-
Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zum Auswerten von mindestens eindimensional
ortsaufgelösten Fluoreszenzmessdaten einer Probe sowie
eine Steuereinheit für ein Laser-Scanning-Mikroskop.
-
Zur
Untersuchung von veränderlichen Stoffkonzentrationen im
mikroskopischen Größenbereich, hervorgerufen durch
Diffusions- und andere Transportprozesse in einer Probe, kann die
sogenannte Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (engl. „fluorescence
correlation spectroscopy”; FCS) verwendet werden. Damit
können physikalische und biologische Transportprozesse
in einem einzelnen beziehungsweise durch ein einzelnes Volumen mit
einem Durchmesser von etwa 200 nm beobachtet werden. Eine räumliche
Auflösung von mikroskopischen Transportvorgängen
wird durch die abtastende Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (engl. „scanning
FCS”; S-FCS), auch als Bildkorrelationsspektroskopie (engl. „image
correlation spectroscopy”; ICS) bezeichnet, erreicht. Hierbei
können zeitliche Größenordnungen von
Sekunden bis Minuten verfolgt werden.
-
Die
zwei- oder dreidimensional ortsaufgelöste Verfolgung innerhalb
einer Zelle oder zwischen durch Membranen getrennten Zellen im Zeitbereich zwischen
Mikro- und Millisekunden wird durch die Rasterbildkorrelationsspektroskopie
(engl. „raster image correlation spectroscopy”;
RICS) ermöglicht (Digman et al.: „Measuring
Fast Dynamics in Solutions and Cells with a Laser Scanning Microscope" in „Biophysical
Journal", Vol. 89, August 2005, 1317–1327).
Hier wird die Probe in zwei oder drei Dimensionen rasterförmig
optisch abgetastet (engl. „scanning”). Typischerweise
werden Zeitreihen (engl. „time series”) aufgenommen.
Für die abtastende Korrelationsspektroskopie wird zweckmäßigerweise
ein Laser-Scanning-Mikroskop (LSM) eingesetzt. Während
der optischen Abtastbewegung einer RICS-Messung werden mit typischerweise
konstanter Abtastwertaufnahmefrequenz („Sampling-Frequenz”)
digitale Abtastwerte (engl. „sampling values”, „samples”)
längs einer ersten Abtastrichtung („Scan-Zeile”)
elektronisch aufgenommen und zu Pixelwerten weiterverarbeitet. Jeder
Pixelwert wird dabei aus einem oder mehreren Abtastwerten ermittelt. Die
Abtastung längs der ersten Abtastrichtung wird nach Versetzung
des Abtaststrahls längs einer zweiten Abtastrichtung („Scan-Spalte”)
wiederholt durchgeführt, so dass eine Folge von Pixelzeilen
aufgenommen wird.
-
Um
Aussagen über die Transportvorgänge in der Probe
machen zu können, werden korrelationsspektroskopische Messverfahren
typischerweise ausgewertet, indem Korrelationen der Fluoreszenzmessdaten,
beispielsweise Auto- oder Kreuzkorrelationen, ermittelt und mathematische
Transportmodelle an diese Korrelationen angepasst werden, beispielsweise
mittels Ausgleichsrechnungen. So können aus den angepassten
Modellen Probeneigenschaften, beispielsweise Diffusionskonstanten,
bestimmt werden. Die Transportmodelle liegen in Form mathematischer
Funktionen vor, deren Parameter angepasst werden. Solche Korrelationsanalysen werden
bei RICS-Messungen in der Regel für mehrere, typischerweise überlappende
Regionen des Abtastfelds (engl. „scan field”)
separat durchgeführt. Die Bestimmung der Modellparameter
in den einzelnen Regionen, also die Bestimmung der räumlichen
Verteilung der Modellparameter in der Probe, wird als Kartierung
bezeichnet. Die Ergebnisse der Korrelationsanalysen können
für die einzelnen Regionen bildlich dargestellt werden,
beispielsweise mittels Falschfarben.
-
Problematisch
ist, dass in einer oder mehreren Probenregionen Bereiche enthalten
sein können, die nur wenig oder gar keine Information enthalten und
dadurch die Ergebnisse der Auswertung verfälschen. Beispielsweise
kann es sich um dunkle, nahezu fluoreszenzfreie Bereiche handeln,
in denen allenfalls Rauschen detektiert wird. In Bereichen mit niedriger
Fluoreszenzstärke ist es hingegen möglich, dass
eine Korrelation der Messdaten der betreffenden Probenregion mangels
ausreichender Statistik nicht ausgewertet werden kann. Werden in
solchen Probenregionen trotz des geringen Informationsgehalts Probeneigenschaften
bestimmt, beispielsweise eine Diffusionskonstante, so ergibt die
Anpassung der Parameter einer Modellfunktion im Rahmen einer Ausgleichsrechnung
trotz guter Qualität der Anpassung unsinnige Werte für
die gesuchten Probeneigenschaften. Im Fall einer Diffusionskonstante
ergeben sich beispielsweise Werte, die um mehrere Größenordnungen
zu hoch sind.
-
Im
Stand der Technik ist es bekannt, fehlerhafte Fluoreszenzkorrelationsanalysen
zu filtern, indem die Ergebnisse der Ausgleichsrechnungen, also die
angepassten Modellfunktionsparameter, mit sinnvollen Wertebereichen
verglichen werden. Liegen die Ergebnisse außerhalb dieser
Wertebereiche, werden sie verworfen, also nicht zur Bestimmung der
gesuchten Probeneigenschaften verwendet. Neben der Begrenzung auf
Wertebereiche ist es auch bekannt, die Ausgleichsrechnungsergebnisse
zu verwerfen, wenn die Mittelwertabweichungen der Modellfunktionsparameter
einen vorgegebenen Schwellwert überschreiten oder wenn
das Verhältnis der Standardabweichungen der Modellfunktionsparameter
zu deren Bestwerten einen vorgegebenen Schwellwert überschreitet.
Alle genannten Vorgehensweisen haben den Nachteil, dass die sinnvollen
Wertebereiche beziehungsweise die Schwellwerte als sogenanntes a-priori-Wissen
in zeitaufwendigen Versuchsreihen ermittelt werden müssen.
Durch die starre Begrenzung auf einen bestimmten Wertebereich beziehungsweise
auf Schwellwerte wird die Genauigkeit der Auswertung verringert,
denn statistisch korrekte Korrelationen, die jedoch Modellparameterwerte
außerhalb der Grenzen ergeben, werden zu unrecht verworfen.
Zudem müssen vor der Prüfung auf sinnvolle Ergebnisse
erst eine oder, bei der Kartierung mehrerer Probenregionen, sogar
mehrere rechen- und zeitaufwendige Ausgleichsrechnungen durchgeführt
werden.
-
Der
Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und eine
Steuereinheit der eingangs genannten Arten anzugeben, mit deren
Hilfe Probeneigenschaften aus Fluoreszenzkorrelationen einfacher,
schneller und genauer ermittelt werden können.
-
Die
Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren, welches die in
Anspruch 1 angegebenen Merkmale aufweist, sowie durch eine Steuereinheit,
welche die in Anspruch 16 angegebenen Merkmale aufweist.
-
Vorteilhafte
Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen
angegeben.
-
Erfindungsgemäß wird
für eine oder mehrere Regionen der Probe ein Eignungsgrad
für eine Korrelationsauswertung ermittelt. Als Eignungsgrad
wird im Sinne der Erfindung jede Größe angesehen,
die quantitativ den Informationsgehalt der betreffenden Region oder
den bei einer Korrelationsauswertung zu erwartenden Fehler beschreibt
und dadurch in einem Vergleich als Kriterium zur Filterung und/oder
Auswahl der betreffenden Region vor einer Korrelationsauswertung
verwendet werden kann. Insbesondere kann es sich um einen skalaren
Wert, einen mehrkomponentigen Vektor oder einen Tensor höherer Ordnung
handeln. Mit anderen Worten wird erfindungsgemäß für
die betreffende Region ein charakteristischer Wert ermittelt, der
die Eignung für eine Korrelationsauswertung quantitativ
angibt. Als Korrelationsauswertung oder Korrelationsanalyse wird
im Sinne der Erfindung die quantitative Prüfung von aus diskreten
Punkten bestehenden Daten auf Ähnlichkeit unter Berücksichtigung
von Translationen zwischen den Datenpunkten angesehen.
-
Die
Erfindung ermöglicht eine feinere Filterung, ohne dass
eine rechen- und zeitaufwendige Ausgleichsrechnung notwendig ist.
Durch die feinere Filterung kann eine höhere Genauigkeit
bei der Ermittlung der Probeneigenschaften erreicht werden. Anhand
des ermittelten Eignungsgrads kann sodann entschieden werden, ob überhaupt
eine Ausgleichsrechnung durchgeführt wird. Insbesondere
können auf diese Weise einzelne von mehreren Regionen für eine
Ausgleichsrechnung ausgewählt und andere verworfen werden.
Alternativ können Ausgleichsrechnungen für alle
Regionen bedingungslos durchgeführt und als Qualitätsmerkmal
der betreffende Eignungsgrad für die Korrelationsanalyse
neben den angepassten Modellfunktionsparametern gespeichert werden.
Dadurch ist später ohne nachträgliche Ausgleichsrechnung
eine Filterung nach dem Eignungsgrad möglich. In jedem
Fall ist die Filterung vorteilhafterweise nicht an die werthafte
Ausprägung eines oder mehrerer bestimmter Modellparameter
gebunden. Es wird also insbesondere möglich, für
die Auswertung relevante Probenregionen von nicht relevanten Probenregionen
schon vor der rechenaufwendigen Ausgleichsrechnung zu unterscheiden,
indem vorteilhafterweise der Eignungsgrad ermittelt wird, bevor
eine Ausgleichsrechnung zum Anpassen einer Modellfunktion an die
Korrelation durchgeführt wird. Dies ist mit den bekannten
Verfahren nicht möglich, insbesondere nicht in Probenregionen,
die ausschließlich Rauschen enthalten.
-
Vorteilhafterweise
wird der Eignungsgrad bestimmt, indem eine mindestens eindimensionale
Korrelation mit mehreren Korrelationsdatenpunkten anhand von Messdaten
aus der betreffenden Region ermittelt wird und Korrelationsdatenpunkte,
die statistisch signifikant von einer Vergleichsmenge innerhalb der
Korrelation abweichen, gezählt werden. Die Erfindung kann
dabei sowohl auf räumliche als auch auf zeitliche Korrelationen
angewandt werden. Die so ermittelte Anzahl wird zweckmäßigerweise
ausgegeben oder gespeichert, sie kann aber auch unmittelbar weiterverarbeitet
werden, beispielsweise in einer Entscheidung über die Durchführung
einer Ausgleichsrechnung.
-
Erfindungsgemäß wird
als Eignungsgrad der Region die Anzahl der signifikant abweichenden
Korrelationsdatenpunkte in der betreffenden Korrelation verwendet.
Sie stellt eine hochgenaue Aussage über den Informationsgehalt
der betreffenden Probenregion im Hinblick auf eine Korrelationsanalyse,
beispielsweise mittels Ausgleichsrechnung, dar.
-
Vorzugsweise
wird ausschließlich eine unterbrochene oder ununterbrochene
Reihe von benachbarten Korrelationsdatenpunkten gezählt,
die am Maximum der Korrelation beginnt. Die für eine Korrelationsanalyse
informativsten Datenpunkte liegen im Bereich um das Maximum der
Korrelation. Durch Beschränkung der Zählung auf
einen am Maximum beginnenden, linearen Bereich wird das Verfahren
bei nahezu unveränderter Genauigkeit vereinfacht und beschleunigt.
Bei einer Autokorrelation liegt das Maximum am Koordinatenursprung,
bei einer Kreuzkorrelation kann es hingegen abseits des Koordinatenursprungs
liegen, so dass vor der Zählung zunächst das Korrelationsmaximum
ermittelt werden muss.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform wird als Vergleichsmenge
eine echte Untermenge der Korrelation (also ihrer Datenpunkte),
insbesondere eine echte oder eine unechte Untermenge eines Quadranten
der Korrelation, verwendet. Die echte Untermenge kann dabei eine
rechteckige, insbesondere eine quadratische Form haben. Auch dadurch kann
das Verfahren bei nahezu unveränderter Genauigkeit vereinfacht
und beschleunigt werden. Der Eckpunkt des Quadranten kann dabei
anstelle des Koordinatenursprungs auch ein Maximum der Korrelation
sein. Die Beschränkung auf maximal einen Quadranten nutzt
die mathematische Gegebenheit aus, dass insbesondere im vierten
Quadranten (bezogen auf das Korrelationsmaximum) die für
die Erkennung einer Verschiebung wesentlichen Informationen enthalten
sind.
-
Vorteilhafterweise
wird zum Ermitteln der signifikant abweichenden Korrelationsdatenpunkte
ein Wert einer statistischen Größe innerhalb der
Vergleichsmenge ermittelt und es werden diejenigen Korrelationsdatenpunkte
als signifikant abweichend ermittelt, deren Wert relativ zu dem
Wert der statistischen Größe der Vergleichsmenge über
einem vorgebbaren oder vorgegebenen Schwellwert liegt. So können
die informativen Datenpunkte einfach und schnell ermittelt werden.
-
Zweckmäßigerweise
wird als statistische Größe ein Mittelwert der
Vergleichsmenge und als Schwellwert ein Vielfaches einer Standardabweichung
des Mittelwerts verwendet. Diese Größen können
mit geringem Rechenaufwand bestimmt werden und ermöglichen
eine hochgenaue Aussage über den Informationsgehalt der
Datenpunkte.
-
In
einer anderen Ausgestaltung des Verfahrens werden zum Ermitteln
des Eignungsgrads eine mindestens eindimensionale Korrelation mit
mehreren Korrelationsdatenpunkten anhand von Messdaten aus der betreffenden
Region und ein Verhältnis von positiven zu negativen Korrelationswerten
ermittelt. Bei hinsichtlich einer Korrelationsanalyse aussagekräftigen
Korrelationen ist das Verhältnis von positiven und negativen
Korrelationswerten zugunsten der positiven Werte verschoben. Das
Verhältnis der positiven und negativen Werte bestimmt somit
eine Eignung für eine Korrelationsanalyse. Das ermittelte Verhältnis
wird zweckmäßigerweise ausgegeben oder gespeichert,
es kann aber auch unmittelbar weiterverarbeitet werden, beispielsweise
in einer Entscheidung über die Durchführung einer
Ausgleichsrechnung. Das ermittelte Verhältnis kann neben
oder zusätzlich zu der oben beschriebenen Bestimmung der
statistisch signifikant herausragenden Datenpunkte zur Ermittlung
eines Eignungsgrads der Region verwendet werden.
-
Vorzugsweise
wird das Verhältnis der positiven und negativen Werte entweder
als Quotient aus dem positiven Maximalwert der Korrelation und dem negativen
Minimalwert der Korrelation oder aus der Anzahl der positiven Korrelationswerte
und der Anzahl der negativen Korrelationswerte ermittelt. Diese Quotienten
können mit geringem Rechenaufwand ermittelt werden.
-
In
einer ersten Ausführungsform wird für mehrere
Regionen ein jeweiliger Eignungsgrad ermittelt, anhand der Eignungsgrade
mindestens eine der Regionen für eine Ausgleichsrechnung
ausgewählt und die betreffende Ausgleichsrechnung durchgeführt.
Dadurch werden unnötige, das Ergebnis nur negativ beeinflussende
Ausgleichsrechnungen vermieden.
-
In
einer alternativen zweiten Ausführungsform wird für
mehrere Regionen jeweils eine Ausgleichsrechnung durchgeführt
und zu den Ergebnissen der Ausgleichsrechnungen der jeweilige Eignungsgrad
gespeichert. Das erlaubt es, die Ergebnisse der Ausgleichsrechnungen
nachträglich zu filtern und die Genauigkeit der Modellparameter
zu bestimmen.
-
Zweckmäßigerweise
werden zunächst die Korrelationsspektroskopiemessdaten
mittels eines Laser-Scanning-Mikroskops aufgenommen.
-
Die
Erfindung umfasst auch ein Computerprogramm, das zur Durchführung
eines erfindungsgemäßen Verfahrens eingerichtet
ist, und eine Steuereinheit für ein Laser-Scanning-Mikroskop,
die programmtechnisch zur Durchführung eines erfindungsgemäßen
Verfahrens eingerichtet ist, sowie ein entsprechend ausgerüstetes
Laser-Scanning-Mikroskop.
-
Insbesondere
umfasst die Erfindung eine Steuereinheit für ein Laser-Scanning-Mikroskop,
wobei die Steuereinheit zum Auswerten von mindestens eindimensional
ortsaufgelösten Fluoreszenzmessdaten einer Probe für
eine oder mehrere Regionen der Probe einen Eignungsgrad für
eine Korrelationsauswertung ermittelt.
-
Nachfolgend
wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher
erläutert.
-
In
den Zeichnungen zeigen:
-
1 ein
Schema eines Laser-Scanning-Mikroskops,
-
2 eine
konfokale Fluoreszenzaufnahme des Randbereiches einer Zelle,
-
3 ein
Flussdiagramm eines erfindungsgemäßen Auswerteverfahrens,
-
4 eine Korrelation eines langsamen Diffusionsprozesses,
-
5 eine Korrelation eines schnellen Diffusionsprozesses,
-
6 eine angepasste zweidimensionale Modellfunktion
mit Restfehlern und
-
7 resultierende Diffusionskartierungen ohne
Filterung, mit Filterung nach dem Stand der Technik und mit der
erfindungsgemäßen Filterung.
-
1 ist
eine schematische Darstellung eines LSM, das mittels einer Steuereinheit 34 gesteuert
wird. Das LSM ist modular aus einem Beleuchtungsmodul L mit Lasern 23,
einem Abtastmodul S (engl. „scanning module”),
einem Detektionsmodul D und der Mikroskopeinheit M mit dem Mikroskopobjektiv 31 zusammengesetzt.
Das Licht der Laser 23 kann durch Lichtklappen 24 und
Abschwächer 25 von der Steuereinheit 34 beeinflusst
werden, bevor es über Lichtleitfasern und Koppeloptiken 20 in
die Abtasteinheit S eingespeist und vereinigt wird. Über
den Hauptstrahlteiler 33 und die X-Y-Abtasteinheit 30,
die zwei Galvanometerspiegel aufweist (nicht dargestellt), gelangt
es durch das Mikroskopobjektiv 21 zur Probe 22,
wo es ein Fokusvolumen (nicht abgebildet) beleuchtet. Von der Probe
reflektiertes Licht oder emittiertes Fluoreszenzlicht gelangt durch
das Mikroskopobjektiv 21 über die Abtasteinheit 30 durch
den Hauptstrahlteiler 30 in das Detektionsmodul D. Zur Fluoreszenzdetektion
kann der Hauptstrahlteiler 30 beispielsweise als dichroitischer
Farbteiler ausgebildet sein. Das Detektionsmodul D weist mehrere
Detektionskanäle mit jeweils einer Lochblende 31,
einem Filter 28 und einem Photovervielfacher 32 auf, die
durch Farbteiler 29 separiert sind. Anstelle von Lochblenden 31 können,
beispielsweise bei linienförmiger Beleuchtung, auch Schlitzblenden
(nicht abgebildet) verwendet werden. Die konfokalen Loch- oder Schlitzblenden 31 dienen
der Diskriminierung von Probenlicht, das nicht aus dem Fokusvolumen stammt.
Die Photovervielfacher 32 detektieren daher ausschließlich
Licht aus dem Fokusvolumen. Das konfokal beleuchtete und aufgenommene
Fokusvolumen der Probe 22 kann mittels der Abtasteinheit 30 über
die Probe 22 bewegt werden, um pixelweise ein Bild aufzunehmen,
indem die Galvanometerspiegel der Abtasteinheit 30 gezielt
verdreht werden. Sowohl die Bewegung der Galvanometerspiegel als
auch das Schalten der Beleuchtung mittels der Lichtklappen 24 oder
der Abschwächer 25 werden unmittelbar von der
Steuereinheit 34 gesteuert. Die Datenaufnahme von den Photovervielfachern 32 erfolgt
ebenfalls über die Peripherieschnittstelle 4.
-
2 zeigt
eine Fluoreszenzaufnahme im Randbereich einer biologischen Zelle
als Probe 22 mit einer beispielhaften Bildgröße
von 512×512 Bildpunkten (Pixel), bei der die Photovervielfacher 32 im Photonenzählmodus
betrieben wurden. Zum Zweck einer besseren Darstellung wurde das
Bild schwarz-weiß gerastert. Der Zellrand verläuft
im Bild etwa diagonal von links oben nach rechts unten. Es ist deutlich
zu erkennen, dass der linke untere Bereich des Bildes keine Informationen
enthält und dass die Fluoreszenzaktivität im rechten
oberen Bereich des Bildes nicht einheitlich verteilt ist. Für
eine beispielhafte Diffusionskartierung wird das Bild in mehrere
Regionen Bmn derselben Größe,
beispielsweise 128×128 Pixel, unterteilt, in denen jeweils
eine Diffusionskonstante durch eine Korrelationsanalyse zu bestimmen
ist. Diese Regionen können einander überlappen.
Bei einer Überlappung um die Hälfte jeweils in
horizontaler und vertikaler Richtung ergibt sich die Zahl von 49 zu
auszuwertenden Probenregionen (m = 0...6; n = 0...6).
-
In 3 ist
eine beispielhafte Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens in Form eines Flussdiagramms abgebildet. Für
jede Probenregion Bmn wird eine separate
zweidimensionale Korrelation Gmn, beispielsweise
die Autokorrelation der betreffenden Region, aus den Intensitätswerten
der Bildpunkte berechnet. Jede Korrelation besteht aus einer zweidimensionalen
Menge von i = 0...(r × s), beispielsweise 0...128 × 128,
Datenpunkten (xi, yi) mit
einem Wert Gmn(xi,
yi), der längs einer dritten Koordinate
oder durch Farbkodierung bildlich dargestellt werden kann. Alternativ
können je nach Anwendungsfall ein-, drei- oder mehrdimensionale
Korrelationen mit einer entsprechenden Menge von Datenpunkten (nicht
abgebildet) verwendet werden.
-
4 und 5 zeigen
zwei beispielhafte Korrelationen G(xi, yi) in Pseudo-3D-Darstellungen. Die Teilfiguren
zeigen jeweils zwei unterschiedliche Blickwinkel. Der Koordinatenursprung
der Korrelation G liegt jeweils im Maximum der Korrelation. Die
in 4 abgebildete Korrelation repräsentiert
einen langsamen Diffusionsprozess, was anhand des flachen Abfalls
sowohl in x- als auch in y-Richtung erkennbar ist. Die in 5 abgebildete Korrelation repräsentiert
hingegen einen schnellen Diffusionsprozess, da sie in y-Richtung
sehr steil abfällt.
-
Gemäß dem
in 3 abgebildeten Verfahren wird anschließend
für jede Region Bmn der Kartierung
eine informative Datenpunktanalyse zur Ermittlung eines Eignungsgrads
der betreffenden Region Bmn durchgeführt.
Die informative Datenpunktanalyse umfasst zunächst die
Auswahl einer statistisch repräsentativen Vergleichsmenge
V aus den Korrelationsdatenpunkten Gmn(xi, yi). Beispielsweise
wird aus dem vierten Quadranten der Korrelation ein Bereich von
80 × 80 Datenpunkten (xi, yi) als Vergleichsmenge V ausgewählt.
Zur Illustration ist in 4 eine quadratische
Vergleichsmenge V durch einen unterbrochen umrandeten Bereich angedeutet.
Es handelt sich um eine echte Untermenge des vierten Quadranten
der Korrelation G. Alternativ könnte der volle Quadrant
oder ein noch größerer Bereich als Vergleichsmenge
V verwendet werden. Zweckmäßigerweise wird aber
die Größe der Vergleichsmenge beschränkt,
beispielsweise auf 80 × 80 Datenpunkte. Bei grundsätzlicher
Verwendung eines vollen Quadranten ergibt sich so bei einer Korrelationsgröße von
128 × 128 Datenpunkten eine Vergleichsmenge V der Größe
64 × 64. Bei einer Korrelationsgröße
von 256 × 256 hingegen ergibt sich aufgrund der Beschränkung
nur eine Vergleichsmenge V der Größe 80 × 80.
In 5 ist eine alternative Form einer
Vergleichsmenge V auf dieselbe Weise wie in 4 angedeutet.
Es handelt sich um eine fortlaufende, einzelne Reihe benachbarter
Korrelationsdatenpunkte, die im Koordinatenursprung am Maximum der
Korrelation G beginnt. Alternativ könnten nur einzelne Punkte
aus einer solchen Reihe als Vergleichsmenge V verwendet werden.
-
Alternativ
zu einem einzelnen rechteckigen Bereich kann die Vergleichsmenge
aus mehreren disjunkten, regelmäßig oder unregelmäßig
geformten Abschnitten von Korrelationsdaten zusammengesetzt sein,
die zufällig oder nach einem vorgegebenen Muster ausgewählt
werden (nicht abgebildet). Beispielsweise könnte im zweidimensionalen
Fall ein regelmäßiges Schachbrettmuster oder eine
Zufallsverteilung von Einzelpunkten (xi,
yi) verwendet werden, im dreidimensionalen Fall
beispielsweise eine regelmäßiges, unterbrochenes
Würfelmuster. Die Auswahl der Vergleichsmenge kann vollautomatisch nach
einem vorgegebenen Schema erfolgen. Alternativ kann die Art, Form,
Lage und Größe der Vergleichsmenge vom Benutzer
festgelegt werden.
-
Nach
der automatischen Auswahl der Vergleichsmenge werden in einem ersten
Schritt zur Bestimmung des Eignungsgrads zwei statistische Parameter
der Vergleichsmenge ermittelt, nämlich der arithmetische
Mittelwert und die Standardabweichung der Vergleichsmenge. In einem
zusätzlichen Schritt kann optional der Wertebereich der
Korrelationsdatenpunkte auf ein Verhältnis der positiven
Datenpunkte Gmn(xi,
yi) > 0
zu den negativen Datenpunkten Gmn(xi, yi) < 0 in einem vorgegebenen
Fenster der Korrelation Gmn untersucht werden,
was unterstützend als Indiz für die Ermittlung
des Eignungsgrades verwendet werden kann. Das auf den Wertebereich untersuchte
Fenster kann beispielsweise längs der x-Achse der Korrelation
Gmn liegen. Das Verhältnis kann
beispielsweise mathematisch als Differenz oder Quotient der Anzahl
der positiven und der Anzahl der negativen Datenpunkte ermittelt
werden. Stellvertretend für die Anzahl können
die Minimal- und Maximalwerte der Korrelation verglichen werden.
Bei einer Übereinstimmung der Anzahlen beziehungsweise
einer betragsmäßigen Übereinstimmung
der Minimal- und Maximalwerte wird beispielsweise der Eignungsgrad
willkürlich auf Null festgesetzt. In der Folge kann anhand
des resultierenden Verhältnisses ein Eignungsgrad, der
ausschließlich anhand der statistischen Parameter ermittelt
wird, skaliert werden. Alternativ kann ausschließlich das
ermittelte Verhältnis als Eignungsgrad weiterverwendet
werden, beispielsweise durch entsprechende Skalierung auf eine vergleichbare
Pixelanzahl.
-
Allgemein
kann als Eignungsgrad der untersuchten Region Bmn die
Anzahl derjenigen Datenpunkte (xi, yi) verwendet werden, deren Wert Gmn(xi, yi)
von der Vergleichsmenge signifikant abweicht. Diese Datenpunkte
(xi, yi) können
anhand der statistischen Parameter der Vergleichsmenge ermittelt werden,
beispielsweise durch Vergleichen des Korrelationswerts Gmn(xi, yi)
mit dem Mittelwert der Vergleichsmenge. Es wird beispielsweise geprüft,
ob der Korrelationswerts Gmn(xi,
yi) mehr als das zweifache der Standardabweichung über
dem Mittelwert liegt. Wenn diese Bedingung zutrifft, wird der betreffende Datenpunkt
(xi, yi) als informativ
für eine Korrelationsanalyse angesehen, weil er sich signifikant
von der Vergleichsmenge abhebt. Die Anzahl der auf diese Weise sukzessive
ermittelten informativen Datenpunkte (xi,
yi) in der Korrelation Gmn wird
am Ende der informativen Datenpunktanalyse als Eignungsgrad verwertet.
Der Eignungsgrad wird mit einem vom Benutzer vorgebbaren Schwellwert
verglichen. Beispielsweise wird nur dann, wenn der Eignungsgrad größer
als der Schwellwert ist, ohne weiteres eine Ausgleichsrechnung durchgeführt
und deren Ergebnisse abgespeichert. Ist der Eignungsgrad niedriger, so
wird in dem gezeigten Beispiel der Benutzer explizit gefragt, ob
dennoch eine Ausgleichsrechnung erfolgen soll. In anderen Ausprägungen
(nicht abgebildet) erfolgt in diesem Fall keine Benutzerabfrage, sondern
die Region Bmn wird automatisch als nicht
informativ markiert und das Verfahren mit der nächsten Region
fortgesetzt.
-
Erfindungsgemäß wurde
erkannt, dass auch die Ermittlung der informativen Datenpunkte vorteilhafterweise
auf ein vorgegebenes Fenster in der Korrelation Gmn beschränkt
werden kann, beispielsweise auf Datenpunkte längs der x-Achse
der Korrelation Gmn, beispielsweise maximal
30 unmittelbar benachbarte Datenpunkte, wobei neben dem Ursprung
am Datenpunkt Gmn(1,0) mit der Untersuchung
und Zählung begonnen wird. Durch ein solches Fenster kann die
Ermittlung des Ereignisgrads bei ausreichend hoher Genauigkeit schnell
durchgeführt werden, da eine Korrelationskurve über
einen Bereich von zehn bis dreißig Datenpunkte abfallen
sollte, um eine gute Auswertung mittels einer Ausgleichsrechnung
zu erzielen. Zweckmäßigerweise wird der Datenpunkt
am Ursprung Gmn(0,0) generell ausgelassen,
da er nicht aussagekräftig ist. Fällt die Korrelation
sofort nach dem Ursprungswert Gmn(0,0) ab,
weist das darauf hin, dass in der betreffenden Probenregion Bmn nur Rauschen aufgezeichnet wurde. Vorzugsweise
wird eine ununterbrochene Reihe von benachbarten Korrelationsdatenpunkten
längs der x-Achse untersucht, es können jedoch
auch Muster oder eine bestimmte (beispielsweise nicht-lineare) Funktion
zur Auswahl von zu untersuchenden Datenpunkten verwendet werden.
Die Vergleichsmenge sollte in jedem Fall statistisch relevant sein
und einen nicht unbedeutenden Teil der jeweiligen Korrelation Gmn ausmachen.
-
Die
informative Datenpunktanalyse und gegebenenfalls die Korrelationsanalyse
werden beispielsweise unabhängig von den resultierenden
Eignungsgraden iterativ für alle Probenregionen Bmn durchgeführt und zusammen mit
dem jeweiligen Eignungsgrad für eine spätere Filterung
abgespeichert. Die Korrelationsanalyse kann in einer alternativen Ausführungsform
(nicht abgebildet) unabhängig von den resultierenden Eignungsgraden
für alle Probenregionen Bmn durchgeführt
und zusammen mit dem jeweiligen Eignungsgrad für eine spätere
Filterung abgespeichert werden.
-
Neben
oder alternativ zu Mittelwert und Standardabweichung können
andere statistische Parameter aus der Vergleichsmenge ermittelt
und in Bedingungen für die Werte der einzelnen Korrelationsdatenpunkte
verwendet werden, um statistisch signifikant von der Vergleichsmenge
abweichende Datenpunkte (xi, yi)
zu bestimmen.
-
6 zeigt in Pseudo-3D-Darstellung eine angepasste
zweidimensionale Modellfunktion Gmn(xi, yi) (Teilfigur 6A)
mit Restfehlern Rmn(xi,
yi)(Teilfigur 6B). Die
gezeigte Modellfunktion ist rein exemplarisch.
-
In 7 sind Beispiele für Diffusionskartierungen
dargestellt, die mit unterschiedlichen Auswerteverfahren aus dem
Fluoreszenzbild der 2 ermittelt wurden. In der linken
Spalte sind die Kartierungen farbkodiert, in der rechten Spalte
wurde jeweils eine korrespondierende Schwarz-Weiß-Rasterung dargestellt.
Teilfigur 7A zeigt eine ungefilterte Kartierung.
Deutlich ist zu erkennen, dass durch die erzwungene Ausgleichsrechnung
einigen Regionen außerhalb der Zelle extrem hohe Diffusionskoeffizienten
zugewiesen werden, während in weiten Teilen der Zelle aufgrund
der notwendigen Skalierung der Falschfarben keine sinnvollen Diffusionskoeffizienten erkennbar
sind. Teilfigur 7B zeigt eine nachträglich
auf die Modellparameterwerte hin gefilterte Kartierung. Hier entfernt
die bekannte Filterung nach Modellparametern beispielsweise die
schwarz abgebildeten Regionen im Inneren der Zelle, obwohl diese einen
normalen Korrelationsabfall aufweisen. Dies kann zwar durch spezifisches
Einstellen der Filtergrenzwerte verbessert werden. Es ist jedoch
zeitaufwendig, diese zu bestimmen. Schließlich zeigt Teilfigur 7C das
Ergebnis einer Filterung nach erfindungsgemäß ermittelten
Eignungsgraden, beispielsweise der Anzahl der informativen Korrelationsdatenpunkte
in der jeweiligen Region Bmn. Die Eignungsgrade
ermöglichen eine hochgenaue Filterung, so dass Innerhalb
der Zelle keine Regionen Bmn ausgelassen
werden, wobei dennoch der Übergang zu den informationslosen
Regionen Bmn korrekt ermittelt wird.
-
Zweckmäßigerweise
kann die Größe und der Überlapp oder
die Anzahl der zu kartierenden Regionen Bmn vom
Benutzer ebenso wie das spezifische Probenmodell und einzelne Modellparameter
vorgegeben werden. In einer Vorverarbeitung können die Fluoreszenzbilddaten
auf immobile Strukturen gefiltert werden. Auch eine Bleichbehandlung
ist möglich. Nach der Kartierung kann beispielsweise die
visuelle Darstellung der angepassten Modellparameterwerte oder abgeleiteter
Größen anhand der Eignungsgrade und/oder weiterer
Kriterien gefiltert werden. So kann beispielsweise schwellwertbasiert
nach einzelnen oder mehreren angepassten Modellparameterwerten oder
nach dem Verhältnis der Standardabweichung der Modellparameter
zu den Modellparameterwerten gefiltert werden.
-
- 20
- Kollimationsoptik
- 21
- Mikroskopobjektiv
- 22
- Probe
- 23
- Laser
- 24
- Lichtklappe
- 25
- Abschwächer
- 26
- Faserkoppler
- 27
- Tubuslinse
- 28
- Filter
- 29
- Dichroitischer
Strahlteiler
- 30
- Scannerspiegel
- 31
- Lochblende
- 32
- Photovervielfacher
- 33
- Hauptstrahlteiler
- 34
- Steuereinheit
- D
- Detektionsmodul
- M
- Mikroskop
- L
- Beleuchtungsmodul
- S
- Abtastmodul
- Bmn
- Probenregion
- xi, yi
- Datenpunkt
- G
- Korrelation
- R
- Restfehler
- V
- Vergleichsmenge
-
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
-
Diese Liste
der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert
erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information
des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen
Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt
keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
-
Zitierte Nicht-Patentliteratur
-
- - Digman et
al.: „Measuring Fast Dynamics in Solutions and Cells with
a Laser Scanning Microscope” in „Biophysical Journal”,
Vol. 89, August 2005, 1317–1327 [0003]