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Gegenstand der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Enzym-katalysiertes Verfahren
in Anwesenheit mindestens einer Ionischen Flüssigkeit als
Lösungsmittel, eine Zusammensetzung enthaltend mindestens
eine Ionische Flüssigkeit und mindestens ein aus Aspergillus
spec. isoliertes Enzym oder eine aus Aspergillus spec. isolierte
Enzym- oder Proteinmischung sowie die Verwendung mindestens eines
aus Aspergillus spec. isolierten Enzyms oder mindestens einer aus
Aspergillus spec. isolierten oder Enzym- oder Proteinmischung zur
Enzym-katalytischen Umsetzung von in Ionischer Flüssigkeit
gelösten Stoffen, ausgewählt aus Di- oder Trisacchariden,
Polysacchariden, Polysaccharid-haltigen Materialien oder Mischungen
dieser Verbindungen.
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Stand der Technik
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Aus Seongsoon
Park and Romas, Current Opinion in Biotechnology 14 (2003) S. 432–437,
ist bekannt, dass Ionische Flüssigkeiten im Gegensatz zu
polaren organischen Lösungsmitteln Enzyme nicht inaktivieren. Diese
Eigenschaft ermöglicht Enzym-katalysierte Reaktionen in
einem polaren Lösungsmittelbereich, der vorher unmöglich
erschien.
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Die
Möglichkeit Lösungsmittel mit größerer
Polarität einzusetzen, erhöht zwangsläufig
die Löslichkeit von polaren Substraten, wie zum Beispiel
Glucose, Maltose und Ascorbinsäure, was zu schnelleren
Reaktionsprozessen und Änderungen in der Selektivität
führt. Aus R. P. Swatlowski, S. K. Seear, J. D.
Holbrey, R. D. Rogers, J. Am. Chem. Soc., 124 (2002) S. 4974,
ist beispielsweise bekannt, dass Ionische Flüssigkeiten
mit Halogenidanionen, wie beispielsweise BMIMCI (1-Butyl-3-methyl
imidazoliumchlorid) starke Lösungsmittel sind, die es erlauben,
abbauresistente Zellulosen in großem Umfang zu lösen.
So gewinnen enzymatische Methoden in Ionischen Flüssigkeiten
zunehmend an Bedeutung, da Naturstoffe, wie zum Beispiel Peptide,
Zucker, Nukleotide und Stoffe, die aus Biomasse gewonnen werden,
ein bedeutendes Ausgangsmaterial für Arzneimittel und für
die Feinchemie sind. Insbesondere gewinnt Zellulose als ein wertvolles
Biopolymer für die Herstellung von Bio-Kraftstoffen, beispielsweise
Bio-Ethanol, immer mehr an Bedeutung.
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Nachteilig
an den bekannten Methoden ist, dass die bekannten Enzyme, insbesondere
Zellulasen, in Ionischen Flüssigkeiten mit Halogenidanionen
sehr gering stabil bis instabil sind. So wurde sogar festgestellt, dass
beispielsweise aus dem Pilz Trichoderma reesei gewonnene Zellulasen
in BMIM·Cl nicht aktiv sind. Vielmehr konnte sogar beobachtet
werden, dass die Zellulasen in diesen Ionischen Flüssigkeiten
denaturieren (M. B. Turner, S. K. Seear, J. G. Huddlestone,
J. D. Holbrey, R. D. Rogers, Green Chemistry, 5 (2003), S. 443).
So ist auch aus Seongsoon Park and Romas, Current Opinion
in Biotechnology 14 (2003) S. 432–437, bekannt, dass
Enzyme gewöhnlich nur in Ionischen Flüssigkeiten
stabil sind, die Tetrafluoroborat-, Hexyfluorophosphat oder Bis(trifluormethansulfonyl)imid-Anionen
enthalten, jedoch in in Ionischen Flüssigkeiten mit Chlorid-,
Nitrat-, Trifluormethylsulfonat-, Trifluoracetat- und Acetatanionen
instabil sind. Ein Grund dafür scheint die geringere basische
Eigenschaft der Wasserstoffbrückenbindung der Enzym-kompatiblen
Anionen zu sein. Auch aus A. S. Roger, M. L. Rute, J. S.
Menno, F. van Rantwijk and R. S. Kenneth, Green Chemistry, 4 (2002),
S. 147–151, ist bekannt, dass Lipase B (CaLB)
aus Candida antarctica, sowohl als ungebundenes Enzym (SP525) als
auch in immobilisierter Form (Novozym 435) in BMIM·BF4 (1-Butyl-3-methyl-imidazolium Tetrafluoroborat)
oder BMIM·PF6 (1-Butyl-3-methylimidazolium
Hexafluorophosphat) in Abwesenheit von Wasser eine Vielzahl von
Prozessen katalysieren kann. Aus dem zuletzt genannten Artikel ist
auch bekannt, dass die Enzyme in anderen ionischen Flüssigkeiten,
wie zum Beispiel in BMIM·NO3, BMIM·Lactat,
BMIM·Ethylsulfat und in Ethylammoniumnitrat (EtNH3·NO3) keine
bzw. nur eine geringe Aktivität zeigen. Als Grund für
die geringe Aktivität wird vermutet, dass die Struktur
der Ionischen Flüssigkeiten, insbesondere die sehr starke
Bindung und Anzahl der Anionen entscheidend ist, was zu Konformationsänderungen
und dadurch zum Verlust der Aktivität der Enzyme führt.
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Auch
aus der
US 2008/0017224
A1 sind Zusammensetzungen oder Produkte bekannt, die Ionische Flüssigkeiten
enthalten. Insbesondere werden Ionische Flüssigkeiten zur
Verwendung in Textilien, harten Oberflächen oder in Luft-Behandlungs-Zusammensetzungen
verwendet. Zudem werden Zusammensetzungen beschrieben, die sich
aus drei oder mehr verschiedenen Ionischen Flüssigkeiten
zusammensetzen. Als Anionen der Ionischen Flüssigkeiten
werden Hexafluoroposphat und Tetrafluoroborat genannt. Als Enzyme werden
Proteasen, Amylasen, Lipasen und Mischungen offenbart.
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Obwohl
die Aktivität der Enzyme, hier insbesondere der Zellulasen,
von unterschiedlichen Faktoren abhängt, nämlich
von der Herkunft der Zellulasen, der Inkubationsdauer, der Inkubationstemperatur,
die nicht mehr als 50 bis 60°C betragen sollte, und von
verschiedenen Eigenschaften der Ionischen Flüssigkeiten,
so schien es doch bis zum Zeitpunkt der Anmeldung der vorliegenden
Erfindung unmöglich, ein effizientes Lösungsmittel
zu finden, in dem beispielsweise Zellulose effektiv aufgelöst
werden kann und in welchem die enzymatische Aktivität der
Zellulasen nicht eingeschränkt wird, wie aus Current
opinion in Biotechnology, 14 (2003), p. 432–437 ableitbar.
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Der
vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein effizientes
Enzym-katalysiertes Verfahren bereitzustellen.
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Eine
weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es insbesondere,
ein effizientes Verfahren zur Enzym-katalysierten Umsetzung von
Zellulose in ein Ausgangsmaterial für beispielsweise Arzneimittel,
Feinchemikalien oder für die Umwandlung in Bio-Ethanol
bereitzustellen.
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Zudem
liegt der vorliegenden Erfindung die weitere Aufgabe zugrunde, Enzyme
zur Verwendung in Ionischen Flüssigkeiten mit starkem Anion
bereitzustellen.
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Die
voranstehenden Aufgaben werden durch die Merkmale der nebengeordneten
Patentansprüche 1, 11, 18 und 19 gelöst.
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Gegenstand
der Erfindung ist ein Enzym-katalysiertes Verfahren in Anwesenheit
mindestens einer Ionischen Flüssigkeit als Lösungsmittel,
wobei mindestens ein aus Aspergillus spec. isoliertes Enzym oder
eine aus Aspergillus spec. isolierte Enzym- oder Proteinmischung
zur Enzym-katalytischen Umsetzung eines im Lösungsmittel
gelösten Stoffes verwendet wird.
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Erfindungsgemäß ist
erkannt worden, dass sich ein aus Aspergillus spec. isoliertes Enzym
oder eine aus Aspergillus spec. isolierte Enzym- oder Proteinmischung
in einem Enzym-katalytischen Verfahren vorteilhaft verwenden lässt.
Darüber hinaus ist erfindungsgemäß erkannt
worden, dass sich das beanspruchte Enzym oder die Enzym- oder Proteinmischung
für ein Enzym-katalytisches Verfahren unter Verwendung
mindestens einer Ionischen Flüssigkeit als Lösungsmittel
einsetzen lässt.
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Schließlich
ist erfindungsgemäß erkannt worden, dass sich
ein in der mindestens einen Ionischen Flüssigkeit gelöster
Stoff Enzym-katalytisch durch aus Aspergillus spec. isolierte Enzyme
oder Enzym- oder Proteinmischungen umsetzen lässt. Als
Enzym-katalysierte Umsetzung können sämtliche
bekannte enzymatische Reaktionen verstanden werden. Vorzugsweise
werden unter dem Begriff Enzym-katalysierte Umsetzung lipolytische,
cellulolytische, amylolytische und proteolytische enzymatische Reaktionen
verstanden. Bevorzugt wird unter dem Begriff Enzym- katalysierte
Umsetzung cellulolytische enzymatische Reatkionen verstanden.
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Es
bietet sich als besonders vorteilhaft an, das gewünschte
Enzym in einem Gemisch aus verschiedenen Proteinen/Enzymen zu verwenden.
So handelt es sich beispielsweise bei der Aspergillus spec.-Zellulase
der Firma Sigma, Germany, um ein Gemisch aus verschiedenen Proteinen,
die in zueinander unterschiedlichen Konzentrationen in dem Gemisch
vorliegen. Bei Verwendung dieses Gemisches wurde erfindungsgemäß erkannt,
dass eine erhöhte Aktivität und Stabilität
der Aspergillus spec.-Zellulase mit cellulolytischer Aktivität
in Ionischen Flüssigkeit bereitgestellt werden kann. Als
Grund dafür gilt, dass alle Proteine in diesem Gemisch
in ihrer Gesamtheit aufgrund synergetischer Effekte zwischen den
Proteinen/Enzymen zu der hohen Aktivität und Stabilität
der Enzyme in der mindestens einen Ionischen Flüssigkeit
führen.
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Vorzugsweise
werden als Lösungsmittel ausschließlich Ionische
Flüssigkeiten verwendet.
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In
Bezug auf die Aufgabenstellung der vorliegenden Erfindung, eignen
sich insbesondere Ionische Flüssigkeiten mit Halogenidanionen
und in besonders bevorzugter Weise Ionische Flüssigkeiten
mit Chloridanionen, die es erlauben, auch abbauresistente Zellulosen
zu lösen. Darüber hinaus eignen sich ganz besonders
bevorzugt neben den Ionischen Flüssigkeiten mit Halogenidanionen
auch Ionische Flüssigkeiten mit Anionen insbesondere ausgewählt
aus der Gruppe [RFSO3]–, [Alkyl-SO3]–, [Alkyl-OSO3]–, [Alkyl-C(O)O]–, [RFC(O)O]–,
wobei
RF die
Bedeutung fluoriertes Alkyl (CmF2m-x+1Hx)
mit
m = 1 – 12 und x = 0 – 7 hat, wobei für
m = 1 x = 0 bis 2 sein soll und Alkyl eine geradkettige oder verzweigte Alkylgruppen
mit 1 bis 20 C-Atomen bedeutet, zum Lösen von Di- oder
Trisacchariden, Polysacchariden, Polysaccharid-haltigem Material
oder zum Lösen von Mischungen dieser Verbindungen und ebenfalls
zum enzymatischen Abbau.
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Disaccharide
sind beispielsweise Rohrzucker (Saccharose), Milchzucker (Lactose)
oder Malzzucker ((+)-Maltose), (+)-Cellobiose, Gentiiobiose oder
Melibiiose.
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Trisaccharide
sind beispielsweise Raffinose.
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Polysaccharide
sind beispielsweise Stärke, Glykogen oder Zellulose. Im
erfindungsgemäßen Verfahren wird Zellulose, modifizierte
Zellulose oder Zellulose-haltiges Material bevorzugt verwendet.
Im erfindungsgemäßen Verfahren wird ganz besonders
bevorzugt Zellulose verwendet.
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Modifizierte
Zellulose ist beispielsweise veretherte oder veresterte Zellulose.
Insbesondere ist Carboxymethylcellulose eine modifizierte Zellulose.
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Zellulose-haltige
Materialien sind beispielsweise Zellstoff oder Papier.
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Mischungen
von Di- und Trisacchariden, Polysacchariden oder Polysaccharid-haltigen
Materialien können auch Monosaccharide enthalten.
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In
bekannter Weise sind Zellulosen durch cellulolytisch aktive Enzyme
und insbesondere durch Zellulasen abbaubar, weshalb als besonders
vorteilhaft eine Zellulase aus Aspergillus spec. oder ein Enzym-
oder Proteingemisch, enthaltend mindestens eine Zellulase aus Aspergillus
spec. verwendet wird.
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In
bevorzugter Weise wird ein Proteingemisch enthaltend mindestens
eine Zellulase aus Aspergillus spec. zum Abbau und zur Umsetzung
im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet, da aufgrund
von Synergieeffekten zwischen den Proteinen, die Aktivität
und Stabilität der Zellulasen, bzw. des aktiven Enzyms über einen
längeren Zeitraum konserviert werden kann. Dies erhöht
die Effizienz und Spezifität der Enzym-katalysierten Reaktion.
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Für
Iipolytische, amylolytische und proteolytische enzymatisch-katalysierte
Reaktionen in Ionischen Flüssigkeiten können als
weitere typische Bespiele für die Enzyme aus Aspergillus
spec. isolierte Lipasen, Amylasen und Proteasen oder Mischungen
daraus genannt werden, die natürlich auch zusammen mit
der mindestens einen beanspruchten Zellulase oder anderen Zellulasen
als Mischungen vorliegen können.
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Vorzugsweise
sind die Reaktionsgeschwindigkeit und die Umsetzung des gelösten
Stoffes, insbesondere der Zellulose, über die eingesetzte
Enzymmenge einstellbar. Dabei kann das Enzym, hier vorzugsweise Zellulase,
in einer Menge, die durch das Verhältnis zur Gesamtmenge
des Enzym- oder Proteingemisches zu der Menge des Enzyms bestimmt
wird, von 0,1% bis 99% eingesetzt werden.
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Zur
Steigerung der Enzymaktivität in den beschriebenen Ionischen
Flüssigkeiten kann es erwünscht sein, dass Wasser
dem Reaktionsgemisch beigefügt wird. Bei dem Verfahren
der vorliegenden Erfindung ist eine Zugabe von Wasser aber nicht
zwingend notwendig.
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Um
die Löslichkeit von polaren Stoffen zu erhöhen,
und dabei die Enzymaktivität/-Spezifität aufrecht zu
erhalten, bietet es sich an, für das erfindungsgemäße
Verfahren ein Ionische Flüssigkeit oder Mischungen von
Ionischen Flüssigkeiten der allgemeinen Formel KA, wobei
K für Kation und A für Anion steht, zu verwenden.
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Dabei
spielt insbesondere die Auswahl des Anions der Ionischen Flüssigkeit
eine besondere Rolle.
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Das
Anion A kann daher ausgewählt sein aus der Gruppe, umfassend
[HSO4]–,
[SO4]2–,
[NO3]–,
[BF4]–, [(RF)BF3]–,
[(RF)2BF2]–, [(RF)3BF]–,
[(RF)4B]–, [B(CN)4]–, [PO4]3–, [HPO4]2–, [H2PO4]–, [Alkyl-OPO3]2–, [(AlkylO)(HO)PO2], [(Alkyl-O)2PO2]–, [Alkyl-PO3]2–, [RFPO3]2–,
[(Alkyl)2PO2]–, [(RF)2PO2]–,
[RFSO3]–, [HOSO2(CF2)nSO2O]–, [OSO2(CF2)nSO2O]2–, [Alkyl-SO3]–, [HOSO2(CH2)nSO2O]–, [OSO2(CH2)nSO2O]2–, [Alkyl-OSO3]–, [Alkyl-C(O)O]–, [O(O)C(CH2)nC(O)O]2–,
[HO(O)C-(CH2)n-C(O)O]–2, [RFC(O)O]–, [HO(O)C(CF2)nC(O)O]–,
[O(O)C(CF2)nC(0)O]2–, [(RFSO2)2N]–,
[(FSO2)2N]–, [((RF)2P(O))2N]–, [(RFSO2)3C]–, [(FSO2)3C]–, [Alkyl-CH(OH)C(O)O]–, [HO(O)CCH2CH(OH)C(O)O]–, [O(O)CCH2CH(OH)C(O)O]2–, {HOC[CH2C(O)OH]2C(O)O}–,
{HOC[CH2C(O)OH][CH2C(O)O]C(O)O}2–, {HOC[CH2C(O)O][CH2C(O)O]C(O)O}3–,
Cl– und/oder Br–,
und
wobei
n = 0 bis 6 bedeutet
RF die
Bedeutung fluoriertes Alkyl
(CmF2m-x+1Hx)
mit
m = 1 – 12 und x = 0 – 7 hat, wobei für
m = 1 x = 0 bis 2 sein soll und Alkyl eine geradkettige oder verzweigte Alkylgruppen
mit 1 bis 20 C-Atomen bedeutet.
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Die
Alkylgruppe in den oben genannten Anionen kann ausgewählt
sein aus geradkettigen oder verzweigten Alkylgruppen mit 1 bis 20
C-Atomen, vorzugsweise mit 1 bis 14 C-Atomen und insbesondere bevorzugt
mit 1 bis 4 C-Atomen.
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[Alkyl-CH(OH)C(O)O]– ist bevorzugt [CH3-CH(OH)C(O)O]–.
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Vorzugsweise
bedeutet RF CF3,
C2F5, C3F7 oder C4F9.
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Vorzugsweise
handelt es sich bei dem Anion um ein Anion einer korrespondierenden
starken Säure.
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Insbesondere
sind Anionen der Gruppe Cl–, Br–, [RFSO3]–, [Alkyl-SO3]–, [Alkyl-OSO3]–, [Alkyl-C(O)O]–, [RFC(O)O]–,
[(HO)PO3]–2,
[(HO)2PO2]–, [PO4]–3 [(Alkyl-O)PO3]–2, [(Alkyl-O)(HO)PO2]–, [(Alkyl-O)2PO2]–, [(Alkyl)2PO2]–, [(Alkyl)PO3]2–, [(RF)2PO2]–,
[(RF)PO3]2–, [O(O)C-(CH2)n-C(O)O]2–,
[HO(O)C-(CH2)n-C(O)O]2–, [Alkyl-CH(OH)C(O)O]–,
[HO(O)CCH2CH(OH)C(O)O]–,
[O(O)CCH2CH(OH)C(O)O]2–,
{HOC[CH2C(O)OH]2C(O)O}–, {HOC[CH2C(O)OH][CH2C(O)O]C(O)O}2– oder
{HOC[CH2C(O)O][CH2C(O)O]C(O)O}–3 geeignet, wobei n, RF oder
Alkyl eine der zuvor genannten Bedeutungen haben.
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Besonders
bevorzugt sind Anionen der Gruppe Cl–,
Br–, [RFSO3]–, [Alkyl-SO3]–, [Alkyl-OSO3]–, [Alkyl-C(O)O]–, [RFC(O)O]–,
[(HO)2PO2]-, [(Alkyl-O)PO3]2–, [(Alkyl-O)(HO)PO2]– oder
[(Alkyl-O)2PO2]
geeignet, wobei RF oder Alkyl eine der zuvor
genannten Bedeutungen haben.
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Ganz
besonders bevorzugt sind Anionen der Gruppe Cl–,
Br–, [RFSO3]–, [Alkyl-SO3]–, [Alkyl-OSO3]–, [Alkyl-C(O)O]–, [RFC(O)O]– geeignet, wobei RF oder
Alkyl eine der zuvor genannten Bedeutungen haben.
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In
Bezug auf die Wahl des Kations der Ionischen Flüssigkeit
gibt es per se keine Einschränkungen. Vorzugsweise handelt
es sich aber um organische Kationen, wobei es sich insbesondere
bevorzugt um Ammonium-, Phosphonium, Thiouronium-, Guanidiniumkationen
oder um heterocyclische Kationen, wie beispielsweise Imidazolium
handelt.
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Ammoniumkationen
können beispielsweise durch die Formel (1) [NR4]+ (1),beschrieben
werden, wobei
R jeweils unabhängig voneinander
H,
wobei nicht alle Substituenten R gleichzeitig H sein dürfen,
geradkettiges
oder verzweigtes Alkyl mit 1-20 C-Atomen,
geradkettiges oder
verzweigtes Alkenyl mit 2-20 C-Atomen und einer oder mehreren nicht
konjugierten Doppelbindungen,
geradkettiges oder verzweigtes
Alkinyl mit 2-20 C-Atomen und einer oder mehreren nicht konjugierten
Dreifachbindungen,
gesättigtes, teilweise oder vollständig
ungesättigtes Cycloalkyl mit 3-7 C-Atomen, das mit Alkylgruppen
mit 1-6 C-Atomen substituiert sein kann, bedeutet, wobei ein oder
mehrere R teilweise oder vollständig mit Halogenen, insbesondere
-F und/oder -Cl, oder teilweise mit -OR', -CN, -C(O)OH, -C(O)NR'2, -SO2NR'2, -SO2OH, -SO2X, -NO2, substituiert
sein können, und wobei ein oder zwei nicht benachbarte
und nicht α-ständige Kohlenstoffatome des R, durch
Atome und/oder Atomgruppierungen ausgewählt aus der Gruppe
-O-, -S-, -S(O)-, -SO2-, -N+R'2-, -C(O)NR'-, SO2NR'-,
oder -P(O)R'- ersetzt sein können mit R' = H, nicht, teilweise
oder perfluoriertes C1- bis C6-Alkyl,
C3- bis C7-Cycloalkyl,
unsubstituiertes oder substituiertes Phenyl und X = Halogen sein
kann.
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Phosphoniumkationen
können beispielsweise durch die Formel (2) [PR2 4]+ (2),beschrieben
werden, wobei
R2 jeweils unabhängig
voneinander
H, NR'2
geradkettiges
oder verzweigtes Alkyl mit 1-20 C-Atomen,
geradkettiges oder
verzweigtes Alkenyl mit 2-20 C-Atomen und einer oder mehreren nicht
konjugierten Doppelbindungen,
geradkettiges oder verzweigtes
Alkinyl mit 2-20 C-Atomen und einer oder mehreren nicht konjugierten
Dreifachbindungen,
gesättigtes, teilweise oder vollständig
ungesättigtes Cycloalkyl mit 3-7 C-Atomen, das mit Alkylgruppen
mit 1-6 C-Atomen substituiert sein kann, bedeutet, wobei ein oder
mehrere R2 teilweise oder vollständig
mit Halogenen, insbesondere -F und/oder -Cl, oder teilweise mit
-OR', -CN, -C(O)OH, -C(O)NR'2, -SO2NR'2, -SO2OH, -SO2X, -NO2, substituiert sein können, und
wobei ein oder zwei nicht benachbarte und nicht α-ständige
Kohlenstoffatome des R2, durch Atome und/oder
Atomgruppierungen ausgewählt aus der Gruppe -O-, -S-, -S(O)-, -SO2-, -N+R'2-, -C(O)NR'-, -SO2NR'-,
oder -P(O)R'- ersetzt sein können mit R' = H, nicht, teilweise
oder perfluoriertes C1- bis C6-Alkyl,
C3- bis C7-Cycloalkyl,
unsubstituiertes oder substituiertes Phenyl und X = Halogen.
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Ausgeschlossen
sind jedoch Kationen der Formeln (1) und (2), in denen alle vier
oder drei Substituenten R und R2 vollständig
mit Halogenen substituiert sind, beispielsweise das Tris(trifluormethyl)methylammoniumkation,
das Tetra(trifluormethyl)ammoniumkation oder das Tetra(nonafluorbutyl)ammoniumkation.
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Geeignete
Thiouroniumkationen können durch die Formel (3), [C(R3R4N)(SR5)(NR6R7)]+ (3),beschrieben
werden, wobei
R3 bis R7 jeweils
unabhängig voneinander
H,
geradkettiges oder
verzweigtes Alkyl mit 1 bis 20 C-Atomen,
geradkettiges oder
verzweigtes Alkenyl mit 2-20 C-Atomen und einer oder mehreren nicht
konjugierten Doppelbindungen,
geradkettiges oder verzweigtes
Alkinyl mit 2-20 C-Atomen und einer oder mehreren nicht konjugierten
Dreifachbindungen, gesättigtes, teilweise oder vollständig
ungesättigtes Cycloalkyl mit 3-7 C-Atomen, das mit Alkylgruppen
mit 1-6 C-Atomen substituiert sein kann, bedeutet, wobei ein oder
mehrere der Substituenten R3 bis R7 teilweise oder vollständig mit
Halogenen, insbesondere -F und/oder -Cl, oder teilweise mit -OH,
-OR', -CN, -C(O)OH, -C(O)NR'2, -SO2NR'2, -SO2OH, -SO2X, -NO2, substituiert sein können, und
wobei ein oder zwei nicht benachbarte und nicht α-ständige
Kohlenstoffatome von R3 bis R7 durch
Atome und/oder Atomgruppierungen ausgewählt aus der Gruppe
-O-, -S-, -S(O)-, -SO2-, -N+R'2-, -C(O)NR'-, -SO2NR'-,
oder -P(O)R'- ersetzt sein können mit R' = H, nicht, teilweise
oder perfluoriertes C1- bis C6-Alkyl,
C3- bis C7-Cycloalkyl,
unsubstituiertes oder substituiertes Phenyl und X = Halogen.
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Guanidiniumkationen
können durch die Formel (4) [C(NR8R9)(NR10R11)(NR12R13)]+ (4),beschrieben
werden, wobei
R8 bis R13 jeweils
unabhängig voneinander
H, -CN, NR'2,
geradkettiges
oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 20 C-Atomen,
geradkettiges
oder verzweigtes Alkenyl mit 2-20 C-Atomen und einer oder mehreren
nicht konjugierten Doppelbindungen,
geradkettiges oder verzweigtes
Alkinyl mit 2-20 C-Atomen und einer oder mehreren nicht konjugierten
Dreifachbindungen,
gesättigtes, teilweise oder vollständig
ungesättigtes Cycloalkyl mit 3-7 C-Atomen, das mit Alkylgruppen
mit 1-6 C-Atomen substituiert sein kann, bedeutet, wobei ein oder
mehrere der Substituenten R8 bis R13 teilweise oder vollständig mit
Halogenen, insbesondere -F und/oder -Cl, oder teilweise mit -OR',
-CN, -C(O)OH, -C(O)NR'2, -SO2NR'2, -SO2OH, -SO2X, -NO2, substituiert
sein können, und wobei ein oder zwei nicht benachbarte
und nicht α-ständige Kohlenstoffatome von R8 bis R13 durch Atome
und/oder Atomgruppierungen ausgewählt aus der Gruppe -O-,
-S-, -S(O)-, -SO2-, -N+R'2-, -C(O)NR'-, -SO2NR'-,
oder -P(O)R'- ersetzt sein können mit R' = H, nicht, teilweise
oder perfluoriertes C1- bis C6-Alkyl,
C3- bis C7-Cycloalkyl,
unsubstituiertes oder substituiertes Phenyl und X = Halogen.
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Darüber
hinaus können Kationen der allgemeinen Formel (5)
[HetN]+ (5)eingesetzt
werden, wobei
HetN
+ ein heterocyclisches
Kation, ausgewählt aus der Gruppe
oder
bedeutet,
wobei die Substituenten
R
1' bis R
4' jeweils unabhängig voneinander
H,
-CN,
geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1-20 C-Atomen,
geradkettiges
oder verzweigtes Alkenyl mit 2-20 C-Atomen und einer oder mehreren
nicht konjugierten Doppelbindungen,
geradkettiges oder verzweigtes
Alkinyl mit 2-20 C-Atomen und einer oder mehreren nicht konjugierten
Dreifachbindungen,
gesättigtes, teilweise oder vollständig
ungesättigtes Cycloalkyl mit 3-7 C-Atomen, das mit Alkylgruppen
mit 1-6 C-Atomen substituiert sein kann,
gesättigtes,
teilweise oder vollständig ungesättigtes Heteroaryl,
Heteroaryl-C
1-C
6-alkyl oder Aryl-C
1-C
6-alkyl bedeutet,
wobei
die Substituenten R
1', R
2',
R
3' und/oder R
4' zusammen
auch ein Ringsystem bilden können,
wobei ein oder
mehrere Substituenten R
1' bis R
4'
teilweise oder vollständig mit Halogenen, insbesondere
-Cl und/oder -F, oder -OR', -CN, -C(O)OH, -C(O)NR'
2,
-SO
2NR'
2, -C(O)X,
-SO
2OH, -SO
2X, -NO
2, substituiert sein können, wobei
jedoch nicht gleichzeitig R
1' und R
4' vollständig mit Halogenen substituiert
sein dürfen, und wobei ein oder zwei nicht benachbarte
und nicht am Heteroatom gebundene Kohlenstoffatome der Substituenten R
1' bis R
4', durch
Atome und/oder Atomgruppierungen ausgewählt aus der -O-,
-S-, -S(O)-, -SO
2-, -N
+R'
2-, -C(O)NR'-, -SO
2NR'-,
oder -P(O)R'- ersetzt sein können mit R' = H, nicht, teilweise
oder perfluoriertes C
1- bis C
6-Alkyl,
C
3- bis C
7-Cycloalkyl,
unsubstituiertes oder substituiertes Phenyl und X = Halogen.
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Als
Substituent R2' eignen sich insbesondere
auch Atomgruppierungen ausgewählt aus -OR',-NR'2, -C(O)OH, -C(O)NR'2,
-SO2NR'2, -SO2OH, SO2X oder -NO2.
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Unter
vollständig ungesättigten Substituenten werden
auch aromatische Substituenten verstanden.
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Als
Substituenten R und R2 bis R13 der
Verbindungen der Formeln (1) bis (4) kommen dabei neben H auch in
Frage: C1- bis C20-,
insbesondere C1-bis C14-Alkylgruppen,
und gesättigte oder ungesättigte, d. h. auch aromatische,
C3- bis C7-Cycloalkylgruppen,
die mit C1- bis C6-Alkylgruppen
substituiert sein können, insbesondere Phenyl.
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Die
Substituenten R und R2 in den Verbindungen
der Formel (1) oder (2) können dabei gleich oder verschieden
sein.
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Die
Substituenten R und R2 können Methyl,
Ethyl, Isopropyl, Propyl, Butyl, sek.-Butyl, Pentyl, Hexyl, Octyl,
Decyl oder Tetradecyl sein.
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Bis
zu vier Substituenten des Guanidinium-Kations [C(NR8R9)(NR10R11)(NR12R13)]+ können
auch paarweise derart verbunden sein, dass mono-, bi- oder polycyclische
Kationen entstehen.
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Ohne
Einschränkung der Allgemeinheit sind Beispiele für
solche Guanidinium-Kationen:
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Gegebenenfalls
können die Carbocyclen oder Heterocyclen der zuvor angegebenen
Guanidinium-Kationen noch durch C1- bis
C6-Alkyl, C1- bis
C6-Alkenyl, NO2,
CN, NR'2, F, Cl, Br, I, C1-C6-Alkoxy, SCF3, SO2CF3, COOH, SO2NR'2, SO2X' oder SO3H substituiert
sein, wobei X und R' eine zuvor angegebene Bedeutung haben, substituiertes
oder unsubstituiertes Phenyl oder unsubstituierter oder substituierter
Heterocyclus substituiert sein.
-
Bis
zu vier Substituenten des Thiouroniumkations [C(R3R4N)(SR5)(NR6R7)]+ können
auch paarweise derart verbunden sein, dass mono-, bi- oder polycyclische
Kationen entstehen.
-
Ohne
Einschränkung der Allgemeinheit sind Beispiele für
solche Kationen im Folgenden angegeben, wobei Y = S bedeutet:
-
Gegebenenfalls
können die Carbocyclen oder Heterocyclen der zuvor angegebenen
Kationen noch durch C1- bis C6-Alkyl,
C1- bis C6-Alkenyl,
NO2, CN, NR'2, F,
Cl, Br, I, C1-C6-Alkoxy,
SCF3, SO2CF3, COOH, SO2NR'2, SO2X oder SO3H oder substituiertes oder unsubstituiertes
Phenyl oder unsubstituierter oder substituierter Heterocyclus substituiert
sein, wobei X und R' eine zuvor angegebene Bedeutung haben.
-
Die
Substituenten R3 bis R13 können
jeweils unabhängig voneinander eine geradkettige oder verzweigte
Alkylgruppe mit 1 bis 10 C-Atomen sein. Die Substituenten R3 und R4, R6 und R7, R8 und R9, R10 und R11 und R12 und R13 in Verbindungen
der Formeln (3) bis (4) können dabei gleich oder verschieden
sein. Bevorzugt sind R3 bis R13 jeweils
unabhängig voneinander Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl,
n-Butyl, tert.-Butyl, sek.-Butyl, Phenyl oder Cyclohexyl.
-
Als
Substituenten R1' bis R4' von
Verbindungen der Formel (5) kommen neben H auch in Frage: C1- bis C20, insbesondere
C1- bis C12-Alkylgruppen,
und gesättigte oder ungesättigte, d. h. auch aromatische,
C3- bis C7-Cycloalkylgruppen,
die mit C1- bis C6-Alkylgruppen
substituiert sein können, insbesondere Phenyl.
-
Die
Substituenten R1' und R4' können
jeweils unabhängig voneinander Methyl, Ethyl, Isopropyl,
Propyl, Butyl, sek.-Butyl, Pentyl, Hexyl, Octyl, Decyl, Cyclohexyl,
Phenyl oder Benzyl sein. In Pyrrolidinium-, Piperidinium- oder Indolinium-Verbindungen
sind die beiden Substituenten R1' und R4' bevorzugt unterschiedlich.
-
Der
Substituent R2' oder R3' ist
jeweils unabhängig voneinander insbesondere H, Methyl,
Ethyl, Isopropyl, Propyl, Butyl, sek.-Butyl, tert.-Butyl, Cyclohexyl,
Phenyl oder Benzyl.
-
Die
C1-C12-Alkylgruppe
ist beispielsweise Methyl, Ethyl, Isopropyl, Propyl, Butyl, sek.-Butyl
oder tert.-Butyl, ferner auch Pentyl, 1-, 2- oder 3-Methylbutyl,
1,1-, 1,2- oder 2,2-Dimethylpropyl, 1-Ethylpropyl, Hexyl, Heptyl,
Octyl, Nonyl, Decyl, Undecyl oder Dodecyl. Gegebenenfalls Difluormethyl,
Trifluormethyl, Pentafluorethyl, Heptafluorpropyl oder Nonafluorbutyl.
-
Ein
geradkettiges oder verzweigtes Alkenyl mit 2 bis 20 C-Atomen, wobei
auch mehrere Doppelbindungen vorhanden sein können, ist
beispielsweise Allyl, 2- oder 3-Butenyl, Isobutenyl, sek.-Butenyl,
ferner 4-Pentenyl, iso-Pentenyl, Hexenyl, Heptenyl, Octenyl, -C9H17, -C10H19 bis -C20H39; vorzugsweise Allyl, 2- oder 3-Butenyl,
Isobutenyl, sek.-Butenyl, ferner bevorzugt ist 4-Pentenyl, iso-Pentenyl
oder Hexenyl.
-
Ein
geradkettiges oder verzweigtes Alkinyl mit 2 bis 20 C-Atomen, wobei
auch mehrere Dreifachbindungen vorhanden sein können, ist
beispielsweise Ethinyl, 1- oder 2-Propinyl, 2- oder 3-Butinyl, ferner
4-Pentinyl, 3-Pentinyl, Hexinyl, Heptinyl, Octinyl, -C9H15, -C10H17 bis -C20H37, vorzugsweise Ethinyl, 1- oder 2-Propinyl, 2-
oder 3-Butinyl, 4-Pentinyl, 3-Pentinyl oder Hexinyl.
-
Aryl-C1-C6-alkyl bedeutet
beispielsweise Benzyl, Phenylethyl, Phenylpropyl, Phenylbutyl, Phenylpentyl oder
Phenylhexyl, wobei sowohl der Phenylring als auch die Alkylenkette,
wie zuvor beschrieben teilweise oder vollständig mit Halogenen,
insbesondere -F und/oder -Cl, oder teilweise mit -OR', -NR'2, -CN, -C(O)OH, -C(O)NR'2,
-SO2NR'2, -C(O)X,
-SO2OH, -SO2X, -NO2 substituiert sein können.
-
Unsubstituierte
gesättigte oder teilweise oder vollständig ungesättigte
Cycloalkylgruppen mit 3-7 C-Atomen sind daher Cyclopropyl, Cyclobutyl,
Cyclopentyl, Cyclohexyl, Cycloheptyl, Cyclopentenyl, Cyclohexenyl,
Phenyl, Cycloheptenyl, welche mit C1- bis
C6-Alkylgruppen substituiert sein können, wobei
wiederum die Cycloalkylgruppe oder die mit C1-
bis C6-Alkylgruppen substituierte Cycloalkylgruppe
auch mit Halogenatomen wie F, Cl, Br oder I, insbesondere F oder
Cl oder mit -OR', -CN, -C(O)OH, -C(O)NR'2,
-SO2NR'2, -SO2OH, -SO2X, -NqO2 substituiert sein kann.
-
In
den Substituenten R, R2 bis R13 oder
R1' bis R4' können
auch ein oder zwei nicht benachbarte und nicht α-ständig
zum Heteroatom gebundene Kohlenstoffatome, durch Atome und/oder
Atomgruppierungen ausgewählt aus der Gruppe -O-, -S-, -S(O)-,
-SO2-, -N+R'2-, -C(O)NR'-, -SO2NR'-,
oder -P(O)R'- ersetzt werden, mit R' = nicht, teilweise oder perfluoriertes
C1- bis C6-Alkyl,
C3- bis C7-Cycloalkyl,
unsubstituiertes oder substituiertes Phenyl.
-
Ohne
Einschränkung der Allgemeinheit sind Beispiele für
derart modifizierte Substituenten R, R2 bis R13 und R1' bis R4':
-OCH3, -OCH(CH3)2, -CH2OCH3, -CH2-CH2-O-CH3, -C2H4OCH(CH3)2, C2H4SC2H5,
-C2H4SCH(CH3)2, -S(O)CH3, -SO2CH3, -SO2C6H5, -SO2C3H7, -SO2CH(CH3)2, -SO2CH2CF3, -CH2SO2CH3,
-O-C4H8-O-C4H9, -CF3,
-C2F5, -C3F7, -C4F9, -C(CF3)3, -CF2SO2CF3, -C2F4N(C2F5)C2F5, -CHF2, -CH2CF3, C2F2H3, -C3FH6,
-CH2C3F7,
-C(CFH2)3, -CH2C(O)OH, -CH2C6H5 oder P(O)(C2H5)2.
-
In
R' ist C3- bis C7-Cycloalkyl
beispielsweise Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl
oder Cycloheptyl.
-
In
R' bedeutet substituiertes Phenyl, durch C1-
bis C6-Alkyl, C1-
bis C6-Alkenyl, NO2,
CN, NR'2, F, Cl, Br, I, C1-C6-Alkoxy, SCF3, SO2CF3, COOH, SO2X', SO2NR''2 oder SO3H substituiertes
Phenyl, wobei X' F, Cl oder Br und R'' ein nicht, teilweise oder
perfluoriertes C1- bis C6-Alkyl
oder C3- bis C7-Cycloalkyl
wie für R' definiert bedeutet, beispielsweise, o-, m- oder
p-Methylphenyl, o-, m- oder p-Ethylphenyl, o-, m- oder p-Propylphenyl,
o-, m- oder p-Isopropylphenyl, o-, m- oder p-tert.-Butylphenyl,
o-, m- oder p-Nitrophenyl, o-, m- oder p-Methoxyphenyl, o-, m- oder
p-Ethoxyphenyl, o-, m-, p-(Trifluormethyl)phenyl, o-, m-, p-(Trifluormethoxy)phenyl,
o-, m-, p-(Trifluormethylsulfonyl)phenyl, o-, m- oder p-Fluorphenyl,
o-, m- oder p-Chlorphenyl, o-, m- oder p-Bromphenyl, o-, m- oder
p-Iodphenyl, weiter bevorzugt 2,3-, 2,4-, 2,5-, 2,6-, 3,4- oder
3,5-Dimethylphenyl, 2,3-, 2,4-, 2,5-, 2,6-, 3,4- oder 3,5-Dihydroxyphenyl,
2,3-, 2,4-, 2,5-, 2,6-, 3,4- oder 3,5-Difluorphenyl, 2,3-, 2,4-, 2,5-,
2,6-, 3,4- oder 3,5-Dichlorphenyl, 2,3-, 2,4-, 2,5-, 2,6-, 3,4-
oder 3,5-Dibromphenyl, 2,3-, 2,4-, 2,5-, 2,6-, 3,4- oder 3,5-Dimethoxyphenyl,
5-Fluor-2-methylphenyl, 3,4,5-Trimethoxyphenyl oder 2,4,5-Trimethylphenyl.
-
In
R1' bis R4' wird
als Heteroaryl ein gesättigter oder ungesättigter
mono- oder bicyclischer heterocyclischer Rest mit 5 bis 13 Ringgliedern
verstanden, wobei 1, 2 oder 3 N- und/oder 1 oder 2 S- oder O-Atome vorliegen
können und der heterocyclische Rest ein- oder mehrfach
durch C1- bis C6-Alkyl,
C1- bis C6-Alkenyl, NO2, CN, NR'2,F, Cl,
Br, I, C1-C6-Alkoxy,
SCF3, SO2CF3, COOH, SO2X', SO2NR'2 oder SO3H substituiert sein kann, wobei X' und R'
eine zuvor angegebene Bedeutung haben.
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Der
heterocyclische Rest ist beispielweise substituiertes oder unsubstituiertes
2- oder 3-Furyl, 2- oder 3-Thienyl, 1-, 2- oder 3-Pyrrolyl, 1-,
2-, 4- oder 5-Imidazolyl, 3-, 4- oder 5-Pyrazolyl, 2-, 4- oder 5-Oxazolyl,
3-, 4- oder 5-Isoxazolyl, 2-, 4- oder 5-Thiazolyl, 3-, 4- oder 5-Isothiazolyl,
2-, 3- oder 4-Pyridyl, 2-, 4-, 5- oder 6-Pyrimidinyl, weiterhin
bevorzugt 1,2,3-Triazol-1-, -4- oder -5-yl, 1,2,4-Triazol-1-, -4-
oder -5-yl, 1- oder 5-Tetrazolyl, 1,2,3-Oxadiazol-4- oder -5-yl
1,2,4-Oxadiazol-3- oder -5-yl, 1,3,4-Thiadiazol-2- oder -5-yl, 1,2,4-Thiadiazol-3-
oder -5-yl, 1,2,3-Thiadiazol-4- oder -5-yl, 2-, 3-, 4-, 5- oder
6-2H-Thiopyranyl, 2-, 3- oder 4-4H-Thiopyranyl, 3- oder 4-Pyridazinyl,
Pyrazinyl, 2-, 3-, 4-, 5-, 6- oder 7-Benzofuryl, 2-, 3-, 4-, 5-,
6- oder 7-Benzothienyl, 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6- oder 7-1H-Indolyl,
1-, 2-, 4- oder 5-Benzimidazolyl, 1-, 3-, 4-, 5-, 6- oder 7-Benzopyrazolyl, 2-,
4-, 5-, 6- oder 7-Benzoxazolyl, 3-, 4-, 5-, 6- oder 7-Benzisoxazolyl,
2-, 4-, 5-, 6- oder 7-Benzthiazolyl, 2-, 4-, 5-, 6- oder 7- Benzisothiazolyl,
4-, 5-, 6- oder 7-Benz-2,1,3-oxadiazolyl, 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-,
7- oder 8-Chinolinyl, 1-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- oder 8-Isochinolinyl,
1-, 2-, 3-, 4- oder 9-Carbazolyl, 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-
oder 9-Acridinyl, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- oder 8-Cinnolinyl, 2-, 4-,
5-, 6-, 7- oder 8-Chinazolinyl oder 1-, 2- oder 3-Pyrrolidinyl.
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Unter
Heteroaryl-C1-C6-alkyl
wird in Analogie zu Aryl-C1-C6-alkyl
beispielsweise Pyridinyl-methyl, Pyridinyl-ethyl, Pyridinyl-propyl,
Pyridinyl-butyl, Pyridinyl-pentyl, Pyridinyl-hexyl verstanden, wobei
weiterhin die zuvor beschriebenen Heterocyclen in dieser Weise mit
der Alkylenkette verknüpft werden können.
-
HetN
+ kann sein:
wobei
die Substituenten R
1' bis R
4' jeweils
unabhängig voneinander eine zuvor beschriebene Bedeutung
haben.
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Vorzugsweise
handelt es sich bei den Kationen der ionischen Flüssigkeit
um Imidazolium-, Morpholinium- oder Pyrrolidinium-Kationen, wie
in den zuvor stehenden zugehörigen Formeln und den zugehörigen Substituenten
beschrieben. Diese zeigen in Verbindung mit den als bevorzugt oder
besonders bevorzugt angegebenen Anionen eine besonders hohe Zellulaseaktivität
der aus Aspergillus spec. isolierten Enzyme oder Proteingemische.
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Es
können aber auch die Ionischen Flüssigkeiten Ammonium-,
Phosphonium-, Imidazolium-, Morpholinium- oder Pyrrolidinium-Acetat,
-Trifluoracetat, -Hydrogensulfat, -Alkylsulfat, -Alkylsulfonat,
-Perfluoralkylsulfonat, -Phosphat, -Hydrogenphosphat, -Alkylphosphat,
-Alkyl- und Perfluoralkyl-phosphinat, -Alkyl- und Perfluoroalkyl-phosphonat
oder -Perfluoralkylcarboxylat, mit Substituenten, wie zuvor beschrieben,
für enzymatisch katalytische Verfahren genannt werden.
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Ganz
besonders bevorzugte Ionische Flüssigkeiten für
das erfindungsgemäße Verfahren sind 1-Butyl-3-methylimidazolium
Chlorid (BMIM·Cl), 1-Butyl-3-methylimidazolium Trifluoromethansulfonat
(BMIM OTF), 1-Butyl-2,3-dimethylimidazolium Chlorid (BMMIM·Cl),
1-Ethyl-3-methylimidazolium Trifluoracetat (EMIM·ATF),
1-Butyl-1-methylpyrrolidinium Trifluormethansulfonat (BMPL·OTF),
1-Allyl-3-methylimidazolium Chlorid (AMIM·Cl) oder 1-Ethyl-3-methylimidazolium
Trifluoromethansulfonat (EMIM·OTF), ganz besonders bevorzugt
sind 1-Butyl-3-methylimidazolium Chlorid, 1-Ethyl-3-methylimidazolium
Trifluoracetat oder 1-Butyl-1-methylpyrrolidinium Trifluormethansulfonat.
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Vorzugsweise
können in den beschriebenen Ionischen Flüssigkeiten,
Di- oder Trisaccharide oder Polysaccharide oder es kann Polysaccharidhaltiges
Material gelöst werden und mit dem aus Aspergillus spec. isolierten
Enzym oder mit mindestens einer aus Aspergillus spec. isolierten
Enzym- oder Proteinmischung enzymatisch in Saccharide- oder Polysaccharid-Gemische
umgesetzt werden, die in biochemischen und/oder chemischen Prozessen
verwendet werden. So können beispielsweise aus Zellulose
mit dem erfindungsgemäßen Verfahren Enzym-katalytisch
effektiv im großen Umfang Ausgangsmaterialien für
Arzneimittel und für die Feinchemie hergestellt werden.
Es ist aber auch erstmals denkbar Enzym-katalytisch effektiv Bio-Kraftstoffe mit
dem erfindungsgemäßen Verfahren aus den beschriebenen
Materialien zu gewinnen.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Zusammensetzung enthaltend
a) mindestesns eine Ionische Flüssigkeit und b) mindestens
ein aus Aspergillus spec. isoliertes Enzym oder eine aus Aspergillus spec.
isolierte Enzym- oder Proteinmischung.
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Die
Ausführungen zu den als bevorzugt beschriebenen Ionischen
Flüssigkeiten oder mit anderen Worten den möglichen
Anion-Kation-Kombinationen, wie zuvor beschrieben, oder der bevorzugten
Ausführungsform des isolierten Enzyms oder Enzym-Proteingemischs,
gelten entsprechend auch für die Zusammensetzung. Besondere
Kombinationen an Merkmalen für die Zusammensetzung sind
in den Ansprüchen offenbart.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung mindestens
eines aus Aspergillus spec. isolierten Enzyms oder mindestens einer
aus Aspergillus spec. isolierten Enzym- oder Proteinmischung zur
Enzym-katalytischen Umsetzung von in Ionischer Flüssigkeit
gelöstem Di- oder Trisaccharid, gelöstem Polysaccharid,
gelöstem Polysaccharidhaltigen Material oder gelösten
Mischungen dieser Verbindungen.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls ein Kit, enthaltend
eine Ionische Flüssigkeit oder mindestens eine Mischung
aus Ionischen Flüssigkeiten und enthaltend mindestens ein
aus Aspergillus spec. isoliertes Enzym oder eine aus Aspergillus
spec. isolierte Enzym- oder Proteinmischung.
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Bezüglich
der Zusammensetzung enthaltend mindestens eine Ionische Flüssigkeit
und mindestens ein aus Aspergillus spec. isoliertes Enzym oder eine
aus Aspergillus spec. isolierte Enzym- oder Proteinmischung und
bezüglich der beanspruchten Verwendung mindestens eines
aus Aspergillus spec. isolierten Enzyms oder mindestens einer aus
Aspergillus spec. isolierten Enzym- oder Proteinmischung sowie in
Bezug auf das beanspruchte Kit, wird zur Vermeidung von Wiederholungen
auf die Ausführungen und die Vorteilsangaben zu dem beanspruchten
Enzymkatalysierten Verfahren verwiesen.
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Es
gibt nun verschiedene Möglichkeiten die Lehre der vorliegenden
Erfindung in vorteilhafter Weise auszugestalten und weiterzubilden.
Dazu ist einerseits auf die nachgeordneten Ansprüche, andererseits
auf die nachfolgende Erläuterung eines bevorzugten Beispiels
des erfindungsgemäßen Verfahrens und der erfindungsgemäßen
Verwendung anhand der Zeichnung zu verweisen. In Verbindung mit
der Erläuterung des bevorzugten Ausführungsbeispiels
werden auch im Allgemeinen bevorzugte Ausgestaltungen und Weiterbildungen
der Lehre erläutert, ohne die Lehre darauf einzuschränken.
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Figurenbeschreibung
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In
der Zeichnung zeigt
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1 in
einer Grafik ein Ergebnis der spezifischen Aktivität von
Enzymen (Zellulasen) aus Trichoderma reesei (Sigma-Aldrich, Germany)
nach Inkubationszeiten von 0 h, 2 h und 17 h in verschiedenen Ionischen Flüssigkeiten
gegen Kontrolle in Mclllvaine-Puffer und
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2 in einer Grafik ein Ergebnis der spezifischen
Aktivität von Enzymen (Zellulasen) aus Aspergillus spec.
(Sigma-Aldrich, Germany) nach Inkubationszeiten von 0 h, 2 h und
17 h in verschiedenen Ionischen Flüssigkeiten gegen Kontrolle
in Mclllvaine-Puffer.
-
1 zeigt
das Ergebnis eines DNSA-Referenz-Aktivitätstests des erfindungsgemäßen
Verfahrens, allerdings unter Verwendung von Enzymen (Zellulasen)
aus Trichoderma reesei (Sigma-Aldrich, Germany). MIP bezeichnet
die Kontrolle in Mclllvaine-Puffer ohne Ionische Flüssigkeit.
In der Kontrolle ist eine Reduzierung der Aktivität der
Zellulasen um die Hälfte innerhalb von 2 h Inkubation erreicht.
Danach (17 h Inkubation) sinkt die Zellulaseaktivität nicht
mehr merklich ab. Im Gegensatz dazu, zeigen die in den Ionischen
Lösungen IL1 (1-Butyl-3-methylimidazolium Chlorid = BMIM·Cl),
IL2 (1-Butyl-3-methylimidazolium Trifluoromethansulfonat = BMIM
OTF), IL4 (1-Butyl-2,3-dimethylimidazolium Chlorid = BMMIM·Cl),
IL6 (1-Ethyl-3-methylimidazolium Trifluoracetat = EMIM·ATF),
IL7 (1-Butyl-1-methyl-pyrrolidinium Trifluormethansulfonat = BMPL·OTF)
und IL10 (1-Allyl-3-methylimidazolium Chlorid = AMIM·Cl)
gelösten Enzyme maximal noch bei Inkubation von 0 h eine
Aktivität der Zellulasen. In IL8 (1-Ethyl-3-methylimidazolium
Trifluoromethansulfonat = EMIM·OTF) ist eine geringe, aber
gleichbleibende Aktivität, allerdings in einem Bereich
von 0,1 bis 0,2 über alle Inkubationzeiträume
zu ermitteln. Insbesondere die Messung für IL1, bei der
als Ionische Flüssigkeit BMIM·Cl verwendet wird,
zeigt keine Aktivität. Das bedeutet, dass schon bei Zugabe
von BMIM·Cl zu der Enzymmischung aus Trichoderma reesei
alle Zellulasen durch die stark polare halogenhaltige Ionische Flüssigkeit
inaktiviert werden.
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2 zeigt das Ergebnis eines DNSA-Aktivitätstests
des erfindungsgemäßen Verfahrens, unter Verwendung
von Enzymen (Zellulasen) aus Aspergillus spec. (Sigma-Aldrich, Germany).
MIP zeigt die Kontrolle in Mclllvaine-Puffer ohne Ionische Flüssigkeit.
In der Kontrolle ist eine Reduzierung der Aktivität der
Zellulasen auf 2 Drittel innerhalb von 2 h Inkubation erreicht.
Danach (17 h Inkubation) sinkt die Zellulaseaktivität knapp auf
die Hälfte gemessen an dem Ausgangswert 0 h. Im Gegensatz
zu den Ergebnissen der Enzymaktivität zu den aus Trichoderma
reesei isolierten Enzymen (s. 1) zeigen
die Enzyme aus Aspergillus spec. in allen Ionischen Flüssigkeiten
IL1, IL2, IL4, IL6, IL7, und IL8 nach allen Inkubationszeiten (0
h, 2 h und 17 h) spezifische Aktivität, die sogar im Schnitt
höher als die für die Kontrolle gemessene spezifische
Aktivität liegt, mit Ausnahme von IL10. 2 zeigt
demnach, dass durch Zugabe von Ionischen Flüssigkeiten
die spezifische Enzymaktivität, der aus Aspergillus spec.
isolierten Enzyme, nicht nennenswert sinkt.
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Das
nachfolgende Ausführungsbeispiel zeigt die Versuchsanordnung
für die DNSA-Aktivitätstests.
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Beispiel
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Herstellung/Verdünnung Zellulase-Gemisch
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Für
die Aktivitätstests wird ein Zellulase-Gemisch (Sigma-Aldrich,
Germany) 1:1000 mit 50 mM Tris-Puffer, pH 8,0, verdünnt.
Für jeden Messansatz bei den DNSA-Tests werden 100 μl
der 1:1000 Verdünnung eingesetzt.
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Herstellung CM-Komplett Agar
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CM-Komplett
Agar nach Leach et. Al. J. Gen. Microbiol., 10982 wird
hergestellt aus
10 ml Lösung A (100 g/L Ca(NO3)2 × 4H2O, sterilfiltriert), 10 ml Lösung
B (20 g/L KH2PO4;
25 g/L MgSO4 × 7H2O und
15 g/L NaCl, pH 5,3; sterilfiltriert), 50 ml Yeast-Casein-Mix für
CM-Komplett Agar (1 g Yeastextrakt; 0,5 g saures hydrolysiertes
Casein; 0,5 g enzymatisch hydrolysiertes Casein; ad 50 ml H2Odest), 50 ml Glucose-Lösung
(10 g Glucose in 50 ml H2Odest;
sterilfiltriert), 1 ml MNS (60 mg/L H3BO3; 390 mg/L CuSO4 × 5
H2O; 13 mg/L Kl; 60 mg/L MnSO4 × H2O; 51 mg/L (NH4)6MO7O24 × 4
H2O; 5,48 g/L ZnSO4 × H2O und 932 mg/L FeCl3 × 6 H2O. Die Lösung wird durch Zugabe
von 2 ml Chloroform sterilisiert. 15 mg Agar und 900 ml H2O werden zu der Lösung gegeben.
-
Herstellung Glucose-Rich-Medium
-
Glucose-Rich-Medium
wird aus 1 Gew.-% Glucose; 0,05 Gew.-% Hefeextrakt und 1 × Hefe
Stickstoffbasen w/AA hergestellt.
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Herstellung Salz-Minimal-Medium
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Für
die Induktionskultur wird ein Salz-Minimal-Medium aus 10 ml Salzlösung
(300 g NaNO3; 50 g KCl; 50 g MgSo4 × 7 H2O;
1 g FeSO4 × 7 H2O;
mit H2Odest auf
1 Liter aufgefüllt mit 0,5 g K2HPO4; 5 g Cellulose mit H2O
auf 50 ml aufgefüllt, hergestellt.
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Isolierung
des Zellulasen-Gemisches aus Aspergillus spec. und eines Zellulasen-Gemisches
aus Trichoderma reesei als Referenzgemisch Für den Aktivitätstest
werden Pilz-Überstände hergestellt. CM-Komplett Agarplatten
werden mit Aspergillus spec. (Aspergillus fumigatus, Aspergillus
niger) bzw. Trichoderma reesei beimpft. Nach Bewachsen der Agarplatten,
werden kleine Agarstücke aus der Agarplatte gestanzt. Die
Agarstücke werden jeweils mit 50 ml Glucose-Rich-Medium
beimpft und bei 28°C und 150 rpm über 3 Tage inkubiert.
An die Inkubation schließt sich ein Zentrifugationsschritt
bei Raumtemperatur und 5000 rpm an. Das bei dem Zentrifugationsschritt
entstehende Pellet wird 3 × mit H2Odest gewaschen. Mit dem gewaschenen Pellet wird
eine Induktionskultur angesetzt, wofür das Pellet zunächst
in 50 ml Salz-Minimalmedium resuspendiert wird und die entstehende
Flüssigkultur bei 28°C und 150 rpm über
1 Tag inkubiert. Es folgt die Abzentrifugation dieser Kultur bei
Raumtemperatur und 5000 rpm. Der Zentrifugationsüberstand
(Pilz-Überstände) dient der Durchführung
der Aktivitätstests (DNSA Tests).
-
Bestimmung der cellulolytischen
Aktivitäten der Pilz-Gemische
-
Die
cellulolytischen Aktivitäten der Zenrtrifugationsüberstände
der Pilz-Cellulasen-Gemische werden mittels DNSA Tests nach Bergemeyer,
1974; mod. bestimmt. Eine DNSA-Lösung (10 g 3,5-Dinitrosalicylsäure; 10
g NaOH; 200 g Kalium-Natirum-Tatrat; 0,5 g Na2So3 und 2 g Phenol, aufgefüllt mit
H2Odest); Mclllvaine
Puffer (0,2 M Na2HPO4 mit
0,1 M Zitronensäure auf einen pH von 6,5 eingestellt) und
eine Carboxymethylcellulose-Lösung (2% Carboxymethylcellulose
durch Aufkochen in H2Odest gelöst)
werden hergestellt. Zur Erstellung einer Eichgrade wird 10 mM Glucose-Lösung
(10 mM Glucose in H2Odest)
verwendet. Die Eichgrade wird in Mclllvaine Puffer und in allen
verwendeten ionischen Flüssigkeiten angefertigt. Dazu werden
für die Leerwerte folgende Mischungen wie gemischt: 150 μl
Puffer bzw. 150 μl ionische Flüssigkeit und 350 μl
H2Odest. Für
die Messwerte der Eichgrade werden entsprechend 150 μl
Puffer bzw. 150 μl ionische Flüssigkeit und 0,2 μM,
0,4 μM, 0,6 μM, 0,8 μM, 1,0 μM,
1,2 μM, 1,4 μM bzw. 1,6 μM Glucose-Lösung
jeweils auf 500 μl mit H2O aufgefüllt. Für
jede Konzentration erfolgt eine Doppelbestimmung. Zu den Ansätzen
für die Messwerte werden jeweils 750 μl DNSA-Lösung
gegeben und bei 100°C für 15 min inkubiert. Nach
der Inkubation werden die Ansätze mit Eis gekühlt
gefolgt von einem Zentrifugationsschritt mit 13000 rpm bei Raumtemperatur
und gefolgt von der Extinktion bei 546 nm gegen die Leerwerte.
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Für
die Messung der cellulolytischen Aktivität der Pilz-Überstände
werden jeweils 150 μl Mclllvaine Puffer bzw. 150 μl
ionische Flüssigkeit mit 250 μl Carboxymethylcellulose-Lösung
und 100 μl Pilz-Überstand gemischt. Für
sämtliche Proben werden Doppelbestimmungen durchgeführt.
Für den Leerwert werden 150 μl Mclllvaine Puffer
bzw. 150 μl ionische Flüssigkeit mit 250 μl
Carboxymethylcellulose-Lösung mit 100 μl H2Odest angesetzt.
Die Ansätze werden bei 37°C für 30 min
inkubiert, mit 750 μl DNSA-Lösung versetzt und
bei 100°C für weitere 15 min inkubiert. Nach der
Inkubation werden die Ansätze auf Eis gekühlt
und mit 13000 rpm für 2 min zentrifugiert und die Extinktion
gegen die Leerwerte bei 546 nm gemessen.
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Kolorimetrische Messung
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Die
Cellulose wird durch die in den Pilz-Überständen
enthaltenden Cellulasen zu Bruchstücken hydrolysiert, deren
reduzierende Hemiacetalgruppen mit 3,5-Dinitrosalicylsäure
(gelb) bei 100°C braunrote 3-Amino-5-Nitrosalicylsäure
bilden. Der Farbumschlag lässt sich bei 546 nm bestimmen.
Die bei der Umsetzung gebildete Menge 3-Amino-5-Nitrosalicylsäure
bzw. die gemessene Extinktion bei 546 nm ist äquimolar
zu der Anzahl der reduzierenden Hemiacetalgruppen.
-
Übernacht Inkubationsansatz
-
150 μl
Mclllvaine Puffer bzw. 150 μl ionische Flüssigkeit
werden mit 100 μl Pilz-Überstand versetzt und über
Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation werden die
Ansätze mit 250 μl Carboxymethylcellulose versetzt
und die Restaktivität wie oben beschrieben durch Extinktion
bei 546 nm gemessen.
-
Bestimmung des Proteingehalts
der Pilz-Gemische
-
Die
Proteinbestimmung der Pilz-Überstände erfolgt
nach Bradford mit Roti-Quant (Carl Roth GmbH, Karlsruhe) nach Angaben
des Herstellers.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
-
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-
Zitierte Patentliteratur
-
- - US 2008/0017224
A1 [0005]
-
Zitierte Nicht-Patentliteratur
-
- - Seongsoon
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