DE102009030395A1

DE102009030395A1 - Differnziertes chromatographisches Analysenverfahren zur Kompensation von Varianzen in der signalerzeugenden Einheit bei quantifizierenden chromatographischen Analysen

Info

Publication number: DE102009030395A1
Application number: DE102009030395A
Authority: DE
Original assignee: Tecan Trading AG
Current assignee: Tecan Trading AG
Priority date: 2009-06-25
Filing date: 2009-06-25
Publication date: 2011-05-26
Also published as: JP2012530918A; JP5665863B2; WO2010149595A1; EP2446460A1; CN102484030B; US20120187284A1; CN102484030A; US8829429B2

Abstract

Differenziertes chromatographisches Analysenverfahren zur Kompensation von Varianzen in der signalerzeugenden Einheit bei quantifizierenden chromatographischen Analysen dadurch gekennzeichnet dass der signalerzeugenden Einheit (dem Detektor) während einer Analysenserie kontinuierlich und in gleichbleibender Rate eine Reinlösung des Zielanalyten der Messung zugeführt wird

Description

Gebiet:
Es handelt sich um eine Erfindung aus dem Gebiet der quantiativen chemischen Analytik. Es wird ein Ausführungsbeispiel aus dem Bereich der biomedizinischen Analytik gegeben.
Stand der Technik:
Chromatographische und insbesondere chromatographisch-massenspektrometrische Analyseverfahren sind von wesentlicher Bedeutung für die Biowissenschaften und speziell für die medizinische Labordiagnostik, die Nahrungsmittel- und Umweltanalytik. Hierbei werden biologische Proben wie Serum oder Urin zunächst aufbereitet (z. B. de-proteiniert) und dann durch Chromatographie mit differentieller Adsorption an definierte Oberflächen in einzelne Fraktionen aufgetrennt. Die chromatographisch fraktionierte Probe wird dann kontinuierlich einem Detektor zugeführt.
Im Falle der Massenspektrometrie mit Atmosphärendruck-Ionisation (z. B. Electrospray(ESI-)MS/MS) werden die Zielanalyten zur Detektion ionisiert. Diese Ionisation erfasst jedoch nicht nur die jeweiligen Zielanalyten sondern auch eine sehr große Zahl anderer Stoffe aus der Probenmatrix. Entsprechend stellt jede Atmosphärendruck-Ionisation ein hochkomplexes physiko-chemisches Geschehen dar, in dem eine Vielzahl von molekularen Interaktionen angenommen werden müssen. Dies äußert sich u. a. im Phänomen von „ion suppression” und „ion enhancement”: Meist nicht näher spezifizierbare Komponenten der Probenmatrix, die zeitgleich mit dem jeweiligen Zielanalyten in die Ionenquelle eluieren, können zu einer Verringerung aber auch zu einer Verstärkung der Ionenausbeute des Zielanalyten führen. Ebenso führen Ablagerungen an Teilen der Ionenquelle und der Ionenoptiken („charging”) dazu, dass die Ionisierungseffizienz eines Systems häufig einen Drift oder auch ein „Undulieren” innerhalb einer Analysenserie zeigt. Üblicherweise werden in einer Analysenserie zunächst Kalibrator-Proben (mit bekannten Analyt-Konzentrationen) analysiert, die von den zu quantifizierenden „unknows” gefolgt werden. Tritt in einer solchen Serie ein Drift der Ionisierungsausbeute bezüglich des Zielanalyten innerhalb der Mess-Serie auf, bzw. unterscheiden sich die Ionisationseigenschaften von Kalibrator-Proben und unknows, sind unrichtige Messergebnisse der unknowns die Folge.
Zur Kompensation entsprechender Modulationseffekte der Ionenausbeute werden Substanzen verwendet, die als Interne Standards bezeichnet werden. Hierbei handelt es sich um Substanzen, die in Ihrer molekularen Struktur dem jeweiligen Zielanalyten möglichst ähnlich sein müssen. Ideal geeignet sind stabilisotopen-markierte Moleküle des Zielanalyten (z. B. Cortisol-Moleküle, in denen vier Wasserstoff-Atome durch Deuterium ausgetauscht sind als Interner Standard zur Messung von Cortisol mittels LC-MS/MS). In einer Analysenserie von Kalibrator-Proben und unknowns wird eine genau identische Menge einer Lösung des jeweiligen Internen Standards allen Proben (Kalibratoren und unknows) ganz zu Beginn der Probenbearbeitung zugefügt. Hiermit wird für jede Probe ein Konzentrations-Verhältnis von Zielanalyt zu Internem Standard hergestellt, das sich im Laufe der Probenbearbeitung nicht mehr ändert. Im massenspektrometrischen Analysenlauf wird das Signal von Zielanalyt (z. B. kollisionsinduzierter Ionenübergang bei der MS/MS-Technologie) und Internem Standard alternierend/simultan als Chromatogram aufgezeichnet; es werden also zwei unabhängige Chromatograme im selben Analysenlauf aufgezeichnet. Bei weniger spezifischen Detektionsverfahren wie der UV-Detektion ist der Interne Standard so auszuwählen, dass er zu einem vom Zielanalyten unterschiedlichen Zeitpunkt eluiert; in diesem Fall werden im einem Chromatogram zwei Peakflächen bestimmt (Analyt bzw. Interner Standard). Zur quantifizierenden Auswertung werden die Flächen (zu definierten Retentionszeiten) der Peaks von Internem Standard bzw. Zielanalyt bestimmt. Das Verhältnis von Peak-Fläche des Zielanalyten zu Peak-Fläche des Internen Standards wird als Response der Einzelanalyse bezeichnet. Kalibration und Quantifizierung werden anhand dieser Respone (also einem Peak-Flächen-Verhältnis) vorgenommen. Durch dieses Prinzip der Internen Standardisierung werden Varianzen in der Ionisierungsausbeute von Probe zu Probe egalisiert; Voraussetzung hierfür ist jedoch, dass das Ionisierungsverhalten von Zielanalyt und Internem Standard in sehr gleichartiger Weise durch modulierende Effekte („Charging”, Matrix-Komponenten etc.) beeinflusst wird.
Alternativ zum Zugeben einer Lösung eines Internen Standards zur Probe selbst (wodurch zwei chromatographische Peaks generiert werden (entweder in der selben Aufzeichung bzw. in simultan aufgezeichneten unabhängigen Aufzeichnung (bei der Massenspektrometrie-Analyse)), ist unlängst ein Verfahren beschrieben worden, bei dem eine Referenzlösung kontinuierlich in das Eluat der chromatographischen Einheit beigemischt wird, um so eine Kompensation von Schwankungen in der Ionenausbeute zu erlauben (Stahnke et al. 2009, s. u.; PCI, permanent postcolumn infusion). Dabei wird periodisch (alternierend zur Massenübergangsspur des Zielanalyten) ein Signalniveau der Referenzsubstanz aufgezeichnet. Dieses Referenzsignal wird mit Hilfe eines aufwändigen Datenverfahrens zur Meßwertkompensation hinsichtlich Faktoren genutzt, die die Signalgeneration beeinflussen können.
Mängel des Stands der Technik
Das Verfahren nach Stahnke et al. verwendet eine Moitor-Substanz, die nicht mit den Zielanalyten identisch ist. Da sich Zielanalyt und Referenzsubstanz hinsichtlich ihres Ionisationsverhaltens unterscheiden können, ist dieser Ansatz prinzipiell analytisch störanfällig. Die Suche nach einer geeigneten Referenzsubstanz ist anspruchsvoll, da eine Substanz gefunden werden muss, die unter allen Umständen eine gleichartige Modulation der Signalausbeute erfährt wie der Zielanalyt. Für viele Zielanalyten ist anzunehmen, dass keine hierfür geeigneten Substanzen gefunden werden können. Außerdem ist eine komplizierte Auswertung von periodisch aufgezeichnetem Referenz-Signal und Peak-Fläche des Zielanalyten erforderlich, d. h. eine Auswertung und Quantifizierung aus dem primär aufgezeichneten Chromatogram ist nicht direkt möglich. Des Weiteren werden zwingend zusätzliche Ausrüstungsgegenstände benötigt (Spritzenpumpe für die lange andauernde, hochgenaue Zumischung der Referenzsubstanz, Kapillare, T-Stück).
Lösung
Gegenstand der hier beschriebenen Erfindung ist die Kombination eines System-Aufbaus und einer chromatographischen Auswertemethode, die ermöglicht, eine Interne Standardisierung von chromatographischen Methoden allein unter Verwendung einer Reinlösung des jeweiligen Zielanalyten vorzunehmen.
Dies wird erreicht, indem eine Lösung des jeweiligen Zielanalyten selbst dem Eluat des chromatographischen Trennsystems über ein T-Stück mittels einer Spritzenpumpe kontinuierlich zugemischt wird, bevor die Flüssigkeitsmischung den Detektor erreicht ( ). Ebenso kann der Zielanalyt in der mobilen Phase des analytischen chromatographischen Systems gelöst sein, ohne dass eine zusätzliche Pumpe notwendig ist. Dies ist im Falle von isokratischen chromatographischen Analysen möglich. Die Zumischung über ein T-Stück und eine separate Pumpe kann bei Gradientenverfahren verwendet werden. Durch beide Konfigurationen wird erreicht, dass der Zielanalyt in kontinuierlicher Rate dem Detektor zugeführt wird. Im Chromatogram wird so ein anhaltendes „Hintergrund”-Signal erzeugt (Basislinien-Anhebung; offset), das der eigentlichen chromatographischen Analyse unterlagert ist. In der Auswertung der Chromatogramme wird dann zum einen die Peakfläche des Zielanalyten (die durch den eigentlichen chromatographischen Prozess generiert wird) durch etablierte Verfahren der Fußpunkt-Erkennung und Flächenmessung erfasst. Zusätzlich wird der „Untergrund”, d. h. die Fläche des Vierecks unter dem jeweiligen Peak erfasst. Die „Response” der Einzelanalyse wird berechnet als Quotient der Peakfläche zur Fläche des Vierecks unterhalb des Peaks; dieses wird gebildet durch die Integrationslinie des Peaks, die Basislinie des Chromatogramms sowie den Loten, die von den Enden der Peak-Integrationslinie auf die Basislinie gefällt werden ( ; Flächen A und B).
Verringert oder erhöht sich im Zeitraum der Elution des Analyt-Peaks die Ionisierungs-Effizienz hinsichtlich des Zielanalyten, so ergibt sich eine Verringerung bzw. Zunahme der aufgezeichneten Peakfläche; ebenso ergibt sich jedoch eine Verringerung bzw. Zunahme der Fläche unter dem Peak. Hierdurch wird der Quotient der Flächen unabhängig von der momentanen Ionenausbeute. Mithin ist das Verfahren dazu geeignet, Varianzen in der Ionenausbeute zu egalisieren, ebenso wie dies für distinkte Interne Standard-Substanzen gilt, die einer Probe vor Analyse zugesetzt werden.
Erreichte Vorteile
Die beschriebene Erfindung bietet wesentliche und überraschende Vorteile gegenüber dem Stand der Technik, da die Möglichkeit eröffnet wird, chromatographische und v. a. massenspektrometrische Analysenmethoden zu entwickeln, ohne dass hierfür separate Substanzen zur Internen Standardisierung benötigt werden; die Monitor-Substanz (entweder der mobilen Phase zugegeben oder post-coumn dem Fluß zugemischt) ist im beschriebenen Verfahren identisch mit dem jeweiligen Zielanalyten.
Gegenüber konventionellen Verfahren der internen Standardisierung mit Zugabe des Internen Standards im Rahmen der Probenvorbereitung wird eine Arbeitsersparnis in der Probenvorbereitung erzielt. Im Falle massenspektrometrischer Methoden – vor allem auch gegenüber der Methode nach Stahnke et al. – ergibt sich als weiterer Vorteil, dass nur eine einzige Massenspur pro Analyt für die Quantifizierung aufgezeichnet werden muss.
Wird die System-Konfiguration verwendet, bei der der Zielanalyt in der mobilen Phase gelöst ist (wie hier beschrieben) ist ein wesentlicher Vorteil gegenüber der Methode nach Stahnke et al., dass keine zusätzlichen Ausrüstungsgegenstände benötigt werden.
Die Suche nach einer Referenzsubstanz, die in ihren Signalgebungseigenschaften dem Zielanalyten sehr ähnlich ist, stellt bisher eine wesentliche Herausforderung bei der Entwicklung entsprechender Methoden dar; werden keine geeigneten Referenzsubstanzen gefunden, scheitert die Entwicklung spezifischer massenspektrometrischer Methoden nicht selten gänzlich. Mithin erweitert die Erfindung die Anwendbarkeit quantitativer chromatographischer Analyenmethoden in der chemischen Analytik wesentlich.
Beschreibung eines Ausführungsbeispiels:
Die Funktionstüchtigkeit der Erfindung wurde durch die Messung des Immunsuppressivums Tacrolimus aus humanen Vollblutproben demonstriert. Hierfür wurden vier Kalibrator-Proben im therapeutischen Konzentrationsbereich nach Proteinfällung verwendet. Diese Präzipitate wurden mittel LC-MS/MS analysiert (Beschreibung der Methode: Clin Chem 2008; 54: 1406–8). In den Flüssigkeitsstrom zwischen analytischer Säule und Massenspektrometrie-System wurde eine Lösung von Tacrolimus (100 μg/L in Methanol/Wasser, 1/1) mit einer Rate von 5 μL/min über ein T-Stück infundiert (gemäß ). zeigt ein so aufgezeichnetes Chromatogram. Erfasst wird dabei ein für Tacrolimus spezifischer Massenübergang (Mutter-Ion 821,5 m/z; Produkt-Ion 768,5 m/z). Fläche A ist die Peak-Fläche; Fläche B die Fläche unter dem Peak, die durch die kontinuierliche Tacrolimus-Infusion als Untergrund generiert wird.
zeigt die Kalibrierfunktion, die basierend auf dieser chromatographischen Auswertung erstellt wurde. Die x-Achse entspricht der Response als Peakflächen-Verhältnis Fläche A/Fläche B, die y-Achse entspricht der bekannten Analyt-Konzentration der Kalibrator-Proben. Es ergibt sich eine lineare Beziehung zwischen Peak-Flächen-Response und Kalibrator-Konzentrationen. Eine in dieser Serie anhand des dargestellten Prinzips analysierte Qualitätskontrollprobe wurde mit einer Konzentration von 5,2 μg/L innerhalb des vom Hersteller spezifizierten Zielbereichs gefunden.
Fundstellen:

Stahnke H, Reemtsma T, Alder L. copensation of matrix effects by postcolumn infusion of a monitor substance in multiresidue analysis with LC-MS/MS. Anal Chem 2009; 81: 2185–92.

Es zeigen
: Aufbau eines permanent post column infusion (PCI)-Systems
Bezugszeichenliste

1: HPLC-Pumpe
2: Trenn-Säule
3: T-Stück
4: Spritzenpumpe
4b: Reservoir des Internen Standards
5: Detektor

Dieser Aufbau kann zur Zumischung des Zielanalyten als Referenzlösung in konstanter Rate genutzt werden; alternativ kann der Zielanalyti in der mobilen Phase des chromatographischen Systems gelöst vorliegen bei chromatographischen Verfahren mit isokratischer Elution.
: Chromatographische Auswertung gemäß der beschriebenen Erfindung

A:: Peak-Fläche des Zielanalyten (oberhalb der Integrationslinie)
B:: Fläche unter dem Peak als Basislinien-Anhebung unterhalb der Integrationslinie durch Lotfällung

: Kalibrationsfunktion zur Messung von Tacrolimus auf Basis des dargestellten technischen Aufbaus und der beschriebenen chromatographischen Auswertemethode
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Nicht-Patentliteratur

Stahnke et al. 2009, s. u.; PCI, permanent postcolumn infusion [0005]
Stahnke et al [0006]
Stahnke et al. [0011]
Stahnke et al., [0012]
Clin Chem 2008; 54: 1406–8 [0014]
Stahnke H, Reemtsma T, Alder L. copensation of matrix effects by postcolumn infusion of a monitor substance in multiresidue analysis with LC-MS/MS. Anal Chem 2009; 81: 2185–92 [0016]

Claims

Differenziertes chromatographisches Analysenverfahren zur Kompensation von Varianzen in der signalerzeugenden Einheit bei quantifizierenden chromatographischen Analysen dadurch gekennzeichnet dass der signalerzeugenden Einheit (dem Detektor) während einer Analysenserie kontinuierlich und in gleichbleibender Rate eine Reinlösung des Zielanalyten der Messung zugeführt wird
Chromatographisches Analyseverfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet dass auf diese Weise im Chromatogram ein Hintergrund-Signal erzeugt wird (= Basislinien-Anhebung, Offset)
Chromatographisches Analyseverfahren nach Patentanspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet dass die kontinuierliche Zuführung des Zielanalyten entweder dadurch erzielt wird, dass der Zielanalyt in der mobilen Phase des chromatographischen Systems gelöst ist (bei Methoden mit isokratischer Elution) oder dass in den Fluss distal der analytischen Trennsäule durch ein T-Stück und eine zweite Pumpeinheit eine Lösung des Zielanalyten als Referenzsubstanz kontinuierlich und in gleichbleibender Rate zugemischt wird,
Chromatographisches Analyseverfahren nach Patentanspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet dass die so erreichte Basislinien-Anhebung im Chromatogram zur Kompensation von Varianzen der Signalerzeugung des jeweiligen Detektors bezüglich des jeweiligen Zielanalyten genutzt wird,
Chromatographisches Analyseverfahren nach Patentanspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet dass das Viereck unterhalb der Integrationslinie des Peaks eines Zielanalyten bewertet wird.
Chromatographisches Analyseverfahren nach Patentanspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet dass zur Quantifizierung des Zielanalyten die Fläche, die durch Lotfällung von der Peak-Integrationslinie unter dem integrierten chromatographischen Peak des Zielanalyten gefunden wird, in einem Auswerteverfahren mit der integrierten Peakfläche oberhalb der Integrationslinine des Zielanalyten zum Zwecke der Quantifizierung von Zielanalyten in Beziehung gesetzt wird.