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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reduzierung von Ablagerungen
bei der Kultivierung von Zellen oder Organismen, insbesondere von
Zellkulturen, welche zur Agglomeration bzw. Anhaftung an den Bioreaktor und
seine Elemente neigen, oder bei denen Zellen, Zelldebris oder Substanzen
leicht agglomerieren bzw. anhaften.
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Die
Züchtung menschlicher, tierischer und pflanzlicher Zellen
hat große Bedeutung bei der Herstellung biologisch aktiver
Substanzen und pharmazeutisch aktiver Erzeugnisse erlangt. Insbesondere
die Züchtung von Zellen, welche häufig in einem
Nährmedium in freier Suspension durchgeführt wird,
ist anspruchsvoll, weil die Zellen im Gegensatz zu Mikroorganismen
sehr empfindlich hinsichtlich mechanischer Scherbeanspruchung und
unzureichender Versorgung mit Sauerstoff sowie Nährstoffen
sind (siehe z. B. H.-J. Henzler 2000. Particle Stress in
Bioreactors. Adv. Biochem. Eng./Biotechnol. 67: 35–82 oder J.
G. Aunis, H.-J. Henzler 1993. Aeration in Cell Culture Bioreactors.
In: Biotechnology, Second, Completely Revised Edition, Volume
3: Bioprocessing: 219–281, VCH Wiley oder Untersuchungen
zum extrazellulären und intrazellulären Sauerstofftransfer,
von der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Universität
Hannover zur Erlangung des Grades Dr. rer. nat. genehmigte Dissertation
von Oliver Schweder, 2006). Im Gegensatz zu Nährstoffen,
die in solcher Konzentration im Nährmedium vorliegen, dass
sie nicht andauernd nachdosiert werden müssen, ist die
Sauerstofflöslichkeit des Nährmediums so gering,
dass ohne kontinuierliche Sauerstoffzufuhr die Zellen schnell in
eine Sauerstofflimitierung gelangen würden. Neben der ausreichenden
Versorgung mit Sauerstoff kommt dem Abtransport von Kohlendioxid
eine ähnliche Bedeutung zu.
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Meist
werden menschliche, tierische und pflanzliche Zelllinien absatzweise
gezüchtet. Dies hat den Nachteil, dass eine optimale Versorgung
der Zellen infolge der sich ständig verändernden
Substrat-, Produkt und Biomassekonzentrationen nur schwer zu erreichen
ist. Am Ende der Fermentation reichern sich außerdem Nebenprodukte
an, z. B. die Lyseprodukte gestorbener Zellen, die meist unter großem
Aufwand bei der späteren Aufarbeitung eliminiert werden
müssen. Aus den genannten Gründen, insbesondere
aber bei der Herstellung instabiler Produkte, die z. B. durch proteolytische
Angriffe beschädigt werden können, werden daher bevorzugt
kontinuierlich betriebene Bioreaktoren angewendet. Mit kontinuierlichen
Bioreaktoren lassen sich im Vergleich zur absatzweisen Kultivierung
höhere Zelldichten und eine damit verbundene höhere
Produktivität erreichen.
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Einige
Zelllinien verfügen über die Eigenschaft, bevorzugt
Agglomerate zu bilden und/oder sich an die Innenbereiche eines Kultivierungsgefäßes/Bioreaktors
anzuheften bzw. eine Anlagerung von Zelldebris oder Substanzen (z.
B. Proteinen) an die Innenbereiche des Kultivierungsgefäßes
zu bewirken/zu fördern (siehe z. B.
EP 0242984 B1 ). Dies ist
im Allgemeinen von Nachteil, da die Funktionsfähigkeit
von Elementen im Bioreaktor, wie z. B. Membranen zum Gastransfer
oder Sonden, zum Teil erheblich eingeschränkt oder sogar
aufgehoben wird.
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Die
Anlagerung von Debris ist in herkömmlichen Systemen ein
Hauptgrund für die notwendige Reduzierung der Zelldichte
und das vorzeitige Beenden der Kultivierung entsprechender Zelllinien.
Ferner führt in herkömmlichen Systemen die Anlagerung
von Zellen, Debris und/oder Proteinen an Sonden oder sonstigen Mess-/Analytikeinrichtungen
zu deren Fehlfunktion oder Nichtfunktion, was während des
fortlaufenden Betriebs des Bioreaktors meist nicht behoben oder
kompensiert werden kann, wodurch ein vorzeitiges Beenden der Kultivierung
nötig werden kann.
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Probleme
bei (Zellkultur-)Fermentationen hinsichtlich Ablagerungen im Bioreaktor
und der Anhaftung von Zellen und Zelldebris, insbesondere an den
Membranschläuchen sowie der Bildung von Zellagglomeraten, sind
seit langem in der Literatur beschrieben.
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Zur
Verringerung von Ablagerungen ist in
EP 0242984 B1 ein doppelwandiger Fermenter
mit einem Spiralrührer versehen, dessen Rührblätter
bis kurz vor eine innere (semipermeable) Wand des Fermenters ausgeführt
sind. Die Bewegung der Rührblätter in der Nähe
der inneren Wand verursacht Turbulenzen, welche die Ablagerung von
Zellen/Zellresten/Zellprodukten an der inneren Wand und damit Fouling
verhindern sollen. Nachteilig an dem beschriebenen Fermenter ist,
dass Zellkulturen durch die Turbulenzen beschädigt werden können.
Zudem ist bekannt (siehe z. B.
EP 0422149 B1 ), dass Rührwerke,
insbesondere die in
EP
0242984 B1 beschriebenen Rührblätter
hohe Scherkräfte ausüben, die Zellmembranen, insbesondere
von zellwandlosen Zellen schädigen können.
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EP 1935973 A1 beschreibt
eine Kulturvorrichtung für aquatische Organismen, die ohne
Rührwerk auskommt. Gas (Sauerstoff zur Versorgung der Organismen)
wird in der Nähe des Auslasses am Boden des Gefäßes
eingebracht und erzeugt eine Strömung, die das Kulturmedium
im Gefäß vollständig erfasst und die
vollständige Durchmischung der Bestandteile des Kulturmediums
und der ggf. frei schwebenden Kulturorganismen erreichen soll. In
einer besonderen Ausführungsform ist zentral in dem Auslass
eine einzelne Düse angeordnet und im Gefäß eine
Trennscheibe so eingebracht, dass sich durch das Einströmen
von Gasen eine eindeutig gerichtete Strömung aus einer
Aufwärts- und einer Abwärtsbewegung der Nährflüssigkeit
um die Trennscheibe herum ergibt. Es ist bekannt (siehe z. B.
EP 0422149 B1 ),
dass beim Entstehen und Zerplatzen von Gasblasen hohe Scherkräfte
wirken, die zu einer Zellschädigung führen können.
Zudem führen Gasblasen zur Bildung von Schaum. Eine Schaumbildung
ist jedoch zu vermeiden, da Zellen dazu neigen, mit dem Schaum zu
flotieren. In der Schaumschicht finden sie nicht adäquate
Kultivierungsbedingungen vor. Der Einsatz von Antischaummitteln
kann zu Zellschädigung oder Ausbeuteverlusten in der Aufarbeitung
oder zu einem vermehrten Aufarbeitungsaufwand führen. Zudem
kann eine ausreichende Sauerstoffversorgung bei scherempfindlichen
Zellen mit einer grobblasigen Begasungsmethode nur bis zu relativ
niedrigen Zelldichten sichergestellt werden (
H.-J. Henzler: „Verfahrentechnische
Auslegungsunterlagen für Rührbehälter
als Fermenter" Chem. Ing. Tech. 54 (1982) Nr. 5 S. 461–476,
H.-J.
Henzler, J. Kauling: „Oxygenation of cell cultures" Bioprocess
Engineering 9 (1993) S. 61–75,
„Mischen
und Rühren" Herausgegeben von M. Kraume, WILEY-VCH 2003).
Die Skalierung einer grobblasigen Begasung auf einen Bioreaktor
in industriellem Maßstab ist schwierig. Aus den genannten
Gründen ist die in
EP
1935973 A1 beschriebene Kulturvorrichtung daher für
die industrielle Kultivierung einer Vielzahl von Organismen ungeeignet.
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Die
blasenfreie Begasung löst die Problematik, indem der Gasaustausch über
eine eingetauchte Membranfläche erfolgt. Hierbei wird die
Begasung mit geschlossenen oder offenporigen Membranen durchgeführt. Diese
sind z. B. in der durch einen Rührer bewegten Flüssigkeit
angeordnet. Beispielsweise lassen sich Membranen als Schläuche
auf zylindrischen Korbstatoren aufwickeln (
H.-J. Henzler,
J. Kauling: „Oxygenation of cell cultures" Bioprocess
Engineering 9 (1993) S. 61–75,
EP 0172478 B1 ,
EP 0240560 B1 ). Zur Unterbringung
großer Stoffaustauschflächen werden die Schläuche
mit möglichst geringem Abstand dicht nebeneinander platziert.
Als Schlauchmaterial hat sich Silikon gegenüber porösen
Polymeren durchgesetzt. Gründe hierfür sind die
hohe Gaspermeabilität, die hohe thermische Beständigkeit
und die homogen über die Länge der Schlauchsegmente
von bis zu ca. 70 m verteilten Schlaucheigenschaften, die auch nach
einer Sterilisation erhalten bleiben. Problematisch sind aber Toträume
zwischen den Schläuchen und zwischen dem Stator und den
Schläuchen, in denen sich leicht Ablagerungen bilden können.
Die fortschreitende Ablagerung von Substanzen auf den Silikonschläuchen
selbst fuhrt zu einem zunehmend schlechteren Gastransfer, z. B.
zur Versorgung von Zellen mit Sauerstoff oder beim Abtransport von
Kohlendioxid. Im Allgemeinen wird der Silikonschlauch nach einmaliger
Verwendung verworfen.
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Nachteil
an der beschriebenen Membranbegasung ist zudem der vergleichsweise
geringe Stofftransportkoeffizient (H.-J. Henzler, J. Kauling: „Oxygenation
of cell cultures" Bioprocess Engineering 9 (1993) S. 61–75).
Um hohe Stofftransportraten zu erreichen ist es erforderlich, entsprechend
viel Membranfläche im Bioreaktor zu installieren. Dies
ist jedoch bezüglich Konstruktion und Handhabung aufwändig
(Montage, Sterilisation, Reinigung, Erzeugung von unzureichend durchmischten
Bereichen etc.) und führt zur Vergrößerung von
Toträumen. Es ist denkbar, den Leistungseintrag zu erhöhen.
Da der Stofftransportkoeffizient vom Leistungseintrag abhängig
ist, kann hierdurch eine Steigerung der Stofftransportrate erzielt
werden. Das Potential ist jedoch durch die resultierende Scherbelastung
der Zellen aufgrund des höheren Leistungseintrages begrenzt.
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In
WO 2007098850 (A1) ist
ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Begasung von Flüssigkeiten,
insbesondere von in der Biotechnologie verwendeten Flüssigkeiten
und speziell von Zellkulturen, beschrieben, bei welchem/welcher
der Gasaustausch über eine oder mehrere beliebig geartete,
eingetauchte Membranflächen (z. B. Schläuche)
erfolgt, wobei die Membranfläche eine beliebige, rotatorisch
oszillierende Bewegung in der Flüssigkeit ausführt.
Die Bewegung kann so optimiert werden, dass die Anströmung
der Membranfläche optimal ist. Da der Stofftransportkoeffizient
von der Anströmung der Membranfläche abhängt,
kann eine verbesserte Sauerstoffversorgung erreicht werden. Ein
weiterer Vorteil der rotatorisch oszillierenden Bewegung der Membranfläche
ist die Tatsache, dass ein separates Rühr- oder Mischorgan
zur Erzeugung einer Anströmung der Membranfläche
entfällt.
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Während
durch die in
WO
2007098850 (A1) beschriebene rotatorisch oszillierende
Bewegung der Membranfläche eine Verbesserung der Sauerstoffversorgung
und Verringerung der Scherkräfte gegenüber den
in
EP 0172478 B1 und
EP 0240560 B1 beschriebenen
statischen Membranen, die durch ein Rührwerk angeströmt
werden, erreicht wird, ist bei
WO 2007098850 (A1) zu befürchten,
dass durch die Bewegung der Membranschläuche durch das
Kulturmedium Partikel eingefangen werden, die sich entweder an den
Membranschläuchen festsetzen oder entlang der Membranschläuche
in die Toträume zwischen den Membranschläuchen
rutschen und hier zu Ablagerungen führen.
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In
WO 86/07604 A1 wird
ein Air-Lift-Fermenter beschrieben. Es wird vorgeschlagen, bei der
Kultivierung von tierischen Zellen Flockungsmittel einzusetzen,
um Zelldebris vom Produktstrom zu trennen. Die ausgeflockten schweren
Partikel sinken in eine turbulenzfreie Zone des Air-Lift-Fermenters
und können hier abgezogen werden. Der Einsatz von Flockungsmitteln
kann Ablagerungen reduzieren aber nicht dauerhaft verhindern. Der
Einsatz von Flockungsmitteln bei der Verwendung rotatorisch oszillierender
Membranflächen zur Sauerstoffversorgung birgt die Gefahr,
dass ausgeflockte Partikel eingefangen und in Totzonen transportiert werden,
wo sie sich dauerhaft festsetzen können. Zudem ist der
Einsatz von Flockungsmitteln nicht bei der Kultivierung von allen
Zelllinien angebracht, da Flockungsmittel negativen Einfluss auf
die Physiologie der Zellen ausüben können und überschüssiges
Flockungsmittel ggf. vom Produkt entfernt werden muss.
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Ausgehend
vom beschriebenen Stand der Technik stellt sich die Aufgabe, ein
Verfahren zur Verminderung von Ablagerungen bei der Kultivierung
von Zellen oder Organismen bereitzustellen, insbesondere bei der
Kultivierung von Zellkulturen, die zur Agglomeration bzw. Anhaftung
an den Bioreaktor und seine Elemente neigen, oder bei denen Zellen,
Zelldebris oder Substanzen leicht agglomerieren bzw. anhaften. Das
gesuchte Verfahren sollte eine optimale Versorgung der Organismen
mit Nährstoffen insbesondere bezüglich Gastransfer,
z. B. mit Sauerstoff, gewährleisten. Es sollte ohne den
Einsatz von zusätzlichen Scherkräften auskommen, welche
zur Zerstörung von Zellen und damit zur Verminderung der
Produktivität führt. Das gesuchte Verfahren sollte
ohne den Einsatz von Chemikalien (z. B. Flockungsmittel) auskommen,
um eine zusätzliche Belastung der Organismen und einen
höheren Aufwand bei der Produktisolierung zu vermeiden.
Das gesuchte Verfahren sollte insbesondere Ablagerungen vermindern,
die zu einer Reduzierung des Gastransfers, z. B. der Sauerstoffversorgung,
führen. Das gesuchte Verfahren sollte einfach auszuführen
und kostengünstig sein.
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Überraschend
wurde gefunden, dass die Agglomeration und/oder Anlagerung von Zellen,
Debris und/oder Proteinen, insbesondere an den Elementen zum Gastransfer,
z. B. zur Sauerstoffversorgung, aber auch an allen weiteren Flächen
sowie Sonden dadurch signifikant reduziert oder sogar verhindert
werden kann, dass zur Gasversorgung eine Membranfläche
in das Kulturmedium taucht, die eine diskontinuierliche Bewegung
im Kulturmedium ausführt.
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Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Reduzierung
von Ablagerungen bei der Kultivierung von Zellen und Organismen,
insbesondere von Zellkulturen, welche zur Agglomeration bzw. Anhaftung
an den Bioreaktor und seine Elemente neigen, oder bei denen Zellen,
Zelldebris oder Substanzen leicht agglomerieren bzw. anhaften, dadurch
gekennzeichnet, dass eine zum Gasaustausch in das Kulturmedium eintauchende
Membranfläche eine diskontinuierliche Bewegung ausführt.
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Die
Agglomeration und/oder Anlagerung von Zellen, Debris und/oder Proteinen,
besonders an den Membranen, aber auch an allen weiteren Kontaktflächen
sowie Sonden, wird durch die diskontinuierliche Bewegung signifikant
reduziert oder verhindert, wodurch ein höherer Gasaustausch über
die Membranen möglich ist und dies auch für einen
längeren Zeitraum. Dadurch werden Zelldichte und damit
Produktausbeute erhöht, und die maximale Laufzeit des Prozesses
wird verlängert.
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Unter „Bewegung” wird
allgemein ein Vorgang verstanden, bei dem ein sich bewegender Körper
(hier die Membranfläche) eine Änderung seiner
Anordnung im Raum erfahrt. Dabei kann sich der Körper als
Ganzes bewegen (Translation) oder nur Teile des Körpers,
z. B. durch Verbiegen des Körpers (Schwingung). Die Bewegung
des Körpers kann auch in einer Drehung (Rotation) bestehen.
Ferner sind Kombinationen aus Translation, Schwingung und Rotation
möglich.
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Unter
einer „diskontinuierlichen Bewegung” wird eine
Bewegung verstanden, die nicht gleichförmig über
einen gegebenen Zeitraum abläuft. Ein Beispiel einer diskontinuierlichen
Bewegung ist die Bewegung eines Pendels. Über den Zeitraum
einer Periode, z. B. beginnend mit einer Maximalauslenkung des Pendels nach
rechts, führt das Pendel zunächst eine beschleunigende
Bewegung nach links aus, bis es eine maximale Geschwindigkeit in
der Ruhelage aufweist. Dann wird das Pendel allmählich
abgebremst, bis das Pendel in der Maximalauslenkung nach links für
einen Augenblick zum Stillstand kommt, bevor das Pendel wieder beschleunigt,
in der Ruhelage die maximale Geschwindigkeit erreicht und wieder
abgebremst wird, bis es wieder seine Ausgangslage erreicht hat (maximale
Auslenkung nach rechts). Im Unterschied hierzu wird unter einer
kontinuierlichen Bewegung eine Bewegung verstanden, die über
einen gegebenen Zeitraum gleichförmig ist. Ein Beispiel
einer kontinuierlichen Bewegung ist z. B. die Rotation eines Rührelements
mit konstanter Winkelgeschwindigkeit um eine feststehende Rotationsachse.
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Bevorzugt
führt die Membranfläche eine diskontinuierliche
Bewegung mit einer Bewegungsumkehr aus, d. h. die Membranfläche
führt zunächst eine beliebig geartete erste Bewegung
in eine erste Richtung aus, bevor die Membranfläche zum
Stillstand kommt und dann eine beliebig geartete zweite Bewegung
in eine andere Richtung, bevorzugt in die der ersten Richtung entgegen
gesetzte Richtung ausführt. Die erste Bewegung und die
zweite Bewegung können völlig verschieden voneinander
sein. Bevorzugt ist die zweite Bewegung jedoch eine spiegel-, punkt-
und/oder rotationssymmetrische Ausführung zur ersten Bewegung.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens führt die Membranfläche eine oszillierende
Bewegung aus. Unter „oszillierend” wird ein sich
regelmäßig und gleichförmig wiederholender
Vorgang verstanden, d. h. das erfindungsgemäße
Verfahren ist bevorzugt dadurch gekennzeichnet, dass es eine Zeitdauer
gibt, nachfolgend Periode genannt, in der die Membranfläche
eine beliebige erste Bewegung vollzieht, und anschließende
Bewegungen Kopien der ersten Bewegung sind, die sich durch dieselbe
zeitliche Abfolge von Beschleunigungen und Geschwindigkeiten auszeichnen
wie die erste Bewegung. Die oben beschriebene Bewegung eines Pendels
ist ein Beispiel einer oszillierenden Bewegung.
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Besonders
bevorzugt führt die Membranfläche eine rotatorisch
oszillierende Bewegung aus. Bei einer rotatorisch oszillierenden
Bewegung bewegt sich (rotiert) die Membranfläche zunächst
in die eine Rotationsrichtung, wobei die Bewegung beliebig gestaltet
werden kann. Ein Beispiel ist die Beschleunigung der Membranfläche
mit einer bestimmten Winkelbeschleunigung bis zu einer bestimmten
Winkelgeschwindigkeit, mit der sich die Membranfläche dann
für eine bestimmte Zeit bewegt. Anschließend wird
die Membranfläche mit einer festgelegten Verzögerung
bis zum Stillstand abgebremst. Es folgt, ggf. nach einer festgelegten
Stillstandszeit, anschließend die Bewegung in die andere
Rotationsrichtung. Diese Bewegung kann spiegelbildlich der vorher beschriebenen
erfolgen oder andersartig gestaltet sein. Unter einer rotatorisch
oszillierenden Bewegung soll auch eine Bewegung verstanden werden,
bei der die Membranfläche zunächst in eine Richtung
beschleunigt wird, eine Zeit t, die größer oder
gleich Null ist, mit konstanter Geschwindigkeit in diese vorgegebene
Richtung rotiert, dann abgebremst wird (wobei die Membranfläche
zum Stillstand kommen kann aber auch mit einer kleinen Winkelgeschwindigkeit in
dieselbe Richtung weiter rotieren kann), und dann wieder in dieselbe
Richtung beschleunigt wird.
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Bevorzugt
wird die Bewegung so ausgeführt, dass die Membranfläche
zunächst in eine und nach einer vorgegebenen Zeit in die
entgegengesetzte Richtung rotiert.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens erfolgt die Bewegung der Membranfläche rotatorisch
oszillierend mit Drehrichtungsumkehr und mit minimalen Stillstandszeiten
an den Punkten der Drehrichtungsumkehr. Unter minimaler Stillstandszeit
wird verstanden, dass die Drehrichtungsumkehr ohne technische/vermeidbare
Verzögerung erfolgt, d. h. die Membranfläche unmittelbar
nach Erreichen eines Punktes der Drehrichtungsumkehr eine Beschleunigung
in die der vorherigen Richtung entgegengesetzte Richtung erfährt.
Die bevorzugte Ausführungform ist ferner dadurch charakterisiert,
dass die Membranfläche ausgehend von einem Punkt der Drehrichtungsumkehr über
einen definierbaren Zeitraum mit konstanter Winkelbeschleunigung
beschleunigt wird und dann bei Erreichen einer Maximalgeschwindigkeit
die Membranfläche mit einer konstanten Winkelverzögerung
wieder abgebremst wird, bis die Membranfläche den zweiten
Punkt der Drehrichtungsumkehr erreicht (Bewegungsphase 1). Dann
erfolgt eine Bewegungsphase 2 spiegelbildlich zur Bewegungsphase
1. Bevorzugt sind die konstante Winkelbeschleunigung und Winkelverzögerung
betragsmäßig gleich. Die bevorzugte Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet,
dass keine Bewegungsphase mit einer konstanten Winkelgeschwindigkeit
auftritt.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens wird die Membranfläche infolge der diskontinuierlichen
Bewegung innerhalb des Kulturmediums tangential angeströmt.
Die tangentiale Anströmung gewährleistet einen
effektiven Gasaustausch zwischen Membranfläche und Kulturmedium
(Sauerstoffzufuhr, Kohlendioxidabfuhr).
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Unter „Membranfläche” wird
eine Fläche verstanden, durch die ein Gas, insbesondere
Sauerstoff, in gelöster Form oder in Form von feinen Bläschen
in eine Flüssigkeit eingebracht werden kann und/oder ein
Gas aus der Flüssigkeit entfernt werden kann. Unter „feinen
Gasblasen” werden Gasblasen verstanden, die in dem eingesetzten
Kulturmedium eine geringe Neigung zur Koaleszenz aufweisen.
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Als
Membranflächen eignen sich beispielsweise spezielle Sinterkörper
aus metallischen und keramischen Werkstoffen, Filterplatten oder
laserperforierten Platten, die Poren oder Löcher mit einem
Durchmesser von in der Regel kleiner als 15 μm aufweisen.
Die Membranflächen sind bevorzugt als hohle Körper,
z. B. Rohre ausgeführt, durch die Gas strömen
kann. Bei kleinen Gasleerrohrgeschwindigkeiten von weniger als 0,5
m h–1 werden sehr feine Gasblasen
erzeugt, die in den in der Zellkultur normalerweise eingesetzten
Medien eine geringe Neigung zur Koaleszenz aufweisen.
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Als
Membranflächen eignen sich weiterhin Membranschläuche.
Unter Membranschläuchen werden flexible rohrförmige
Gebilde verstanden, die für Gase wie Sauerstoff und Kohlendioxid
durchlässig sind. Als Beispiel seien Membranhohlfäden
aus mikroporösem Polypropylen genannt, wie sie beispielhaft
in
Chem.-Ing.-rech. 62 (1990), Nr. 5, S. 393–395
von H. Büntemeyer et al. beschrieben werden. Ebenso
können Silikonschläuche eingesetzt werden, wie
sie beispielhaft in den folgenden Dokumenten beschrieben sind:
H.-J. Henzler,
J. Kauling: „Oxygenation of cell cultures" Bioprocess
Engineering 9 (1993) S. 61–75,
EP 1948780 ,
WO 07/051551 A1 ,
WO 07/098850 A1 .
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Bevorzugt
werden als Membranflächen nicht-poröse Silikonschläuche
verwendet. Vorzugsweise liegen diese in einem Bereich von Innendurchmesser
~1 mm bei einem Außendurchmesser von ~1,4 mm bis zu einem
Innendurchmesser von ~2 mm bei einem Außendurchmesser von
~3 mm. Die Parameter Schlauchdurchmesser und Schlauchgesamtlänge
sollten so gewählt werden, dass ein ausreichender Stofftransport
für die Applikation gewährleistet ist. Der Stofftransport
wird u. a. von dem Verhältnis von Membranoberfläche
zu Reaktorflüssigvolumen bestimmt (volumenspezifische Stoffaustauschfläche).
Hier sind Werte von 25 m–1 bis 45
m–1 für tierische Zellkulturen
gebräuchlich. In dem erfindungsgemäßen
Verfahren erreicht die volumenspezifische Stoffaustauschfläche
Werte zwischen 0,1 m–1 und 150
m–1, bevorzugt werden 1 m–1 bis 100 m–1 und besonders
bevorzugt 5 m–1 bis 75 m–1.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens ist die Membranfläche an einen drehbar gelagerten
Rotor angebracht, der im Inneren eines Behältnisses, z.
B. eines Bioreaktors, bewegt werden kann. Der Rotor ist so ausgestaltet,
dass er im Inneren des Bioreaktors mindestens eine Membranfläche
wie zum Beispiel Schläuche, Zylinder, Module etc. tragen
kann. Der Rotor wird bevorzugt zur Ausführung einer rotatorisch
oszillierenden Bewegung eingesetzt. Dazu kann der drehbar gelagerte
Rotor z. B. von außerhalb des Bioreaktors durch einen Antrieb
in eine rotatorisch oszillierende Bewegung versetzt werden. Die Übertragung
des erforderlichen Antriebsdrehmoments vom Antrieb auf den Rotor
im Inneren des Reaktors kann entweder über eine Magnetkupplung
erfolgen, oder die Rotorwelle wird über eine drehende Abdichtung durch
das Gehäuse des Bioreaktors geführt und direkt
an den Antrieb gekuppelt. Die Verwendung einer Magnetkupplung ist
aus steriltechnischer Sicht besonders vorteilhaft, weil sie sterile
und insterile Räume eindeutig und ohne drehende Dichtung
voneinander trennt.
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Als
Antrieb zur Erzeugung einer rotatorisch oszillierenden Bewegung
muss die vom Motor zur Verfügung gestellte Leistung ausreichen,
um mit dem Rotor trotz des Massenträgheitsmomentes des
Rotors und des Kulturmediums eine oszillierende Bewegung mit vorgegebenem
Bewegungsablauf durchzuführen. Für die Auslegung
des Antriebes ist also sowohl das Massenträgheitsmoment
des Rotors als auch die Krafteinwirkung vom Kulturmedium auf den
Rotor entscheidend. Bei ausreichender Drehzahl des Motors bietet
ein Getriebe die Möglichkeit, das erforderliche Drehmoment
bereitzustellen. Als Antriebskonfiguration kommt zum Beispiel ein
Exzentertrieb in Frage. Ein Exzentertrieb verwandelt die gleichförmige
Rotation eines konventionellen Antriebsmotors in eine rotatorisch
oszillierende Bewegung an der Abtriebswelle um. Daneben kommen als
Antriebskonfiguration für die erfindungsgemäße
Vorrichtung auch frei programmierbare Positionierantriebe in Frage,
wie zum Beispiel ein Schrittmotor. Der Vorteil solcher frei programmierbarer
Antriebssysteme liegt darin, dass die rotatorisch oszillierende
Bewegung der Membranfläche in weiten Bereichen den Erfordernissen
des Prozesses angepasst werden kann, während ein Exzentertrieb
in der Regel nur eingeschränkte Verstellmöglichkeiten
aufweist.
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Parameter
des Antriebs wie Drehzahl, Drehmoment und Getriebeuntersetzungen
sind für die jeweilige Anwendung frei wählbar
und vom Maßstab abhängig. Für Anwendungen
im Bereich Biotechnologie werden die Parameter üblicherweise
so gestaltet, dass sich ein volumenspezifischer Leistungseintrag
von 0,01 W pro m–3 bis zu 4000
W pro m–3 Flüssigvolumen,
bevorzugt um 1000 W pro m–3, ergibt.
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Für
Zellkulturen beträgt der volumenspezifische Leistungseintrag üblicherweise
zwischen 0,01 und 100 W pro m–3.
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Weiterhin
sollte die Parametergestaltung so erfolgen, dass sich für
die Zellkulturapplikation maximale Relativgeschwindigkeiten zwischen
Rotor und Kulturmedium von 1 ms–1,
ergeben.
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Um
die Spannungen aus der Verbindung Getriebe und Rotor zu absorbieren,
wird das Getriebe üblicherweise mit dem Rotor über
eine beliebige torsionssteife Kupplung verbunden, welche geringen
Wellenversatz oder geringes Nicht-Fluchten der Wellen aufnimmt.
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Die
Vorrichtung zur Anbringung einer oder mehrerer Membranflächen
kann in vorteilhafter Weise in ihrer Ausbildung leicht den besonderen
Verhältnissen in Zellkulturen, z. B. Zellagglomeration,
angepasst werden. Dies kann beispielsweise durch die Art und Anordnung
der Membranflächen erfolgen.
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Der
Rotor weist bevorzugt 1 bis 64, bevorzugt 2 bis 32 und besonders
bevorzugt 4 bis 16 Rotorarme auf, an denen eine oder mehrere Membranflächen
angebracht werden können.
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In
einer besonderen Gestaltung der Vorrichtung bilden zwei Wickelarme
einen Rotorarm. Auf diese Wickelarme wird die Membranfläche,
bevorzugt die Membranschläuche, horizontal oder vertikal
in regelmäßigem bzw. unregelmäßigem
Abstand gewickelt.
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Erfolgt
jetzt eine Drehung des Rotors, so werden die Membranschläuche
durch das Kulturmedium im Reaktor bewegt und dadurch tangential
angeströmt. Überraschend wurde gefunden, dass
durch die Anströmung nicht, wie der Fachmann annehmen würde,
Partikel in der Lösung durch die Membranflächen
eingefangen und festgehalten oder in (deren) Toträume transportiert
werden, so dass es zu Ablagerungen kommt. Überraschend
wurde gefunden, dass eine diskontinuierliche Bewegung, bevorzugt
eine rotatorisch oszillierende Bewegung zu einer Verminderung von
Ablagerungen im Vergleich zu einer statisch angeordneten Membranfläche,
bei der ggf. ein zusätzliches Rührwerk eine Anströmung
mit Kulturmedium bewirkt, führt.
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Hinsichtlich
der Anströmung der Membranschläuche ist zu beachten,
dass die Anströmung bei gleicher Winkelgeschwindigkeit
in Abhängigkeit von der Position des Membranschlauches
mit zunehmender radialer Entfernung von der Rotorwelle im Allgemeinen
besser wird. Grund hierfür ist die gleichermaßen
zunehmende Umfangsgeschwindigkeit. Bevorzugt werden möglichst
viele Membranschläuche möglichst weit außen bei
guter Anströmung installiert. Eine Möglichkeit,
diesem Anspruch gerecht zu werden, besteht darin, die Anzahl der
Rotorarme um die Welle zu erhöhen. Negativ wirkt sich eine
Erhöhung der Anzahl der Arme allerdings sowohl auf die
Durchmischung als auch auf die Anströmung der Membran aus
(Schaffung von weniger durchmischten Kompartimenten zwischen den
Armen). Hinzu kommt, dass unter der zunehmenden Anzahl der Arme
die Handhabung des Rotors beim Auf- und Abwickeln der Schläuche
sowie beim Ein- und Ausbau leidet. Auch die Befestigung der Arme
an der Welle gestaltet sich mit größerer Anzahl
der Arme aus Platzgründen zunehmend schwieriger.
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Die
Versorgung der diskontinuierlich bewegten Membranfläche
für die Zu- und Abfuhr von Gas erfolgt vorzugsweise von
der nicht bewegten Umgebung aus, z. B. dem Reaktordeckel, mit einer
Drehdichtung oder mit Hilfe von flexiblen Schläuchen. Drehdichtungen
sind in der Zellkulturtechnik meist unerwünscht, da sie Schwierigkeiten
beim Reinigen und der Sterilisation bereiten können. Hier
bietet das erfindungsgemäße Verfahrens mit Bewegungsumkehr
gegenüber einem Verfahren ohne Umkehr der Bewegungsrichtung
einen klaren Vorteil: Ohne Umkehr der Bewegungsrichtung würden
sich die Schläuche mit zunehmender Umdrehung immer stärker
tordieren und schließlich abreißen. Bei einer
Bewegung mit Bewegungsumkehr, z. B. bei rotatorisch oszillierenden
Membranflächen, findet aufgrund der Hin- und Herbewegung
keine Netto-Torsion der flexiblen Schläuche statt. Voraussetzung
ist natürlich die Gestaltung der Hin- und Herbewegung derart,
dass die Membranfläche sich nach Abschluss einer Periode
der Bewegung am Ausgangspunkt der Bewegung befindet.
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Ein
weiterer Vorteil der Vorrichtung mit gewickelten Membranschläuchen
ist, dass die Spannung der Membranfläche, z. B. der Membranschläuche
variiert werden kann. Die optimale Spannung ergibt sich u. a. anhand
der Parameter Druck des in den Raum innerhalb der Membranfläche
einströmenden Gases oder Gasgemisches, Druck des aus dem
Raum innerhalb der Membranfläche ausströmenden
Gases oder Gasgemisches und Geometrie, Strömungswiderstand
und Deformation des Raumes innerhalb der Membranfläche
(bei einem Membranschlauch z. B. Eingangsdruck, Ausgangsdruck, Innendurchmesser,
Anzahl und Geometrie der Krümmungen des Membranschlauches
sowie die Deformation der Krümmungen) (H. N. Qi,
C. T. Goudar, J. D. Michaels, H.-J. Henzler, G. N. Jovanovic, K.
B. Konstantinov: „Experimental and Theoretical Analysis
of Tubular Membrane Aeration for Mammalian Cell Bioreactors" Biotechnology
Progress 19 (2003) S. 1183–1189). Bei Membranschläuchen
führt die Reduktion der Schlauchspannung zu einer verstärkten
Auslenkung der Schläuche während der Bewegung.
Eine größere Auslenkung der Schläuche
verbessert deren Umströmung und damit den Stofftransportkoeffizienten.
Die Spannung ist je nach Art der Applikation so zu wählen,
dass die Membranschläuche einerseits langzeitstabil befestigt
sind, sich andererseits aber vorzugsweise in der Strömung bewegen
und um z. B. einige Millimeter auslenken können.
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Aus
der Reduzierung der Schlauchspannung ergibt sich das Problem der
Fixierung der Membranschläuche auf den Wickelarmen. Eine
große Krafteinwirkung auf die Membranschläuche
könnte bei geringerer Schlauchspannung zum Abgleiten der
Membranschläuche von den Wickelarmen führen. Um
diesem Problem zu begegnen, wird z. B. die Oberfläche der
Wickelarme mit einem Außengewinde versehen. Ferner können
z. B. außen an den Wickelarmen Stege vorgesehen werden,
die ein Abrutschen der Schläuche außen von den Armen
verhindern. Hierbei ist darauf zu achten, dass die aufgewickelten
Membranschläuche durch etwaige Grate des Gewindes nicht
zu Schaden kommen. Ferner bietet das Außengewinde auf den
Wickelarmen eines Sternhalters die Möglichkeit, die Schlauchwicklung
zu variieren. Bei der Aufwicklung der Schläuche könnte
z. B. nur jede zweite oder dritte Gewindevertiefung genutzt werden.
Hierdurch ist die Einstellung eines definierten Abstandes zwischen
den einzelnen Membranschläuchen möglich.
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Weitere
Ausgestaltungen von Membranflächen in Form von Schläuchen,
die den Armen eines Rotors befestigt und zur Ausführung
einer diskontinuierlichen Bewegung ausgestaltet sind, finden sich
in der Anmeldeschrift
WO
2007098850 (A1) .
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Die
eine diskontinuierliche Bewegung ausführende Membranfläche
kann ganz oder teilweise in das Kulturmedium eintauchen. Ebenso
ist es denkbar, die Eintauchtiefe während der diskontinuierlichen
Bewegung zu variieren.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren kann vielfältig
eingesetzt werden, z. B. bei der Kultivierung von Organismen, menschlichen,
tierischen oder pflanzlichen Zellen, in der Aufarbeitung von Abwässern,
oder in einem sonstigen Verfahren, in dem sich Ablagerungen bilden
können. Bevorzugt wird es bei der Kultivierung von Zellkulturen,
welche zur Agglomeration bzw. Anhaftung an den Bioreaktor und seine
Elemente neigen, oder bei denen Zellen, Zelldebris oder Substanzen
leicht agglomerieren bzw. anhaften, eingesetzt. Hier zeigt es keine
nachteilhaften Effekte, z. B. auf die Zellbiologie, z. B. bezüglich
Apoptose und Zellzyklus. Beispiele für Zellkulturen sind
z. B. BHK-Zellen (Baby Hamster Kidney) zur Gewinnung von Gerinnungsfaktoren
oder CHO-Zellen (Chinese Hamster Ovary) zur Gewinnung therapeutischer
Antikörper.
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Mit
einer diskontinuierlichen, insbesondere einer rotatorisch oszillierenden
Bewegung der Membranfläche innerhalb des Kulturmediums
werden drei Funktionalitäten miteinander kombiniert:
-
- 1. Die Membranfläche sorgt für
den nötigen Gasaustausch und damit für die nötige
Versorgung der Organismen mit z. B. Sauerstoff, sowie die nötige
Entfernung von gasförmigen Stoffwechselprodukten (insbesondere
Kohlendioxid) der Organismen.
- 2. Die oszillierende Bewegung verbessert den Stoffaustausch
signifikant gegenüber einer statisch angeordneten Membranfläche,
die über ein zusätzliches Rührwerk angeströmt
wird. Ein zusätzliches Rührwerk ist nicht notwendig.
- 3. Die oszillierende Bewegung hat überraschenderweise
eine reduzierende Wirkung auf die Bildung von Ablagerungen und Agglomeraten,
sowohl auf Ablagerungen und Agglomerate, die sich auf der Membranfläche
festsetzen, als auch auf Ablagerungen und Agglomerate, die sich
auf anderen Elementen/Flächen innerhalb des Bioreaktors
festsetzen.
-
Es
ist denkbar, zusätzlich zur diskontinuierlichen Bewegung
der Membranfläche auch noch eine diskontinuierliche Bewegung
einer oder mehrerer Sonden (pH-Sonde, Thermometer, Elektrode zur
Bestimmung des Sauerstoffgehalts und ähnliche Sonden) in
dem Bioreaktor auszuführen. Bevorzugt werden dabei eine oder
mehrere Sonden mit der Membranfläche ggf. über
eine gemeinsame Halterung verbunden, sodass Membranfläche
und Sonde(n) zu einer gemeinsamen/gekoppelten Bewegung veranlasst
werden. Auf diese Weise werden Ablagerungen auf den Sonden wirksamer
vermieden.
-
Beispiele
-
Die
Erfindung wird nachstehend anhand von Beispielen näher
erläutert, ohne sie jedoch auf diese zu beschränken.
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Beispiel 1: Vorrichtung zur Ausführung
des erfindungsgemäßen Verfahrens
-
In 1 ist
schematisch ein Beispiel einer Vorrichtung zur Ausführung
des erfindungsgemäßen Verfahrens dargestellt.
Die Membranfläche wird durch Membranschläuche
(1) gebildet, die an einer Rotorwelle (2) vertikal
quer zur Rotationsrichtung (3) angeordnet sind. Durch die
Membranschläuche kann sauerstoffhaltiges Gas zur Versorgung
von Organismen gepumpt werden. Die Vorrichtung wird bevorzugt innerhalb
eines Bioreaktors (4) betrieben. Bevorzugt taucht die Membranfläche
vollständig in das Kulturmedium ein, d. h. die Flüssigkeitsoberfläche
(5) befindet sich im Betrieb oberhalb der Membranfläche.
Die Vorrichtung kann eine rotatorische Bewegung um die Rotorwelle
(2) ausführen. Bevorzugt führt sie eine
rotatorisch oszillierende Bewegung aus. Diese Bewegung führt
zum einen zu einer verbesserten Versorgung der Organismen im Bioreaktor
und zum anderen zu einer deutlich verringerten Neigung zur Bildung
von Ablagerungen und Agglomeraten (im Vergleich zu einer statischen
Membranfläche, die durch ein Rührwerk angeströmt
wird).
-
2 zeigt
die fotografische Aufnahme einer Vorrichtung zur Aufnahme von Membranschläuchen.
Die Vorrichtung umfasst oben zwei konzentrische Verteilerringe zur
Zu- und Abfuhr von Gas. Meist wird der äußere zur
Gaszufuhr verwendet, damit das sauerstoffreiche Gas zuerst in die
Schlauchabschnitte gelangt, welche am weitesten entfernt von der
Rotorwelle sind und damit am besten angeströmt werden.
Die Verteilerringe haben in diesem Beispiel jeweils 16 Stutzen,
welche die Versorgung der Membranschlauchsegmente auf den bis zu
16 Rotorarmen erlauben. Hierbei zeigt das Foto den Rotor mit nur
8 montierten Rotorarmen, wobei die 8 verbleibenden möglichen
Rotorarme jeweils zwischen den jetzigen montiert werden würden.
Pro Rotorarm ist in diesem Beispiel ein Membranschlauchsegment von
57 m Länge aufgewickelt. Erfolgt jetzt eine Drehung des Rotors,
so werden die Membranschläuche durch das Fluid im Reaktor
bewegt und dadurch tangential angeströmt.
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Die
in 2 dargestellte Vorrichtung zur Durchführung
des erfindungsgemäßen Verfahrens dient der Begasung
eines Zellkultur-Bioreaktors mit bis ca. 200 L Flüssigvolumen,
wobei der Reaktorinnendurchmesser 510 mm beträgt und das
Höhe zu Durchmesser-Verhältnis 2:1. Die zentrische
Rotorwelle besitzt einen Durchmesser von 20 mm und der Rotor einen
Außendurchmesser von 409 mm. Die Rotorarme haben in der
Vertiefung, in welcher der Membranschlauch geführt ist,
einen Radius von 7,7 mm. Um das Verrutschen der Membranschläuche
aus Silikon mit Innendurchmesser 1,98 mm und Außendurchmesser
3,18 mm zu verhindern, sind parallele Vertiefungen mit Abstand von
3,65 mm hergestellt. Die Differenz von 3,65 mm gegenüber
3,18 mm ergibt sich aus der Motivation, dass die Membranschläuche
auch im druckbeaufschlagten Zustand (bis 1,5 bar Überdruck)
noch Platz zur Volumenvergrößerung („Aufblähen”)
haben, wodurch der Druckverlust in der Schlauchumlenkung minimiert
wird.
-
Als
Rotorantrieb kann z. B. ein Schrittmotor mit einer Maximaldrehzahl
von 2500 min–1, einem Stillstandsmoment
von 5,8 Nm und einer Getriebeuntersetzung von 1:12 eingesetzt werden.
-
In
Tabelle 1 sind Beispiele für Winkelbeschleunigungen und
maximale Winkelgeschwindigkeiten sowie für maximale Geschwindigkeiten
der Rotorarmenden, also derjenigen Punkte des Rotors, die sich am
schnellsten bewegen, exemplarisch für drei Maßstäbe
in der angegebenen Konfiguration aufgeführt.
| | 15
L Zellkultursystem | 20
L Zellkultursystem | 200
L Zellkultursystem |
| Füllvolumen | [L] | 12 | 20 | 200 |
| Winkelbeschleunigung | [rads–2] | 4,3 | 3,7 | 0,75 |
| Winkelverzögerung | [rads–2] | 4,3 | 3,7 | 0,75 |
| Zeit
für eine Hinbewegung | [ms] | 1250 | 2000 | 4000 |
| überstrichener
Winkel | [°] | 90 | 180 | 180 |
| max.
Winkelgeschwindigkeit | [rads–1] | 2,7 | 3,7 | 1,5 |
| Rotordurchmesser | [m] | 0,2 | 0,2 | 0,41 |
| max.
Geschwindigkeit der Rotorenden | [ms–1] | 0,27 | 0,37 | 0,31 |
| Schlauchlänge | [m] | 65 | 105 | 755 |
| Membranfläche
pro Füllvolumen | [m2m–3] | 54,1 | 52,5 | 37,7 |
| ca.
Leistungseintrag pro Füllvolumen | [Wm–3] | 12 | 11,1 | ~10 |
- * im geometr. ähnlichen Modellsystem
gemessen
-
Tabelle 1
-
Beispiel 2: Einsatz des erfindungsgemäßen
Verfahrens zur Kultivierung einer klebrigen humanen Hybrid-Zeillinie
HKB-11
-
Das
erfindungsgemäße Verfahren wurde beispielhaft
bei der Kultivierung der humanen Zelllinie HKB-11 zur Produktion
von Blutgerinnungsfaktor VIII (Mei, Baisong et al., "Expression
of Human Coagulation Factor VIII in a Human Hybrid Cell Line",
HKB11, Molecular Biotechnology. 34(2): 165–178, Oktober
2006) eingesetzt. Diese Zelllinie weist eine sehr hohe
Neigung zur Aggregatbildung auf.
-
Daneben
wurde dieselbe Zelllinie in einem Referenzverfahren (nicht erfindungsgemäß)
kultiviert, um einen Vergleich der Verfahren vornehmen zu können.
-
Das
erfindungsgemäße Verfahren wurde in einem 15 L-Bioreaktor
der Firma Applikon durchgeführt. Der Bioreaktor war mit
einem Rotor ausgestattet, an dem eine Membranfläche in
Form von Silikonschläuchen (SILASTIC RX 50 Medical Grade
Tubing Special, 0.078 in. (1.98 mm) ID × 0.125 in. (3.18
mm) OD (500 ft roll, Dow Corning)) angebracht war. Die Membranschläuche
waren auf den 8 Armen des Rotors, die sternförmig um eine
Rotorwelle angebracht waren, befestigt. Die Gesamtlänge
an Membranschläuchen betrug 58,7 m (48,8 m2 Membranoberfläche
pro m3 Reaktorvolumen bei 12 L Füllvolumen),
wobei die zwei innersten Reihen der Rotorarme nicht bewickelt wurden.
Die vollständige Bewicklung hätte einer Gesamtlänge
an Membranschlauch von 65 m entsprochen (54,1 m2 Membranoberfläche
pro m3 Reaktorvolumen bei 12 L Füllvolumen). Der
Rotor konnte über einen Servomotor (Modell Nr. 23S21, Jenaer
Antriebstechnik, Jena, Deutschland) mit einen Stillstandsmoment
von 0,9 Nm, an den ein Planetengetriebe mit einer Untersetzung von
1:12 geflanscht war, in eine diskontinuierliche Bewegung versetzt
werden. Informationen zur verwendeten humanen HKB-Zelllinie sind
der folgenden Literatur zu entnehmen: Mei, Baisong et al., "Expression
of Human Coagulation Factor VIII in a Human Hybrid Cell Line",
HKB11, Molecular Biotechnology. 34(2): 165–178, Oktober
2006.
-
Über
die Membranfläche (Membranschläuche) wurden die
Zellen mit Sauerstoff versorgt und von Kohlendioxid befreit. Der
Gasdurchsatz betrug 1 Normliter pro Stunde. Der Gasfluss durch die
Membranschläuche der 8 Rotorarme wird am Ende der Membranschläuche
wieder zusammengeführt und durch einen flexiblen Schlauch
zum Bioreaktordeckel geführt. Dort wird der Gegendruck
am Gasausgang zwischen 5 und 15 psig variiert. Dies bietet die Möglichkeit,
die Gastransfereigenschaften gezielt zu beeinflussen. Durch den
Kopfraum des Fermenters wurde während der Kultivierung
kontinuierlich ein Luftstrom von 1 Normliter pro Stunde per Zuluft-
und Abluftstutzen geleitet. Informationen zum Aufbau der Anlage
zum kontinuierlichen Zellkulturbetrieb sind
WO 2003/020919 A1 zu
entnehmen.
-
Erfindungsgemäß wurde
die Membranfläche innerhalb des Kulturmediums in eine rotatorisch
oszillierende Bewegung versetzt. Der Bewegungsablauf war wie folgt:
ausgehend von einem der Punkte der Drehrichtungsumkehr wurde die
Membranfläche mit einer konstanten Winkelbeschleunigung
von 11 rads–2 für eine Dauer
von 400 ms beschleunigt und daraufhin für den gleichen
Zeitraum mit einer der betragsmäßig gleichen Winkelbeschleunigung
verzögert, so dass er nach 800 ms wiederum zum Stillstand
kam. Der dabei überstrichene Winkel beträgt 90°.
Der Leistungseintrag beläuft sich auf ca. 56 Wm–3. Die maximale Geschwindigkeit der
Rotorenden beträgt ca. 0,44 ms–1.
-
Das
erfindungsgemäße Verfahren wird nachfolgend als
DMA-Verfahren (Dynamic Membrane Aeration) und die entsprechende
Vorrichtung zur Ausführung des erfindungsgemäßen
Verfahrens als DMA-Reaktor bezeichnet.
-
Das
Referenzverfahren wurde ebenfalls in einem baugleichen 15 L-Bioreaktor
(Referenzreaktor) der Firma Applikon ausgeführt. Dieser
war mit einer statischen Membranfläche und einem Ankerrührer
ausgestattet. Die statische Membranfläche umfasste 49,6
m Schlauchlänge (entsprechend 41,3 m2 Membranoberfläche pro
m3 Reaktorfüllvolumen) des obig
genannten Silikonschlauches (für DMA- und Referenzsystem
wurde das gleiche Silikonschlauchfabrikat verwendet). Die Durchflussrate
durch die Membranschläuche betrug 0,5 Normliter pro Stunde.
Der firmenintern entworfene Ankerrührer diente der Anströmung
der Membranfläche zur Verbesserung des Stoffaustauschs
(Sauerstoffzufuhr, Kohlendioxidabfuhr). Der Ankerrührer
wurde mit einer konstanten Drehzahl von 150 rpm (entsprechend ca.
165 Wm–3) betrieben. Diese hohe
Rührerdrehzahl bzw. dieser hohe Leistungseintrag, welcher
ansonsten aus Gründen der Zellschädigung und unerwünschten
Nebenproduktbildung vermieden wird, war zur Vermeidung/Begrenzung
von Zellagglomeration und Ablagerungen erforderlich.
-
Informationen
zum Aufbau der Anlage zum kontinuierlichen Zellkulturbetrieb und
zum Zellabscheider sind wiederum
WO 2003/020919 A1 zu entnehmen.
-
Zum
Beimpfen des Referenzsystems wurde Zellinokulum eingesetzt, welches
im Vorfeld in Schüttelkolben in adäquater Menge
herangezüchtet wurde. Das Beimpfen des 15 L DMA Reaktors
erfolgte mit Zellen aus dem 15 L Referenzsystems, wodurch die Vergleichbarkeit
beider Systeme hinsichtlich gemeinsamer Zellquelle und bis auf den
geringen Zeitunterschied auch hinsichtlich gleichen Zellalters gegeben
ist. Beispiele der Animfzelldichten sind 3 und 4 zu
entnehmen.
-
Sowohl
aus dem DMA-Verfahren als auch dem Referenzverfahren wurden täglich
Proben aus dem Bioreaktor und dem Erntestrom genommen, die auf Zelldichte,
Vitalität, Aggregationsrate, offline-pH-Wert, Konzentration
an gelöstem Sauerstoff und gelöstem Kohlendioxid,
Konzentration an Glukose, Laktat, Glutamin, Glutamat, Ammonium,
LDH und Titer (Blutgerinnungsfaktor VIII (rFVIII)) analysiert wurden.
-
3 zeigt
die zeitliche Entwicklung der Dichte an lebenden Zellen (a) beim
DMA-Verfahren und (b) im Referenzverfahren in einer ersten Zellkultivierung.
Aufgetragen ist jeweils die Dichte cd an lebenden Zellen in der
Einheit [106 Zellen mL–1]
gegen die Zeit t in der Einheit [Tage]. Die Zelldichte wurde anhand
eines CEDEX Systems (Innovatis GmbH, Bielefeld, Deutschland) bestimmt.
Um den Einfluss von Zellagglomeration zu minimieren und eine möglichst
representative Zelldichte zu ermitteln, erfolgte vorher eine Pipettierung,
wodurch die Zellagglomerate durch die Scherkräfte in der
Pipette weitgehend aufgelöst werden. In 3(b) ist
ein Abfall der Zelldichte nach 53 Tagen auf etwa 10 × 106 Zellen mL–1 zu
beobachten. Ursache waren Ablagerungen auf den Membranschläuchen,
die offensichtlich zu einem geringeren Sauerstoffeintrag führten.
Das DMA-Verfahren zeigte diese Ablagerungen nicht; hier konnte eine
hohe Zelldichte über den gesamten Beobachtungszeitraum
hinweg aufrecht erhalten werden.
-
Nach
der ersten Zellkultivierung wurde der Bioreaktor des DMA-Verfahrens
nur mit Medium (Mediumformulierung unterliegt der Geheimhaltung)
gewaschen. Dabei blieben Ablagerungen auf den Sensoren und der Membranfläche
bestehen. Anschließend wurde eine zweite Zellkultivierung
mit frisch angezogenen Zellen durchgeführt. Die Vorgehensweise
diente der Simulation einer Langzeitkultivierung.
-
4 zeigt
die zeitliche Entwicklung der Dichte an lebenden Zellen (a) beim
DMA-Verfahren und (b) im Referenzverfahren in der zweiten Zellkultivierung.
Aufgetragen ist jeweils die Dichte cd an lebenden Zellen in der
Einheit [106 Zellen mL–1]
gegen die Zeit t in der Einheit [Tage].
-
Im
DMA-Verfahren konnte eine Zelldichte von über 15 × 106 Zellen mL–1 nach
knapp 7 Tagen Kultivierung erreicht und gehalten werden. Im Referenzverfahren
wurde eine solche Zelldichte nicht erreicht; die Produktionsrate
war entsprechend geringer. Zu beachten ist
-
In
beiden Zellkulturen zeigte das DMA-Verfahren somit eine höhere
Zelldichte und damit eine höhere Produktionsrate als das
Referenzverfahren. Ursächlich war nachweislich die verminderte
Neigung zur Bildung von Ablagerungen im DMA-Verfahren gegenüber
dem Referenzverfahren.
-
In
dem Beispiel ergaben sich zusammenfassend die folgenden Vorteile
des erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber
dem beschriebenen Referenzverfahren:
- – Erhöhter
Sauerstoffeintrag; die Zelldichte lag beim DMA-Verfahren während
der gesamten Kultivierungszeit im Durchschnitt höher als
beim Referenzverfahren.
- – Beim DMA-Verfahren wurden weniger Ablagerungen sowohl
an den Membranschläuchen als auch an den unbewegten Teilen
des Bioreaktors und an den Sonden beobachtet.
- – Beim DMA-Verfahren konnten mit ca. ein Drittel des
Leistungseintrages des Referenzsystems vergleichbare Strömungsbedingungen
erzielt werden (bezogen auf die Scherrate).
- – Das DMA-Verfahren zeigte keine nachteiligen Effekte
auf die Zellbiologie (Apoptose und Zellzyklus).
-
Abbildungen
-
1:
Schematische Darstellung einer rotatorisch oszillierenden Bewegung
zur Be- und Entgasung von Flüssigkeiten mittels einer Membranfläche
in einem Behältnis.
-
2:
Fotografische Aufnahme einer Vorrichtung zur Aufnahme einer Membranfläche:
Membranschläuche sind auf die sternförmig angeordneten
Arme eines Rotors gewickelt.
-
3:
Grafische Darstellung der zeitlichen Entwicklung der Dichte an lebenden
Zellen (a) beim DMA-Verfahren und (b) im Referenzverfahren in einer
ersten Zellkultivierung. Aufgetragen ist jeweils die Dichte cd an
lebenden Zellen in der Einheit [106 Zellen
mL–1] gegen die Zeit t in der Einheit
[Tage].
-
4:
Grafische Darstellung der zeitlichen Entwicklung der Dichte an lebenden
Zellen (a) beim DMA-Verfahren und (b) im Referenzverfahren in einer
zweiten Zellkultivierung. Aufgetragen ist jeweils die Dichte cd
an lebenden Zellen in der Einheit [106 Zellen
mL–1] gegen die Zeit t in der Einheit
[Tage].
-
- 1
- Membranschläuche
- 2
- Rotorwelle
- 3
- Rotationsrichtung
- 4
- Bioreaktor
- 5
- Flüssigkeitslevel
-
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
-
Diese Liste
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erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information
des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen
Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt
keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
-
Zitierte Patentliteratur
-
- - EP 0242984
B1 [0004, 0007, 0007]
- - EP 0422149 B1 [0007, 0008]
- - EP 1935973 A1 [0008, 0008]
- - EP 01724781 B [0009, 0012]
- - EP 02405601 B [0009, 0012]
- - WO 2007098850 A1 [0011, 0012, 0012, 0044]
- - WO 86/07604 A1 [0013]
- - EP 1948780 [0028]
- - WO 07/051551 A1 [0028]
- - WO 07/0988501 A [0028]
- - WO 2003/020919 A1 [0058, 0062]
-
Zitierte Nicht-Patentliteratur
-
- - H.-J. Henzler
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- - H.-J. Henzler, J. Kauling: „Oxygenation of cell cultures” Bioprocess
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- - H.-J. Henzler, J. Kauling: „Oxygenation of cell cultures” Bioprocess
Engineering 9 (1993) S. 61–75 [0009]
- - H.-J. Henzler, J. Kauling: „Oxygenation of cell cultures” Bioprocess
Engineering 9 (1993) S. 61–75 [0010]
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Engineering 9 (1993) S. 61–75 [0028]
- - H. N. Qi, C. T. Goudar, J. D. Michaels, H.-J. Henzler, G.
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- - Mei, Baisong et al., ”Expression of Human Coagulation
Factor VIII in a Human Hybrid Cell Line”, HKB11, Molecular
Biotechnology. 34(2): 165–178, Oktober 2006 [0057]