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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zur Kultivierung von phototrophen
Organismen in kleinformatigen Kompartimenten.
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Phototrophe
Mikroalgen, beispielsweise Spirulina oder Chlorella, sind in der
Lage, mit Hilfe von Lichtenergie, unter Vorhandensein entsprechender Nährelemente,
CO2 und Wasser in Biomasse umzuwandeln.
Anstelle von gasförmigen CO2 können
auch organische oder anorganische Kohlenstoffquellen in Nährmedien
als Kohlenstoffquelle eingesetzt werden. Einen Überblick über
gängige geschlossene Kultivierungstechnologien gibt Eriksen
N. T., Biotechnol. Lett., Vol. 30, Nr. 9, 1525–1536 (2008).
Algenbiomasse kann zur Herstellung hochwertiger Wert- oder Wirkstoffe,
beispielweise Pharmazeutika, eingesetzt werden. Die Massenproduktion
von Algenbiomasse als Nahrungs- oder Futtermittel, nachwachsender
Energie- oder Chemierohstoff wird wegen der, im Vergleich zum Produktwert,
verhältnismäßig hohen Energiekosten,
Betriebskosten sowie Investitionskosten geschlossener Anlagen heute
bevorzugt in Flachwasser-Algenfarmen oder offenen Bioreaktoren,
unter ausschließlicher Nutzung der direkten Sormenlichteinstrahlung,
durchgeführt. Photobioreaktoren der ersten Generation nutzen
das Sonnenlicht als Lichtquelle. Die Reaktoren bestehen aus großen
offenen Beckenanlagen wie Raceway ponds oder z. B. Rundbeckenanlagen
mit Durchmessern bis zu 45 m und umlaufenden Mischarmen. Nachteilig
sind hierbei die Abhängigkeit von der Intensität
der Sonneneinstrahlung, inhomogene Prozessbedingungen und der Eintrag
von Kontaminationen aufgrund des offenen Systems (www.ybsweb.co.jp:
YAEYAMA Premium Quality Chlorella).
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Es
sind auch relativ großvolumige, geschlossene Photobioreaktoren
bekannt, beispielsweise aus der
WO 2007/047805 A2 , welche künstlich
beleuchtet werden. In der
GB
2339763 A werden durchsichtige Kunststoffsäcke
mit einer Länge von 0,5 m bis 50 m als Photobioreaktoren
zur Algenkultivierung empfohlen, wobei wegen der Transparenz des
Materials das Sonnenlicht als Lichtquelle genutzt werden kann. In
Martinez-Jeronimo
et al, J. appl. Phycol. 6: 423–425, 1994 wird
die Algenkultivierung im Labormaßstab in PE-Bags mit einem
Volumen von 8 Litern bis 40 Litern durchgeführt. Photobioreaktoren
auf Basis von transparenten Einwegmaterialien, mit relativ großem
Volumen werden in der
WO
98/13469 A1 empfohlen. Auch bei den geschlossenen Reaktortypen
dieses Volumens ist die Kontamination der Kulturen problematisch.
In der
GB 2339763 A wird
dazu empfohlen, die Kunststoffsäcke vor deren Gebrauch zur
Sterilisation in einem Autoklaven zu erhitzen. In der
WO 98/13469 A1 wird empfohlen,
die Behälter vor deren Gebrauch mit gamma-Strahlen zu behandeln.
Für die großtechnische Produktion sind diese Maßnahmen
zu aufwändig.
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In www.instructables.com/id/An
Algae Bioreactor from Recycled Water Bottles wird die Algenkultivierung
in wiederverwendeten Plastikflaschen ohne besondere Maßnahmen
zur Reinigung oder Sterilisierung der recycelten Flaschen beschrieben.
Der Verzicht auf Maßnahmen zur Reinigung oder zur Vermeidung
von Kontaminationen ist für die industrielle Produktion
aber nicht zu praktizieren. Insbesondere wenn Algenkulturen zur
Herstellung hochwertiger Wirkstoffe, beispielsweise pharmazeutischer
Produkte, eingesetzt werden, können Kontaminationen nicht vernachlässigt
werden.
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Es
bestand daher die Aufgabe, ein Verfahren zur Kultivierung von phototrophen
Organismen zur Verfügung zu stellen, mit welchem die Organismen
in großtechnischen Mengen hergestellt werden können und
die Kontaminationsproblematik in einer ökonomisch vorteilhaften
Weise gelöst werden kann.
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Gegenstand
der Erfindung ist ein Verfahren zur Kultivierung von phototrophen
Organismen in kleinformatigen Kompartimenten, in einem mehrstufigen Verfahren,
in welchem verschließbare Behältnisse als Kultivierungsgefäße
mit einem Volumen von vorzugsweise 10–1 bis
101 Litern bereitgestellt werden, diese
in einer automatisierten Anlage, mit phototrophen Organismen und
wässerigem Medium befüllt werden, unter Lichteinwirkung
gelagert werden, nach Beendigung der Lagerung die phototrophen Organismen
und/oder die durch die phototrophen Organismen hergestellten Stoffe
gewonnen werden, und gegebenenfalls die Behältnisse der
Wiederverwertung in dem Verfahren zugeführt werden.
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Zur
Kultivierung geeignete phototrophe Organismen sind phototrophe Makroorganismen
und phototrophe Mikroorganismen. Beispiele für phototrophe
Makroorganismen sind Makroalgen, Pflanzen, Moose, Pflanzenzellkulturen.
Beispiele für phototrophe Mikroorganismen sind phototrophe
Bakterien wie Purpurbakterien, phototrophe Mikroalgen einschließlich
Cyanobakterien. Bevorzugt wird das Verfahren zur Kultivierung von
phototrophen Mikroorganismen. Besonders bevorzugt wird das Verfahren
zur Kultivierung phototropher Mikroalgen.
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Als
Behälter zur Kultivierung werden bevorzugt transparente
oder transluzente Kultivierungsgefäße verwendet.
Bevorzugt werden Kultivierungsgefäße mit einem
Volumen von < 10
Litern, besonders bevorzugt 0,2 bis 5 Litern. Geeignete Materialien
für die Kultivierungsgefäße sind Glas
oder Kunststoffe, vorzugsweise transparente Thermoplasten wie Polyethylen
(PE), Polypropylen (PP), Polystyrol (PS), Polycarbonat (PC), Polymethylpenten
(PMP), Polyethylenterephthalat (PET), Perfluorethylenpropen (FEP), Perfluoralkoxycopolymere
(PFA), Polyvinylchlorid (PVC). Geeignet sind auch Silikone, sowie
Coextrudate oder Kombinationen der genannten Thermoplasten oder
Silikone.
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Die
Herstellung der Kultivierungsgefäße kann mittels
dem Fachmann bekannter Methoden, beispielsweise in den üblichen
thermoplastischen Verfahren wie Blasextrusion erfolgen. Die Kultivierungsgefäße
können in allen möglichen Formen, in die Flüssigkeiten
abgefüllt werden können, eingesetzt werden. Die
Kultivierungsgefäße werden vorzugsweise in Flaschenform,
als Beutel oder als flache, plattenförmige Behälter
gefertigt, damit deren Befüllung mittels Abfülltechnologie
aus der Getränkeindustrie erfolgen kann.
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Die
Befüllung erfolgt mit einer automatisierten Abfüllanlage.
Vorzugsweise in automatisierten Abfüllanlagen für
Flaschen und unter Nutzung von aseptischen oder sterilen Abfülltechniken.
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Vor
der Befüllung werden die Kultivierungsgefäße
gegebenenfalls gereinigt, vorzugsweise in einer Reinigungsstation,
beispielsweise mittels einmaligem oder mehrmaligem Waschen mit Wasser
oder Lauge. Vorzugsweise werden die Kulivierungsgefäße mittels
eines Sterilisators sterilisiert. Beispielsweise durch Sterilisation
mittels Einsatz von Wasserstoffperoxid oder Peressigsäure
enthaltenden Medien oder durch Einleiten von Dampf oder Heißwasser. Nach
der Sterilisierung werden die Kultivierungsgefäße
gegebenenfalls mit sterilem Wasser ausgespült. Bei der
Anwendung von sterilen Kultivierungsgefäßen werden
die Verschlüsse vorzugsweise sterilisiert.
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Die
Befüllung mit den phototrophen Organismen und dem wässerigem
Medium erfolgt anschließend in einer, vorzugsweise separaten,
Füllstation. Die Befüllung erfolgt vorzugsweise
unter aseptischen oder sterilen Bedingungen. Zur Befüllung
werden die phototrophen Organismen, gegebenenfalls aus einer Vorkultur,
in wässerigem Medium aufgenommen. Die die phototrophen
Organismen enthaltende Suspension kann gegebenenfalls mit Nährmedium
abgemischt und abgefüllt werden. Es kann aber auch so vorgegangen
werden, dass die Abfüllung der phototrophen Organismen
und des wässerigen Mediums getrennt, und simultan oder
seriell erfolgt. Bevorzugt ist die getrennte und serielle Befüllung
mit wässerigem Medium und phototrophen Organismen mit anschließender
Mischung in dem Kultivierungsgefäß. Simultan oder
separat kann Kohlendioxid zugegeben werden. Geeignete Nährmedien
enthalten vorzugweise neben Nährsalzen und/oder Wachstums-
oder Produktbildungs-fördernden Stoffen, gegebenenfalls organische
oder anorganische Kohlenstoffquellen wie Bicarbonate, beispielsweise
Natriumhydrogencarbonat. Das Kultivierungsmedium kann bezüglich des
pH-Wertes gegebenenfalls zusätzlich abgepuffert werden.
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Nach
der Befüllung werden die Kultivierungsgefäße
verschlossen, vorzugsweise unter aseptischen oder sterilen Bedingungen.
Das Befüllen und Verschließen kann beispielsweise
in abgeschlossenen Vorrichtungen unter Reinraum-Bedingungen erfolgen.
Die befüllten Kultivierungsgefäße werden
anschließend an einen Lagerort verbracht. Der Transport
erfolgt vorzugsweise unter Bedingungen bei denen das Kultivierungsmedium
in Bewegung gehalten wird, um Sedimentation zu verhindern. Das kann
beispielsweise mittels Rütteln, Schütteln, Wenden,
Kippen, Wendeln, Drehen oder Rollen erfolgen.
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Mit
der beschriebenen Technologie lassen sich Abfüllleistungen
von vorzugsweise 100 bis 60000 Kultivierungsgefäßen
pro Stunde erzielen, je nach Größe der Kultivierungsgefäße.
Bei kleinen Kultivierungsgefäßen mit einem Volumen
bis 0,5 Litern können gegebenenfalls bis zu 60000 Gefäße
pro Stunde abgefüllt werden. Besonders bevorzugt werden
1000 bis 30000 Kultivierungsgefäße pro Stunde abgefüllt.
Die Lagerkapazitäten sind den eingesetzten Abfüllleistungen,
unter Berücksichtigung einer gegebenenfalls mehrwöchigen
Lagerzeit, entsprechend anzupassen.
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Die
Lagerung der befüllten Kultivierungsgefäße
kann im Freien oder in geschlossenen Gebäuden erfolgen.
Bevorzugt wird die Lagerung in geschlossenen Gebäuden,
beispielsweise in Hochregalen. Die Beleuchtung erfolgt im Freien
mittels Sonnenlicht, welches gegebenenfalls durch Kunstlicht (künstliche
Lichtquellen) ergänzt werden kann. In geschlossenen Gebäuden
kann die Lagerung in transparenter Umhausung, unter Ausnutzung des
Sonnenlichts, gegebenenfalls unter Unterstützung mit Kunstlicht
erfolgen. Bei nicht-transparenter Umhausung kann die Lagerung unter
Kunstlicht und/oder Zuleitung des Sonnenlichts mit lichtleitenden
Einrichtungen erfolgen. Sind während der Lagerung definierte
und konstante Lichtverhältnisse erforderlich, wird in geschlossenen,
transparenten oder nicht-transparenten, Gebäuden unter
Beleuchtung mit Kunstlicht und/oder Nutzung von lichtleitenden Einrichtungen
gelagert.
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Bevorzugt
werden zur künstlichen Beleuchtung LEDs enthaltende Beleuchtungsmittel
eingesetzt. Geeignet sind aber auch andere künstliche Lichtquellen
wie beispielsweise Fluoreszenz-Leuchtstofflampen, Neonlampen, Metalldampf-Lampen, Edelgas-Lampen,
Halogenlampen, Schwefelplasmalampen. Falls nicht-transparente Kultivierungsgefäße eingesetzt
werden sollen, kann das Sonnenlicht und/oder Kunstlicht, beispielsweise
mittels lichtleitender Einrichtungen, in das Kultivierungsgefäß geführt werden.
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Bei
der Lagerung werden Bedingungen bevorzugt, welche die Sedimentation
der Kulturen verhindern. Dazu können die Kultivierungsgefäße
temporär oder permanent, mittels Rütteln, Schütteln, Wenden,
Kippen, Wendeln, Drehen oder Rollen, in Bewegung gehalten werden.
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Die
mit den phototrophen Organismen befüllten Kultivierungsbehälter
werden vorzugsweise ohne aktiven Gasaustausch über die
Behältergrenzen hinweg gelagert. Unter einem aktiven Gasaustausch wird
dabei die Zuführung von Gasen über Zuleitungen
verstanden, nicht aber ein materialbedingter Gasaustausch mit der
Umgebung, wie etwa bei PET-Behältern. Gegebenenfalls kann
während der Lagerung ein aktiver Gasaustausch, beispielsweise mit
Luft und/oder Sauerstoff und/oder CO2; und/oder ein
Flüssigkeitsaustausch, beispielsweise mit Nährstoffen,
Korrekturmitteln, Induktoren und/oder Precursoren, erfolgen. Dieser
kann über entsprechende Anschlüsse an den Kultivierungsgefäßen,
beispielsweise am Verschluß, erfolgen. Vorzugsweise erfolgt der
Gas- oder Flüssigkeitsaustausch unter sterilen oder aseptischen
Bedingungen.
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Vorzugsweise
wird die Lagerung mit Automatisierungstechnologie organisiert. Dazu
zählen die automatisierte Überwachung und Einstellung
von Lichtintensität und/oder des Spektralbereichs der Beleuchtung
und/oder der Lagertemperatur und/oder der Bewegung der Kultivierungsgefäße
und/oder des aktiven Gasaustausches und/oder der Lagerdauer. Die
Aufbringung von Barcodes oder Verwendung anderer Kennzeichungen
für die Logistik, wie beispielsweise Radio Frequency Identification
(RFID), ist beispielsweise für die Chargierung und Festlegung
spezifischer Prozessparameter wie Licht (Intensität, Wellenlänge,
Hell/Dunkel-Zyklus, zeitliche Anpassung/Wechsel), Temperatur, Regelung
der Durchmischung für die einzelnen Reaktionsbehältnisse,
aktivem Gasaustausch und/oder Flüssigkeitsaustausch oder
auch zur Überwachung der Lagerdauer von Nutzem.
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Nach
der zur Kultivierung notwendigen Lagerzeit, im Allgemeinen ein bis
vier Wochen, werden die Kulturen geerntet. Vorzugsweise in einem
automatisierten Prozess, welcher ein oder mehrere Prozeßschritte
wie die Öffnung der Kultivierungsgefäße
und die Gewinnung der phototrophen Organismen, und/oder der durch
die phototrophen Organismen hergestellten Stoffe, umfassen kann.
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Zur
Gewinnung der phototrophen Organismen und/oder der durch die phototrophen
Organismen hergestellten Stoffe, können diese, ohne vorherige
Entleerung der Kultivierungsgefäße, direkt aus dem
Medium extrahiert werden oder vom Medium abgetrennt werden. Gegebenenfalls
können vor der Gewinnung der phototrophen Organismen und/oder der
durch die phototrophen Organismen hergestellten Stoffe, die Kultivierungsgefäße
entleert werden, die entleerte Flüssigkeit gesammelt werden
und danach die phototrophen Organismen und/oder die durch die phototrophen
Organismen hergestellten Stoffe gewonnen werden. Die Abtrennung
der phototrophen Organismen vom Medium kann mittels beliebiger fest-flüssig-Trennverfahren
erfolgen. Bei hochwertigen Kulturen vorzugsweise mittels Zentrifugation.
Geeignete Trennverfahren sind auch Sedimentation oder Flotation
gegebenenfalls unter Einsatz von Flockulationsmitteln, oder Filtration.
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Die
Kultivierungsgefäße können gegebenenfalls
wiederverwendet werden und erneut in dem Verfahren eingesetzt werden.
Die Öffnung der Flaschen kann durch Aufdrehen der Verschlüsse,
aber auch mittels Schlitzen, Stechen oder Aufbohren erfolgen, falls
die Wiederverwertung der Kultivierungsgefäße nicht
beabsichtigt wird. Gegebenenfalls kann auch nur das Material aus
dem die Kultivierungsgefäße gefertigt sind, wiederverwendet
werden.
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Mit
dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die Massenproduktion
von phototrophen Organismen, und gegebenenfalls auch die Massenproduktion
der durch die phototrophen Organismen hergestellten Stoffe, unter
einheitlichen, konstanten und reproduzierbaren Prozeßbedingungen
ermöglicht. Beispiele für durch die phototrophen
Organismen hergestellte Stoffe sind pharmazeutische Wirkstoffe.
Das für die Massenproduktion erforderliche große
Volumen wird in eine Vielzahl kleiner Kompartimente aufgeteilt,
in denen einheitliche und konstante Prozeßbedingungen eingestellt
werden. Mit entsprechendem Scale-Up, das heißt Abfüllung
und Lagerung von bis zu mehreren Tausend kleinformatigen Kompartimenten
stehen wieder die für die Massenproduktion gewünschten
Volumina zur Verfügung. Aufgrund des modularen Aufbaus
wird eine hohe Flexibilität bezüglich der Kultivierungsbedingungen
erhalten.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- - WO 2007/047805
A2 [0003]
- - GB 2339763 A [0003, 0003]
- - WO 98/13469 A1 [0003, 0003]
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- - Eriksen N.
T., Biotechnol. Lett., Vol. 30, Nr. 9, 1525–1536 (2008) [0002]
- - Martinez-Jeronimo et al, J. appl. Phycol. 6: 423–425,
1994 [0003]
- - www.instructables.com/id/An Algae Bioreactor from Recycled
Water Bottles [0004]