindungsgemäße Protein oder Polypeptid biochemisch markiert werden und so unmittelbar als Biomarker zum Nachweis von Tubulinstrukturen eingesetzt werden. Ebenso ist auch die Kopplung an einen medizinischen Wirkstoff möglich, der in Verbindung mit dem erfindungsgemäßen Protein oder Polypeptid seinen Wirkort in der Zelle erreichen kann.The above object is achieved by providing the protein or polypeptide of
Gemäß einer Ausführungsform weist das Protein oder Polypeptid eine Aminosäuresequenz auf, die mindestens die Sequenz Phe-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Phe-Xaa-Xaa-Xaa-Lys umfasst. Die beiden voneinander beabstandeten Phenylalaninreste unterstützen die Bindungsaffinität des erfindungsgemäßen Proteins oder Polypeptids an Tubulin.According to one embodiment, the protein or polypeptide has an amino acid sequence which has at least the sequence Phe-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaaa. Phe-Xaa-Xaa-Xaa-Lys. The two spaced apart phenylalanine residues support the binding affinity of the protein or polypeptide of the invention to tubulin.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung weist das Protein oder Polypeptid eine Aminosäuresequenz auf, die mindestens die Sequenz Lys-Phe-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Phe-Xaa-Xaa-Xaa-Lys (SEQ ID NO: 1) umfasst. Erfindungsgemäß wird die Bindungsaffinität des Proteins oder Polypeptids durch zwei voneinander beabstandete lysinhaltige Sequenzbereiche noch erhöht. Die positiv geladenen Lysinreste binden bevorzugt an stark negativ geladene Bereiche des Tubulins, wie beispielsweise Glutamatreste.According to a further embodiment of the invention, the protein or polypeptide has an amino acid sequence which has at least the sequence Lys-Phe-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa -Xaa-Xaa-Phe-Xaa-Xaa-Xaa-Lys (SEQ ID NO: 1). According to the invention, the binding affinity of the protein or polypeptide is further increased by two lysine-containing sequence regions spaced apart from one another. The positively charged lysine residues preferentially bind to strongly negatively charged regions of the tubulin, such as glutamate residues.
Erfindungsgemäß bindet auch ein Protein oder Polypeptid an Tubulin, sofern es eine Aminosäuresequenz mit der Sequenz Lys-Phe-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Phe-Xaa-Lys-Lys-Lys (SEQ. ID NO: 2) umfasst.Also, according to the present invention, a protein or polypeptide binds to tubulin if it has an amino acid sequence having the sequence Lys-Phe-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa Xaa-Phe-Xaa-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 2).
Die Erfindung betrifft insbesondere ein Protein oder Polypeptid gemäß den vorgenannten Ausführungsformen umfassend eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 3 oder eine Teilsequenz davon. SEQ ID NO: 3 betrifft die Aminosäuren 20 bis 78 des N-terminalen Bereichs des humanen peroxisomalen Biogenesefaktors PEX14. Erfindungsgemäß ist auch ein Teilbereich aus diesem Abschnitt für die Bindung ausreichend, insbesondere sofern er zwei lysinreiche Sequenzbereiche aufweist, d. h. Sequenzbereiche in denen mindestens ein Lysinrest vorhanden ist. Ebenso ist erfindungsgemäß eine Aminosäuresequenz geeignet, sofern sie eine durch Substitution, Insertion oder Addition von Aminosäuren abgewandelte Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 3 umfasst. Bevorzugt sind die die Lysinreste umgebenden Sequenzbereiche reich an den Aminosäuren Alanin, Threonin und Arginin.The invention particularly relates to a protein or polypeptide according to the aforementioned embodiments comprising an amino acid sequence according to SEQ ID NO: 3 or a partial sequence thereof. SEQ ID NO: 3 relates to amino acids 20 to 78 of the N-terminal region of the human peroxisomal biogenesis factor PEX14. According to the invention, a subregion from this section is also sufficient for the binding, in particular if it has two lysine-rich sequence regions, ie. H. Sequence areas in which at least one lysine residue is present. Likewise, an amino acid sequence according to the invention is suitable provided that it comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 modified by substitution, insertion or addition of amino acids. Preferably, the sequence regions surrounding the lysine residues are rich in the amino acids alanine, threonine and arginine.
Die Erfindung betrifft auch ein Protein oder Polypeptid umfassend eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 4. Diese Sequenz betrifft die Aminosäuren 1–78 des N-terminalen Bereichs des humanen peroxisomalen Biogenesefaktors PEX14.The invention also relates to a protein or polypeptide comprising an amino acid sequence according to SEQ ID NO: 4. This sequence relates to amino acids 1-78 of the N-terminal region of the human peroxisomal biogenesis factor PEX14.
Bevorzugt bildet das Protein oder Polypeptid eine dreidimensionale Struktur aus, welche mindestens drei α-Helices umfasst. Die Bindung an Tubulin ist optimal, wenn die drei α-Helices in etwa U-förmig angeordnet sind. Sie können durch eine vierte diagonale Helix stabilisiert werden. Ein Beispiel einer bevorzugt ausgebildeten dreidimensionalen Struktur des erfindungsgemäßen Proteins oder Polypeptids ist in
Gemäß einer weiteren Ausführungsform liegt das Protein oder Polypeptid in seiner Bindung an Tubulin als Dimer vorliegt. Bevorzugt liegt das Protein oder Polypeptid an Glutathion-S-Transferase (GST) gekoppelt vor. GST fördert die Bildung von Dimeren fördert. Die Dimerisierung findet erfindungsgemäß bereits vor der Bindung an das Zielprotein Tubulin statt. Beispielsweise handlet es sich bei dem erfindungsgemäßen Protein oder Polypeptid um ein Fusionsprotein umfassend GST und die an Tubulin bindende Aminosäuresequenz.In another embodiment, the protein or polypeptide is present as a dimer in its binding to tubulin. Preferably, the protein or polypeptide is coupled to glutathione-S-transferase (GST). GST promotes the formation of dimers promotes. According to the invention, the dimerization already takes place before the binding to the target protein tubulin. For example, the protein or polypeptide of the present invention is a fusion protein comprising GST and the tubulin-binding amino acid sequence.
Das Protein oder Polypeptid weist gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung eine hohe Dissoziationskonstante auf. Das erfindungsgemäße Protein oder Polypeptid bindet damit mit hoher Affinität an Tubulin.The protein or polypeptide has a high dissociation constant according to a preferred embodiment of the invention. The protein or polypeptide according to the invention thus binds to tubulin with high affinity.
In einer Ausführungsform der Erfindung ist das Protein oder Polypeptid mit mindestens einem heterologen Molekül gekoppelt. Das Protein oder Polypeptid kann dabei über den C- oder den N-Terminus der Aminosäurekette, sowie auch über Seitenketten einzelner Aminosäuren mit dem heterologen Molekül verknüpft sein. Eine Verknüpfung mit mehreren gleichartigen oder untereinander verschiedenen heterologen Molekülen ist möglich. Beispielsweise kann das erfindungsgemäße Protein oder Polypeptid als Fusionsprotein mit dem heterologen Molekül vorliegen.In one embodiment of the invention, the protein or polypeptide is coupled to at least one heterologous molecule. The protein or polypeptide can be linked to the heterologous molecule via the C- or the N-terminus of the amino acid chain, as well as via side chains of individual amino acids. A linkage with several similar or mutually different heterologous molecules is possible. For example, the protein or polypeptide of the invention may be present as a fusion protein with the heterologous molecule.
Erfindungsgemäß kann das heterologe Molekül ein Markermolekül sein. Dieses kann fluoreszierende Eigenschaften aufweisen, wie z. B. FITC (Fluoreszeinisothiocyanat). Ein fluoreszierendes Markermolekül ist bevorzugterweise ein Polypeptid, beispielsweise GFP (green fluorescent protein), YFP (yellow fluorescent protein), CFP (cyan fluorescent protein), BFP (blue fluorescent protein) oder drFP583 (red fluorescent protein). Beispielsweise kann das erfindungsgemäße Protein oder Polypeptid als Fusionsprotein vorliegen, wobei es mit GFP oder YFP am C-Terminus der Aminosäurenkette verbunden ist. Erfindungsgemäß ist jedes andere fluoreszierende Polypeptid ebenfalls zur Kopplung an das Protein oder Polypeptid geeignet.According to the invention, the heterologous molecule can be a marker molecule. This may have fluorescent properties, such as. B. FITC (fluorescein isothiocyanate). A fluorescent marker molecule is preferably a polypeptide, for example GFP (green fluorescent protein), YFP (yellow fluorescent protein), CFP (cyan fluorescent protein), BFP (blue fluorescent protein) or drFP583 (red fluorescent protein). For example, the protein or polypeptide of the invention may be present as a fusion protein, being linked to GFP or YFP at the C-terminus of the amino acid chain. In the invention, any other fluorescent polypeptide is also suitable for coupling to the protein or polypeptide.
Des Weiteren kann das Markermolekül in einer anderen Ausführungsform der Erfindung auch ein nicht-fluoreszierendes Markermolekül sein. Als nicht-fluoreszierende Markermoleküle werden alle Markermoleküle bezeichnet, die kein fluoreszierende Markierung, sondern einen durch einen chemische Reaktion hervorgerufene farbige Reaktion auf dem Versuchsmedium erzeugen. Diese werden üblicherweise lichtmikroskopisch nachgewiesen. Insbesondere sind hier Peroxidasen, NBT (Nitroblau-Tetrazoliumchlorid), welches mit BCIP (5-Brom-4-chlor-3-indoxylphosphat) farbig reagiert, oder DAB (Diaminobenzidin) zu nennen. Jeder andere histochemische Farbstoff ist ebenfalls als nicht-fluoreszierendes Markermolekül geeignet. Das nicht-fluoreszierende Markermolekül kann beispielsweise in Form eines Fusionsproteins zusammen mit dem erfindungsgemäßen Protein oder Polypeptid vorliegen.Furthermore, in another embodiment of the invention, the marker molecule may also be a non-fluorescent marker molecule. As non-fluorescent marker molecules, all marker molecules become which do not produce a fluorescent label but produce a colored reaction on the test medium caused by a chemical reaction. These are usually detected by light microscopy. In particular, peroxidases, NBT (nitro blue tetrazolium chloride), which reacts with BCIP (5-bromo-4-chloro-3-indoxyl phosphate) in color, or DAB (diaminobenzidine) are mentioned here. Any other histochemical dye is also suitable as a non-fluorescent marker molecule. The non-fluorescent marker molecule can be present, for example, in the form of a fusion protein together with the protein or polypeptide according to the invention.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das erfindungsgemäß Protein oder Polypeptid an einen medizinischen Wirkstoff gekoppelt. Dieser kann erfindungsgemäß unmittelbar an das Protein oder Polypeptid gekoppelt sein oder über ein weiteres Molekül, z. B. einem so genannten Linker, mit dem erfindungsgemäßen Protein oder Polypeptid verbunden sein. Ein Markermolekül kann bei einer besonderen Ausführungsform der Erfindung zusätzlich zu dem medizinischen Wirkstoff an das Protein oder Polypeptid gekoppelt sein. Ebenso ist es möglich, dass das zusätzliche Markermolekül nicht an das Protein oder Polypeptid selbst, sondern an den medizinischen Wirkstoff gekoppelt ist, welcher mit dem Protein oder Polypeptid verbunden ist.In a further embodiment of the invention, the protein or polypeptide according to the invention is coupled to a medicinal active substance. This can be coupled according to the invention directly to the protein or polypeptide or via another molecule, for. As a so-called linker, be connected to the protein or polypeptide of the invention. A marker molecule in a particular embodiment of the invention may be coupled to the protein or polypeptide in addition to the medicinal agent. Likewise, it is possible that the additional marker molecule is not coupled to the protein or polypeptide itself, but to the medicinal agent that is linked to the protein or polypeptide.
Gegenstand der Erfindung ist insbesondere die Verwendung eines Proteins oder Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14 als Biomarker zur Detektion von Tubulin und/oder Mikrotubulistrukturen. Das erfindungsgemäße Protein oder Polypeptid kann zur Herstellung eines Biomarkers verwendet werden. Dieser kann kostengünstig direkt mit einem Markermolekül markiert werden. So kann der Biomarker direkt und schnell zur Darstellung von Mikrotubulistrukturen eingesetzt werden. Dies ist nicht nur in der Grundlagenforschung zur weiteren Erforschung des Cytoskeletts und seiner assoziierten Proteine von Bedeutung, sondern insbesondere auch in der Diagnose von ungewöhnlichen Mikrotubulistrukturen aufgrund von Tumorbildungen oder anderen krankhaften Veränderungen von Zellen. Mit dem erfindungsgemäßen Protein oder Peptid liegt ein kostengünstiger Biomarker vor, der eine spezifische Markierung von Tubulin gewährleistet. Der Biomarker lässt sich vorteilhafterweise sowohl in lebenden als auch in fixierten Zellen zur Darstellung von Mikrotubulistrukturen verwenden. Auch aufgereinigte Mikrotubulistrukturen können unabhängig von einer Zellumgebung detektiert werden. Er ist erfindungsgemäß ebenso dazu geeignet, den Mikrotubuli-Baustein Tubulin zu markieren. So findete der Biomarker ebenfalls Verwendung in Zelllysaten, ELISA-Assays oder membranbasierten Versuchen.The invention particularly relates to the use of a protein or polypeptide according to any one of
Das erfindungsgemäße Protein oder Polypeptid kann zudem als Bestandteil eines Mikrotransporters zur Einbringung von Wirkstoffen in Zellen genutzt werden. Dabei kann die Shuttle-Funktion des Proteins oder Polypeptids genutzt werden. Durch seine Bindungseigenschaft an Tubulin können so medizinische oder andere Wirkstoffe zielgerichtet an ihren Wirkort, z. B. die Mikrotubuli einer Zelle transportiert werden. Das Protein oder Polypeptid kann somit auch zu therapeutischen Zwecken, beispielsweise in der Krebstherapie eingesetzt werden.The protein or polypeptide according to the invention can also be used as part of a microtransporter for introducing active substances into cells. In this case, the shuttle function of the protein or polypeptide can be used. By virtue of its binding property to tubulin, medicinal or other active ingredients can be targeted to their site of action, eg. B. the microtubules of a cell are transported. The protein or polypeptide can thus also be used for therapeutic purposes, for example in cancer therapy.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung eines Biomarkers zur Detektion von Tubulin und/oder Mikrotubulistrukturen. Erfindungsgemäß wird dazu zunächst ein Konstrukt erstellt, welches eine entsprechende Nukleinsäure kodierend für ein Protein oder Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 umfasst. Zusätzlich umfasst das Konstrukt eine für ein Markermolekül kodierenden Nukleinsäure, sowie alle weiteren Faktoren, die zur korrekten Expression des Biomarkers benötigt werden, wie beispielsweise Promotoren oder Enhancer. Zur Expression des Konstrukts wird dieses in geeignete Empfängerzellen transfiziert. Als geeignete Empfängerzellen sind im Rahmen der Erfindung alle gängigen Klonierungszelllinien zu verstehen, insbesondere Zellen des Bakteriums Escherichia coli, jedoch sind auch Zellen pilzlicher Herkunft oder Algenzellen zur Klonierung geeignet. Nach Selektion erfolgreich transformierter Zellen und deren Vermehrung wird der Biomarker umfassend das erfindungsgemäße Protein oder Polypeptid sowie ein aus den Empfängerzellen aufgereinigt. Der Biomarker liegt dann beispielsweise in Form eines Fusionsproteins vor, welches zum direkten Nachweis von Tubulin eingesetzt werden kann.The invention also provides a method for producing a biomarker for the detection of tubulin and / or microtubule structures. According to the invention, a construct is first prepared for this purpose, which comprises a corresponding nucleic acid encoding a protein or polypeptide according to one of
Das Konstrukt kann erfindungsgemäß zusätzlich eine Nukleinsäure kodierend für einen Protein-Tag umfassen. Im Rahmen der Erfindung ist jeder Protein-Tag, der die Aufreinigung des erfindungsgemäßen Proteins oder Polypeptids ermöglicht geeignet. Insbesondere ist hier der Protein-Tag Glutathion-S-Transferase (GST) zu erwähnen. Vorteilhafterweise fördert GST die Dimerisierung seiner fusionierten Proteine.The construct according to the invention may additionally comprise a nucleic acid encoding a protein tag. In the context of the invention, any protein tag which allows the purification of the protein or polypeptide according to the invention is suitable. In particular, the protein tag glutathione-S-transferase (GST) should be mentioned here. Advantageously, GST promotes dimerization of its fused proteins.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Detektion von Tubulin und/oder Mikrotubulistrukturen. Das erfindungsgemäße Protein oder Polypeptid gekoppelt an ein Markermolekül wird in einem ersten Schritt zu lebenden Zellen, fixierten Zellen oder Zellfraktionen zugegeben. Im Falle von intakten Zellen wird vorausgesetzt, dass die Membran der Zellen durchlässig für das erfindungsgemäße Protein oder Polypeptid ist oder dafür durchlässig gemacht wurde. Anschließend wird eine Hybridisierung des erfindungsgemäßen Biomarkers an Tubulin durchgeführt. Dabei ist es unerheblich, ob das Tubulin als Bestandteil von Mikrotubulistrukturen oder als Protein frei in einer Lösung oder gebunden an eine Membran vorliegt. Das hybridisierte Protein oder Polypeptid wird nach entsprechenden Waschschritten je nach gewünschter Stringenz detektiert. Die Detektion kann in Form einer Visualisierung stattfinden. Die Detektion erfolgt bevorzugt mikroskopisch mit entsprechend dem Markermolekül angepassten Lichtquellen.The invention also relates to a method for the detection of tubulin and / or microtubule structures. The protein or polypeptide according to the invention coupled to a marker molecule is added in a first step to living cells, fixed cells or cell fractions. In the case of intact cells, it is assumed that the membrane of the cells is permeable to, or rendered permeable to, the protein or polypeptide of the invention. Subsequently, a hybridization of the biomarker according to the invention performed on tubulin. It is irrelevant whether the tubulin is present as a component of Mikrotubulistrukturen or as protein freely in a solution or bound to a membrane. The hybridized protein or polypeptide is detected after appropriate washing steps depending on the desired stringency. The detection can take place in the form of a visualization. The detection is preferably carried out microscopically with light sources adapted to the marker molecule.
Die Erfindung betrifft zudem ein Kit zur Detektion von Tubulin und/oder Mikrotubulistrukturen umfassend ein Protein oder Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14. Das Kit umfasst das erfindungsgemäße Protein oder Polypeptid, welches bereits mit einem Markermolekül in Form eines Fusionsproteins verbunden ist. Alternativ wird das Protein oder Polypeptid separat zu einem Marker bereitgestellt. Das Kit umfasst diese Bestandteile erfindungsgemäß als einsatzbereite Lösungen oder in konzentrierter Form. Auch umfasst das Kit ein Anweisung für den Verwender. Optional sind zudem weitere Lösungen, beispielsweise Pufferlösungen in dem erfindungsgemäßen Kit enthalten.The invention also relates to a kit for the detection of tubulin and / or microtubule structures comprising a protein or polypeptide according to any one of
Des Weiteren betrifft die Erfindung eine rekombinante eukaryontische Zelle, die mit einem Konstrukt transfiziert oder stabil transformiert ist, welches mindestens eine Nukleinsäure umfasst, die für das erfindungsgemäße Protein oder Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 kodiert. Die korrekte Expression des Konstrukts wird durch entsprechende Promotoren oder andere zusätzliche Faktoren gewährleistet. Das in die rekombinante eukaryontische Zelle transfizierte oder stabil transformierte Konstrukt umfasst gemäß einer Ausführungsform der Erfindung auch eine Nukleinsäure kodierend für ein Markermolekül, beispielsweise GFP oder YFP, die operativ mit der Nukleinsäure kodierende für das erfindungsgemäße Protein oder Polypeptid verbunden ist.Furthermore, the invention relates to a recombinant eukaryotic cell which is transfected or stably transformed with a construct which comprises at least one nucleic acid which codes for the protein or polypeptide according to any one of
Ein zellbasiertes Screeningsystem für medizinische Wirkstoffe ist ebenfalls Gegenstand der Erfindung. Das Screeningsystem kann beispielsweise in Form eines Kits vorliegen und umfasst erfindungsgemäß die oben beschriebenen rekombinanten eukaryontischen Zellen.A cell-based screening system for medicinal agents is also an object of the invention. The screening system can be present for example in the form of a kit and according to the invention comprises the above-described recombinant eukaryotic cells.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Screeningverfahren für medizinische Wirkstoffe, in welchem die beschriebenen rekombinanten eukaryontischen Zellen zum Einsatz kommen. Dabei werden rekombinante eukaryontische Zellen umfassend mindestens ein Konstrukt mit einer Nukleinsäure kodierend für ein erfindungsgemäßes Protein oder Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 bereitgestellt. Nach Zugeben mindestens eines medizinischen Wirkstoffes zu den rekombinanten eukaryontischen Zellen reagieren die Zellen mit diesem. Gegebenenfalls müssen die Zellen für den Wirkstoff entsprechend durchlässig gemacht werden. Der Einfluss des Wirkstoffs auf die in der Zelle vorhandenen Mikrotubulistrukturen, bzw. frei vorliegendes Tubulin wird anschließend ausgewertet. Bevorzugt erfolgt die Auswertung mikroskopisch. Beispielsweise ist jedoch auch eine Sortierung nach lebenden und abgestorbenen Zellen (z. B. durch FACS – fluorescent activated cell sorting) möglich.The invention also provides a screening method for medicinal active ingredients in which the described recombinant eukaryotic cells are used. In this case, recombinant eukaryotic cells comprising at least one construct with a nucleic acid encoding a protein or polypeptide according to the invention according to one of
Beispiel 1example 1
Das Konstrukt GST-PEX14(1–78) und Fusionsproteine mit fluoreszierenden Proteinen (z. B. GST-eYFP-PEX14(1–78) Aminosäuren 1 bis 78 des humanen peroxisomalen Biogenesefaktors PEX14 gekoppelt an Glutathion-S-Transferase und den Fluoreszenzmarker enhanced Yellow Fluorescent Protein) wurden in pGEX4T1-Vektoren kloniert. Die Expression erfolgte über Nacht bei 20°C mit 1 mM IPTG. Die GST-Fusionsproteine wurden mittels Glutathion-Sepharose 4B (GE Healthcare) nach Herstellerangaben aufgereinigt.The construct GST-PEX14 (1-78) and fusion proteins with fluorescent proteins (e.g., GST-eYFP-PEX14 (1-78) amino acids 1-78 of the human peroxisomal biogenesis factor PEX14 coupled to glutathione-S-transferase and the fluorescence label enhanced Yellow Fluorescent Protein) were cloned into pGEX4T1 vectors. Expression was overnight at 20 ° C with 1 mM IPTG. The GST fusion proteins were purified by Glutathione-Sepharose 4B (GE Healthcare) according to the manufacturer's instructions.
Für die Fluoreszenzmikroskopie wurden eine humane Fibroblastenzelllinie, eine Astrozytenzelllinien (Ratte), primäre Nervenzellenkulturen des Rattenkleinhirns und der Spinalganglien des Huhns, sowie einzelne Trypanosomen genutzt:For fluorescence microscopy, a human fibroblast cell line, an astrocyte cell line (rat), primary neuronal cultures of the rat cerebellum and the dorsal root ganglia of the chicken, and individual trypanosomes were used:
Humane Fibroblasten:Human fibroblasts:
- GM5756T (SV-40 transformierte GM5756, Coriell Cell Repository, Camden NJ)GM5756T (SV-40 transformed GM5756, Corial Cell Repository, Camden NJ)
- Medium: DMEM High Glucose (PAA) + 10% FCS (Gibco) + Pen/Strep (Gibco) + 2 mM L-Glutamin (PAA)Medium: DMEM High Glucose (PAA) + 10% FCS (Gibco) + Pen / Strep (Gibco) + 2mM L-glutamine (PAA)
- Kultivierungsbedingungen: 37°C; 8,5% CO2 Cultivation conditions: 37 ° C; 8.5% CO 2
Rollkulturen Körnerzellen bzw. Purkinjezellen: Roll cultures of granule cells or Purkinje cells:
Sagitalschnitte (400 μm) von Ratten (Postnataltag 10) wurden als Rollkulturen für 16 Tage kultiviert und mit 4% Formaldehyd fixiert. Aufgrund der größeren Schichtdicke gegenüber den Monolayer-Kulturen wurden alle Inkubationszeiten des Färbeprotokolls verdoppelt.
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Astrocyten:astrocytes:
- aus Rattencortex isolierte Zelllinie.isolated from rat cortex cell line.
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Theiss & Meller, 2002, Cell & Tissue Research 310: 143–154 Theiss & Meller, 2002, Cell & Tissue Research 310: 143-154
Chicken DRG (dorsal root ganglion, Spinalganglion)Chicken DRG (dorsal root ganglion, spinal ganglion)
Aus Hühnchen (Embryonaltag 10) explantierte Spinalganglienneurone wurden für 3 Tage kultiviert und mit 4% Formaldehyd fixiert.
(
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Sämtliche Lösungen für die Detektion von Mikrotubulistrukturen der o. g. Zellen wurden in D'PBS (Dulbecco's phosphate buffered saline) angesetzt. Alle Schritte wurden bei Raumtemperatur (RT) durchgeführt.All solutions for the detection of microtubule structures o. G. Cells were seeded in D'PBS (Dulbecco's phosphate buffered saline). All steps were carried out at room temperature (RT).
Die Zellen wurden, soweit nicht anders angegeben, mit 3% Formaldehyd für 20 min oder 2% Glutaraldehyd für 30 min fixiert, anschließend mit 1% Triton-X100 für 5 min solubilisiert, worauf unspezifische Anbindungsstellen mit einer 3%-igen BSA-Lösung (bovines Serumalbumin) blockiert wurden. Zwischen diesen Inkubationsschritten wurde jeweils dreimal mit D'PBS gewaschen. Zwischen den folgenden Inkubationsschritten wurde jeweils dreimal für 5 Minuten mit 0,1% BSA in D'PBS gewaschen. Die Inkubationen mit dem Biomarker (10–1000 ng/μl) in 0,1% BSA erfolgten für 30 min. Für Marker ohne Fluoreszenzmarkierung erfolgte eine weitere Inkubation mit einem monoklonalen anti-GST-Primär- und einem fluoreszenzmarkierten Sekundär-Antikörper (Alexa 488 bzw. Alexa 594). Anschließend wurden die Zellen dreimal für 5 Minuten mit 0,1% BSA in D'PBS und zweimal mit D'PBS gewaschen und mit Mowiol-Einbettmedium auf Objektträgern eingedeckelt.Unless otherwise stated, the cells were fixed with 3% formaldehyde for 20 min or 2% glutaraldehyde for 30 min, then solubilized with 1% Triton-X100 for 5 min, whereupon nonspecific attachment sites with a 3% BSA solution ( bovine serum albumin) were blocked. Between these incubation steps, three times each was washed with D'PBS. Between the following incubation steps, each was washed three times for 5 minutes with 0.1% BSA in D'PBS. The incubations with the biomarker (10-1000 ng / μl) in 0.1% BSA were carried out for 30 min. For markers without fluorescence labeling, a further incubation was carried out with a monoclonal anti-GST primary and a fluorescently labeled secondary antibody (Alexa 488 or Alexa 594). The cells were then washed three times for 5 minutes with 0.1% BSA in D'PBS and twice with D'PBS and capped with slides on Mowiol embedding medium.
Zur weiteren Überprüfung der korrekten Markierung von Mikrotubuli wurden außerdem Doppelmarkierungen mit dem oben beschriebenen rekombinanten Protein sowie kommerziellen, spezifischen Tubulin-Antikörpern durchgeführt. Das Protokoll entspricht dem vorgestellten, wobei die Mikrotubuli mit Hilfe des Zweischrittverfahrens (Primär- und Sekundärantikörper) immunhistochemisch dargestellt wurden.In order to further verify the correct labeling of microtubules, double-labeling was also performed with the recombinant protein described above as well as commercial specific tubulin antibodies. The protocol corresponds to the one presented, in which the microtubules were displayed immunohistochemically using the two-step method (primary and secondary antibodies).
Das folgende Protokoll beschreibt die einzelnen Schritte des Nachweisverfahrens für Mikrotubuli:
- 1.
Zellen 3× waschen mit D'PBS (Gibco) - 2.
Fixierung mit 4% Formaldehyd 4% Glutaraldehyd für 20 min - 3. 2× waschen mit D'PBS
- 4. Permeabilisierung
der Zellmembran mit 1% Triton-X100 für 5 min - 5. 2× waschen mit D'PBS
- 6. Blockieren von
unspezifischen Bindungen mit 3% BSA - 7. Inkubation mit dem neuen Tubulin-Marker (0,2 μg/μl) bzw. Erstantikörper (1:200) in 0,1% BSA für 30 min
- 8. 3× für
je 5min Waschen mit 0,1% BSA - 9. Inkubation mit Zweitantikörper (1:200) für 30 min
- 10. 3× für
je 5min Waschen mit 0,1% BSA - 11. 2× waschen mit D'PBS
- 12. Deckgläschen auf Objektträger mounten (Mowiol)
- 1. Wash
cells 3 × with D'PBS (Gibco) - 2. fixation with 4
% formaldehyde 4% glutaraldehyde for 20 min - 3. Wash 2x with D'PBS
- 4. Permeabilization of cell membrane with 1% Triton-X100 for 5 min
- 5. Wash 2x with D'PBS
- 6. Block unspecific binding with 3% BSA
- 7. Incubation with the new tubulin marker (0.2 μg / μl) or first antibody (1: 200) in 0.1% BSA for 30 min
- 8.
Wash 3 × for 5 min each with 0.1% BSA - 9. Incubation with second antibody (1: 200) for 30 min
- 10. 3x for 5 min each, wash with 0.1% BSA
- 11. Wash 2x with D'PBS
- 12. Mount coverslips on microscope slides (Mowiol)
Für die Verwendung des erfindungsgemäßen Biomarkers GST-eYFP-PEX14(1–78) entfallen die Schritte 8 und 9.For the use of the biomarker GST-eYFP-PEX14 (1-78) according to the invention, steps 8 and 9 are omitted.
Bei Verwendung von GST-PEX14(1–78), also ohne fluoreszierenden Fusionsanteil, werden insgesamt drei Inkubationsschritte (GST-PEX14N, anti-GST-Erstantikörper, fluoreszenzmarkierter Zweitantikörper) entsprechend den Schritten 7 und 8 bzw. 9 und 10 durchgeführt.When using GST-PEX14 (1-78), ie without fluorescent fusion, a total of three incubation steps (GST-PEX14N, anti-GST first antibody, fluorescently labeled second antibody) are performed according to
Bei Fixierung mit Methanol wird an Stelle von Schritt 2 für 5 Minuten mit –20°C-kaltem Methanol-Fixationsreagenz (90% (v/v) Methanol, 10 mM MES pH6,9; 0,1 mM EGTA, 0,1 mM MgCl2) inkubiert, die Permeabilisierung der Zellmembran (Schritte 3 und 4) ist nicht notwendig.When fixed with methanol, instead of
Soweit nicht anders angegeben wurde immer mit Formaldehyd fixiert und nach obigem Protokoll markiert. Bei der Färbung der Rollkulturen (Körnerzellen bzw. Purkinje-Zellen) wurden jedoch alle Inkubationszeiten verdoppelt. Unless otherwise stated, it was always fixed with formaldehyde and labeled according to the above protocol. However, in the staining of the roll cultures (granule cells or Purkinje cells) all incubation times were doubled.
Zum mikroskopischen Nachweis der Mikrotubulistrukturen wurde ein Zeiss LSM 510 meta konfokales Laserscanning Mikroskop verwendet. Zur Vergrößerung wurden die Objektive Plan-Apochromat 63×/1.4 Oil, Plan-Neofluar 40×/1.3 Oil und Plan-Neofluar 10×/0.3 verwendet. Die Fluoreszenzmarkierung eYFP (enhanced Yellow Fluorescent Protein) wurde bei den Wellenlängen 514 nm (Anregung) und 530–600 nm (Emission) nachgewiesen. Für den Sekundärantikörper Alexa 594 (rot) wurden die Wellenlängen 543 nm (Anregung) und 585 nm (Emission) genutzt. Für Fluorescein wurden die Wellenlängen 488 nm (Anregung) und 505–550 nm (Emission) genutzt.For microscopic detection of microtubule structures, a Zeiss LSM 510 meta confocal laser scanning microscope was used. For magnification the objectives Plan-Apochromat 63 × / 1.4 Oil, Plan-Neofluar 40 × / 1.3 Oil and Plan-
Zusammenfassend ist für die oben dargestellten Nachweisverfahren Folgendes festzuhalten:
Der erfindungsgemäße Biomarker PEX14(1–78) wurde in Form von GST-Fusionsproteinen rekombinant in E. coli exprimiert und mit Hilfe des GST-Tags aufgereinigt. Zur Fluoreszenzmarkierung wurde entweder zusätzlich ein eYFP-Fusionsanteil exprimiert (GST-eYFP-PEX14(1–78)), oder das aufgereinigte GST-PEX14(1–78) wurde an den exponierten Cystein-Resten des GST-Fusionsanteils spezifisch mit 5-Iodoaceto-Fluorescein (5-IAF) markiert.In summary, for the detection methods presented above, the following should be stated:
The biomarker PEX14 (1-78) according to the invention was expressed recombinantly in E. coli in the form of GST fusion proteins and purified by means of the GST tag. For fluorescent labeling, either an eYFP fusion moiety was expressed (GST-eYFP-PEX14 (1-78)) or the purified GST-PEX14 (1-78) was specific to 5-iodoaceto on the exposed cysteine residues of the GST fusion moiety Fluorescein (5-IAF) labeled.
Die getesteten Zellen wurden mit einem üblichen Protokoll für Immunofluoreszenz behandelt, wobei der erfindungsgemäße Biomarker wie ein Antikörper verwendet wurde, allerdings ohne Inkubation mit einem Zweitantikörper, da der Biomarker bereits fluoreszenzmarkiert war.The cells tested were treated with a standard protocol for immunofluorescence using the biomarker of the invention as an antibody, but without incubation with a second antibody, since the biomarker was already fluorescently labeled.
In allen getesteten Zellen konnten mit Hilfe des erfindungsgemäßen Biomarkers Mikrotubuli mit einer sehr guten Qualität markiert werden. In allen Fällen wurde das humane PEX14(1–78) verwendet. Der Marker kann demnach speziesübergreifend verwendet werden, was insbesondere bei den evolutionär weit vom Menschen entfernten Trypanosomen erwähnenswert ist. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass der Marker sowohl als fluoreszierendes Fusionsprotein (GST-eYFP-PEX14(1–78)) als auch mit einem chemischen Fluoreszenzlabel (5-IAF) gleichermaßen verwendbar ist.In all cells tested microtubules could be labeled with a very good quality using the biomarker according to the invention. In all cases, the human PEX14 (1-78) was used. The marker can therefore be used cross-species, which is particularly worth mentioning in the evolutionary far from human trypanosomes. In addition, it has been shown that the marker is equally useful as both a fluorescent fusion protein (GST-eYFP-PEX14 (1-78)) and a chemical fluorescent label (5-IAF).
Zum Nachweis, dass es sich bei den markierten Strukturen tatsächlich um Mikrotubuli handelt. wurde in einigen Fällen die Mikrotubuli zusätzlich mit anti-Tubulin-Antikörper markiert. Die Doppelmarkierungen zeigen eine nahezu identische Markierung von Mikrotubuli mit dem neuen Marker und mit den Antikörpern.To prove that the labeled structures are indeed microtubules. In some cases, the microtubules were additionally labeled with anti-tubulin antibody. The double labels show a nearly identical labeling of microtubules with the new marker and with the antibodies.
Beispiel 2Example 2
Zur genaueren Charakterisierung der Bindungsbereiche von PEX14(1–78) an Tubulin wurde ein so genannter Peptide Scan durchgeführt. Peptide Scans werden zur Darstellung spezifischer Protein-Protein-Interaktionen eingesetzt.For a more detailed characterization of the binding regions of PEX14 (1-78) to tubulin, a so-called peptide scan was performed. Peptide scans are used to visualize specific protein-protein interactions.
Zur Lokalisierung spezifischer Bindungsstellen wurde jedes zweite 15mer-Peptid von PEX14(1–78) synthetisiert und auf einer Zellulose-Membran fixiert. Kontrollversuche zeigten, dass die verwendeten Antikörper nicht mit den synthetischen Peptiden kreuzreagierten (Daten nicht dargestellt). Die auf der Membran fixierten 15-mer-Peptide wurden dann mit 1 nM reinem Tubulin inkubiert und mit Anti-Tubulin-Antikörpern hybridisiert.To localize specific binding sites, every other 15mer peptide from PEX14 (1-78) was synthesized and fixed on a cellulose membrane. Control experiments showed that the antibodies used did not cross-react with the synthetic peptides (data not shown). The 15-mer peptides fixed on the membrane were then incubated with 1 nM of pure tubulin and hybridized with anti-tubulin antibodies.
Wie in
Ausführungsbeispiele des erfindungsgemäßen Proteins oder Polypeptids sowie seiner Verwendung als Biomarker werden zusätzlich durch die folgenden
Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.This is followed by a sequence protocol according to WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.This can be downloaded from the official publication platform of the DPMA.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG QUOTES INCLUDE IN THE DESCRIPTION
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Zitierte PatentliteraturCited patent literature
- WO 2007/095359 A2 [0004] WO 2007/095359 A2 [0004]
Zitierte Nicht-PatentliteraturCited non-patent literature
- Meller, Krah, Theiss, 2005, Development Brain Research 160: 101–105 [0030] Meller, Krah, Theiss, 2005, Development Brain Research 160: 101-105 [0030]
- Theiss & Meller, 2002, Cell & Tissue Research 310: 143–154 [0030] Theiss & Meller, 2002, Cell & Tissue Research 310: 143-154 [0030]
- Theiss & Meller, 2001, Journal of Neurocytology 30: 59–71 [0031] Theiss & Meller, 2001, Journal of Neurocytology 30: 59-71 [0031]
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| Theiss & Meller, 2002, Cell & Tissue Research 310: 143-154 |
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