-
Die Erfindung betrifft eine optische Vorrichtung mit einer fokussierenden Optik, die zumindest einen Lichtstrahl in einer Brennebene fokussiert und meinem Phasenfilter zur Formung des Fokus des Lichtstrahls, wobei der Phasenfilter zwischen einem ersten Teil des Lichtstrahls und dem zweiten Teil des Lichtstrahls eine Phasenverschiebung bewirkt.
-
Die Erfindung betrifft außerdem ein Rastermikroskop mit einer fokussierenden Optik, die einen Lichtstrahl in einer Brennebene fokussiert und mit einem Phasenfilter zur Formung des Fokus des Lichtbündels, wobei der Phasenfilter zwischen einem ersten Teil des Lichtstrahls und dem zweiten Teil des Lichtstrahls eine Phasenverschiebung bewirkt.
-
In der Rastermikroskopie (Scanmikroskopie) wird eine Probe mit einem Lichtstrahl beleuchtet, um das von der Probe emittiere Reflexions- oder Fluoreszenzlicht zu beobachten. Der Fokus des Beleuchtungslichtstrahles wird mit Hilfe einer steuerbaren Strahlablenkeinrichtung, im allgemeinen durch Verkippen zweier Spiegel, in einer Objektebene bewegt, wobei die Ablenkachsen meist senkrecht aufeinander stehen, so dass ein Spiegel in x- und der andere in y-Richtung ablenkt.
-
Ein konfokales Rastermikroskop umfasst im allgemeinen eine Lichtquelle, eine Fokussieroptik, mit der das Licht der Quelle auf eine Lochblende fokussiert wird, einen Strahlteiler, eine Strahlablenkeinrichtung zur Strahlsteuerung, eine Mikroskopoptik, eine Detektionsblende und die Detektoren zum Nachweis des Detektions- bzw. Fluoreszenzlichtes. Das Beleuchtungslicht wird über einen Strahlteiler eingekoppelt. Das vom Objekt kommende Fluoreszenzlicht oder Reflexionslicht gelangt über die Strahlablenkungsvorrichtung zurück zum Strahlteiler, passiert diesen, um anschließend auf die Detektionsblende fokussiert zu werden, hinter der sich die Detektoren befinden. Detektionslicht, das nicht direkt aus der Fokusebene stammt, nimmt einen anderen Lichtweg und passiert die Detektionsblenden nicht, so dass man eine Punktinformation erhält, die durch sequentielles Abtasten des Objektes zu einem dreidimensionalen Bild führt. Meist wird ein dreidimensionales Bild durch schichtweise Bilddatennahme erzielt.
-
Das Auflösungsvermögen eines konfokalen Rastermikroskops ist unter anderem durch die Intensitätsverteilung und die räumliche Ausdehnung des Fokus des Anregungslichtstrahles gegeben. Eine Möglichkeit der Auflösungssteigerung bietet die STED (Stimulated Emission Depletion) Mikroskopie, wie sie von Prof. Stefan Hell entwickelt worden ist. Dabei werden die lateralen Randbereiche des Fokusvolumens des Anregungslichtstrahles mit einem Lichtstrahl einer anderen Wellenlänge, dem sog. Stimulationslichtstrahl bzw. Abregungslichtstrahl, der vorzugsweise von einem zweiten Laser emittiert wird, beleuchtet, um dort die vom Licht des ersten Lasers angeregten Probenbereiche stimuliert in den Grundzustand zurückzubringen. Detektiert wird dann nur das spontan emittierte Licht aus den nicht vom zweiten Laser beleuchteten Bereichen, so dass insgesamt eine Auflösungsverbesserung erreicht wird.
-
Es hart sich gezeigt, dass man gleichzeitig sowohl lateral als auch axial eine Auflösungsverbesserung erzielen kann, wenn es gelingt, den Fokus des Stimulationslichtstrahles innen hohl zu machen. Hierzu wird in den Strahlengang des Stimulationslichtstrahles ein Phasenfilter eingebracht, der ein runde λ/2-Platte beinhaltet, die in ihrem Durchmesser kleiner als der Strahldurchmesser ist und folglich überbeleuchtet wird. Die Form des Stimulationsfokus ergibt sich aus der Fouriertransformierten der Phasenfilterfunktion. Daneben sind auch sogenannte Vortex-Phasenfilter bekannt, die durch die Überlagerung zweier um 90° gegeneinander gedrehten Phasenplatten, wie sie z. B. in Appl. Phys. Lett., Vol. 82, No. 18,% May 2003, 3125–3127 beschrieben ist, erzeugt werden können.
-
Allerdings müssen für unterschiedliche Fluoreszenzfarbstoffe auch unterschiedliche Wellenlängen des Anregungs- und Abregungslichtes verwendet werden. Die bekannten Phasenfilter besitzen den Nachteil, dass sie nur für eine Lichtwellenlänge eine Phasenverschiebung, die zu der gewünschten Intensitätsverteilung im Fokus führt, exakt durchführen. Sie sind daher im allgemeinen nur in einem schmalen Wellenlängenband von ca. 60 nm um die zentrale Wellenlänge verwendbar.
-
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine optische Vorrichtung anzugeben, die eine weitgehende wellenlängenunabhängige Fokusformung ermöglicht und somit hochauflösende Mikroskopie in einem größeren Wellenlängenspektrum erlaubt.
-
Die Aufgabe wird durch eine optische Vorrichtung gelöst, die dadurch gekennzeichnet ist, dass zumindest zwei Phasenfilter auf einem Träger angeordnet sind. Vorteilhafterweise handelt es sich bei dem Träger um ein Filterrad oder einen Schieber. Vorzugsweise sind mehrere Phasenfilter matrixförmig auf dem Träger angeordnet. Zweckmäßigerweise befindet sich zu Justagezwecken befindet auf dem Träger zusätzlich noch eine Position, bei deren Durchgang die Wellenfront des Lichts nicht beeinflusst wird, d. h. es handelt sich hierbei um eine Leerstelle.
-
Zur Justage des Strahlenganges des Lichtes wird zunächst die Leerstelle in den Strahlengang eingestellt, so dass der Strahlengang beginnend vom Laserausgang bzw. dem Anregungspinhole oder einem Ende einer Lichtleitfaser, in die der Laser eingekoppelt wurde, bis zum Fokus in der Probenebene ohne Beeinflussung durch einen Phasenfilter justiert werden kann. Dies ist insbesondere vorteilhaft, wenn beispielsweise ein in der
DE 10 2007 011 305 A1 beschriebenes Justageverfahren für die Justage von zwei Lichtstrahlen, wie dies in der STED-Mikroskopie erforderlich ist, zur Anwendung kommt.
-
Vorteilhafterweise sollten sich die Phasenfilter in der Pupille des Mikroskopobjektivs oder einer dazu konjugierten Ebene befinden. Da die Phasenfilter in der Regel jedoch aus baulichen Gründen nicht direkt in die Objektivpupille eingebaut werden können, werden sie entweder möglichst nahe an der Objektivpupille platziert oder mittels einer Abbildungsoptik in die Objektivpupille abgebildet. Der Phasenfilter wird in Bezug auf die optische Achse des Mikroskops justiert, so dass er bzw. sein Abbild zentrisch in der Pupille des Objektivs angeordnet sind. Bei Verwendung eines Filterrades für die Phasenfilter ist es erforderlich, dass beim Drehen des Filterrades der Mittelpunkt der einzelnen Phasenfilter jeweils auf den Mittelpunkt der Pupille des Objektivs abbildbar ist. Daher ist es erforderlich, dass die Drehachse des Filterrades entsprechend justiert worden ist, so dass beim Drehen des Rades der Mittelpunkt der jeweiligen Phasenfilter auch mit dem Mittelpunkt der Pupille übereinstimmt. Das Filterrad kann angetrieben durch einen Motor gedreht werden. Die Platzierung der einzelnen Phasenfilter im Strahlengang kann elektronisch gesteuert durch einen Computer erfolgen. Es ist dabei ein exaktes Positionieren der einzelnen Phasenfilter nötig in Bezug auf den Mittelpunkt der Objektivpupille. Zur Vermessung der Phasenfilterposition wird ein hochgenaues Messsystem, beispielsweise ein magnetoresistives Messsystem verwendet, mit dem eine exakte Vermessung der Position des jeweiligen in den Strahlengang eingeschwenkten Phasenfilter möglich ist. Die Justage des Phasenfilters kann dann z. B. wie folgt erfolgen: Die Position der Drehachse des Filterrades wird von Hand justiert und die jeweiligen Phasenfilter werden dann durch Drehen des Filterrades justiert. Insbesondere ist die folgende Ausführungsvariante vorteilhaft: In X-Richtung wird mittels einer Feinstellschraube der Kreis der einzelnen Phasenfilterpositionen auf den Strahlengang ausgerichtet. In Y-Richtung wird durch Drehen des Rades über einen Schrittmotorantrieb die exakte Y-Position eingestellt. Durch Verwendung eines Abtasters, vorteilhafterweise ein magnetoresistiver Sensor in Verbindung mit einem magnetischen Polrad, welches direkt am Phasenfilterrad angebracht ist, kann die Drehposition exakt und reproduzierbar eingestellt werden. Es ist auch denkbar, dass die Einstellung in x-Richtung auch über einen Abtaster erfolgt. Hierdurch kann die Justage automatisch mittels eines in einem Computer implementieren Algorithmus gesteuert werden. Vorteilhafterweise werden die Messwerte der richtigen Radstellungen in einer Datentabelle elektronisch gespeichert. Bei der späteren Positionierung der Phasenfiltermatrix im Betrieb werden die Phasenfilter in einem iterativen Verfahren platziert, wobei das Filterrad gedreht und die aktuelle Position gemessen wird. Falls die Zielposition noch nicht erreicht worden ist, wird das Rad wieder bewegt, die aktuelle Position gemessen usw., bis endlich die Endposition erreicht worden ist. Eine andere Vorgehensweise zur korrekten Positionierung ist die Verwendung eines Positionsreglers. Durch eine Justage der Phasenfiltermatrix in Bezug auf die optischen Achse kann die optimale Positionierung der Phasenfiltermatrix bzw. ihres Abbildes in der Pupille erreicht werden. Dies kann auch motorisiert durchgeführt werden, um z. B. für unterschiedliche Objektive mit jeweils verschiedener Pupillenlage automatisch die richtige Einstellung zu erhalten. Hierfür kann wieder eine Datentabelle verwendet werden. Die Auswahl des Objektivs erfolgt computergesteuert. Damit kann dann für jedes gewählte Objektiv der Phasenfilter entsprechend positioniert werden.
-
Um in einem Mikroskop sowohl eine laterale als auch eine axiale Auflösungserhöhung zu realisieren, kann die Phasenfiltermatrix sowohl mit Phasenfiltern, die die laterale Auflösung erhöhen als auch mit Phasenfiltern, die die axiale Auflösung erhöhen, bestückt werden. Alternativ kann z. B. für die STED-Mikroskopie der Stimulationsstrahl mittels eines Strahlteilers in zwei Teilstrahlen geteilt werden. Hierzu kann z. B. ein Polarisationsteiler verwendet werden und das Verhältnis der Lichtleistung für die beiden Teilstrahlen mit einer λ/2-Platte eingestellt werden. Jeder der beiden Teilstrahlen kann durch einen Phasenfilter-hindurchgehen, wobei jeder der beiden Phasenfilter Teil des erfindungsgemäßen Phasenfilterträgers ist. Man kann dann z. B. einen Träger nur mit Phasenfiltern bestücken, die nur die laterale Auflösung erhöhen und den anderen Träger nur mit Phasenfiltern bestücken, welche die axiale Auflösung erhöhen. Dadurch kann man neben den beiden Extremstellungen nur laterale Auflösungserhöhung und nur axiale Auflösungserhöhung auch eine Kombination aus lateraler und axialer Auflösungserhöhung wählen. Es ist auch denkbar, dass verschiedene Abregungslaser gleichzeitig verwendet werden, wobei jeweils ein Laser einem spezifischen Phasenfilter zugeordnet ist. Diese können sich auf verschiedenen Phasenfilterträgern befinden. Für die STED-Mikroskopie ist nötig, dass die Fokusse des Anregungs- und des Abregungslichts exakt übereinander liegen, d. h. die zulässige Abweichung liegt bei weniger als 100 nm. Um dies zu realisieren, ist es vorteilhaft, wenn die verwendeten Laser mittels einer Lichtleitfaser in das STED-Mikroskop eingekoppelt werden, da dann alle Lichtstrahlen von einer quasi Punktlichtquelle ausgehen und bei Drift von Systemkomponenten die Lage der Fokusse zueinander unverändert bleibt. In der praktischen Umsetzung ist es aufgrund der unterschiedlichen Eigenschaften von Anregungs- und Abregungslicht oftmals vorteilhaft, zwei unterschiedliche Fasern für Anregungs- und Abregungslicht zu verwenden. Eventuell bietet sich auch eine Verwendung von unterschiedlichen Fasern für unterschiedliche Abregungswellenlängen an, um z. B. das Licht jeweils im Monomode führen zu können. Die Verwendung einer Punktlichtquelle bzw. einer Lichtleitfaser aus der Licht verschiedener Wellenlängen tritt erfordert eine gut korrigierte Optik. Insbesondere chromatische Aberrationen der beteiligten Wellenlängen müssen im Fokus bis auf 100 nm korrigiert sein. Dies ist insbesondere für Mehrfarbenaufnahmen notwendig, bei denen mehrere Fluoreszenzmarker verwendet werden und die mit unterschiedlichen Anregungslaser und/oder Abregungslaser an- bzw. abgeregt werden. Für maximale Flexibilität werden die Laser über einen akustooptischen Strahlteiler (AOBS) eingekoppelt. Hierfür kann ein AOBS für alle Wellenlängen verwendet werden oder mehrere AOBS, z. B. einen zur Einkopplung des Anregungslichts und einen zur Einkopplung des Abregungslichts.
-
Die Auswahl des Phasenfilters bzw. der Phasenfilter erfolgt über die Benutzeroberfläche der Software. Diese steuert dann die Elektronik und die Mechanik zur Positionierung des Phasenfilters. Es bieten sich verschiedene Möglichkeiten die Benutzereingabe zu gestalten. Eine erste Möglichkeit ist, dass der Benutzer den entsprechenden Phasenfilter bzw. die entsprechenden Phasenfilter direkt in der Benutzeroberfläche auswählt. Eine weitere Möglichkeit ist die Auswahl des Phasenfilters bzw. der Phasenfilter an die benutzten Abregungslaser bzw. Abregungswellenlängen zu knüpfen. So könnte z. B. bei der Auswahl eines Abregungslasers mit der Wellenlänge von 592 nm der Phasenfilter für 592 nm bzw. der Phasenfilter des entsprechenden Wellenlängenbandes eingefahren werden. Hierfür können Nachschlagetabellen erstellt und verwendet werden. Es ist auch denkbar, dass bei gleichzeitiger Benutzung von Phasenfiltern, die die laterale Auflösung erhöhen und von Phasenfiltern, die die axiale Auflösung erhöhen, der Benutzer in der Benutzeroberfläche die Werte für die gewünschte laterale und axiale Auflösung eingibt. Die Software steuert dann die Elektronik bzw. Mechanik entsprechend an, so dass die für diesen Laser benötigten Phasenfilter zur lateralen und axialen Auflösungserhöhung in den Strahlengang gefahren werden und die Lichtleistung zwischen den beiden Pfaden, z. B. durch Drehen der oben erwähnten Halbwellenplatte, so aufgeteilt wird, dass das entsprechende Verhältnis dem Verhältnis der Auflösungserhöhungen in lateraler und axialer Richtung entspricht. Hierfür können Nachschlagetabellen verwendet werden. Durch Einstellen der Laserleistung des Abregungslasers wird dann die Auflösung im STED-Mikroskop eingestellt. Dies ist möglich, da die Auflösungserhöhung in einem STED-Mikroskop gegenüber einem Konfokalmikroskop proportional zur Quadratwurzel aus der Laserleistung des Abregungslasers ist. Auch hierfür können Nachschlagetabellen verwendet werden und/oder der einzustellende Wert kann berechnet werden.
-
In der Zeichnung ist der Erfindungsgegenstand schematisch dargestellt und wird anhand der Figuren nachfolgend beschrieben. Dabei zeigen:
-
1 einen erfindungsgemäßen Träger mit mehreren Phasenfiltern,
-
2 ein erfindungsgemäßes Rastermikroskop
-
1 zeigt einen erfindungsgemäßen Träger mit zumindest zwei Phasenfiltern. Zweckmäßigerweise befindet sich zu Justagezwecken befindet auf dem Träger zusätzlich noch eine Position, bei deren Durchgang die Wellenfront des Lichts nicht beeinflusst wird, d. h. es handelt sich hierbei um eine Leerstelle.
-
Zur Justage des Strahlenganges des Lichtes wird zunächst die Leerstelle in den Strahlengang eingestellt, so dass der Strahlengang beginnend vom Laserausgang bzw. dem Anregungspinhole oder einem Ende einer Lichtleitfaser, in die der Laser eingekoppelt wurde, bis zum Fokus in der Probenebene ohne Beeinflussung durch einen Phasenfilter justiert werden kann. Dies ist insbesondere vorteilhaft, wenn beispielsweise ein in der
DE 10 2007 011 305 A1 beschriebenes Justageverfahren für die Justage von zwei Lichtstrahlen, wie dies in der STED-Mikroskopie erforderlich ist, zur Anwendung kommt.
-
Vorteilhafterweise sollten sich die Phasenfilter in der Pupille des Mikroskopobjektivs oder einer dazu konjugierten Ebene befinden. Da die Phasenfilter in der Regel jedoch aus baulichen Gründen nicht direkt in die Objektivpupille eingebaut werden können, werden sie entweder möglichst nahe an der Objektivpupille platziert oder mittels einer Abbildungsoptik in die Objektivpupille abgebildet. Der Phasenfilter wird in Bezug auf die optische Achse des Mikroskops justiert, so dass er bzw. sein Abbild zentrisch in der Pupille des Objektivs angeordnet sind. Bei Verwendung eines Filterrades für die Phasenfilter ist es erforderlich, dass beim Drehen des Filterrades der Mittelpunkt der einzelnen Phasenfilter jeweils auf den Mittelpunkt der Pupille des Objektivs abbildbar ist. Daher ist es erforderlich, dass die Drehachse des Filterrades entsprechend justiert worden ist, so dass beim Drehen des Rades der Mittelpunkt der jeweiligen Phasenfilter auch mit dem Mittelpunkt der Pupille übereinstimmt. Das Filterrad kann angetrieben durch einen Motor gedreht werden. Die Platzierung der einzelnen Phasenfilter im Strahlengang kann elektronisch gesteuert durch einen Computer erfolgen. Es ist dabei ein exaktes Positionieren der einzelnen Phasenfilter nötig in Bezug auf den Mittelpunkt der Objektivpupille. Zur Vermessung der Phasenfilterposition wird ein hochgenaues Messsystem, beispielsweise ein magnetoresistives Messsystem verwendet, mit dem eine exakte Vermessung der Position des jeweiligen in den Strahlengang eingeschwenkten Phasenfilter möglich ist. Die Justage des Phasenfilters kann dann z. B. wie folgt erfolgen: Die Position der Drehachse des Filterrades wird von Hand justiert und die jeweiligen Phasenfilter werden dann durch Drehen des Filterrades justiert. Insbesondere ist die folgende Ausführungsvariante vorteilhaft: In X-Richtung wird mittels einer Feinstellschraube der Kreis der einzelnen Phasenfilterpositionen auf den Strahlengang ausgerichtet. In Y-Richtung wird durch Drehen des Rades über einen Schrittmotorantrieb die exakte Y-Position eingestellt. Durch Verwendung eines Abtasters, vorteilhafterweise ein magnetoresistiver Sensor in Verbindung mit einem magnetischen Polrad, welches direkt am Phasenfilterrad angebracht ist, kann die Drehposition exakt und reproduzierbar eingestellt werden. Es ist auch denkbar, dass die Einstellung in x-Richtung auch über einen Abtaster erfolgt. Hierdurch kann die Justage automatisch mittels eines in einem Computer implementieren Algorithmus gesteuert werden. Vorteilhafterweise werden die Messwerte der richtigen Radstellungen in einer Datentabelle elektronisch gespeichert. Bei der späteren Positionierung der Phasenfiltermatrix im Betrieb werden die Phasenfilter in einem iterativen Verfahren platziert, wobei das Filterrad gedreht und die aktuelle Position gemessen wird. Falls die Zielposition noch nicht erreicht worden ist, wird das Rad wieder bewegt, die aktuelle Position gemessen usw., bis endlich die Endposition erreicht worden ist. Eine andere Vorgehensweise zur korrekten Positionierung ist die Verwendung eines Positionsreglers. Durch eine Justage der Phasenfiltermatrix in Bezug auf die optischen Achse kann die optimale Positionierung der Phasenfiltermatrix bzw. ihres Abbildes in der Pupille erreicht werden. Dies kann auch motorisiert durchgeführt werden, um z. B. für unterschiedliche Objektive mit jeweils verschiedener Pupillenlage automatisch die richtige Einstellung zu erhalten. Hierfür kann wieder eine Datentabelle verwendet werden. Die Auswahl des Objektivs erfolgt computergesteuert. Damit kann dann für jedes gewählte Objektiv der Phasenfilter entsprechend positioniert werden.
-
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
-
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
-
Zitierte Patentliteratur
-
- DE 102007011305 A1 [0010, 0018]
-
Zitierte Nicht-Patentliteratur
-
- Appl. Phys. Lett., Vol. 82, No. 18,% May 2003, 3125–3127 [0006]