DE102008059985B3

DE102008059985B3 - Real-Time-PCR mittels Gigahertz- oder Terahertz-Spektrometrie

Info

Publication number: DE102008059985B3
Application number: DE102008059985A
Authority: DE
Inventors: Tanja Dr. Danker
Original assignee: IP BEWERTUNGS AG
Current assignee: DRITTE PATENTPORTFOLIO BETEILIGUNGSGESELLSCHAF, DE
Priority date: 2008-12-02
Filing date: 2008-12-02
Publication date: 2010-04-01
Anticipated expiration: 2028-12-03
Also published as: CA2744894A1; EP2361316A1; SG171450A1; CN102301001B; WO2010063683A1; US20120100547A1; JP2015119706A; CN102301001A; JP2012510626A

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum spektroskopischen real-time Nachweis von Nukleinsäuremolekülen, insbesondere von Polynucleotidsequenzen, in einer PCR-Amplifikation (PCR = Polymerase-Kettenreaktion), wobei die PCR-Amplifikation das Bereitstellen der für die Herstellung einer PCR-Lösung notwendigen Ausgangssubstanzen in einer Pufferlösung sowie die sich wiederholenden PCR-Reaktionsschritte der Denaturierung, der Primerhybridisierung und der Elongation umfasst, und wobei während der PCR-Amplifikation zu definierten Zeitpunkten aus einer Strahlungsquelle elektromagnetische Strahlung im Giga-Hertz- oder Tera-Hertz-Regime in die PCR-Lösung eingestrahlt wird, um mittels eines Detektors in einem real-time Nachweis wenigstens die Anwesenheit oder Abwesenheit einer Polynucleotidsequenz nachzuweisen.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum spektroskopischen real-time Nachweis von Nukleinsäuremolekülen, insbesondere von Polynucleotidsequenzen, in einer PCR-Amplifikation, sowie eine entsprechende PCR-Anordnung (PCR = Polymerase-Kettenreaktion).
Derartige Verfahren sowie PCR-Anordnungen werden typischerweise zur quantitativen Analyse der Expression bestimmter Gensequenzen eingesetzt. PCR-Amplifikationen allgemein finden bei der Vervielfältigung und Untersuchung von DNS- bzw. RNS-Sequenzen, wie sie in vielen biologischen Systemen vorzufinden sind, häufige Verwendung, können jedoch auch im Prinzip mit künstlich hergestellten Polynucleotidsequenzen verwendet werden.
Das vorliegend beschriebene Verfahren bezieht sich auf einen spektroskopischen real-time Nachweis in einer PCR-Amplifikation. Damit wird sich sowohl auf Nachweise während des Ablaufs aller Reaktionsschritte einer PCR-Amplifikation bezogen, als auch auf zweckdienliche Nachweise davor und danach. So können beispielsweise in einleitenden Schritten vor der Ausführung der eigentlichen PCR-Reaktionsschritte zur Replikation von Polynucleotidsequenzen eingesetzte Substanzen mittels eines spektroskopischen Nachweises qualitativ wie quantitativ untersucht werden. Weiterhin können ebenso spektroskopische Untersuchungsschritte während der PCR-Amplifikation vorgenommen werden, und auch dann, wenn die PCR-Amplifikation an sich bereits beendet wurde.
PCR-Amplikationen werden typischerweise dafür eingesetzt, im Vergleich zum menschlichen Genom relativ kurze und in ihrem Aufbau klar definierte Polynucleotidsequenzen zu vervielfältigen. Im Gegensatz zu lebenden Organismen vermag die PCR-Amplifikation lediglich die Vervielfältigung von Polynucleotidsequenzen mit wenigen tausend Basenpaaren pro Sequenz zu gewährleisten. Zur Durchführung einer PCR-Amplifikation bedarf es zunächst der Herstellung einer PCR-Lösung, welche neben einer Pufferlösung als geeignete chemische Umgebung eine Anzahl an weiteren, für den Ablauf einer PCR-Amplifikation notwendigen Ausgangssubstanzen aufweist. Diese Ausgangssubstanzen umfassen typischerweise eine originale, zu vervielfältigende Polynucleotidsequenz, Primer zur Festlegung eines Anfangs- sowie eines Endabschnittes der zu vervielfältigenden Polynucleotidsequenz eine entsprechende Polymerase, um den durch die Primer definierten Abschnitt zu replizieren, sowie Desoxynukleosidtriphosphate, welche die Bausteine der replizierten Polynucleotidsequenz darstellen. Neben diesen Ausgangssubstanzen kann eine PCR-Lösung zudem eine Anzahl an weiteren funktionellen Komponenten enthalten, welche etwa erlauben, den Ablauf der PCR-Amplifikation in Bezug auf die Effektivität zu steigern oder zu optimieren.
Eine PCR-Amplifikation besteht aus einer sich wiederholenden Abfolge von PCR-Reaktionsschritten, wie sie etwa in laborüblichen Thermocyclern durchgeführt werden können. Jede Wiederholung umfasst hierbei die drei PCR-Reaktionsschritte der Denaturierung, der Primerhybridisierung und der Elongation. Bei der Denaturierung kommt es zunächst zu einem Aufschmelzen von doppelsträngigen Polynucleotidsequenzen, unter Erhitzen der PCR-Lösung auf eine Temperatur von etwa 95°C, um die Wasserstoffbrückenbindungen, die die beiden einzelsträngigen Polynucleotidsequenzen zusammenhalten, zu lösen. Das Temperaturniveau wird solange beibehalten, bis gewährleistet ist, dass in der PCR-Lösung nur noch einzelsträngige Polynucleotidsequenzen vorliegen. In dem PCR-Reaktionsschritt der Primerhybridisierung, wird die Temperatur typischerweise für einige Sekunden lang auf einem Niveau gehalten, welches eine spezifische Anlagerung des Primers an die Polynucleotidsequenz erlaubt. Das bezeichnete Temperaturniveau liegt dabei normalerweise um wenige °C unter dem Schmelzpunkt der durch die spezifische Anlagerung entstehenden Primersequenzen, und entspricht meist einer Temperatur zwischen 55°C bis 65°C. Ist die Anlagerung der Primer an die vorbestimmten Stellen der Polynucleotidsequenz abgeschlossen, erfolgt in dem PCR-Reaktionsschritt der Elongation das Auffüllen durch die fehlenden Stränge oder Bausteine an freien Nucleotiden unter Einwirkung der Polymerase. Hierbei bildet der Primer den Anfang eines neuen Einzelstrangs, welcher stückweise repliziert wird. Die während dieses PCR-Reaktionsschrittes einzustellende Temperatur hängt von dem Arbeitsoptimum der jeweils verwendeten Polymerase ab, liegt jedoch typischerweise um 10°C bis 15°C über dem Temperaturniveau der Primerhybridisierung. Nach Abschluss des PCR-Reaktionsschrittes der Elongation wiederholt sich die Reaktionsabfolge, und die gewünschten Polynucleotidsequenzen vermehren sich im besten Reaktionsfalle exponentiell, da in jedem weiteren Reaktionsschritt auch die zuvor synthetisierten Polynucleotidsequenzen als Matrizen für eine weiteren Strangsynthese dienen können.
In der Real-Time-quantitative PCR, einer aus dem Stande der Technik bekannten Weiterentwicklung der PCR-Amplifikation, wird eine PCR-Amplifikation zur Replikation von Polynucleotidsequenzen durchgeführt und gleichzeitig eine Möglichkeit der Quantifizierung der so gewonnenen Polynucleotidsequenzen bereit gestellt. Die Quantifizierung beruht hierbei auf der Ausführung von Fluoreszenzmessungen, die während des Ablaufes der PCR-Amplifikation vorgenommen werden. Das nachgewiesene Fluoreszenzsignal nimmt dabei proportional mit der Menge an replizierten Polynucleotidsequenzen zu. Dementsprechend erlaubt die Real-Time-quantitative PCR im Gegensatz zu den meisten herkömmlichen quantitativen Nachweismethoden, welche erst nach der PCR-Amplifikation angewendet werden können, eine quantitative Auswertung der in der PCR-Amplifikation replizierten Polynucleotidsequenzen noch während ihrer Vervielfältigung.
Hierbei soll darauf hingewiesen werden, dass hier und im Folgenden ein quantitativer Nachweis im Sinne der Quantifizierung in Verbindung mit einer Real-Time-quantitative PCR zu verstehen ist. Dieser können verschiede bekannte Quantifizierungsmodelle zugrunde liegen. In einem einfachen Fall kann etwa die Tatsache benutzt werden, dass zwischen dem Logarithmus der eingesetzten Menge an der zu replizierenden Polynucleotidsequenz und dem CT (Threshold Cycle = ”Schwellenwert-Zyklus”, d. h. dem Zyklus, zu welchem die nachgewiesene Fluoreszenz erstmalig signifikant über die Hintergrund-Fluoreszenz liegt) eine lineare, umgekehrt proportionale Beziehung besteht. Ist die eingesetzte Menge etwa zunächst bekannt, kann eine Standardkurve erzeugt werden, gegen deren Steigung jede unbekannte Menge an Polynucleotidsequenz verglichen und quantifiziert werden kann. Ist andererseits die Ausgangsmenge unbekannt, kann mitunter durch Bestimmung des CT auch auf die Ausgangsmenge zurückgeschlossen werden. Weitere Berechnungsmethoden sind dem Fachmann bekannt.
Die Real-Time-Quantitative PCR bedarf dabei Fluoreszenzfarbstoffe oder sogenannter Fluoreszenzmarker, welche chemisch oder physikalisch mit den replizierten Polynucleotidsequenzen in Wechselwirkung treten, und infolgedessen ihr eigenes Fluoreszenzverhalten ändern. Dementsprechend korreliert die Zunahme der Intensität eines nachgewiese nen Fluoreszenzsignals nach den sich wiederholenden PCR-Reaktionsschritten mit einer entsprechenden Zunahme an replizierten Polynucleotidsequenzen. Der Nachweis des Verlaufs einer PCR-Amplifikation über gemessene Fluoreszenzsignale, kann sich beispielsweise auf die Verwendung von einfachen Fluoreszenzfarbstoffen stützen, die sich relativ unspezifisch an die zu replizierende Polynucleotidsequenz binden. Solche Fluoreszenzfarbstoffe sind etwa SybrGreen, welches ein asymmetrisches Cyanin-Farbstoffmolkül ist und mit zu replizierenden DNA-Molekülen einen DNA-Fluoreszenzfarbstoff-Komplex bildet, welcher blaues Licht bei einer Wellenlänge von λ_max = 494 nm absorbiert und grünes Licht bei einer Wellenlänge von λ_max = 521 nm emittiert. Ein weiterer häufig verwendeter Fluoreszenzfarbstoff ist Ethidiumbromid. In Ergänzung zu diesen Fluoreszenzfarbstoffen kommen auch noch Fluoreszenzmarker wie FRET-Sonden, Lightcycler-Sonden^®, TaqMan-Sonden^®, Molecular-beacons, Scorpionprimer oder auch Luxprimer^® zum Einsatz, welche zwar eine spezifische Bindung an einzelne Stellen der Polynucleotidsequenz erlauben und folglich eng definierte Fluoreszenzeigenschaften aufweisen, aber vergleichsweise teurer sind. Folglich finden solche Fluoreszenzmarker nicht die breite Anwendung, wie sie etwa für die Fluoreszenzfarbstoffe typisch ist. Weiterhin stellen sich etwa Molecular-beacons als relativ komplexe Strukturen dar, die zusätzlich optimierter und damit teuerer Primer zur Durchführung der PCR-Amplifikation bedürfen. Weiterhin erschweren derartige komplexe Strukturen eine optimierte Einstellung der PCR-Reaktionsbedingungen und fördern so eine relativ ineffiziente Vervielfältigung der Polynucleotidsequenzen als auch die Darstellung vieler unerwünschter Nebenprodukte.
Zur Vermeidung dieser Nachteile der auf den Nachweis von Fluoreszenzsignalen beruhenden Real-Time-quantitative PCR schlägt die aus dem Stand der Technik bekannte WO 03/102238 A2 ein Verfahren zum Nachweis der Darstellung von zusammenhängenden Nukleinsäuremolekülen in einer PCR-Lösung vor, sowie eine Anordnung vor, um das besagte Verfahren auszuführen. Das Verfahren umfasst die Bereitstellung von PCR-Ausgangsstoffen in einer Kammer, sowie die Durchführung der sich wiederholenden PCR-Reaktionsschritte der Denaturierung, der Primerhybridisierung und der Elongation. Während der Ausführung dieser PCR-Reaktionsschritte wird die Darstellung zusammenhängender Nukleinsäuremoleküle durch die Einstrahlung von UV-Licht in die PCR-Lösung und dem darauf folgenden Nachweis der absorbierten Lichtintensität vorgenommen. Die PCR-Lösung wird hierbei von einer für die Durchführung einer PCR-Amplifikation angepassten Kammer aufgenommen, in welche die Lichtenergie der UV-Lichtquelle eingestrahlt wird.
Obwohl das in der WO 03/102238 A2 beschriebene Verfahren die Verwendung von Fluoreszenzmarkern unnötig werden lässt, zeigt sich diese Methode als sehr störanfällig in Bezug auf einzelne Komponenten der PCR-Lösung oder in Bezug auf verbliebene Überreste aus Reaktionsschritten von vorhergehenden Isolierungsreaktionen, z. B. Phenole. Ein weiterer Nachteil der quantitativen Bestimmung mittels UV-Absorption ist auch darin zu sehen, dass einzelsträngige von doppelsträngigen Nukleinsäuremolekülen nur begrenzt unterschieden werden können und folglich eine nur sehr unspezifische Nachweismöglichkeit für Polynucleotidsequenzen zur Verfügung steht.
WO 2008/109706 A1 beschreibt die Anwendung von Terahertz-Spektroskopie in verschiedenster Art. Dabei wird auch die Detektion doppelsträngiger und einzelsträngiger DNA beschrieben. Eine real-time Methode zum Nachweis des PCR-Produktes wird in dieser Druckschrift in keiner Weise beschrieben.
WO 2006/064192 A1 beschreibt einen Bandfilter im Terahertzbereich. Ein Verfahren bezüglich dem Nachweis von Nucleinsäuremoleküllen wird in dieser Druckschrift nicht beschrieben.
Die US 2006/0216742 beschreibt ein Verfahren und ein System zum Nachweis biomolekularer Bindungsereignisse unter Verwendung von Gigahertz- oder Terahertzstrahlung.
Die WO 03/100396 A1 offenbart ein Verfahren zum Nachweis der Spezifität eines Liganden zu einer biologischen Probe.
Die DE 100 54 476 A1 beschreibt ein Verfahren zum Nachweis von Polynucleotidsequenzen, bei dem der Brechungsindex oder eine äquivalente Größe der mit dem Testmedium in Kontakt befindlichen Probe durch Wechselwirkung mit einfallender elektromagnetischer Strahlung bestimmt wird.
Die WO 2004/024949 A2 beschreibt ein Verfahren zum schnellen Nachweis von Mutationen und Nucleotidpolymorphismen unter Einsatz von Spektraldaten.
Eine spezifischere Methode zum Nachweis des Vorliegens einer biomolekularischen Bindung zwischen zwei Molekülen wird von der US 2006/0216742 A1 vorgeschlagen, welche eine Nachweismethode sowie eine entsprechende Vorrichtung betrifft. Gemäß der Of fenbarung wird über Teraherzstrahlung das Vorliegen einer biomolekularischen Bindung zweier Moleküle nachweisen, indem aus einer Quelle Teraherzstrahlung ausgesendet wird und nach Durchstrahlung einer die Moleküle umfassenden Probe von einem Detektor nachgewiesen wird. Hierbei erlaubt die offenbarte Methode jedoch nicht die Quantifizierung eingesetzter Mengen der Moleküle, und ist folglich für eine Verwendung zum Real-Time-Nachweis in einer PCR-Amplifikation ungeeignet.
Es stellt sich demnach die Aufgabe dar, ein markerfreies Verfahren zum Real-Time-Nachweis von Polynucleotidsequenzen in einer PCR-Amplifikation vorzuschlagen, welches einen spezifischen und quantitativen Nachweis von Polynucleotidsequenzen, insbesondere eine Unterscheidung zwischen einzel- und doppelsträngigen Polynucleotidsequenzen, ermöglicht, und von der Reinheit oder Qualität der Lösung weitgehend unbeeinflusst ist.
Gelöst wird diese Aufgabe durch ein Verfahren gemäß Patentanspruch 1 und 15 sowie eine PCR-Anordnung gemäß Patentanspruch 14.
Insbesondere wird die Aufgabe durch ein Verfahren zum auch quantitativen spektroskopischen real-time Nachweis von Nukleinsäuremolekülen, insbesondere von Polynucleotidsequenzen, in einer PCR-Amplifikation gelöst, wobei die PCR-Amplifikation das Bereitstellen der für die Herstellung einer PCR-Lösung notwendigen Ausgangssubstanzen in einer Pufferlösung sowie die sich wiederholenden PCR-Reaktionsschritte der Denaturierung, der Primerhybridisierung und der Elongation umfasst, und wobei während der PCR-Amplifikation zu definierten Zeitpunkten aus einer Strahlungsquelle elektromagneti sche Strahlung im Giga-Hertz- oder Tera-Hertz-Regime in die PCR-Lösung eingestrahlt wird, um mittels eines Detektors in einem quantitativen real-time Nachweis wenigstens die Anwesenheit oder Abwesenheit einer Polynucleotidsequenz nachzuweisen.
Fernerhin wird die Aufgabe durch ein Verfahren zum auch quantitativen spektroskopischen real-time Nachweis von Nukleinsäuremolekülen, insbesondere von Polynucleotidsequenzen, in einer PCR-Amplifikation gelöst, wobei die PCR-Amplifikation das Bereitstellen der für die Herstellung einer PCR-Lösung notwendigen Ausgangssubstanzen in einer Pufferlösung sowie die sich wiederholenden PCR-Reaktionsschritte der Denaturierung, der Primerhybridisierung und der Elongation umfasst, und wobei während der PCR-Amplifikation zu definierten Zeitpunkten aus einer Strahlungsquelle elektromagnetische Strahlung im Giga-Hertz- oder Tera-Hertz-Regime in die PCR-Lösung eingestrahlt wird, um mittels eines Detektors in einem real-time Nachweis wenigstens die Anwesenheit oder Abwesenheit einer Polynucleotidsequenz nachzuweisen, und wobei der Reaktionsschritt der Denaturierung durch Tera-Hertz-Strahlung aus der Strahlungsquelle bewirkt wird.
Überdies wird die Aufgabe durch Eine PCR-Anordnung zum auch quantitativen spektroskopischen real-time Nachweis von Polynucleotidsequenzen in einer PCR-Amplifikation gelöst, wobei diese ein Substrat mit einem Aufnahmebereich für eine PCR-Lösung, bestehend aus den notwendigen Ausgangssubstanzen und einer Pufferlösung, Temperaturänderungsmittel, mittels derer die PCR-Lösung auf vorgegebene Temperaturen geheizt und/oder gekühlt werden kann, um die sich wiederholenden PCR-Reaktionsschritte der Denaturierung, der Primerhybridisierung oder der Elongation zu ermöglichen, eine Strahlungsquelle, um elektromagnetische Strahlung im Giga-Hertz- oder Tera-Hertz-Regime in die PCR-Lösung einzustrahlen, und einen Detektor, um durch die PCR-Lösung transmittierte Strahlung auch quantitativ spektroskopisch nachzuweisen, umfasst.
Ein Kerngedanke der vorliegenden Verfahren sowie der erfindungsgemäßen PCR-Anordnung liegt in der Ausführung einer PCR-Amplifikation sowie einem spektroskopischen Real-Time-Nachweis im Giga-Hertz- oder Tera-Hertz-Regime des elektromagnetischen Spektrums. Typischerweise in diesem Frequenzbereich verwendete Strahlungen liegen zwischen 100 Gigahertz und 20 Terahertz, insbesondere zwischen 300 Gigahertz und 10 Terahertz. Diese Strahlungsfrequenzen sind geeignet, bestimmte Anregungszustände (typischerweise vibratorische Schwingungsmoden) von einzelsträngigen und doppelsträngigen Polynucleotidsequenzen anzuregen. Anregungszustände einzelner funktioneller Gruppen dieser Polynucleotidsequenzen sind folglich mit einer vorbestimmten Frequenz der elektromagnetischen Strahlung korreliert, und können in Extinktionsmessungen nachgewiesen werden. Unter Extinktionsmessungen werden im Folgenden allgemein alle spektroskopischen Nachweise, auch quantitative, bezeichnet, welche Teile der in die PCR-Lösung eingestrahlten Lichtintensität mit Teilen der aus ihr austretenden und mit einem Detektor nachgewiesenen Lichtintensität in Beziehung setzt, um Rückschlüsse auf nachzuweisende Stoffe und Strukturen in der PCR-Lösung zu erlauben. Diese Anregungsmoden (Anregungsfrequenzen) sind überdies charakteristisch für die chemischen Bindungszustände dieser funktionellen Gruppen, und können infolge einer Veränderung des Bindungszustandes mit einer Veränderung der elektromagnetischen Anregungsfrequenz einhergehen. Insbesondere lassen sich Anregungsmoden nachweisen, deren Auftreten charakteristisch für das Vorliegen von Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den beiden einzelsträngigen Polynucleotidsequenz in einer doppelsträngigen Polynucleotidsequenz ist. Dementsprechend können durch Extinktionsmessungen in diesem bezeichneten Frequenzbereich quantitative Aussagen darüber gewonnen werden, ob in einer PCR-Lösung ein Gemisch von einzel- oder doppelsträngigen Polynucleotidsequenzen vorliegt.
Der Nachweis vorbestimmter Anregungszustände von Polynucleotidsequenzen in einer PCR-Lösung mittels spektroskopischer Extinktionsmessungen erfordert im Vergleich zum bisher herkömmlichen Verfahren des Nachweises mittels Fluoreszenzmessungen keinerlei Fluoreszenzmarker, welche einer PCR-Lösung zugegeben werden müssen. Damit gestaltet sich einerseits die Herstellung einer PCR-Lösung als weniger komplex und kostengünstiger. Andererseits kann auf den Einsatz von für die PCR-Lösung mitunter schädlichen UV-Lichts verzichtet werden. Gerade durch UV-Licht, welches elektronische Anregungen in biologischen Makromolekülen bewirkt, sind die möglichen Fehlerquellen durch chemische Nebenreaktionen, welche durch die Einstrahlung von UV-Licht mitunter initiiert werden, sehr problematisch. Elektromagnetische Strahlung im Giga-Hertz- sowie Tera-Hertz-Regime vermögen jedoch typischerweise nur vibratorische Anregungen hervorzurufen und stören somit die chemische Reaktionsumgebung in einer PCR-Lösung in praktischer Hinsicht kaum. Überdies ist die Strahlungsfrequenz von Giga-Hertz- und Tera-Hertz-Strahlung geeignet, um Hybridisierungszustände von zusammen hängenden Nucleinsäuremolekülen bzw. von Polynucleotidsequenzen nachzuweisen. Anders als in einem Real-Time-Quantitative PCR-Verfahren mittels Fluoreszenzmessung im UV-Regime können folglich Nachweise entsprechend des erfindungsgemäßen Verfahrens das Vorliegen einzelner Hybridisierungszustände, insbesondere das Vorliegen von einzelsträngigen und doppelsträngigen Polynucleotidsequenzen, nachweisen. Dieser für die Durchführung einer PCR-Amplifikation mitunter entscheidende, auch quantitative Nachweis erlaubt Schlüsse auf den Fortschritt sowie die Qualität der in der PCR-Lösung stattfindenden Reaktionsschritte und damit eine Erhöhung der Effizienz der PCR-Amplifikation allgemein.
Ein weiterer Kerngedanke des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt fernerhin darin, dass die zum spektroskopischen Real-Time-Nachweis eingesetzte Strahlungsquelle auch dafür eingesetzt werden kann, den Reaktionsschritt der Denaturierung in der PCR-Amplifikation durch elektromagnetische Strahlung herbeizuführen. Der eingestrahlte Frequenzbereich ist nämlich durchaus geeignet, die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den beiden Einzelsträngen in einer doppelsträngigen Polynucleotidsequenz aufzuschmelzen, ohne dass dem gesamten System der PCR-Lösung direkt thermische Energie hinzugefügt werden muss. Folglich bedarf es in dem Reaktionsschritt der Denaturierung nicht einer Temperaturerhöhung einer PCR-Lösung um das Aufschmelzen der chemischen Verbindungen zwischen einzelnen Strängen einer Polynucleotidsequenz zu bewirken. Vielmehr bewirkt die Strahlungsquelle durch Einstrahlen elektromagnetischer Strahlung einer vorbestimmten Frequenz im Giga-Hertz- sowie Tera-Hertz-Regime in die PCR-Lösung ein Aufschmelzen doppelsträngigen Polynucleotidsequenzen ohne dass die PCR-Lösung selbst eine starke Temperaturänderung erfahren muss. Ein derartiges Verfahren verkürzt somit die für die sich wiederholenden PCR-Reaktionsschritte nötigen Aufheiz- und Abkühlphasen der PCR-Lösung und ermöglicht eine zeitlich schnellere Darstellung einer gewünschten Menge an zu vervielfältigenden Polynucleotidsequenzen.
In einer ersten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass die für die Herstellung einer PCR-Lösung notwendigen Ausgangssubstanzen in einer Pufferlösung keine chemischen oder physikalischen Nachweismarker, insbesondere keine Fluoreszenzmarker, umfassen. Hierbei handelt es sich um Marker, welche für die Herstellung einer weiter oben beschriebenen PCR-Lösung als nicht notwendige Ausgangssubstanzen zugesetzt werden, um in einem Messverfahren, das aus dem Stande der Technik bekannt ist, die Darstellung von Polynucleotidsequenzen nachweisen zu können. Die für das ausführungsgemäße Verfahren bereitgestellte PCR-Lösung, kann folglich auf die notwendigen Ausgangssubstanzen beschränkt werden, wie sie etwa für eine gewöhnliche PCR-Amplifikation ohne Real-Time-Nachweis notwendig sind. Damit werden einerseits mögliche Störeinflüsse chemischer sowie physikalischer Natur in dem Verfahren der PCR-Amplifikation vermindert, und gleichzeitig die Kontrollierbarkeit der Reaktionsbedingungen erhöht.
In einer weiteren Ausführungsform kann vorgesehen sein, dass die Intensität der eingestrahlten elektromagnetischen Strahlung im Giga-Hertz- oder Tera-Hertz-Regime so ausgewählt wird, dass sie eine vorbestimmte Schichtdicke der PCR-Lösung durchdringt. Die Schichtdicke kann sich hierbei entweder auf den gesamten Probenquerschnitt, welcher von der eingestrahlten elektromagnetischen Strahlung durchdrungen wird, oder aber auch nur auf einen Teilbereich des Probenquerschnittes beziehen. Die Schichtdicke ist geeignet, bei Einstrahlung einer vorgegebenen Strahlungsintensität und Vorliegen einer Anzahl an Polynucleotidsequenzen oberhalb einer bestimmten Detektionsschwelle ein Extinktionssignal nachzuweisen. Das Extinktionssignal, welches aus einer Abschwächung der elektromagnetischen Strahlungsintensität resultiert, kann etwa aus Absorption, Streuung, Beugung sowie Reflexion resultieren. Ist die durchstrahlte Schichtdicke konstant, sowie die eingestrahlte elektromagnetische Strahlung in ihrer Intensität unveränderlich, kann auf die Menge an dargestellten Polynucleotidsequenzen etwa bei bekanntem Extinktionsquerschnitt der Polynucleotidsequenzen rückgeschlossen werden.
In einer weiterführenden Ausführungsform des Verfahrens ist vorgesehen, dass die Frequenz der eingestrahlten elektromagnetischen Strahlung im Giga-Hertz- oder Tera-Hertz-Regime zwischen 100 GHz und 20 THz, insbesondere zwischen 300 GHz und 10 THz liegt. Diese Frequenzbereiche decken die spektroskopisch leicht nachweisbaren Anregungsfrequenzen der meisten Polynucleotidsequenzen ab und erlauben somit die Anregungsschwingungen spektroskopisch, insbesondere spektroskopisch quantitativ, nachzuweisen.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass die Pufferlösung der PCR-Lösung in Bezug auf eine Frequenz der eingestrahlten elektromagnetischen Strahlung im Giga-Hertz- oder Tera-Hertz-Regime so ausgewählt wird, dass die Strahlungsintensität nach Transmission einer vorbestimmten Schichtdicke der PCR-Lösung mit dem Detektor weitgehend ungeschwächt nachgewiesen werden kann. Die Pufferlösung selbst wird somit in Bezug auf die eingesetzten elektromagnetischen Strahlungsfrequenzen so ausgewählt, dass die eingestrahlte elektromagnetische Strahlung vorbestimmter Frequenzbereiche eine möglichst große Transmission erfährt. Überlappen diese Frequenzbereiche mit nachzuweisenden Anregungszuständen der Polynucleotidsequenzen, ist gewährleistet, dass eine Verringerung der elektromagnetischen Strahlungsintensität nach Wechselwirkung mit der PCR-Lösung nicht auf dem Extinktionsverhalten der Pufferlösung selbst, sondern lediglich auf das der Ausgangssubstanzen sowie mit den dargestellten Molekülen beruht. Kann weiterhin eine Extinktion durch Nebenprodukte der PCR-Amplifikation ausgeschlossen werden, beruht die Abschwächung der elektromagnetischen Strahlungsintensität in den Bereichen der Anregungszuständen der Polynucleotidsequenzen weitgehend alleinig auf der Wechselwirkung der elektromagnetischen Strahlung mit den Polynucleotidsequenzen. Das Verhältnis von Nutzsignal und ungewünschter Abschwächung der elektromagnetischen Strahlung wird infolge erhöht und die Qualität des auch quantitativen spektroskopischen Real-Time-Nachweises verbessert.
In einer weiterführenden Ausführungsform des Verfahrens zeichnet sich dieses dadurch aus, dass die PCR-Lösung auf einem Substrat, insbesondere in einem vorbestimmten Aufnahmebereich des Substrats aufgebracht ist, welches für die eingestrahlte elektromagnetische Strahlung im Giga-Hertz- oder Tera-Hertz-Regime weitgehend transparent ist. Ein derartiger Aufnahmebereich kann durch ein begrenztes Volumen ausgebildet sein, oder aber lediglich auch als Fläche zum Auftrag einer PCR-Lösung. Das Substrat selbst kann ein mineralisches Substrat, beispielsweise Glas, oder aber auch ein Kunststoffsubstrat sein. Ist das Substrat selbst für die eingestrahlten elektromagnetische Strahlung weitgehend transparent, verursacht es lediglich einen geringen Anteil des in dem spektroskopischen Real-Time-Nachweisverfahren nachgewiesenen Extinktionssignals. Die nachgewiesene Extinktion beruht damit weitgehend auf der Wechselwirkung der elektromagnetischen Strahlung und der PCR-Lösung, bzw. der darin enthaltenen Stoffe, falls die Pufferlösung der PCR-Lösung selbst ebenfalls in dem Frequenzbereich der eingestrahlten elektromagnetischen Strahlung keine oder nur geringe Schwächung der Strahlungsintensität verursacht. Weiterhin kann das Substrat, falls es ein Kunststoff ist, durch die Auswahl eines geeigneten Kunststoffes an den Nutzfrequenzbereich der eingestrahlten elektromagnetischen Strahlung angepasst werden, um eine möglichst geringe Abschwächung der Strahlungsintensität zu bewirken.
In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens umfasst das Substrat wenigstens einen Wellenleiter für elektromagnetische Strahlung im Giga-Hertz- oder Tera-Hertz-Regime. Dieser Wellenleiter kann einerseits als Strahlungsführungsmittel als auch gleichzeitig als Substrat mit einem möglichen Aufnahmebereich für die PCR-Lösung dienen. Dementsprechend kann die Einstrahlung von elektromagnetischer Strahlung in die PCR-Lösung örtlich in gut kontrollierbarer Weise erfolgen. Zudem kann die Streustrahlung bzw. Verluststrahlung, wie sie in gewöhnlichen Kollimations- und Fokussierverfahren auftritt, verringert und der spektroskopische Real-Time-Nachweis verbessert werden. Besonders vorteilhaft lässt sich ein Wellenleiter einsetzen, wenn der vorbestimmte Aufnahmebereich für die PCR-Lösung sich in einem Bereich befindet, welcher von dem evaneszenten Strahlungsfeld des Wellenleiters durchdrungen wird. Ein Nachweis der Polynucleotidsequenzen findet folglich mit elektromagnetischer Strahlung statt, welche einerseits durch den Wellenleiter geführt wird, andererseits jedoch mit Bereichen der Oberfläche außerhalb des Wellenleiters kommuniziert.
In einer weiterführenden Ausführungsform des Verfahrens zum spektroskopischen Real-Time-Nachweis sind fernerhin Temperaturänderungsmittel bereitgestellt, mittels derer die PCR-Lösung auf vorgegebene Temperaturen geheizt und/oder gekühlt werden kann. Derartige Temperaturänderungsmittel können entweder direkt oder indirekt die PCR-Lösung heizen oder kühlen. Eine direkte Temperaturerhöhung kann beispielsweise auf einer direkten Strahlungsheizung oder einer Widerstandsheizung beruhen. Eine Kühlung kann etwa durch geeignet angeordnete Peltierelemente oder aber auch durch ein Kühlmedium, beispielsweise Luft, bewirkt werden, welches mit einem Wärmeaustauscher in Verbindung steht. Die Temperaturänderungsmittel gewährleisten dabei, dass ein möglichst schnelles und genaues Wechseln der für die einzelnen PCR-Reaktionsschritte notwendigen Temperaturen ermöglicht wird.
In einer weiterführenden Ausführungsform des Verfahrens ist vorgesehen, dass die Temperaturänderungsmittel ein Wärmemedium heizen und/oder kühlen, welches über das Substrat die PCR-Lösung indirekt heizt und/oder kühlt. Ferner ist zu berücksichtigen, dass die Wärmekapazität des Substrats selbst gering und die Wärmeleitfähigkeit möglichst groß ist. Ausführungsgemäß kann das Wärmemedium flächig in Wechselwirkung stehen, oder aber auch dieses in dafür vorgesehenen Führungsmitteln, beispielsweise in Kanälen, durchdringen. Mittels der Heizung oder Kühlung des Substrats wird bei geeignetem Kontakt der PCR-Lösung mit dem Substrat die Temperatur der PCR-Lösung entsprechend verändert. Folglich können die für den Ablauf der PCR-Reaktionsschritte notwendigen Temperaturbedingungen gewährleistet werden.
In einer vorteilhaften Ausführung des Verfahrens ist vorgesehen, dass elektromagnetische Strahlung im Giga-Hertz- oder Tera-Hertz-Regime aus der Strahlungsquelle in die PCR-Lösung vor und/oder nach einem Schritt der Denaturierung, und/oder der Primerhybridisierung und/oder der Elongation eingestrahlt wird. Dementsprechend können die Ausgangsbedingungen sowie Reaktionserfolge nach jeder der in der PCR-Amplifikation stattfindenden Reaktionsschritte mittels eines spektroskopischen Nachweises überprüft werden. Sollte sich etwa durch den Nachweis herausstellen, dass die Ausgangsvoraussetzun gen für einen nachfolgenden PCR-Reaktionsschritt ungünstig sind, können entsprechende Veränderungen der Reaktionsbedingungen, beispielsweise in der Temperaturwahl, vorgenommen werden, um einen verbesserten Erfolg herbeizuführen. In einer alternativen Ausgestaltung kann auch die elektromagnetische Strahlung im Giga-Hertz- oder Tera-Hertz-Regime während der PCR-Amplifikation stattfindenden Reaktionsschritte der Denaturierung, der Primerhybridisierung oder der Elongation eingestrahlt werden, um beispielsweise Rückschlüsse auf das zeitliche Bindungsverhalten einzelner molekularer Bausteine zu gewinnen.
In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens wird die Frequenz der elektromagnetischen Strahlung ausgewählt, um definierte vibratorische Anregungsmoden von einzel- und/oder doppelsträngigen Polynucleotidsequenzen zu erregen, um diese, insbesondere die für das Vorliegen von Hybridisierungszuständen von doppelsträngigen Polynucleotidsequenzen charakteristischen Moden, nachzuweisen. Folglich kann während der PCR-Amplifikation das Vorliegen bestimmter molekularer Strukturen der Polynucleotidsequenzen nachgewiesen werden, mittels derer die Qualität des Ablaufs der PCR-Amplifikation überprüft und nachgewiesen werden kann. Weiterhin kann auch nach erfolgtem Nachweis der Polynucleotidsequenzen ein Abbruch der PCR-Amplifikation eingeleitet werden. Insbesondere kann auch über den Nachweis der Verschiebung der Anregungsfrequenz definierter Anregungsmoden ein Rückschluss auf die Struktur der Polynucleotidsequenzen, insbesondere auf deren Hybridisierungszustand, gewonnen werden.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden während der PCR-Amplifikation zeitlich vorausgehende Nachweise mittels der elektromagnetischen Strahlung im Giga-Hertz- oder Tera-Hertz-Regime als Untergrund für zeitlich nachfolgende Nachweise in der Analyse der Nachweise berücksichtigt. Die zeitlich vorausgehenden Nachweise können für die Untergrundsubtraktion, welche in Extinktionsmessungen unerlässlich sind, entweder in direkter, gemittelter, oder in gefilterter Weise von nachfolgenden Nachweisen abgezogen werden. Dieser für den Erhalt von quantitativen Ergebnissen notwendige Schritt der Untergrundsubtraktion bedarf somit keiner weiteren Vorkenntnisse über das konkrete Extinktionsverhalten der PCR-Anordnung, sondern erlaubt eine gute Untergrundbestimmung in zeitlich naher Weise.
In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens zum spektroskopischen Real-Time-Nachweis von Polynucleotidsequenzen wird elektromagnetische Strahlung im Giga-Hertz- oder Tera-Hertz-Regime aus der Strahlungsquelle vor Durchführen einer PCR- Amplifikation in eine Lösung von in der PCR-Amplifikation zu verwendenden Ausgangssubstanzen eingestrahlt, um chemische oder physikalische Eigenschaften einzelner Ausgangssubstanzen, insbesondere deren Qualität, Spezifität und deren Bindungsverhalten, mittels spektroskopischer Nachweise zu bestimmen. Hierbei ist anzuführen, dass typischerweise vor dem Durchführen einer Real-Time-quantitative PCR die meisten Anwender von PCR-Amplifikationen die Qualität bzw. Spezifität und deren Bindungsverhalten (Qualität der Polynucleotidsequenzen, Primerbindung, Primerspezifität, Amplifikationsmengen) aus Kostengründen in einer PCR-Vorrichtung, welche nicht die Möglichkeit eines spektroskopischen Real-Time-Nachweises unter Einsatz von Fluoreszenzmessungen bereit hält, testen. Gemäß einer Durchführung des ausführungsgemäßen Verfahrens kann folglich diese separate Überprüfung entfallen, und die physikalischen und chemischen Eigenschaften einzelner Ausgangssubstanzen mittels einer erfindungsgemäßen PCR-Anordnung direkt bestimmt werden. Weiterhin sind die in PCR-Amplifikationen typischerweise verwendete Primer für die Verwendung in gewöhnlichen PCR-Anordnungen ohne spektroskopischen Real-Time-Nachweis ausgelegt, und erfordern in der Verwendung in einer PCR-Anordnung mit spektroskopischem Real-Time-Nachweis auf der Grundlage des Einsatzes von Fluoreszenzmarken eine neuerliche Optimierung der Reaktionsbedingungen für die die Primer enthaltenden PCR-Lösung mit Fluoreszenzmarkern. Diese erneute Optimierung wird meist deswegen notwendig, weil der Zusatz von Fluoreszenzmarken die Schmelzpunkte der Polynucleotidsequenzen und damit die Primerbindung beeinflusst. Kann die Primerbindung bzw. Primerspezifität vorab in einer PCR-Anordnung bestimmt werden, in welcher zu einem späteren Zeitpunkt auch die spektroskopischen Real-Time-Nachweise von Polynucleotidsequenzen mit Giga-Hertz oder Tera-Hertz Strahlung durchgeführt werden, entfallen folglich aufwändige Optimierungsanstrengungen.
Weiterhin sei auch darauf hingewiesen, dass die in Floureszenzmessungen im UV-Regime eingesetzten Reaktionsgefäße aufgrund von Verschmutzungen, wie beispielsweise Fingerabdrücken, leicht Anlass zu Fehlmessungen sein können und daraus mitunter falsche Absorptionswerte resultieren können. Elektromagnetische Strahlung im Giga-Hertz oder Tera-Hertz Regime ist aufgrund der größeren Wellenlänge weitaus unempfindlicher gegenüber derartiger Verunreinigungen der Reaktionsgefäße sowie auch der Pufferlösungsbestandteile. Zudem entfällt entsprechend der vorliegenden Verfahrens die Verwendung von verdorbenen oder ungenau angesetzten Fluoreszenzfarbstoffen als mögliche Fehlerquelle für den spektroskopischen Nachweis.
Weitere Ausführungsformen der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen.
Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen beschrieben, die anhand der Abbildungen näher erläutert werden.
Hierbei zeigen:
1 ein Flussdiagramm zur Veranschaulichung der zeitlichen Abfolge einzelner Schritte in einem Verfahren zum spektroskopischen Real-Time-Nachweis von Polynucleotidsequenzen in einer PCR-Amplifikation gemäß einer ersten Ausführungsform der Erfindung;
2 eine schematische Darstellung des Extinktionsverhaltens einer PCR-Lösung im Verlauf einer PCR-Amplifikation bei Strahlungsfrequenzen, welche mit Anregungszuständen vorbestimmter Polynucleotidsequenzen in einer PCR-Lösung übereinstimmen;
3 eine Teilansicht einer schematischen Darstellung einer zweiten Ausführungsform der erfindungsgemäßen PCR-Anordnung;
4 eine Teilansicht einer dritten Ausführungsform einer erfindungsgemäßen PCR-Anordnung;
5 eine Teilansicht einer vierten Ausführungsform einer erfindungsgemäßen PCR-Anordnung;
6 eine Teilansicht einer fünften Ausführungsform einer erfindungsgemäßen PCR-Anordnung;
7 eine sechsten Ausführungsform einer erfindungsgemäßen PCR-Anordnung, welche auf der in 5 gezeigten Teilansicht der vierten Ausführungsform beruht;
8 eine schematische Darstellung des Extinktionsverhaltens einer zur Herstellung einer PCR-Lösung verwendeten Pufferlösung sowie einer Polynucleotidsequenz im Frequenzregime der Giga-Hertz- und/oder Tera-Hertz-Regime.
1 zeigt ein schematisches Flussdiagramm des typischen Ablaufes einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zum spektroskopischen Real-Time-Nachweis von Polynucleotidsequenzen 10 in einer PCR-Amplifikation. In einem solchen Verfahren bedarf es zunächst der Bereitstellung einer Pufferlösung 13 in welcher die für die Herstellung einer PCR-Lösung notwendigen Ausgangssubstanzen aufgenommen oder gelöst werden. Notwendige Ausgangssubstanzen 12 sind die zu replizierende Polynucleotidsequenz 10, geeignete Primer, eine Polymerase sowie Desoxynukleosidtriphosphate zur Synthetisierung von Polynucleotidsequenzen. Bereits vor der Herstellung der PCR-Lösung 11 kann die Qualität, Spezifität und das Bildungsverhalten einzelner Ausgangssubstanzen 12 in einem spektroskopischen Real-Time-Nachweis bestimmt werden. Dieser Nachweis findet zu einem in der 1 mit 1 dargestellten Zeitpunkt statt. Nach Herstellung der PCR-Lösung 11 können erneut weitere spektroskopische Real-Time-Nachweise der PCR-Lösung 11 vorgenommen werden (Zeitpunkt 2). Erst dann findet durch die Wiederholung der PCR-Reaktionsschritte der Denaturierung, Primerhybridisierung, und Elongation eine Vervielfältigung der zu replizierenden Polynucleotidsequenzen statt, wobei nach jedem erfolgten PCR-Reaktionsschritt spektroskopische Real-Time-Nachweise durchgeführt werden können (Zeitpunkte 3, 4 und 5). Hierbei werden bevorzugt Anregungszustände der einsträngigen Polynucleotidsequenzen nach dem PCR-Reaktionsschritt der Denaturierung gemessen (Zeitpunkt 3), wobei Anregungszustände von doppelsträngigen Polynucleotidsequenzen in geeigneter Weise nach dem PCR-Reaktionsschritt der Elongation (Zeitpunkt 5) gemessen werden. Mittels des ausführungsgemäßen Verfahrens können somit spektroskopische Real-Time-Nachweise während der gesamten Abfolge der PCR-Amplifikation ausgeführt werden, und der zeitliche Verlauf der in der PCR-Amplifikation auftretenden Polynucleotidsequenzen auch quantitativ charakterisiert werden. Ferner ist es natürlich auch möglich, noch nach Ablauf der PCR-Amplifikation spektroskopische Nachweismessung durchzuführen.
Sollte gemäß einem erfindungsgemäßen Aspekt des vorliegenden Verfahrens der PCR-Reaktionsschritt der Denaturierung durch Einstrahlung von elektromagnetischer Strahlung im Tera-Hertz-Regime bewirkt werden, so würde dieses Verfahren eine Einstrahlung von entsprechender elektromagnetischer Strahlung zum Zeitpunkt des Ablaufes der Denaturierung erfolgen.
2 zeigt eine schematische Darstellung des Extinktionsverlaufes in einer PCR-Lösung, welcher nach einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung mit elektromagnetischer Strahlung im Giga-Hertz- oder Tera-Hertz-Regime spektroskopisch bestimmt wer den kann. Die Frequenz der eingestrahlten elektromagnetischen Strahlung ist dabei so gewählt, dass diese mit der Frequenz von vorbestimmten Anregungszuständen einzelner Polynucleotidsequenzen übereinstimmt und nach entsprechender Einstrahlung in die PCR-Lösung von diesen abgeschwächt wird. Da in einer PCR-Amplifikation typischerweise die Anzahl an zu replizierenden Polynucleotidsequenzen zeitlich exponentiell zunehmend ist, liegen die Messpunkte spektroskopischer Real-Time-Nachweise zur Extinktion auf einer Kurve mit exponentiellem Verlauf. Vorliegend sind die einzelnen Nachweise der Extinktion der PCR-Lösung durch Kreuze veranschaulicht. Der Zeitverlauf bestimmt sich dabei nach physikalischen wie nach chemischen Größen, welche die Effizienz bzw. Geschwindigkeit der PCR-Amplifikation beeinflussen können. Aus den Extinktionsmessungen kann nachfolgend mittels rechnerischer Methode die Menge an spezifischen Polynucleotidsequenzen bestimmt werden.
In der praktischen Durchführung von spektroskopischen Real-Time-Nachweisen von Polynucleotidsequenzen während der PCR-Amplifikation findet man, dass nur solche Nachweise oberhalb einer vorbestimmten Detektionsschwelle D₁ eindeutige Nachweisergebnisse liefern, welche auch zur weiteren Auswertung verwendet werden können. Nachweiswerte unterhalb dieser Detektionsschwelle D₁ sind lediglich theoretischer Natur, da das Signal-zu-Rauschverhältnisse keine eindeutige Extinktionsbestimmungen erlauben. Der früheste Zeitpunkt T₁ für einen eindeutigen spektroskopischen Real-Time-Nachweis tritt folglich dann auf, wenn die gemessene Extinktion über der Detektionsschwelle D₁ liegt. Durch eine entsprechende Frequenzwahl der eingestrahlten elektromagnetischen Strahlung kann erreicht werden, dass eine Detektionsschwelle D₂ möglichst gering ist und unter der der Detektionsschwelle D₁ für elektromagnetische Strahlung anderer Frequenzen liegt. Folglich müssen weniger PCR-Reaktionsschritte durchlaufen werden als in herkömmlichen Real-Time-quantitative PCR-Verfahren. Ferner ist auch der früheste Zeitpunkt T₂ möglichst gering, insbesondere kürzer als T₁ für elektromagnetische Strahlung der anderen Frequenzen.
3 zeigt eine Teilansicht einer schematischen Darstellung einer Ausführungsform einer erfindungsgemäßen PCR-Anordnung zum spektroskopischen Real-Time-Nachweis von Polynucleotidsequenzen in einer PCR-Amplifikation. Gemäß dieser Ausführungsform emittiert eine Strahlungsquelle 20 elektromagnetische Strahlung im Giga-Hertz- und/oder Tera-Hertz-Regime in eine PCR-Lösung 11. Die PCR-Lösung 11 befindet sich in dem Aufnahmebereich 23 eines Substrats 24, welches durch seine Formung die Schichtdicke S der PCR-Lösung definiert, durch welche die elektromagnetische Strahlung 21 hindurch strahlt. Ein derartiger Aufnahmebereich 23 ist vorliegend durch ein wenigstens teilweise begrenztes Volumen, wie einem Behälter ausgebildet. Die Frequenz der Strahlung ist dabei derart eingestellt, dass sie mit der Frequenz vorbestimmter Anregungszustände sich in der PCR-Lösung 11 befindender Polynucleotidsequenzen 10 übereinstimmt. Nach Transmission der eingestrahlten elektromagnetischen Strahlung 21 durch den Querschnitt des Aufnahmebereichs 23 wird die entsprechend geschwächte Intensität der elektromagnetischen Strahlung 21 von einem Detektor 22 nachgewiesen.
Vorliegend wurde verzichtet, die im optischen Aufbau typischen weiteren optischen Elemente wie Fokussierelemente, Kollimationselemente, Strahlführungselemente und Filter anzugeben. Das zusätzliche Vorsehen solcher herkömmlicher optischer Elemente zur Strahlkonditionierung stellen sich für einen Fachmann als offensichtlich dar.
4 zeigt eine weitere Teilansicht einer Ausführungsform einer PCR-Anordnung zum spektroskopischen Real-Time-Nachweis von Polynucleotidsequenzen in einer PCR-Amplifikation. Im Gegensatz zum Aufnahmebereich 23 der ersten Ausführungsform gemäß 3, sieht die zweite Ausführungsform gemäß 4 keinen doppelwandigen Aufnahmebereich 23 vor, sondern lediglich einen einwandigen, an welchen die PCR-Lösung 11 aufgenommen ist. Hierbei kann es sich beispielsweise um einen Filmauftrag einer PCR-Lösung auf den Aufnahmebereich 23 des Substrats handeln. Weiterhin kann auch die Anordnung der PCR-Lösung 11 auf dem Aufnahmebereich 23 des Substrats 24 im Feld der Erdanziehung so orientiert sein, dass während des spektroskopischen Real-Time-Nachweises eine gleichbleibende Schichtdicke S gewährleistet werden kann. Zudem kann der Aufnahmebereich 23 des Substrats 24 noch konstruktive Anordnungen enthalten, welche die Adhäsion zwischen PCR-Lösung 11 und dem Aufnahmebereich 23 des Substrats 24 erhöhen. Solche Anordnungen sind beispielsweise feine Oberflächenstrukturen, welche ein Festhaften der PCR-Lösung 11 auf dem Substrat 24 unterstützen.
5 zeigt eine Teilansicht einer vierten Ausführungsform der erfindungsgemäßen PCR-Anordnung zum spektroskopischen Real-Time-Nachweis von Polynucleotidsequenzen in einer PCR-Amplifikation. Bei dieser ist die Richtung der aus der Strahlungsquelle 20 emittierten elektromagnetischen Strahlung 21 und die Richtung der von dem Detektor 22 nachgewiesenen Strahlung nicht in Verlängerung zueinander angeordnet. Vielmehr wird die elektromagnetische Strahlung 21 von der PCR-Lösung 11 und/oder dem Substrat des Aufnahmebereichs 23 derart umgelenkt, dass kein geradliniger Strahlengang erfolgt. Ein derartiger Strahlengang ist etwa bei Streuungsmessungen vorteilhaft. Eine derartige relati ve Anordnung von Strahlungsquelle 20 und Detektor 22 kann zudem zu einer verbesserten räumlichen Anordnung verschiedener Komponenten beitragen, welche zur Verringerung der Gesamtgröße der ausführungsgemäßen PCR-Anordnung beiträgt.
Im Vergleich zu den Ausführungsformen des freien Strahlenganges der elektromagnetischen Strahlung 21 in den Darstellungen gemäß 3 bis 5 wird in der Teilansicht der Ausführungsform gemäß 6 die elektromagnetische Strahlung 21 in einem für den Frequenzbereich der Strahlung geeigneten Wellenleiter W geführt. Hierbei kann die elektromagnetische Strahlung 21 direkt an der Strahlungsquelle 20 in den Wellenleiter W eingekoppelt werden oder jedoch erst nach geeigneter Konditionierung. Entsprechend kann der Wellenleiter W mit dem Detektor 22 direkt in Verbindung stehen oder die Strahlung erst für den Nachweis mittels des Detektors 22 konditioniert werden. Der Wellenleiter W ist dazu ausgebildet, in dem Aufnahmebereich 23 elektromagnetische Strahlung 21 als evaneszentes Strahlungsfeld abzugeben, welches folglich durch die Wechselwirkung mit einer auf dem Wellenleiter W äußerlich aufgebrachten PCR-Lösung eine Extinktion der elektromagnetischen Strahlung 21 hervorrufen kann. Die Ausführungsformen des Wellenreiters W können isolierte Wellenleiterstrukturen umfassen, oder jedoch auch in weitere Aufnahmevorrichtungen integrierte Wellenleiterabschnitte. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Wellenleiter W in einer Chipkonstruktion integriert.
7 zeigt eine auf der Teilansicht der vierten Ausführungsform in 5 beruhenden Ausführungsform einer PCR-Anordnung zum spektroskopischen Real-Time-Nachweis von Polynucleotidsequenzen in einer PCR-Amplifikation, welche als weiteres Element die Temperaturänderungsmittel 25 darstellt, die mit dem Substrat 24 des Aufnahmebereichs 23 wechselwirkt. Die Temperaturänderungsmittel 25 sind dafür ausgebildet, das Substrat 24 auf der Seite zu heizen und/oder zu kühlen, welche der Seite des Aufnahmebereiches 23 zur Aufnahme der PCR-Lösung 11 gegenüberliegt. Durch die Veränderung der Temperatur des Substrats 24 erfolgt durch entsprechende Wärmeleitung eine Temperaturänderung der PCR-Lösung 11. Ist der Wärmewiderstand des Substrates 24 gering, sowie die Wärme- und/oder Kühlleistung der Temperaturänderungsmittel 25 im Vergleich zur Wärmekapazität der aufgetragenen PCR-Lösung 11 groß, erfolgt eine relativ schnelle Temperaturänderung der PCR-Lösung 11, und eine rasche Abfolge der sich wiederholenden PCR-Reaktionsschritte kann gewährleistet werden. Zur verbesserten Wärmeleitung kann zwischen den Temperaturänderungsmitteln 25 sowie dem Substrat 24 Mittel vorgesehen sein, die eine Wärmeleitung unterstützen. In einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen PCR-Anordnung können die Temperaturänderungsmittel 25 einen Luft strom heizen und/oder kühlen, welcher direkt auf das Substrat 24 geleitet wird, und nach entsprechender Wärmeleitung durch das Substrat 24 die Temperatur der PCR-Lösung 11 entsprechend ändert.
8 zeigt das Extinktionsverhalten 13' der zur Herstellung der PCR-Lösung 11 notwendigen Pufferlösung 13 sowie das Extinktionsverhalten 10' vorbestimmter Anregungszustände der nachzuweisenden Polynucleotidsequenz 10 in einem Frequenzbereich des Giga-Hertz- bzw. Tera-Hertz-Regimes. Aufgrund ihres Brechungsverhaltens variiert die Extinktion der Pufferlösung 13 über einen vorbestimmten Frequenzbereich nachweisbar. Viele laborübliche Pufferlösungen 13 weisen ein derartiges Extinktionsverhalten auf. Für den möglichst rauscharmen Nachweis eines Anregungszustandes einer Polynucleotidsequenz 10 kann es erforderlich sein, eine Pufferlösung 13 zu wählen, welche in dem Frequenzbereich des bezeichneten Anregungszustandes der Polynucleotidsequenz 10 ein Minimum ihres Extinktionsverhaltens aufweist. Dementsprechend ist die Extinktion der in die PCR-Lösung 11 eingestrahlten elektromagnetischen Strahlung 21 durch die Pufferlösung 13 im Vergleich zur Extinktion durch die Polynucleotidsequenzen 10 in der PCR-Lösung 11 gering, und der Extinktionsnachweis des Anregungszustandes der Polynucleotidsequenz 10 erfolgt mit nur geringer Störung durch die Pufferlösung 13. Durch entsprechende Wahl oder Einstellung der Pufferlösung 13 auf die nachzuweisende Polynucleotidsequenz 10 und deren Anregungsfrequenz kann ein vorteilhaftes Signal zu Rauschverhältnis erreicht werden.
An dieser Stelle sei darauf hingewiesen, dass alle oben beschriebenen Teile für sich allein gesehen und in jeder Kombination, insbesondere den in Zeichnungen dargestellten Details als erfindungswesentlich beansprucht werden. Änderungen hiervon sind dem Fachmann geläufig.

10: Polynucleotidsequenz
10': Extinktion des Anregungszustandes einer Polynucleotidsequenz
11: PCR-Lösung
12: Ausgangssubstanz
13: Pufferlösung
13': Extinktion der Pufferlösung
14: Marker
20: Strahlungsquelle
21: Elektromagnetische Strahlung
22: Detektor
23: Aufnahmebereich
24: Substrat
25: Temperaturänderungsmittel
26: Wärmemedium
S: Schichtdicke
W: Wellenleiter
D₁: Detektionsschwelle
D₂: Detektionsschwelle
T: Frühester Zeitpunkt für die Detektion

Claims

Ein Verfahren zum spektroskopischen real-time Nachweis von Nukleinsäuremolekülen, in einer PCR-Amplifikation, wobei die PCR-Amplifikation das Bereitstellen der für die Herstellung einer PCR-Lösung (11) notwendigen Ausgangssubstanzen (12) in einer Pufferlösung (13) sowie die sich wiederholenden PCR-Reaktionsschritte der Denaturierung, der Primerhybridisierung und der Elongation umfasst, und wobei während der PCR-Amplifikation zu definierten Zeitpunkten aus einer Strahlungsquelle (20) elektromagnetische Strahlung (21) im Giga-Hertz- oder Tera-Hertz-Regime in die PCR-Lösung (11) eingestrahlt wird, um mittels eines Detektors (22) in einem real-time Nachweis wenigstens die Anwesenheit oder Abwesenheit einer Polynucleotidsequenz (10) nachzuweisen.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Nucleinsäuremolekülen um Polynucleotidsequenzen handelt.
Ein Verfahren zum spektroskopischen real-time Nachweis von Nukleinsäuremolekülen in einer PCR-Amplifikation nach Anspruch 1 oder 2 dadurch gekennzeichnet, dass dass die für die Herstellung der PCR-Lösung (11) notwendigen Ausgangssubstanzen (12) in einer Pufferlösung (13) keine chemischen oder physikalischen Nachweismarker (14), insbesondere keine Fluoreszenzmarker, umfassen.
Ein Verfahren zum spektroskopischen real-time Nachweis von Nukleinsäuremolekülen in einer PCR-Amplifikation nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass dass die Intensität der eingestrahlten elektromagnetischen Strahlung (21) im Giga-Hertz- oder Tera-Hertz-Regime so ausgewählt wird, dass sie eine vorbestimmte Schichtdicke (S) der PCR-Lösung (11) durchdringt.
Ein Verfahren zum spektroskopischen real-time Nachweis von Nukleinsäuremolekülen in einer PCR-Amplifikation nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass dass die Frequenz der eingestrahlten elektromagnetischen Strahlung (21) im Giga-Hertz- oder Tera-Hertz-Regime zwischen 100 GHz und 20 THz, insbesondere zwischen 300 GHz und 10 THz liegt.
Ein Verfahren zum spektroskopischen real-time Nachweis von Nukleinsäuremolekülen in einer PCR-Amplifikation nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass dass die Pufferlösung (13) der PCR-Lösung (11) in Bezug auf eine Frequenz der eingestrahlten elektromagnetischen Strahlung (21) im Giga-Hertz- oder Tera-Hertz-Regime so ausgewählt wird, dass die Strahlungsintensität nach Transmission einer vorbestimmten Schichtdicke (S) der PCR-Lösung mit dem Detektor (22) weitgehend ungeschwächt nachgewiesen werden kann.
Ein Verfahren zum spektroskopischen real-time Nachweis von Nukleinsäuremolekülen in einer PCR-Amplifikation nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass dass die PCR-Lösung (11) auf einem Substrat (24), insbesondere in einem vorbestimmten Aufnahmebereich (23) des Substrats (24) aufgebracht ist, welches für die eingestrahlte elektromagnetische Strahlung (21) im Giga-Hertz- oder Tera-Hertz-Regime weitgehend transparent ist.
Ein Verfahren zum spektroskopischen real-time Nachweis von Nukleinsäuremolekülen in einer PCR-Amplifikation nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass dass das Substrat (24) wenigstens einen Wellenleiter (W) für elektromagnetische Strahlung im Giga-Hertz- oder Tera-Hertz-Regime umfasst.
Ein Verfahren zum spektroskopischen real-time Nachweis von Nukleinsäuremolekülen in einer PCR-Amplifikation nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ferner Temperaturänderungsmittel (24) bereit gestellt werden, mittels derer die PCR-Lösung (11) auf vorgegebene Temperaturen geheizt und/oder gekühlt werden kann.
Ein Verfahren zum spektroskopischen real-time Nachweis von Nukleinsäuremolekülen in einer PCR-Amplifikation nach einem der Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Temperaturänderungsmittel (24) ein Wärmemedium (26) heizen und/oder kühlen, welches über das Substrat die PCR-Lösung (11) direkt oder indirekt heizt und/oder kühlt.
Ein Verfahren zum spektroskopischen real-time Nachweis von Nukleinsäuremolekülen in einer PCR-Amplifikation nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die elektromagnetische Strahlung (21) im Giga-Hertz- oder Tera-Hertz-Regime aus der Strahlungsquelle (20) in die PCR-Lösung (11) vor und/oder nach einem Schritt der Denaturierung, und/oder der Primerhybridisierung und/oder der Elongation eingestrahlt wird.
Ein Verfahren zum spektroskopischen real-time Nachweis von Nukleinsäuremolekülen in einer PCR-Amplifikation nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Frequenz der elektromagnetischen Strahlung ausgewählt wird, um definierte vibratorische Anregungsmoden von einzel- und/oder doppelsträngigen Polynucleotidsequenzen (10) zu erregen, um diese, insbesondere die für das Vorliegen von Hybridisierungszuständen von doppelsträngigen Polynucleotidsequenzen (10) charakteristischen Moden, nachzuweisen.
Ein Verfahren zum spektroskopischen real-time Nachweis von Nukleinsäuremolekülen in einer PCR-Amplifikation nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass dass während der PCR-Amplifikation zeitlich vorausgehende Nachweise mittels der elektromagnetischen Strahlung (21) im Giga-Hertz- oder Tera-Hertz-Regime als Untergrund für zeitlich nachfolgende Nachweise in einer Analyse der Nachweise berücksichtigt werden.
Ein Verfahren zum spektroskopischen real-time Nachweis von Nukleinsäuremolekülen in einer PCR-Amplifikation nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass dass elektromagnetische Strahlung (21) im Giga-Hertz- oder Tera-Hertz-Regime aus der Strahlungsquelle (20) vor Durchführen einer PCR-Amplifikation in eine Lösung von in der PCR-Amplifikation zu verwendenden Ausgangssubstanzen (12) eingestrahlt wird, um chemische oder physikalische Eigenschaften einzelner Ausgangssubstanzen (12), insbesondere deren Qualität, Spezifität und deren Bindungsverhalten, mittels spektroskopischen Nachweises zu bestimmen.
Eine PCR-Anordnung zum spektroskopischen real-time Nachweis von Polynucleotidsequenzen in einer PCR-Amplifikation, wobei diese – Ein Substrat (24) mit einem Aufnahmebereich (23) für eine PCR-Lösung (11), bestehend aus den notwendigen Ausgangssubstanzen (12) und einer Pufferlösung (13), – Temperaturänderungsmittel (24), mittels derer die PCR-Lösung (11) auf vorgegebene Temperaturen geheizt und/oder gekühlt werden kann, um die sich wiederholenden PCR-Reaktionsschritte der Denaturierung, der Primerhybridisierung oder der Elongation zu ermöglichen, – eine Strahlungsquelle (20), um elektromagnetische Strahlung (13) im Giga-Hertz- oder Tera-Hertz-Regime in die PCR-Lösung (11) einzustrahlen, – und einen Detektor (22), um durch die PCR-Lösung (11) transmittierte Strahlung spektroskopisch nachzuweisen, umfasst.
Ein Verfahren zum spektroskopischen real-time Nachweis von Nukleinsäuremolekülen in einer PCR-Amplifikation, wobei die PCR-Amplifikation das Bereitstellen der für die Herstellung einer PCR-Lösung (11) notwendigen Ausgangssubstanzen (12) in einer Pufferlösung (13) sowie die sich wiederholenden PCR-Reaktionsschritte der Denaturierung, der Primerhybridisierung und der Elongation umfasst, und wobei während der PCR-Amplifikation zu definierten Zeitpunkten aus einer Strahlungsquelle (20) elektromagnetische Strahlung (21) im Giga-Hertz- oder Tera-Hertz-Regime in die PCR-Lösung (11) eingestrahlt wird, um mittels eines Detektors (22) in einem spektroskopischen real-time Nachweis wenigstens die Anwesenheit oder Abwesenheit einer Polynucleotidsequenz (10) nachzuweisen, und wobei der Reaktionsschritt der Denaturierung durch Tera-Hertz-Strahlung aus der Strahlungsquelle (20) bewirkt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei es sich bei den Nucleinsäuremolekülen um Polynucleotidsequenzen handelt.