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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines als Medizinprodukt
verwendbaren kompatiblen und bioabbaubaren Kompositmaterials, ein
Kompositmaterial, das nach diesem Verfahren erhältlich
ist, sowie dessen Verwendung als Träger für biologische
Zellen sowie als Gewebeersatz im menschlichen oder tierischen Körper.
Diesbezüglich sei auf den Stand der Technik nach der
WO 2005/044325 A1 verwiesen.
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Im
medizinischen Bereich werden zunehmend synthetische Gewebeträger
als Ersatz für Organe und Gewebe benötigt. Dieses
Gebiet wird allgemein als Tissue-Engineering bezeichnet. Von besonderer
Bedeutung sind Gewebeträger, die mit dem nativen Organ
oder Gewebe in den biologischen, biochemischen, biomechanischen
und strukturellen Eigenschaften weitgehend übereinstimmen.
Für die rekonstruktive und regenerative Medizin, die Traumatologie
und die Orthopädie sind in den letzten Jahren Gewebeträger
im muskuloskelettalen Bereich (Ersatz für Knochen, Knorpel
und Sehnen) besonders bedeutsam geworden. Die Eigenschaften der
zur Zeit verfügbaren Träger entsprechen in vielerlei
Hinsicht nicht dem nativen Gewebe, da häufig die natürliche
Morphologie nicht nachgebildet wird und/oder biochemische und/oder
biomechanische Eigenschaften nicht übereinstimmen.
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Für
die Reparatur von osteochondralen Defekten stellt Tissue-Engineering
einen vielversprechenden Therapieansatz dar. Dabei werden Zellen
mit einem Potential zur Knorpelbildung in poröse Trägermaterialien eingebracht
und dann direkt oder nach in vitro-Vorkultivierung in den chondralen
Defekt in vivo eingesetzt. Derartige Trägermaterialien
müssen für ihren Einsatz spezifische Materialeigenschaften,
insbesondere bezüglich Formstabilität, verzögerten
Abbau, Biokompatibilität, Zelladhärenz, Chondrokonduktivität,
erfüllen. Von besonderer medizinischer und wirtschaftlicher
Bedeutung ist das Gebiet der Gelenkserkrankungen. Auf diesem Gebiet
sind die schmerzhaftesten Krankheiten diejenigen, bei denen Knorpel
und die darunter liegende Knochenstruktur zerstört sind.
Knorpel hat nur eine eingeschränkte Fähigkeit
zur Regeneration und weist dann in der Regel eine geringere Qualität
auf als der gesunde Knorpel. Zahlreiche Versuche sind unternommen
worden, gesundes Knorpel- und subchondrales Knochengewebe zu transplantieren
oder in Kultur zu halten; jedoch ist bislang auf diesem Wege kein
erfolgreicher Ersatz geschaffen worden.
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Um
synthetische Materialien erfolgreich als Knorpelersatz verwenden
zu können, müssen viele unterschiedliche Eigenschaften
des natürlichen Systems berücksichtig werden.
Zu diesen zählen die biochemische Zusammensetzung, die
strukturelle Identität (Nachahmung der zonalen Morphologie)
und die biomechanische Eigenschaften. Als synthetische Materialien
sind poröse Schäume auf der Grundlage von natürlichen
und synthetischen Polymeren von unterschiedlichen Autoren vorgeschlagen
worden. Ein guter Überblick über die Technologien
zur Erzeugung von porösen Materialien für das
Tissue-Engineering wird von Mikos et al., Electronic Journal
of Biotechnology, Vol. 3 No. 2, 2000 dargestellt. Die Autoren
beschreiben mehrere Verfahren zur Erzeugung von hochporösen
Gitterstrukturen. So werden bspw. Gitterstrukturen durch Ausbildung
eines dreidimensionalen Netzwerks von Fasern aus Polyglycolsäure
geschaffen (”Fiber bonding”).
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Einen
gewissen Fortschritt gegenüber dem vorstehend beschriebenen
Stand stellt die technische Lehre dar, die sich aus der
WO 2005/044325 A1 ergibt.
Diese WO-Schrift offenbart ein Verfahren zur Herstellung eines Kompositmaterials
aus einem natürlichen Polymer und einer anorganischen Komponente,
insbesondere Calciumphosphat, die den Knochen/Knorpelübergang
imitieren soll. Die Herstellung geht von einem Hydrogel aus, das
mindestens einen weiteren Bestandteil wie Calciumcarbonat oder -phosphat
enthält, der bei Anlegen eines elektrischen Feldes an das
Hydrogel ausfällt oder eine feste Phase bildet. Anschließend
wird an das Hydrogel ein elektrisches Feld angelegt und eine Strukturierung,
insbesondere eine Porenbildung, in dem Hydrogel induziert.
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Dieser
Stand der Technik versteht unter dem Begriff ”Hydrogel” ein
Wasser enthaltendes Gel auf Basis hydrophiler Moleküle,
insbesondere Polymere, die als dreidimensionale Netzwerke vorliegen.
In Wasser quellen diese Netzwerke unter weitgehender Formerhaltung
bis zu einem Gleichgewichtsvolumen auf. Die Netzwerkbildung in Wasser
erfolgt vorwiegend über chemische Verknüpfung
der einzelnen Polymerketten, ist aber auch physikalisch durch elektrostatische,
hydrophobe und/oder Dipol/Dipol-Wechselwirkungen zwischen einzelnen
Segmenten der Molekülketten möglich. Ein nach
diesem Verfahren erhaltenes Kompositmaterial eignet sich als Knorpelersatz,
muss jedoch, um die in-vivo-Stabilität zu verbessern, getrocknet
und chemisch und/oder thermisch vernetzt werden. Wahlweise kann
zusätzlich eine das Zellwachstum oder die Zellansiedlung
oder Zelladhäsion fördernde Substanz eingebracht
werden.
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Es
hat sich gezeigt, dass der zuletzt beschriebene Stand der Technik
sehr zufriedenstellt. Es wäre allerdings wünschenswert,
wenn eine Möglichkeit bestünde, die Stabilität
in geeigneter und vorteilhafter Weise zu steuern, um so die in-vivo-Stabilität
des Erzeugnisses auf den jeweiligen Verwendungszweck abstimmen zu
können. Hierin ist eine Aufgabe der nachfolgenden Erfindung
zu sehen. Darüber hinaus soll das später beschriebene
Kompositmaterial im weitesten Sinne biokompatibel und bioabbaubar
sein, so dass eine weitgehend uneingeschränkte Möglichkeit
des Einsatzes als Medizinprodukt gegeben ist. Dazu soll das Kompositmaterial
eine naturnahe Gewebemorphologie aufweisen und eine hervorragende Übereinstimmung
mit nativem Gewebe zeigen, demzufolge hinlänglich biokompatibel
sein, und die erforderlichen biomechanischen und biochemischen Eigenschaften
aufweisen. Insbesondere soll es geeignet sein, die zonale Morphologie
von natürlichem Gewebematerial, insbesondere Knorpel-/Knochengewebe,
in hervorragender Weise zu imitieren. Die Erfindung soll darüber
hinaus ein besonders geeignetes Verfahren zur Herstellung eines
solchen vorteilhaften Medizinproduktes vorschlagen. Ferner sollen
vorteilhafte Möglichkeiten der Verwendung eines solchen Kompositmaterials
vorgeschlagen werden.
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Die
vorstehende Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur
Herstellung eines als Medizinprodukt verwendbaren biokompatiblen
und bioabbaubaren Kompositmaterials, das dadurch gekennzeichnet
ist, dass a) ein Hydrogel, das mindestens ein synthetisches Polymer
und mindestens ein natürliches Polymer enthält, bereitgestellt
wird, b) an das Hydrogel ein elektrisches Feld angelegt wird, c)
eine Strukturierung des Hydrogels induziert wird, insbesondere unter
Ausbildung von Poren in dem Hydrogel, d) das Hydrogel einer Trocknungsmaßnahme
unterzogen wird und e) das getrocknete Hydrogel durch chemische
und/oder physikalische Maßnahmen unter Bildung des Kompositmaterials
sterilisiert und vernetzt wird. Vorteilhafte Ausgestaltungen der Verfahrenslehre
ergeben sich aus den nachfolgend dargestellten Unteransprüchen
2 bis 22.
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Gegenstand
der Erfindung ist des Weiteren ein Kompositmaterial, das nach dem
Verfahren der Ansprüche 1 bis 22 erhältlich ist.
Die nachfolgenden Unteransprüche 24 bis 30 beziehen sich
auf vorteilhafte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen
Kompositmaterials.
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Ferner
ist dem vorliegenden Erfindungskomplex zuzuordnen die Verwendung
des bezeichneten Kompositmaterials als Träger für
biologische Zellen, insbesondere für menschliche, tierische
oder pflanzliche Zellen, oder auch als Gewebeersatz im menschlichen
oder tierischen Körper.
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Die
Erfindung wird nachfolgend detailliert beschrieben:
Ausgangspunkt
der Erfindung gemäß der oben bezeichneten Maßnahme
a) ist ein Hydrogel. Was darunter im Rahmen der Erfindung zu verstehen
ist, wurde vorstehend bereits im Zusammenhang mit dem Stand der
Technik nach der
WO 2005/044325 erörtert,
worauf verwiesen sei. Um weitgehende Wiederholungen zu vermeiden,
sollen die dortigen Ausführungen ausdrücklich
als Offenbarung zur vorliegenden Erfindung gelten. Ferner sei darüber
hinaus auf den Begriff ”Gel” eingegangen: Unter ”Gelen”,
wie sie hier im Stand der Technik angesprochen sind und auch in
Zusammenhang mit der nachfolgend geschilderten Erfindung verwendbar
sind, sind formbeständige, leicht deformierbare, an Flüssigkeiten
und/oder Gasen reiche disperse Systeme aus mindestens zwei Komponenten
zu verstehen, die zumeist aus einem festen, kolloid zerteilten Stoff
mit langen oder stark verzweigten Teilchen und einer Flüssigkeit
(meist Wasser) als Dispersionsmittel bestehen. In der Regel handelt
es sich um eine feste kohärente Substanz, die im Dispersionsmedium
ein räumliches Netzwerk bildet. Dabei haften die Teilchen
durch Neben- oder Hauptvalenzen an verschiedenen Punkten aneinander.
Von ”Gelen” allgemein leiten sich neben ”Hydrogelen” ”Xerogele” ab.
Hierunter sind Gele zu verstehen, die ihre Flüssigkeit
auf irgendeine Weise, insbesondere durch Verdampfen, Abpressen oder
Absaugen, verloren haben, wobei sich auch die räumliche
Anordnung des Netzes verändern kann, so dass die Abstände
zwischen den Strukturelementen andere Dimensionen als in dem Hydrogel
aufweisen.
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Im
Lichte der vorstehenden Darstellungen zu dem terminus technicus ”Hydrogel” ist
die vorliegende Erfindung dahingehend zu verstehen, dass das Hydrogel
nicht nur mindestens ein natürliches Polymer einbezieht,
sondern noch mindestens ein synthetisches Polymer enthält.
Der Fachmann wird dieses Hydrogel aus synthetischem Polymer und
natürlichem Polymer in fachmännischer Weise bereitstellen.
So kann er beispielsweise das synthetische Polymer und das natürliche
Polymer in geeigneter Weise vormischen, um dann durch Wasserzugabe,
beispielsweise gemäß den Vorgaben der
WO 2005/044325 , das
Hydrogel herzustellen.
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Eine
vorteilhafte Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens besteht darin, dass bei der beschriebenen Maßnahme
a) das Hydrogel dadurch bereitgestellt wird, dass das mindestens
eine synthetische Polymer und das mindestens eine natürliche
Polymer bei geeigneter Temperatur, insbesondere in dem Temperaturbereich
von etwa 30°C bis 100°C, vorzugsweise von etwa
40°C bis 70°C und insbesondere von etwa 50°C
bis 65°C, in Wasser gelöst oder vermengt werden
und das Gemisch danach so weit abgekühlt wird, bis sich
der Gelzustand einstellt. Bei der Verwirklichung der vorliegenden
Erfindung hat es sich als zweckmäßig erwiesen,
wenn als synthetisches Polymer Polyglykolsäure, Comonomere
der Milchsäure und der Glykolsäure, Poly-ε-Caprolacton,
Poly(β-hydroxybutyrat), Poly(p-dioxanon). und/oder Polyanhydride
verwendet werden. Das synthetische Polymer kann vorteilhafterweise
als Pulver oder Granulat eingesetzt werden und ist insbesondere
ein durch Mahl-/Mischprozesse homogen in einer wässrigen
Phase dispergierbares Pulver.
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Unabhängig
von den oben beschriebenen synthetischen Polymeren lassen sich unbeschränkt
und vorteilhaft folgende Substanzen als natürliches Polymer
einsetzen lassen: Proteine, insbesondere Collagen, Gelatine, Fibrin,
Fibrinogen, Albumin, Seidenproteine und/oder Kasein und/oder Polysaccharide,
insbesondere Chitin, Chitosan, Cellulose und/oder Alginate.
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Dem
Fachmann steht es frei, aus den Gruppen der bezeichneten synthetischen
und/oder natürlichen Polymeren für den jeweiligen
Anwendungsfall die geeignete Kombination auszuwählen. Als
besonders vorteilhaft hat es sich erwiesen, wenn als synthetisches
Polymer Polylaktid-co-Glycolid und als natürliches Polymer Gelatine
eingesetzt werden. Hier wird der Fachmann in geeigneter Weise den
zweckmäßigen Polymerisationsgrad oder andere wesentliche
Eigenschaften ermitteln. So hat es sich gezeigt, dass eine Gelfestigkeit
der herangezogenen Gelatine nach Bloom (DIN EN ISO 9665)
von etwa 20 bis 450 g, insbesondere etwa 250 bis 300 g besonders
vorteilhaft ist.
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Das
vorteilhafte Gewichtsverhältnis zwischen dem zur Herstellung
des Hydrogels eingesetzten synthetischen Polymers und natürlichen
Polymeren kann, je nach in Betracht gezogener Verwendung des fertigen Kompositmaterials
ermittelt werden. Bevorzugt ist es, wenn auf einen Gewichtsteil
synthetisches Polymer etwa 1 bis 10, insbesondere etwa 4 bis 6 Gewichtsteile
natürliches Polymer eingesetzt werden.
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In Übereinstimmung
mit dem vorstehend beschriebenen Stand der Technik nach der
WO 2005/044325 A1 folgt
der beschriebenen Maßnahme a), nach der das Hydrogel hergestellt
wird, die Behandlung gemäß Maßnahme b).
Hierbei wird an das Hydrogel ein elektrisches Feld angelegt. Dabei
ist es von Vorteil, wenn eine Spannung von etwa 1 bis 50 Volt, insbesondere
25 bis 30 Volt, an das Hydrogel angelegt und/oder durch das Hydrogel
ein Stromfluss der Stärke von etwa 0,5 bis 5 A eingestellt
wird. Der zeitliche Rahmen hierfür ist nicht kritisch.
Es ist zweckmäßig, wenn die Maßnahme
b) während einer Zeitspanne von etwa 1/2 Minute bis zu
etwa 120 Minuten durchgeführt wird. Die zuvor bezeichnete Spannung
kann auf eine Gleichspannung oder eine Wechselspannung zurückgehen.
In einer vorteilhaften Ausführungsform wird eine Wechselspannung
mit einer Frequenz von etwa 0,01 bis 1 Hertz, vorzugsweise etwa
0,05 bis 0,1 Hertz, angelegt. Das Anlegen eines elektrischen Feldes
an das erfindungsgemäß herangezogene Hydrogel
kann über Elektroden an sich bekannter Bauweise erfolgen.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden zwei Elektroden
verwendet, die an gegenüberliegenden Seiten des Hydrogels
positioniert sind und mit diesem in elektrisch leitender Verbindung
stehen.
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Den
beiden oben bezeichneten Maßnahmen a) und b) schließt
sich eine Maßnahme c) an, bei der eine Strukturierung des
Hydrogels induziert wird, insbesondere unter Ausbildung von Poren,
einschließlich Porenkanäle. Dem Fachmann ist es
unter Berücksichtigung des eingangs geschilderten Standes
der Technik geläufig, wie eine Strukturierung erzeugt werden
kann. Insbesondere handelt es sich um die Maßnahme des
Einfrierens des Hydrogels. Bevorzugt erfolgt die Einfriermaßnahme
des Hydrogels in einer gerichteten Weise, so dass die Ausbildung
von Eiskristallen zellular und/oder dendritisch strukturiert erfolgt,
und/oder auf eine Art, die durch physikalische Gesetze bei der Erstarrung
wasserhaltiger Substanzen vorgegeben ist. Der Einfrierschritt kann
auch ungerichtet erfolgen. Ein Beispiel für ein ungerichtetes
Einfrieren ist ein sehr schnelles Erstarren (Schockgefriervorgang),
beispielsweise über einen Zeitraum von etwa 1 s–180
s, vorzugsweise von etwa 50 bis 70 s, die zu einem amorphen glasartigen
Zustand des Hydrogels führt.
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In
Einzelfällen ist es vorteilhaft, wenn die oben beschriebenen
Maßnahmen b) und c) zeitlich überlagert durchgeführt
werden. Dabei können die Maßnahmen b) und c) zeitlich
zusammenfallen, aber auch voneinander getrennt nacheinander oder
so durchgeführt werden, dass eine der beiden Maßnahmen
nach Beginn der jeweiligen anderen Maßnahme durchgeführt
wird, ohne dass die andere Maßnahme bereits abgeschlossen
ist.
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Es
kann auch zweckmäßig sein, wenn das Hydrogel vor
der Durchführung der Maßnahmen b) und/oder c)
als Schicht ausgebildet wird, die dann den Maßnahmen b)
und/oder c) unterzogen wird. Diese Schicht kann nach Durchführung
der Maßnahmen b) und c) des Verfahrens aufgerollt werden.
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Den
oben beschriebenen Maßnahmen a) bis c) folgt eine Trocknungsmaßnahme
d). Auch hier kann rein fachmännisch vorgegangen werden,
beispielsweise kann durch Beströmen mit Luft der erforderliche Trocknungsgrad
eingestellt werden. Als besonders vorteilhaft hat es sich erwiesen,
wenn die Trocknungsmaßnahme d) in Form einer Gefriertrocknung vorgenommen
wird. Es hat sich gezeigt, dass dem Gefriertrocknen zweckmäßigerweise
ein Einfrieren des Hydrogels bei einer Temperatur von etwa –1°C
bis –196°C, insbesondere im Bereich von etwa –10°C
bis –100°C, vorangeht, das insbesondere während
einer Zeitdauer von etwa 30 Minuten bis zu etwa 4 Stunden erfolgt.
Nachdem das Material weitgehend eingefroren ist, schließt
sich dann die Gefriertrocknung an. Diese beträgt in der
Regel etwa 1 bis 7 Tage, insbesondere etwa 2 bis 4 Tage. Dem Fachmann
ist es geläufig, dass das Gefriertrocknen stets durch eine
Sublimation der flüchtigen Bestandteile erfolgt.
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Um
erfindungsgemäß ein für den beschriebenen
Anwendungszweck geeignetes Kompositmaterial bereitzustellen, ist
es erforderlich, die bezeichnete Maßnahme e) durchzuführen.
Das getrocknete Hydrogel soll dabei durch chemische und/oder physikalische
Maßnahmen sterilisiert und vernetzt werden. Der jeweils
eingestellte Vernetzungsgrad bestimmt bei den verschiedenen Anwendungsfällen
die gewünschte Stabilität. Es ist allerdings vorteilhaft,
wenn die Vernetzung und die Sterilisierung zumindest überlappend
oder insbesondere gleichzeitig erfolgen. Die Mehrzahl der nachfolgend
beschriebenen Maßnahmen stellt diese vorteilhafte Ausgestaltung
der Erfindung sicher. So ist es in jedem Fall von Vorteil, wenn
die Maßnahme e) nicht nur zu der gewünschten Vernetzung,
sondern auch zu der erforderlichen Sterilisierung führt.
Dies lässt sich gewährleisten, wenn die Maßnahme
e) eine Trockenhitzebehandlung ist, die bei einer Temperatur von
mehr als etwa 130°C erfolgt. Besonders wird es bevorzugt,
dass die Trockenhitzebehandlung bei einer Temperatur von mehr als
etwa 140°C und/oder weniger als etwa 200°C durchgeführt
wird. Die Zeitdauer der Trockenhitzebehandlung hat einen Einfluss
auf den Grad der Sterilisierung und Vernetzung. Im Allgemeinen ist
es bevorzugt, wenn die Trockenhitzebehandlung während einer
Zeitdauer von mindestens etwa 8 Stunden, insbesondere von mindestens
etwa 24 Stunden, durchgeführt wird. Hierbei werden auch
hitzeresistente Pathogene in wünschenswerter Weise abgetötet.
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Eine
weitere besonders vorteilhafte Ausgestaltung der Maßnahme
e) zur Durchführung der Sterilisierung und des Vernetzens
besteht darin, ionisierende Strahlen einwirken zu lassen, insbesondere
UV-Strahlen, Röntgenstrahlen, Gammastrahlen und/oder Elektronen-/Ionenstrahlen.
Hierbei ist fachmännisch die geeignete Strahlenintensität
einstellbar, da auch diese eine Auswirkung auf den erzielten Grad
der Sterilisierung und der Vernetzung hat. In Einzelfällen
kann es zweckmäßig sein, die bezeichnete Maßnahme
e) zur Sterilisierung und Vernetzung chemisch durchzuführen.
Dies kann insbesondere durch Behandlung mit einem Aldehyd und/oder Keton
erfolgen, insbesondere mit Formaldehyd. Es kann auch zweckmäßig
sein, die Maßnahme e) in Form einer Kombination von einer
chemischen Behandlung und. einer Behandlung mit ionisierenden Strahlen
vorzunehmen. Bei der chemischen Behandlung ist zu bedenken, dass
in dem vernetzten Material toxische Verunreinigungen verbleiben
können. Dies macht im Allgemeinen eine nachfolgende Maßnahme
des Entfernens solcher Verunreinigungen erforderlich. Dies kann
beispielsweise im Falle des Einsatzes von Formaldehyd als chemisches
Vernetzungsmittel dadurch erfolgen, dass anschließend mehrmals
mit steriler Kochsalzlösung (beispielsweise etwa 1%-ig)
gewaschen wird, um die Aldehydreste aus dem getrockneten Hydrogel
zu entfernen.
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Der
Fachmann erkennt ohne Weiteres, dass die angesprochene Vernetzung
innerhalb mindestens einer Polymerkomponente zu kovalenten Bindungen
zwischen einzelnen Polymermolekülen führt. Es
ist vorteilhaft, wenn eine Vernetzung nicht nur innerhalb der einzelnen
Polymerkomponenten erfolgt, sondern auch zwischen den unterschiedlichen
Polymerkomponenten. Dazu können die synthetischen und natürlichen
Polymere so zusammengestellt werden, dass eine solche Vernetzung
möglich ist. Beispielsweise tragen beide Polymere der oben
als vorteilhaft bezeichneten Kombination von Gelatine und Polylactid-co-glycolid
reaktive Gruppen, die unter Bildung von Ester- und/oder Amid-Verknüpfungen
reagieren können. Eine Vernetzung innerhalb der Polymerkomponenten
ist keineswegs zwingend erforderlich. So kann die eine nicht reagierende
Komponente, beispielsweise durch Bildung einer Schmelzphase bei
einem thermischen Prozessschritt, zu einer Stabilisierung des Kompositmaterials
beitragen. Von besonderem Vorteil ist es, wenn die zweite Komponente
sowohl als reagierende Komponente als auch als nicht reagierende
Komponente zur Stabilisierung des Kompositmaterials beiträgt.
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In
Einzelfällen kann es zweckmäßig sein,
wenn das nach der Maßnahme d) anfallende Material vor dem
Verfahrensschritt e) verpackt und versiegelt wird und es während
der Durchführung des Verfahrensschritts e) in der Verpackung
verbleibt. Dies hat den Vorteil, dass eine Kontaminierung des Materials
bei einem späteren Verfahrensschritt vermieden werden kann.
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Schließlich
lässt sich das erfindungsgemäße Verfahren,
auch im Hinblick auf das wünschenswerte Verfahrenserzeugnis
in Form des bezeichneten Kompositmaterials, dadurch vorteilhaft
steuern, dass in Übereinstimmung mit der Offenbarung der
WO 2005/044325 A ,
ein Hydrogel nach der Maßnahme a) bereitgestellt wird,
das einen anorganischen Bestandteil enthält, der bei Anlegen
des elektrischen Feldes nach der Maßnahme b) ausfällt
und eine feste Phase bildet. Hierbei besteht keine wesentliche Einschränkung.
Erforderlich ist es allein, dass dieser weitere Bestandteil bei
Anlegen eines elektrischen Feldes an das Hydrogel ausfällt
bzw. eine feste Phase bildet. Insbesondere können als anorganischer
Bestandteil in Frage kommen: Calciumcarbonat, Calciumphosphat, insbesondere
Hydroxylapatit, Tri-Calciumphosphat, Brushit, Octacalciumphosphat, amorphes
Calciumphosphat, Tetracalciumphosphat, Monetit, Calcium-defizitäres
Hydroxylapatit und/oder Fluor enthaltendes Calciumsalz, insbesondere
fluorierter Hydroxylapatit.
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Neben
den oben beschriebenen Bestandteilen können noch weitere
Bestandteile zur Ausbildung des Kompositmaterials in Frage kommen,
wenn irgendeine besondere Eigenschaft durch die Einbeziehung eines solchen
Bestandteils in dem Fertigerzeugnis eingestellt werden soll. So
kann es in Einzelfällen vorteilhaft sein, wenn bei der
Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens
ein Bestandteil einbezogen wird, der elektrisch leitfähig
ist. Sollte ein solcher Bestandteil einbezogen werden, so könnte
auch dieser bei Anlegen eines elektrischen Feldes an das Hydrogel
ausfallen und eine feste Phase bilden.
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Die
bezeichneten weiteren Bestandteile sollten in dem letztlich vernetzten
und sterilisierten Hydrogel in Form des Kompositmaterials möglichst
homogen verteilt sein. In Einzelfällen stört eine
inhomogene Verteilung nicht.
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Wie
bereits ausgeführt, ist Gegenstand der Erfindung auch ein
Kompositmaterial, das in Übereinstimmung mit dem vorstehend
detailliert beschriebenen Verfahren gemäß der
Erfindung erhältlich ist. Die Strukturierung des in das
Kompositmaterial übergegangenen Hydrogels erweist sich
insbesondere darin, dass das Kompositmaterial Poren und/oder Kanäle
bzw. Porenkanäle aufweist. Bevorzugt wird es, an einer
kristallinen und/oder amorphen festen Phase gebunden. Bei einer
bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich
bei der bezeichneten kristallinen und/oder amorphen festen Phase
um eine Calciumverbindung, wie bereits oben aufgeführt.
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Der
Durchmesser der bezeichneten Poren bzw. Porenkanäle ist
nicht von kritischer Bedeutung. Vorteilhafterweise beträgt
der Durchmesser der Poren bzw. der Kanäle etwa 50 bis 500 μm,
insbesondere 150 bis 300 μm. Wenn hier von ”Porengröße” im
Zusammenhang mit den Porenkanälen bzw. Kanälen
gesprochen wird, dann soll darunter der mittlere Porenkanaldurchmesser
verstanden werden.
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Um
den übergeordneten Erfindungszweck zu erfüllen,
nämlich das in obiger Weise hergestellte Kompositmaterial
gemäß der Erfindung als Medizinprodukt einzusetzen,
kann das Kompositmaterial ohne weitere Modifikationen verwendet
werden. Es ist zweckmäßig, wenn das Kompositmaterial
gemäß der Erfindung in seinen Poren und/oder Kanälen
bzw.
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Porenkanälen
eine das Zellwachstum, die Zellansiedlung und/oder die Zelladhäsion
fördernde Substanz enthält. Die Einbeziehung solcher
Substanzen erfolgt vorteilhafterweise wie folgt: Die einzubringende Substanz
wird in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst
bzw. dispergiert. Mit dieser Lösung wird das trockene Kompositmaterial,
das Poren- bzw. Kanal Struktur aufweist, durchtränkt. Anschließend
erfolgt ein Gefriertrocknen des durchtränkten Kompositmaterials,
so dass die eingebrachte Substanz im Kompositmaterial verbleibt.
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Es
ist bevorzugt, dass die mindestens eine das Zellwachstum, die Zellansiedlung
und/oder die Zelladhäsion fördernden Substanz
ein Wachstumsfaktor oder ein aus humanem oder tierischem Blutserum
erzeugtes Serum, bevorzugt ein aus tierischem Blutserum erzeugtes
Serum, insbesondere ein aus Kälberblut erzeugtes Serum,
oder Poly-L-Lysin ist. Der Wachstumsfaktor wird insbesondere aus
der aus Substanzen der TGF-β Superfamilie, insbesondere
TGF-β1, bestehenden Gruppe ausgewählt. Von besonderem
Vorteil ist es, wenn die mindestens eine das Zellwachstum, die Zellansiedlung
und/oder die Zelladhäsion fördernde Substanz ein Serum
ist, insbesondere autogenen, synergenen, allogenen oder xenogenen
Ursprungs. Des Weiteren ist es vorteilhaft, wenn das erfindungsgemäße
Kompositmaterial biologische Zellen, insbesondere menschliche, tierische
und/oder pflanzliche Zellen enthält.
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Das
oben im Einzelnen dargestellte erfindungsgemäße
Kompositmaterial ist, der eingangs gestellten Aufgabe folgend, als
Träger für biologische Zellen, insbesondere menschliche,
tierische oder pflanzliche Zellen, geeignet. Hier lassen sich als
bevorzugte Zellen konkret bezeichnen: Knorpelzellen, Knochenzellen,
Zellen des Blutsystems, Haut und Nervengewebe.
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Von
besonderem Vorteil ist die Verwendung des erfindungsgemäßen
Kompositmaterials als Gewebeersatz im menschlichen oder tierischen
Körper. Unter Gewebeersatz fallen insbesondere die Anwendungen zur
Heilung von Defekten im Bereich des Gelenkknorpels, des Knochens,
der Haut und der Nervengewebe. Insbesondere ist das beschriebene
Material zur Unterstützung der Knorpelbildung in vivo und
in vitro geeignet und kann mit Vorteil bei Mosaikplastiken am Knie,
der Hüfte und/oder dem Meniskus eingesetzt werden. Weiterhin
kann das beschriebene Material, gegebenenfalls in Kombination mit
einem Pflaster, vorteilhaft als blutstillendes Material herangezogen
werden. Dabei ist es zweckmäßig, wenn als natürliches
Polymer Collagen verwendet wird, weil dieses nicht wie andere Produkte
sauer abgebaut wird.
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Es
erweist sich somit, dass die Erfindung, wie sie oben in verschiedenen
Ausführungsformen dargestellt wird, die gestellte Aufgabe
in vorzüglicher Weise löst. Die dabei insbesondere
herausgestellte Stabilisierung, abgestimmt auf den jeweiligen Anwendungszweck,
lässt sich wünschenswert steuern. Dies geht insbesondere
auf das im Ausgangs-Hydrogel zusätzlich enthaltene synthetische
Polymer zurück. Hier hat nicht nur das synthetische Polymer
als solches Einfluss, sondern auch, wie ohne Weiteres erkennbar,
das gewählte Mengenverhältnis zwischen dem natürlichen
und synthetischen Polymer. Weitere Möglichkeiten der Steuerung der
für den jeweiligen Anwendungsfall gewünschten
Eigenschaften des Kompositmaterials bestehen darin, dass insbesondere
der erläuterte weitere Bestandteil in Form eines organischen
Materials genutzt werden kann. Damit sind folgende Vorteile verbunden:
Kombination einer natürlichen Materialkomponente mit optimal auf
den zu heilenden Defekt bereits vorhandenen Eigenschaften mit einer
synthetischen Materialkomponente mit sehr gezielt einstellbarem
Eigenschaftsprofil hinsichtlich Abbaurate und mechanischer Stabilität.
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Die
Erfindung soll nachfolgend anhand eines detaillierten Beispiels
erläutert werden.
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Beispiel 1
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1. Herstellung einer homogenen Gelatine-Polylactid-co-glycolid
(PLGA)-Lösung
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Für
acht Kompositmaterialien (Scaffolds/Proben) werden jeweils etwa
5 ml Lösung benötigt. 1. Herstellung der Lösung:
Dabei soll diese Lösung pro ml enthalten: 0,05 g Gelatine
(50% Gew./Vol.), 0,01 g PLGA R503H (vertrieben von der Fa. Boehringer,
Ingelheim, Deutschland), (1% Gew./Vol.) und 1,0 ml Wasser. Hierbei
wird im Einzelnen wie folgt vorgegangen: Gelatine auf Wiegepapier
abwiegen und in ein verschließbares 50 ml Gefäß geben.
Wasser dazupipettieren und Gefäß zum Quellen der
Gelatine 10 min in einen Schüttler geben. Falcon für
10–15 min in das 60°C warme Wasserbad stellen,
bis die Gelatine aufgelöst ist. PLGA auf Wiegepapier abwiegen
und in einen Mörser geben. 2–5 ml Gelatine-Lösung
zugeben und mörsern, bis das PLGA sehr fein verteilt ist
(mindestens 10 min). Die Lösung im Mörser eventuell
im Wasserbad erwärmen und mit der 1 ml-Pipette in ein neues
verschließbares Gefäß pipettieren. Das
Gefäß mehrmals für etwa 5 sec in ein Ultraschall-Bad
halten. Zwischendurch schütteln bzw. vortexen. Die fertige
Lösung nach Bedarf im Wasserbad bei etwa 40°C
erwärmen (jedoch nicht oberhalb von 50°C). Das
verschließbare Gefäß gut abtrocknen,
mit Isopropanol abwischen und zurück in den Schüttler
stellen.
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2. Einfrieren der Scaffolds
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Ein
formgebendes Gefäß (Probenform), bestehend aus
einem formgebenden Silikondeckel, einer Metallplatte und zwei Platinelektroden
wird bereitgestellt und an geeignete Temperaturfühler angeschlossen.
Die Elektrolysespannung wird auf 20 V eingestellt. Die Probenform
wird anschließend mit der Gelatine-PLGA-Lösung
so befüllt, dass ein Kontakt mit beiden Platinelektrode
besteht und Elektrolyse ermöglicht. Zum Einfrieren wird
ein Peltier-Element verwendet auf dem die Probenform aufliegt. Die
Temperatur wird auf –5,5°C eingestellt. Danach
wird die Temperatur so reduziert dass eine Abkühlung mit
0,1–0,3°C/min erreicht wird. Es wird die Elektrolyse-Spannung
ausgeschaltet und die Anode entfernt. Nach vollständigem
Einfrieren der Proben wird die Probenform-Form vom Peltier-Element
entfernt. Die Proben werden vorsichtig aus der Probenform gelöst
und für mindestens 4 h in einer Tiefkühltruhe
(–80°C) in geeigneten Teflongefäßen
gelagert.
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3. Gefriertrocknung
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Die
Teflongefäße werden aus der Tiefkühltruhe
entnommen und mit Autoklavierpapier abgedeckt, verschlossen und
in einem Gefriertrockner (Modulyo, BOC Edwards, Großbritannien)
für mindestens 3 Tage gefriergetrocknet.
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4. Sterilisation und Vernetzung der Scaffolds
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Die
Scaffolds werden mit einem geeigneten Messer in etwa 8 × 2
mm große Zylinder zerschnitten und anschließend
in einem Heißluftsterilisationsbeutel doppelt eingeschweißt.
Die Beutel werden 24 Stunden lang bei einer Temperatur von 140°C
im Trockenofen vernetzt und gelegt. Diese Behandlung führt
zu der gewünschten Sterilisierung und Vernetzung.
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Beispiel 2 (Einbringen einer das Zellwachstum,
die Zellansiedlung und/oder die Zelladhäsion fördernden
Substanz)
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Poly-L-Lysin
wird zusammen mit PLGA zermörsert und wie in Beispiel 1
zusammen mit der Gelatine-Lösung weiterverarbeitet. Durch
den hohen Schmelzpunkt des Poly-L-Lysins (etwa 170°C) und
der noch höheren Zersetzungstemperatur des Lysin-Monomers,
wird von einer deutlichen Restaktivität ausgegangen.
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Beispiel 3 (Nachweis der Nicht-Toxizität
von Gelatine und Gelatine-PLGA-basierendem Kompositmaterial)
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Ein
gemäß Beispiel 1 hergestelltes Kompositmaterial,
wurde mit spezialisierten Zellen in einem externen, zertifizierten
und akkreditierten Prüflabor hinsichtlich der Zytotoxizität getestet
(Neutralrottest). Als Vergleich wurden Negativkontrollen und Positivkontrollen
verwendet. Die Reduktion der Zellvitalität liegt im Bereich
der Vorgaben der
DIN EN ISO 10993-5. Die Ergebnisse
der externen Testung sind in
1 und Tabelle 1
dargestellt. Tabelle 1
| | Optische
Dichte (Mittelwert) | Zellvitalität
(Prozent) Normiert auf Negativkontrolle |
| Negativkontrolle
(n = 9) | 1,194 ± 0,035 | 100 |
| Positivkontrolle
(n = 9) | 0,054 ± 0,004 | 4,56 |
| Erfindung
(n = 12) | 0,999 ± 0,029 | 83,64 |
- Anmerkung: Die Tabelle entspricht 1
-
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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-
Zitierte Patentliteratur
-
- - WO 2005/044325
A1 [0001, 0005, 0017]
- - WO 2005/044325 [0011, 0012]
- - WO 2005/044325 A [0026]
-
Zitierte Nicht-Patentliteratur
-
- - Mikos et al.,
Electronic Journal of Biotechnology, Vol. 3 No. 2, 2000 [0004]
- - DIN EN ISO 9665 [0015]
- - DIN EN ISO 10993-5 [0043]