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DE102009027947A1 - Verfahren zur Aufreinigung oder Extraktion - Google Patents

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DE102009027947A1
DE102009027947A1 DE200910027947 DE102009027947A DE102009027947A1 DE 102009027947 A1 DE102009027947 A1 DE 102009027947A1 DE 200910027947 DE200910027947 DE 200910027947 DE 102009027947 A DE102009027947 A DE 102009027947A DE 102009027947 A1 DE102009027947 A1 DE 102009027947A1
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Germany
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solid phase
analyte
carbonyl
organic solvent
polymer resin
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DE200910027947
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Inventor
David Siegel
Matthias Koch
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Bundesanstalt fuer Materialforschung und Pruefung BAM
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Abstract

Um ein wirtschaftliches Verfahren zur Aufreinigung oder Extraktion von Analyten, die in komplexen, insbesondere unpolaren Stoffgemischen vorliegen, zu schaffen, wird vorgeschlagen, dass das Stoffgemisch in einem wasserfreien Medium auf eine mit Hydrazingruppen funktionalisierte Festphase aufgebracht, das Medium wieder abgetrennt sowie anschließend die Festphase mit organischem Lösungsmittel gewaschen wird und dass nach dem Waschen die Festphase mit einer Mischung aus organischem Lösungsmittel und wässriger Säure zur Freisetzung der Carbonylverbindung eluiert wird, wobei die Carbonylverbindung gelöst in dem organischen Lösungsmittel und der wässrigen Säure erhalten wird.

Description

  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Aufreinigung oder Extraktion von Carbonylverbindungen, die in komplexen, insbesondere unpolaren Stoffgemischen vorliegen, wobei die Carbonylgruppe der Carbonylverbindung nicht mit einem Heteroatom konjugiert ist, sowie die Verwendung von Festphase zur Aufreinigung oder Extraktion von Carbonylverbindungen.
  • In der routinemäßigen, quantitativen Analytik von Koritaminanten, wie beispielsweise Mykotoxinen, Pestiziden etc., in festen Lebensmitteln wird im Allgemeinen zunächst ein flüssiges Extrakt des Lebensmittels hergestellt. In diesem flüssigen Extrakt liegen die Zielanalyten zusammen mit einer Reihe von Störsubstanzen wie Fetten, Proteinen oder Zuckern vor. Vor der Quantifizierung der Zielanalyten muss das Extrakt aufgereinigt werden, da die Störsubstanzen die zur Quantifizierung verwendeten Instrumente stören oder beschädigen bzw. das Zielanalytsignal überlagern können. Schwierigkeiten sind insbesondere bei der Erzeugung von Extrakten in der Analytik unpolarer Kontaminanten in Speiseölen, -fetten und hochgradig öl-/fetthaltigen Matrices gegeben, die an sich unpolare Substanzgemische sind. Unpolare Schadstoffe in Ölen und Fetten lassen sich daher im Allgemeinen nicht selektiv mit unpolaren, organischen Lösungsmitteln oder unpolaren Festphasen extrahieren.
  • Bisherige Aufreinigungstechniken hängen von den chemischen und physikalischen Eigenschaften sowohl des Analyten als auch der Matrix, in der der Analyt nachgewiesen werden soll (zum Beispiel Mehl, Öl, Kaffee), ab. Von besonderem Interesse ist der Nachweis des Mykotoxins Zearalenon.
  • Nachfolgend werden übliche analytische Verfahren nach dem Stand der Technik dargestellt:
  • Immunoaffinitätssäulen
  • Das Prinzip der Immunoaffinitätssäulen beruht auf der Verwendung von Antikörpern, die schnell und selektiv den Zielanalyten binden (Antikörper-Antigen Wechselwirkung). Die Antikörper werden immobilisiert (d. h. auf eine Festphase aufgebracht) und in dieser Form in eine Mini-Säule gepackt. In der Folge wird ein Extrakt oder eine flüssige Probe direkt auf die Säule aufgebracht. Die Antikörper binden den Analyten, während Störsubstanzen in Lösung bleiben und abgetrennt werden. In einem anschließenden Elutionsschritt werden die Antikörper denaturiert und der Analyt wieder freigesetzt. Immunoaffinitätssäulen werden häufig im Bereich der Mykotoxinanalytik eingesetzt. Besonders bei der Analytik des östrogenwirksamen Mykotoxins Zearalenon werden kommerzielle Immunoaffinitätssäulen als „state-of-the-art” angesehen. Sie haben weiterhin Relevanz für analytische Methoden zur Überwachung der aktuellen EU-Gesetzgebung.
  • Immunoaffinitätssäulen bieten nach dem heutigen Stand der Technik eine höchstmögliche Selektivität, da im Allgemeinen ausschließlich der Analyt von Interesse zurückgehalten wird. Bedeutende Nachteile der Immunoaffinitätssäulen sind enorme Entwicklungskosten, die sich in beträchtlichen Endverbraucherpreisen niederschlagen. Auf Grund von möglichen Kreuzreaktivitäten der verwendeten Antikörper mit Matrixbestandteilen, muss die Verwendbarkeit von Immunoaffinitätssäulen für jede Matrix neu nachgewiesen werden. Weiterhin ist die Leistungsfähigkeit der Immunoaffinitätssäulen chargenabhängig. Da von Hersteller zu Hersteller und Charge zu Charge ggf. unterschiedliche Antikörper verwendet werden, muss eine analytische Methode stets auf die konkret verwendete Charge angepasst werden, was einen beträchtlichen Mehraufwand nach sich zieht. Da die Antikörper bei der Elution denaturieren, sind Immunoaffinitätssäulen weiterhin nur einmal verwendbar. Auf Grund des vergleichsweise hohen Entwicklungsaufwandes stehen Immunoaffinitätssäulen nur für ein begrenztes Analytenspektrum zur Verfügung. Da mit einem Antikörper im Normalfall nur ein spezifischer Analyt gebunden werden kann, sind Immunoaffinitätssäulen gemeinhin nicht für Multi-Analytmethoden geeignet. Sie sind außerdem nicht mit hohen Anteilen organischer Lösungsmitteln kompatibel, da letztere ebenfalls zu einer Denaturierung führen. Eine starke Verdünnung organischer Extrakte ist daher nötig. Eine direkte Analytik von Ölen und Fetten mit Immunoaffinitätssäulen ist nicht möglich.
  • Solid Phase Extraction (SPE)
  • Zur Probenvorbereitung/-reinigung verwendete Säulen können statt mit immobilisierten Antikörpern ebenfalls mit SPE-Materialien gepackt werden. SPE-Materialien halten den Analyten nicht über eine Antikörper-Antigen Wechselwirkung, sondern über Physisorption oder ionische Wechselwirkungen zurück. Störsubstanzen mit dem Analyten ähnlichen physikalischen/chemischen Eigenschaften werden ebenfalls zurückgehalten. SPE-Säulen sind weniger selektiv, aber preislich günstiger als Immunoaffinitätssäulen. Ein klassisches SPE-Material ist das Octadecyl-modifizierte Silicagel. Es existiert eine Vielzahl an Variationen/Modifikationen.
  • Im Gegensatz zu Immunoaffinitätssäulen leiden SPE-Kartuschen nicht unter erhöhter Chargenabhängigkeit, können in manchen Fällen wiederverwendet werden und stehen für ein breites Anwendungsspektrum zur Verfügung.
  • Auf Grund allgemeiner Rückhaltemechanismen (Physisorption bzw. ionische Wechselwirkungen) ist die Selektivität von SPE-Kartuschen im Allgemeinen aber gering. Weiterhin können Waschschritte zum vorzeitigen, teilweisen Verlust des Analyten führen.
  • Bei der Extraktion unpolarer Analyten (wie etwa dem Mykotoxin Zearelenon, den Rodentiziden Warfarin, Coumafuryl und Coumachlor, dem Pestizid Mesotrion sowie dem Fungizid Zoxamid) kann eine unpolare SPE-Phase verwendet werden, da das Öl bzw. Fett an sich eine unpolare Matrix darstellt wird jedoch keine Selektivität erreicht, so dass die komplette Matrix extrahiert wird.
  • Mycosep/Multisep-Säulen
  • Während die o. g. Verfahren auf einer Fixierung des Analyten an einer Festphase beruhen, kann auch der umgekehrte Weg beschritten werden, indem nicht der Analyt, sondern die abzutrennenden Verunreinigungen an einer Festphase fixiert werden. Beim Überleiten eines Lebensmittelextrakts über eine entsprechende Säule wird ohne Elutionsschritt direkt eine gereinigte Lösung erhalten. Die Firma Romer Labs Diagnostic GmbH, Tulln, Österreich vertreibt unter dem Markennamen MycoSep® bzw. MultiSep® exklusiv entsprechende Produkte. Die Säulen sind mit einer Mischung aus Aktivkohle, Ionentauscherharzen, Celite® und weiteren, nicht offengelegten Materialien gepackt. Die Adsorbentien sind dabei jeweils für eine Analyten-/Anwendungsgruppe optimiert. Der Rückhalt der Störsubstanzen erfolgt über Physisorption/ionische Wechselwirkungen.
  • Die Produkte dieser Kategorie sind jeweils für einen oder einige wenige Analyten optimiert. Für diese Analyten werden sehr gute Ergebnisse erzielt. Nachteile sind die vergleichsweise hohen Preise der Produkte sowie das stark eingeschränkte Analytenspektrum. Die Produkte sind weiterhin nur einmal verwendbar.
  • Konventionelle Aufreinigung durch Flüssig/Flüssig-Extraktion
  • Bei der Flüssig/Flüssig Extraktion wird auf eine Festphase verzichtet. Der Analyt wird in Lösungsmittelgemischen aufgenommen, die einer Phasentrennung unterliegen. Die Selektivität wird durch eine unterschiedliche Affinität von Analyt und Störsubstanzen zu den entsprechenden Phasen erzielt und kann durch Variation des pH-Wertes optimiert werden. Häufig werden mehrere Flüssig/Flüssigextraktionsschritte hintereinander ausgeführt.
  • Diese Methode der Aufreinigung ist im Allgemeinen ineffizient, da eine sehr geringe Selektivität für den Zielanalyten besteht. Eine große Zahl an ähnlich polaren Störsubstanzen wird coextrahiert. Eine Vielzahl an nötigen Arbeitsschritten macht die Methode anfällig für Störungen.
  • Gelpermeationschromatographie (GPC)
  • Zur Erzeugung von gereinigten Extrakten unpolarer Analyten aus Ölen und Fetten bzw. stark öl-/fetthaltigen Matrices wird wegen der genannten Nachteile bei vorgenannten Verfahren nach heutigem Stand der Technik die Gelpermeationschromatographie (GPC) (Synonym: Größenausschlußchromatographie) verwendet. Diese apparative Methode trennt Substanzgemische nach dem hydrodynamischen Volumen ihrer Bestandteile auf und ist daher nicht auf die Polarität als Selektivitätskriterium angewiesen.
  • Zur Durchführung der GPC wird ein entsprechendes Gerät inkl. Säulenmaterial und Eluenten benötigt. Anschaffungs- und Unterhaltskosten sind daher entsprechend hoch. Mitarbeiter müssen in die Bedienung des Geräts eingewiesen werden und der Probendurchsatz ist auf Grund der Geräteverfügbarkeit begrenzt. Der Verbrauch an organischen Lösungsmitteln ist hoch.
  • Verseifung
  • Alternativ zur GPC kann das Öl bzw. Fett verseift (d. h. alkalisch hydrolysiert) werden. Im Anschluss lassen sich die freigesetzten Fettsäuren durch eine Flüssig/Flüssigextraktion abtrennen. Die nicht-verseifbaren Bestandteile können anschließend einer der vorgenannten Aufreinigungsmethoden zugeführt werden.
  • Hier wird kein separates Gerät benötigt, allerdings sind viele Verbindungen unter den aggressiven Verseifungsbedingungen instabil und werden selbst hydrolysiert. Verseifung ist daher z. B. nicht für die Analytik von Zearalenon geeignet. Weiterhin muss nach der Verseifung im Normalfall ein zweiter Reinigungsschritt, z. B. mit SPE-Kartuschen erfolgen, so dass ein erhöhter Arbeitsaufwand nötig wird.
  • Es ist daher Aufgabe der Erfindung, ein wirtschaftliches Verfahren zur Aufreinigung oder Extraktion von Analyten, die in komplexen, insbesondere unpolaren Stoffgemischen vorliegen, zu schaffen.
  • Die Aufgabe wird durch ein Verfahren nach Anspruch 1 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen gekennzeichnet.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren beruht auf der reversiblen Knüpfung einer chemischen, kovalenten Bindung. Diese Bindung wird zwischen dem aufzureinigenden Zielanalyt, der in Lösung vorliegt, und einer reaktiven chemischen Gruppe auf einer Festphase (z. B. einem Polymerharz, vorzugsweise Polystyrenharz) geknüpft. In der Folge ist der Analyt an der Festphase fixiert und die Lösung, welche die nicht-reaktiven Verunreinigungen enthält, kann abgetrennt werden. Die Festphase wird anschließend mehrfach mit organischem Lösungsmittel gewaschen, um über Physisorption anhaftende Verunreinigungen abzutrennen. In einem Elutionsschritt wird schließlich die kovalente Bindung, die den Analyten an der Festphase fixiert, gespalten und so eine gereinigte Lösung des chemisch unveränderten Analyten erhalten. Diese Lösung kann direkt der instrumentellen Detektion, z. B. über HPLC-FLD, HPLC-MS oder GC-MS zugeführt werden.
  • Bei der zu Grunde liegenden Chemie handelt es sich um reversible Hydrazonbildung (eine Kondensationsreaktion). Die Festphase ist mit einer Hydrazingruppe funktionalisiert. Letztere reagiert mit einer Aldehyd- oder Ketogruppe des Analyten (siehe ). Die aufzureinigenden Analyten müssen daher über eine Carbonylgruppe verfügen. Weiterhin darf die Carbonylgruppe nicht mit einem Heteroatom (Stickstoff, Sauerstoff etc.) konjugiert sein (in darf weder R2 noch R3 Heteroatom sein). Auf Carbonsäuren sowie deren Amide und Ester ist das Verfahren daher nur dann anwendbar, wenn im Analytmolekül neben der Carbonsäure/Ester/Amidgruppe eine weitere Carbonylgruppe vorliegt, die nicht mit einem Heteroatom konjugiert ist. Nicht geeignete Analyten sind etwa die Mykotoxine Fumonisin FB1/2, Ochratoxin A oder Aflatoxin G2.
  • Abbildung 1: Allgemeine chemische Grundlage des Verfahrens, R1 = beliebiges Spacermolekül, R2 und R3 keine Heteroatome
    Figure 00060001
  • Nach einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens ist die Festphase mit einer Sulfonylhydrazingruppe funktionalisiert ).
  • Abbildung 2: Spezielle Ausführung für den Analyten Zearalenon und ein Toluensulfonylhydrazinfunktionalisiertes Polystyrenharz
    Figure 00060002
  • Wird als Festphase ein Polymerharz eingesetzt, werden makroporösen (Porengröße 30–60 Å) Harze bevorzugt. Makroporöse Harze verfügen im Vergleich zu quellenden Harzen über eine rigide Struktur, so dass die Poren (und damit die reaktiven Stellen) auch ohne ein Quellen des Harzes gut zugänglich sind. Dies ist von Bedeutung, da im Rahmen des anzumeldenden Verfahrens wässrige Lösungsmittelmischungen verwendet werden, welche ungünstige Quelleigenschaften aufweisen.
  • Bei der Freisetzung des Analyten wird die Hydrazonbindung hydrolysiert und so der chemisch unveränderte Analyt zurückgewonnen.
  • Da es sich bei Bindung sowie Freisetzung des Analyten prinzipiell um dieselbe Gleichgewichtsreaktion handelt, müssen die Reaktionsbedingungen so gewählt werden, dass das Gleichgewicht auf der jeweils gewünschten Seite liegt (Analyt an Festphase gebunden/Analyt in Lösung).
  • Entscheidend für den Erfolg der Bindung ist die Abwesenheit von Wasser im Reaktionsgemisch. Es wird daher mit einem vorzugsweise unpolaren Lösungsmittel, besonders bevorzugt Heptan, gearbeitet, das nahezu wasserfrei ist. Auf Grund der begrenzten Löslichkeit vieler Analyten in Heptan wird vorzugsweise ein Anteil einer Carbonsäure, besonders bevorzugt Essigsäure zugesetzt. Die bevorzugte Essigsäure dient zugleich als Katalysator der Hydrazonbildung. Letztere läuft bevorzugt im sauren Medium ab.
  • Der Analyt wird hydrolytisch freigesetzt. Mischungen aus organischen Lösungsmitteln und wässrigen Säuren (etwa Methanol:konz. HCl 80:20) sind geeignet, setzen allerdings nur einen ungenügenden Teil (< 60%) des gebundenen Analyten frei. Zur vollständigen Freisetzung wird dem Elutionsgemisch ein niedermolekulares Keton/Aldehyd (z. B. Aceton) im hohen Überschuss zugesetzt. Aceton bildet selbst Hydrazonbindungen an der Festphase aus und verdrängt so den Analyten. Das Verfahren erzielt eine analytabhängige Wiederfindung von > 80%. Für die Verwendung in analytischen Methoden sind gemäß des Codex Alimentarius der WHO Wiederfindungen von mindestens 60% unerlässlich. Die Wiederfindung bezeichnet in diesem Zusammenhang den Anteil der anfänglich vorhandenen Stoffmenge in der gereinigten Lösung am Ende des Verfahrens.
  • Die o. g. Chemie läuft vollständig unter milden Bedingungen bei Raumtemperatur ab. Die Festphase ist daher nach Verwendung regenerierbar und kann erneut eingesetzt werden.
  • Bei der Erfindung handelt sich um ein allgemeines Verfahren, das auf eine Vielzahl an Analyten und Matrices anwendbar ist. Gut geeignete Analyten sind etwa das Mykotoxin Zearelenon, die Rodentizide Warfarin, Coumafuryl und Coumachlor, das Pestizid Mesotrion und das Fungizid Zoxamid.
  • Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gereinigte Extrakte sind von kritischen Verunreinigungen wie Fetten, Zuckern, Aminosäuren und Proteinen befreit. Auf Grund der breiten Selektivität für Aldehyde und Ketone werden letztere aber nicht zwangsläufig abgetrennt. Daher ist in der Regel eine zusätzliche chromatographische Trennung vor der Detektion (z. B. mittels HPLC oder GC) vorgesehen.
  • Eine besonders bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens ist in nachstehenden Flussdiagramm erläutert:
  • Flussdiagramm
    Figure 00090001
  • Es werden für das erfindungsgemäße Verfahren zwei Designs besonders bevorzugt. Diese werden im Folgenden beschrieben.
  • Batch-Design
  • Die aktive Festphase wird in ein laborübliches Reaktionsgefäß gewogen. Die Aufgabe-, Wasch- und Elutionslösungen werden direkt zugesetzt und über eine Spritze oder Pipette wieder abgenommen. Vorteil dieses Anwendungsdesigns ist die Flexibilität bei der Wahl Parameter wie Menge der Festphase, Menge der Lösungsmittelmischungen und Reaktionszeiten etc. Da die Festphase nicht fixiert ist, ergeben sich Nachteile beim Handling, da ggf. bei der Zugabe/Entnahme der Lösungen Festphase verschleppt wird.
  • Säulendesign
  • Die aktive Festphase wird zwischen zwei Fritten in einer Säule aus Plastik oder Glas fixiert. Aufgabe-, Wasch- und Elutionslösungen werden von oben aufgegeben und tropfen durch die Säule in ein Auffanggefäß. Dieses Anwendungsdesign zeichnet sich vor allem durch Robustheit und unkompliziertes Handling aus. Eine Vermarktung von Endkundenprodukten auf Basis des Säulendesigns ist denkbar.
  • Gegenstand der Erfindung ist neben dem vorbeschriebenen Verfahren auch die Verwendung von Festphasen, die mit Hydrazingruppen funktionalisiert sind, zur Aufreinigung oder Extraktion von Carbonylverbindungen, insbesondere unpolaren Carbonylverbindungen. Besonders vorteilhaft ist dabei, dass die Isolierung von carbonylhaltigen Verbindungen aus einem komplexen Stoffgemisch inkl. einer anschließenden quantitativen Freisetzung unter reproduzierbaren Bedingungen quantitativ erfolgt. Quantitativ bedeutet in diesem Zusammenhang, dass der Gehalt der freigesetzten, gereinigten Carbonylverbindung nicht weniger als 60% des ursprünglichen Gehalts beträgt.
  • Im Rahmen der Probenvorbereitung bzw. -vorreinigung für analytische Messungen geht üblicherweise ein gewisser Anteil des ursprünglich vorhandenen Analyten verloren.
  • Damit eine analytische Methode verlässliche, robuste Messergebnisse liefern kann, darf dieser Anteil 40% nicht übersteigen. Anders gesagt muss das Verfahren der Probenvorbereitung zumindest 60% des ursprünglich vorhandenen Analyten erhalten (d. h. die Wiederfindung muss größer 60% sein). Diese Schwelle ist im Codex Alimentarius der WHO festgelegt. Ein entscheidender Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, dass je nach Analyt Wiederfindungen > 90% erzielt werden können.
  • Ein weiteres Kriterium für die Güte eines analytischen Verfahrens ist die Streuung der Messwerte. Letztere hängt neben der detektorabhängigen Streuung von der Probenvorbereitung ab. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren werden bei Detektion mittels HPLC-UV bei 5 Replikaten und einer Probenvorbereitung gemäß dem o. g. Beispiel durchweg Streuungen < 5% erhalten. Diese hohe Reproduzierbarkeit ist ein weiterer entscheidender Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens.
  • Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist die Möglichkeit gegeben, Lebensmittelextrakte von carbonylhaltigen Analyten mit guter Selektivität und geringem Kostenaufwand zu reinigen, ohne auf Immunoaffinitätstechniken zurückgreifen zu müssen.
  • Nahrungsmittelmatrices sind chemisch sehr komplex, d. h. Sie enthalten eine Vielzahl (in vielen Fällen mehrere tausend) chemische Verbindungen. Das technische Problem bei der Aufreinigung besteht darin, die Zielanalyten von den übrigen Matrixbestandteilen zu trennen. Dies ist erforderlich, da die Matrixbestandteile den Detektionsschritt, der mit empfindlichen Instrumenten wie etwa der HPLC-MS/MS Kopplung ausgeführt wird, stören bzw. die Instrumente beschädigen können. „Technisch problematisch” ist die Aufreinigung, weil die abzutrennenden Substanzen häufig den Zielanalyten ähnliche chemische und physikalische Eigenschaften aufweisen. Anders gesagt: aus den tausenden chemischen Verbindungen, die in einer Lebensmittelmatrix wie etwa Kaffee, vorliegen, genau eine Verbindung zu isolieren, ist nicht trivial. Hinzu kommt, dass im Rahmen der quantitativen Routineanalytik (wie sie zum Beispiel in Lebensmitteluntersuchungsämtern durchgeführt wird), eine mehrere Tage dauerende Aufreinigung auf Grund der hohen zu bearbeitenden Probenzahl nicht praktikabel ist. Man ist hier auf zeit- und kosteneffektive Verfahren angewiesen. Die Verfahren müssen weiterhin „robust”, d. h. wenig störanfällig und wiederholbar sein. All diesen Ansprüchen wird das erfindungsgemäße Verfahren gerecht.
  • Die Erfindung ermöglicht es weiterhin erstmals, unpolare Carbonylverbindungen selektiv aus Ölen und Fetten zu isolieren, ohne auf Gelpermeationschromatographie oder aggressive Verseifungsbedinungen angewiesen zu sein.
  • Weitere Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber den beschriebenen Verfahren nach dem Stand der Technik werden nachstehend dargestellt
  • Vorteile gegenüber Immunoaffinitätssäulen
  • Die verwendeten Festphasen sind frei von komplexen biologischen Materialien und zeichnen sich daher durch günstige Anschaffungskosten, geringe Chargenvarianzen und hohe Robustheit aus. Es werden hochgradig reproduzierbare Ergebnisse erzielt. Mehrere carbonylhaltige Analyten (wie etwa das Mykotoxin Zearelenon, die Rodentizide Warfarin, Coumafuryl und Coumachlor, das Pestizid Mesotrion und das Fungizid Zoxamid) lassen sich mit derselben Festphase in einem Arbeitsgang aufreinigen. Dies ist mit Immunoaffinitätssäulen nicht möglich.
  • Die Regenerierbarkeit der Festphase senkt die Materialkosten noch weiter. Während die Preise für eine einmal verwendbare Immunoaffinitätssäule derzeit bei 10 bis 20 Euro liegen, kosten für das anzumeldende Verfahren verwendbare Festphasen weniger als 50 Cent je Verwendung.
  • Vorteile gegenüber SPE-Techniken
  • Vorteil ist hier vor allem die erhöhte Selektivität und damit bessere Reinigungsleistung des anzumeldenden Verfahrens. Die Verbindungen werden nicht nach Polarität, sondern nach chemischer Reaktivität unter eng definierten Bedingungen (Zeit, Temperatur) gebunden.
  • Ein weiterer Vorteil ist die hohe Stabilität der bei der Extraktion mit der Festphase geknüpften kovalenten chemischen Bindung. Die Festphase kann ohne signifikante Analyt-Verluste mehrfach selbst mit solchen Lösungsmitteln gewaschen werden, in denen der Analyt eigentlich gut löslich ist. Dies ist bei SPE-Techniken im Allgemeinen nicht möglich.
  • Vorteile gegenüber MycoSep/MultiSep
  • MycoSep/MultiSep-Säulen sind im Vergleich zu dem erfindungsgemäßen Verfahren teuer. Das Analytenspektrum ist stark eingeschränkt, da die MycoSep/MultiSep Produkte auf einen bzw. einige wenige Analyten optimiert sind. Das erfindungsgemäße Verfahren ist hingegen auf ein breites Spektrum an Carbonylverbindungen anwendbar. Eine direkte Aufgabe von gelösten Fetten bzw. verdünnten Ölen auf MycoSep/MultiSep-Produkte ist nicht möglich, während das erfindungsgemäße Verfahren diese Leistung erbringt.
  • Vorteile gegenüber Flüssig/Flüssig-Extraktion
  • Die Flüssig/Flüssigextraktion ist weit weniger selektiv als das erfindungsgemäße Verfahren. Durch eine Vielzahl an Arbeitsschritten ist sie außerdem anfälliger für Störungen. Sie ist nicht für Multi-Analyt Methoden geeignet, insofern die Analyten stark unterschiedliche Polaritäten/Löslichkeiten aufweisen, während beim erfindungsgemäßen Verfahren die Polarität kein Kriterium darstellt.
  • Vorteile gegenüber Gelpermeationschromatographie
  • Das erfindungsgemäße Verfahren ist nicht auf die für die Gelpermeationschromatographie nötige apparative Ausrüstung angewiesen. Der Lösungsmittelverbrauch ist geringer.
  • Vorteile gegenüber Verseifung
  • Das erfindungsgemäße verzichtet auf aggressive Verseifungsbedingungen und gewährleistet daher die Stabilität der zu extrahierenden Analyten.
  • Am Ende des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Zielanalyten, wie bereits beschrieben, quantifiziert. Dieser Schritt erfolgt günstigerweise mittels HPLC-UV/FLD/MS oder GC-FID/ECD/MS. An Stelle der Quantifizierung sind jedoch auch andere Verwendungen des gereinigten Extraktes denkbar.
  • Duft-/Aromachemie
  • Viele natürlich vorkommende Carbonylverbindungen sind Duft-/Aromastoffe (etwa Citronellal, Benzaldehyd). Da das erfindungsgemäße Verfahren praktisch einen Auszug aller reaktiven Carbonylverbindungen einer Matrix enthält, kann es statt der quantitativen Analyse auch einer olfaktorischen Evaluation zugeführt werden.
  • Wird die Festphase vor der Freisetzung der an sie gebundenen Carbonylverbindungen getrocknet und gelagert, lassen sich so Duftauszüge in stabiler Form erhalten und zu späterem Zeitpunkt freisetzen.
  • Vorreinigung bei der Isolierung von Substanzen im präparativen Maßstab
  • Die oben genannten Arbeitsabläufe gehen von analytischen Substanzmengen aus. Bei entsprechendem Upscaling (Erhöhung der Menge der Festphase und somit der reaktiven Stellen) lässt sich die beschriebene Technik auch zur Vorreinigung im Rahmen der quantitativen Isolierung von Stoffen aus komplexen Matrices einsetzen. Hier ist das Ziel, eine einzelne Substanz im Gramm-Maßstab und in hoher Reinheit zu isolieren. Die nötige Menge an aktiver Festphase kann aus der typischen Beladung mit reaktiven Stellen (im Normalfall etwa 2–3 mmol/g) berechnet werden. Nach der Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann der vorgereinigte Stoff durch Umkristallisation oder quantitative HPLC weiter aufgereinigt werden.
  • Im Folgenden ist die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens im Rahmen der Quantifizierung der Analyten Zearalenon (Mykotoxin), Warfarin, Coumachlor und Coumafuryl (Rodentizide), Zoxamide (Fungizid) und Mesotrion (Pestizid) beispielhaft beschrieben.
  • Dabei wird von zwei unterschiedlichen Matrices (Mehl/Öl) ausgegangen. Die Detektion erfolgt mittels HPLC-DAD/FLD.
  • 1) Herstellung der Aufgabelösung
  • Mehl: 10 g Mehl werden mit 40 mL Acetonitril:Wasser (84:16) versetzt und 30 Minuten geschüttelt. Das Gemisch wird zentrifugiert. 10 mL des Überstandes werden eingedampft und in 1 mL Heptan:Essigsäure (85:15 v:v) wiederaufgenommen.
  • Öl: 0.2 mL Öl werden mit 0.8 mL Heptan verdünnt.
  • 2) Extraktion der Analyten gemäß Abb. 3
  • Die Aufgabelösung wird auf 100 mg (± 1 mg) eines kommerziell erhätlichen, makroporösen, toluenesulfonylhydrazinfunktionalisierten Polystyrenharzes mit einer mittleren Hydrazinbeladung von 1.5 mmol/g gegeben. Es wird 1.5 Stunden geschüttelt.
  • 3) Waschen
  • Die Aufgabelösung wird abgenommen. Das Harz wird einmal mit 2 mL Heptan gewaschen und anschließend im sanften Stickstoffstrom getrocknet.
  • 4) Elution und Analyse
  • Das getrocknete Harz wird mit 0.4 mL Aceton:0.4 M HCl (90:10 v:v) für 2 Stunden geschüttelt. Der Überstand wird durch einen 0.2 μm Spritzenfilter (Filtermaterial: regenerierte Cellulose) in ein Vial überführt und mittels HPLC-FLD analysiert. Die Wiederfindung der Zielanalyten ist > 90%.
  • 5) Regeneration des Harzes
  • Die Festphase wird 2x mit 2.5 mL MeOH:konz. Hcl (80:20 v:v), 1x mit 2.5 mL MeOH und 1x mit 2.5 mL Heptan für jeweils 30 Minuten geschüttelt und anschließend getrocknet. Die Wiederverwendbarkeit ist für 5 Recyclingzyklen gewährleistet.

Claims (13)

  1. Verfahren zur Aufreinigung oder Extraktion von Carbonylverbindungen, die in komplexen, insbesondere unpolaren Stoffgemischen vorliegen, wobei die Carbonylgruppe der Carbonylverbindung nicht mit einem Heteroatom konjugiert ist, dadurch gekennzeichnet, dass das Stoffgemisch in einem wasserfreien Medium auf eine mit Hydrazingruppen funktionalisierte Festphase aufgebracht, das Medium wieder abgetrennt sowie anschließend die Festphase mit organischem Lösungsmittel gewaschen wird und dass nach dem Waschen die Festphase mit einer Mischung aus organischen Lösungsmittel und wässriger Säure zur Freisetzung der Carbonylverbindung eluiert wird, wobei die Carbonylverbindung gelöst in dem organischen Lösungsmittel und der wässrigen Säure erhalten wird.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Festphase ein Polymerharz verwendet wird.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Polymerharz Polystyrenharz verwendet wird.
  4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass ein makroporöses Polymerharz verwendet wird.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Festphase mit Toluensulfonylhydrazingruppen funktionalisiert ist.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das wasserfreie Medium ein unpolares Lösungsmittel ist.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das wasserfreie Medium mit einer Carbonsäure versetzt ist.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das organische Lösungsmittel und die wässrige Säure zur Freisetzung der Carbonylverbindung mit einem niedermolekularen Keton oder Aldehyd versetzt ist.
  9. Verwendung von mit Hydrazingruppen funktionalisierter Festphase zur Aufreinigung oder Extraktion von Carbonylverbindungen, wobei die Carbonylgruppe der Carbonylverbindung nicht mit einem Heteroatom konjugiert ist.
  10. Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Festphase ein Polymerharz ist.
  11. Verwendung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymerharz ein Polystyrenharz ist.
  12. Verwendung nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymerharz makroporös ist.
  13. Verwendung nach einem der Ansprüche 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Festphase mit Toluensulfonylhydrazingruppen funktionalisiert ist.
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