DE102008028295A1 - Immunological on-site-rapid test kit for detecting surface protein of pathogen, i.e. Borrelia burgdorferi, after the stinging or biting of the arthropods - Google Patents
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Abstract
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein immunologisches Vor-Ort-Schnelltestkit zum direkten Nachweis von Borrelia burgdorferi sensu lato in Arthropoden.The The present invention relates to an on-site rapid immunological test kit for direct detection of Borrelia burgdorferi sensu lato in arthropods.
Es gibt weltweit eine Vielzahl von Arthropoden, die menschliche oder tierische Wirte durch Stich oder Biß befallen. Diese Arthropoden sind Überträger einer Vielzahl von Krankheitserregern, z. B. Viren, Bakterien, Protozoen oder Würmern. Der bekannteste von Arthropoden, insbesondere Zecken, übertragene Krankheitserreger ist Borrelia burgdorferi, der Lyme-Borreliose hervorruft.It There are a variety of arthropods, human or human, worldwide animal hosts affected by sting or bite. These arthropods are carriers of a variety of pathogens, z. As viruses, bacteria, protozoa or worms. The best known of arthropods, especially ticks, transmitted pathogens is Borrelia burgdorferi, which causes Lyme disease.
Die Lyme-Borreliose oder Lyme-Krankheit ist eine Infektionskrankheit, die durch das Bakterium Borrelia burgdorferi aus der Gruppe der Spirochäten ausgelöst wird. Die Borrelien ziehen sich schon bald nach der Infektion aus dem Blutkreislauf in das Gewebe zurück. Es kann jedes Organ, das Nervensystem, die Gelenke und das Gewebe befallen werden. Deshalb spricht man bei dieser Erkrankung auch von einer multisystemischen Krankheit. Die Erkrankung kommt beim Menschen und allen anderen Säugetieren, sowie Vögeln vor.The Lyme disease or Lyme disease is an infectious disease, which is caused by the bacterium Borrelia burgdorferi from the group of Spirochaetes is triggered. The Borrelia are pulling soon after infection from the bloodstream into the Tissue back. It can be any organ, the nervous system, that Joints and the tissue are attacked. That is why we speak this disease also from a multisystemic disease. The Disease occurs in humans and all other mammals, as well as birds.
Der Krankheitsverlauf der Lyme-Borreliose zeichnet sich in Stadien ab. In Folge des Zeckenstichs kommt es nach einer Inkubationszeit von mehreren Tagen bis wenigen Wochen zunächst zu einer Lokalinfektion (Stadium I; Erythema migrans), im weiteren Verlauf zu einer Erregergeneralisation (Stadium II; Symptome am Nervensystem, am Herzen oder an Gelenken) und nach Monaten oder Jahren zu einer Organmanifestation (Stadium III, spätes Stadium; Lyme-Arthritis oder Acrodermatitis chronica atrophicans). Die einzelnen Erkrankungsstadien können aber auch übersprungen werden, so dass z. B. die typische Wanderröte (Erythema migrans) ausbleibt. Eine spontane Ausheilung ist in seltenen Fällen möglich.Of the Disease progression of Lyme borreliosis is characterized by stages. As a result of the tick bite occurs after an incubation period of several days to a few weeks initially to a local infection (Stage I, erythema migrans), later on to an exciter generalization (Stage II; nervous system, heart or joint symptoms) and after months or years to organ manifestation (stage III, late stage; Lyme arthritis or acrodermatitis chronica atrophicans). The individual disease stages can but also be skipped so that z. B. the typical Wanderer (Erythema migrans) is missing. A spontaneous healing is rare Cases possible.
Insgesamt ist sowohl die klinische als auch die Labordiagnostik der Lyme-Borreliose schwierig und in einigen Krankheitsfällen mit großer Unsicherheit behaftet. Da der direkte Nachweis des Erregers in Materialien von Patienten als unzuverlässig gilt, werden meist serologische Verfahren als Hilfestellung für die Diagnose verwendet. In frühen Krankheitsstadien werden jedoch häufig nicht erhöhte Antikörpertiter gefunden, obwohl eine Infektion stattgefunden hat, so daß hier die Serologie bisweilen kein verläßliches Kriterium darstellt. Dies trifft teilweise sogar auf die Neuroborreliose zu, die ein bedrohliches Krankheitsbild darstellen kann und deren Abgrenzung von neurologischen Erkrankungen anderer Ursache von großer Bedeutung ist.All in all is both clinical and laboratory diagnostics of Lyme disease difficult and in some cases of illness with big ones Uncertainty. Because the direct detection of the pathogen in materials Patients are considered to be unreliable, are usually serological Procedure used as aid to the diagnosis. However, in early stages of the disease become common not found increased antibody titers, though an infection has taken place, so here's the serology sometimes not a reliable criterion. This is partly true even of neuroborreliosis, the one threatening clinical picture and their demarcation of neurological diseases of other cause of great Meaning is.
Bei der Borreliose ist es von äußerster Wichtigkeit, die Krankheit so früh wie möglich zu erkennen und mit einer Behandlung zu beginnen. Nur dann bestehen die besten Heilungschancen für den Patienten.at Lyme disease is of the utmost importance to recognize the disease as early as possible and to start with a treatment. Only then will the best chances of recovery exist for the patient.
Ein erster Schritt dabei ist es, den Arthropoden direkt und so schnell wie möglich auf die Krankheitserreger zu untersuchen. So kann ein erstes Indiz für ein Ansteckungsrisiko erbracht werden.One The first step is to get the arthropod directly and so fast as possible to examine the pathogens. So can provide a first indication of contagion risk become.
Angaben über
das Infektionsrisiko nach Zeckenstich sind bislang spärlich
und meist ohne Bezug zur Positivität oder Negativität
der Zecke ermittelt worden. Amerikanische Untersuchungen gehen davon
aus, daß 1–3% der Zeckenstiche in Endemiegebieten
zur Infektion mit Borrelia burgdorferi führt. Dabei kommen
Ein
Direktnachweis von Borreliose-Erregern in der Zecke mittels einem
PCR-Labor-Verfahren (
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand deshalb darin, ein Testkit bereitzustellen, mit dem es möglich ist, direkt nach Arthropodenstich die Arthropode an Ort und Stelle auf Borrelien zu untersuchen. So kann nützliche Zeit gespart werden, um eine erste Abschätzung des Infektionsrisikos zu erhalten. Der/Die Gestochene kann mit diesem Indiz sofort zum Arzt gehen, um eine geeignete Therapie zu besprechen und/oder einzuleiten. Mit Hilfe des Vor-Ort-Schnelltestkits kann der Arzt, unterstützend zu den Krankheitszeichen, seine Diagnose treffen und schnell eine geeignete Therapie einleiten.The It is an object of the present invention to provide a test kit with which it is possible, directly after arthropod sting to examine the arthropod on the spot for Borrelia. So useful time can be saved to make a first estimate to get the infection risk. The / the stingy can with this Indicate immediately go to the doctor to discuss appropriate therapy and / or initiate. Using the on-site quick test kit can the doctor, supporting to the signs of disease, his Make a diagnosis and quickly initiate appropriate therapy.
Erfindungsgemäß wird dies durch ein immunologischen Vor-Ort-Schnelltestkit gemäß Anspruch 1 erreicht. Vorteilhafte Ausgestaltungen ergeben sich aus den Unteransprüchen.According to the invention this by an on-site rapid immunological test kit according to claim 1 reached. Advantageous embodiments emerge from the subclaims.
Das erfindungsgemäße immunologischen Vor-Ort-Schnelltestkit beruht darauf, dass die Krankheitserreger in der Zecke Oberflächenproteine besitzen, die spezifisch für Borrelia burgdorferi sensu lato sind und die es nachzuweisen gilt.The immunological on-site rapid test kit according to the invention Based on the pathogens in the tick surface proteins possess specific to Borrelia burgdorferi sensu lato are and it must be proven.
Der Ausdruck ”Arthropode” umfasst die Begriffe Insekten, insbesondere Zecken und Mücken, Spinnen und Krebse. Desweiteren umfaßt der Ausdruck ”Krankheitserreger” Viren, Bakterien, Protozen und Würmer.The term "arthropod" includes the terms insects, especially ticks and mosquitoes, Spiders and crabs. Furthermore, the term "pathogens" includes viruses, bacteria, protozoa and worms.
Der Nachweis der Oberflächenproteine des Krankheitserregers im Arthropoden erfolgt mit Hilfe eines immunologischen Vor-Ort-Schnelltestkits. Dafür wird der Arthropode vom Wirt entfernt, in einer speziellen Pufferlösung aufbereitet und in eine Testkassette gegeben. Dort wird das Vorhandensein spezifischer Oberflächenproteine und somit das Vorhandensein von Borrelien in der Zecke nachgewiesen.Of the Detection of surface proteins of the pathogen in arthropods using an immunological on-site rapid test kit. For this, the arthropod is removed from the host, in a special Buffer solution prepared and placed in a test cassette. There is the presence of specific surface proteins and thus detected the presence of Borrelia in the tick.
Die Erfindung besteht darin, dass mit diesem immunologischen Vor-Ort-Schnelltestkit die Arthropode entfernt, direkt vor Ort und nach dem Stich auf Krankheitserreger untersucht werden kann. Das Ergebnis liegt innerhalb von 10 Minuten vor.The Invention is that with this on-site immunological rapid test kit the arthropod removed, on the spot and after the bite on pathogens can be examined. The result is within 10 minutes in front.
Die Vorteile gegenüber den bisherigen Tests sind, dass der Test jederzeit und an jedem Ort ohne jegliche Hilfsmittel angewendet werden kann. Das Einschicken der Zecke ist nicht mehr notwendig und keine Wartezeiten von 2–3 Tagen sind mehr notwendig.The Advantages over the previous tests are that of Test applied anytime and anywhere without any aids can be. Submitting the tick is no longer necessary and no waiting times of 2-3 days are more necessary.
Im Nachfolgenden wird das erfindungsgemäße immunologischen Vor-Ort-Schnelltestkit am Beispiel zum Nachweis von Zecken beschrieben, die Borrelia burgdorferi, den Erreger der Lyme-Borreliose in sich tragen. Dieser Erreger liegt im Mitteldarm der Zecken, nicht jedoch oder nur selten im Speichel dieser vor. In einer ersten Phase nach Zeckenstich wird Zeckenspeichel in die Stichwunde eingebracht, welcher anästhesierende und gewebsverflüssigende Eigenschaften besitzt. In einer zweiten Phase werden Blut und Gewebsbestandteile angesaugt. In dieser Phase kommt es oftmals zur Regurgitation von Mitteldarminhalt, welcher Krankheitserreger, insbesondere Borrelien, enthalten kann, in die Stichwunde.in the Subsequently, the immunological according to the invention On-site rapid test kit described for the detection of ticks the Borrelia burgdorferi, the causative agent of Lyme disease in itself wear. This pathogen is located in the midgut of the ticks, but not or rarely in saliva this before. In a first phase after Tick bite is introduced into the puncture wound tick saliva, which anesthetizing and tissue-liquefying properties has. In a second phase, blood and tissue components become sucked. Regurgitation of midgut content often occurs during this phase. which pathogen, in particular Borrelia, may contain, in the puncture wound.
Borrelien weisen zahlreiche Operflächenproteine auf, die als OspA bis OspF bezeichnet werden, wobei vor allem OspA, OspB und OspC eine wichtige Rolle bei der Pathogenese zu spielen scheinen. OspA wird von Borrelien im Darm der Zecke exprimiert, aber nach einsetzender Blutmahlzeit, Wanderung in die Speicheldrüse und beim Blutkontakt des Säugewirtes herunterreguliert und es findet dann eine Expression von OspC statt. (Ohnishi 2001).Borrelia have numerous opera surface proteins known as OspA are designated OspF, especially OspA, OspB and OspC play an important role in the pathogenesis. OspA is expressed by Borrelia in the intestine of the tick, but after onset Blood meal, migration into the salivary gland and blood contact down regulated by the Säuwirirtes and then it finds one Expression of OspC instead. (Ohnishi 2001).
Der immunologische Vor-Ort-Schnelltest basiert auf dem immunologischen „sandwich assay” zum Nachweis von Oberflächenproteinen der Gruppe Borrelia sensu lato. Anti-Borrelien Antikörper sind auf der Testlinie und Kaninchen anti-Huhn Antikörpern auf der Kontrolllinie fixiert. Auf der einen Seite der Membran befindet sich ein angefärbtes Vlies, welches mit einem Maus anti-Borrelien-Antikörper-Goldkonjugat getränkt ist.Of the immunological on-site rapid test is based on the immunological "sandwich assay "for the detection of surface proteins of Group Borrelia sensu lato. Anti-Borrelia antibodies are on the test line and rabbit anti-chicken antibodies on the Control line fixed. Located on one side of the membrane a stained nonwoven which contains a mouse anti-Borrelia antibody-gold conjugate is soaked.
Bei der Durchführung des Tests wird das Borrelien-Antigen aus der Zecke unter Benutzung der Extraktionsreagenzien (Probengefäß mit Pufferlösung), einer Zerkleinerungshilfe und der Pipette auf den Test gebracht. Hierbei reagiert das Borrelien-Antigen mit den farbigen Goldkonjugat-Partikeln zu einem Komplex.at The Borrelia antigen is used to carry out the test the tick using the extraction reagents (sample vessel with Buffer solution), a comminution aid and the pipette put to the test. Here, the Borrelia antigen reacts with the colored gold conjugate particles into a complex.
Die Zerkleinerungshilfe umfasst die Begriffe Plastikstab, Pistill, Rührstab, Einmal-Rührstab, Einmal-Pistill.The Shredding aid includes the terms plastic rod, pestle, stir bar, Disposable stir bar, disposable pestle.
Bei dem Probengefäß handelt es sich um Begriffe wie Eppendorftube, Kryoröhrchen, Reaktionsgefäß, Cup und Vial.at the sample vessel is a term such as Eppendorf tube, cryotube, reaction tube, Cup and Vial.
Durch die Wirkung von Kapillarkräften läuft das Probengemisch auf der Membran und bindet an die Testlinie, die sich rot anfärbt.By the effect of capillary forces runs the sample mixture on the membrane and binds to the test line, which turns red.
Ist Borrelien-Antigen vorhanden, bildet sich im Bereich „T” eine rote Linie durch Bildung des „sandwich”-Komplexes Festphasen-anti Borrelien-Antikörper/Borrelien-Antigen/anti Borrelien-Antikörper-Goldkonjugat. Bei Nichtvorhandensein von Borrelien erscheint keine Linie im Testfeld.is Borrelia antigen is present, forms in the area "T" one red line through formation of the "sandwich" complex Solid phase anti Borrelia antibody / Borrelia antigen / anti Borrelia antibodies-gold conjugate. Absence from Borrelia no line appears in the test field.
Unabhängig von dem Vorhandensein von Borrelien-Antigenen in der Probe reagiert die Probenmischung beim Passieren der Kontrolllinie „C” immer mit dem immobilisierten Kaninchen anti-Huhn Antikörper und bildet eine rote Linie.Independently reacted by the presence of Borrelia antigens in the sample the sample mixture always passes when passing the control line "C" with the immobilized rabbit anti-chicken antibody and forms a red line.
Die Anwesenheit dieser Linie dient zur Bestätigung, dass das richtige Probevolumen aufgetragen wurde und die Lösung ordnungsgemäß über die Membran gelaufen ist.The Presence of this line serves as confirmation that the correct sample volume was applied and the solution properly over the membrane is.
Erfindungsgemäß beinhaltet das immunologischen Vor-Ort-Schnelltestkit zur Durchführung des vorstehenden Verfahrens alle Materialien und Reagenzien, die für den Nachweis von Oberflächenproteinen von Krankkeitserregern in Arthropoden notwendig sind. Dazu gehören ein Probenröhrchen mit Pufferlösung, ein Teststreifen mit Testkassette, Pipette, eine Zerkleinerungshilfe, sowie eine Anleitung.Included in the invention the on-site immunological rapid test kit of the above method all materials and reagents which for the detection of surface proteins of Pathogens in arthropods are necessary. This includes a sample tube with buffer solution, a test strip with test cassette, pipette, a crushing aid, as well as a Manual.
Im Folgenden ist die genaue Beschreibung der Testdurchführung und Testauswertung dargestellt.in the The following is the detailed description of the test procedure and test evaluation shown.
TestdurchführungTest procedure
- 1. Zecke wird im Probengefäß mit dem beiliegenden Plastikstab zerkleinert (siehe Zeichnung 1)1. Tick is in the sample vessel with shredded on the enclosed plastic rod (see drawing 1)
- 2. Mit Hilfe der Pipette wird die Probe abgesaugt (siehe Zeichnung 2).2. The sample is aspirated using the pipette (see drawing 2).
- 3. 3 Tropfen der Probenlösung wird in die runde Probenöffnung der Testkassette gegeben (siehe Zeichnung 3)3. 3 drops of the sample solution is in the round Sample opening of the test cassette given (see drawing 3)
Testauswertungtest evaluation
Negativ:Negative:
In der Kontrollregion „C” erscheint nach 2–3 Minuten eine rot gefärbte Linie. In der Testregion „T” ist nach 10 min keine rote Linie sichtbar. Borrelien sind nicht nachweisbar.In the control region "C" appears after 2-3 minutes a red colored line. In the test region "T" is no red line visible after 10 minutes. Borrelia are not detectable.
Positiv:Positive:
Im Ergebnisfenster sind nach 10 Minuten 2 rote Linien (”T” und ”C”) zu erkennen. Dieses Ergebnis zeigt, dass Borrelien in der Probe vorhanden sind.in the Results window are 2 red lines ("T" and "C") after 10 minutes to recognize. This result shows that Borrelia is in the sample available.
Erscheinen innerhalb von 10 Minuten weder in der Kontrollregion noch in der Testregion eine Linie, so ist der Test ungültig. Die Untersuchung muss mit einem neuen Test wiederholt werden.Appear within 10 minutes neither in the control region nor in the Test region a line, the test is invalid. The investigation must be repeated with a new test.
Der Test wird spätestens nach 10 Minuten ausgelesen und mit den unten stehenden Ergebnissen verglichen. Später ausgelesene Ergebnisse sind nicht mehr verwertbar. (siehe Zeichnung 4).Of the Test is read out at the latest after 10 minutes and with compared to the results below. Later read out Results are no longer usable. (see drawing 4).
100 gesammelte Zecken wurden zunächst einzeln in Eppendorftubes überführt und nummeriert. Anschliessend wurde jede Probe mit PBS überschichtet und mittels eines Einmal-Pistills homogenisiert. Ein Teil des Homogenisats wurde für die Durchführung des Zeckentests Borreliose in das dazugehörige Probenröhrchen mit Pufferlösung überführt. Der Rest der Probe wurde für die Referenzanalyse eingefroren und je nach Bedarf wieder aufgetaut.100 Collected ticks were first transferred individually to Eppendorf tubes and numbered. Subsequently, each sample was overcoated with PBS and homogenized by means of a disposable pestle. Part of the homogenate was used to carry out the tick test Lyme disease transferred to the associated sample tube with buffer solution. Of the Rest of the sample was frozen for reference analysis and thawed as needed.
Der immunologischen Vor-Ort-Schnelltestkit wurde nach Anleitung durchgeführt und das Ergebnis (pos./neg.) notiert.Of the immunological on-site rapid test kit was performed according to instructions and the result (pos./neg.) noted.
Die dazugehörige eingefrorene Probe wurde dann mittels gattungsspezifischer Diagnostik-PCR untersucht, wobei eine für die Borrelia SP. Spezifische Bande als positiv und eine fehlende Bande als negativ ausgelegt wurde. Vorher ausgezählte Borrelien-Kulturen dienten dabei als Kontrollen und zur achweisgrenzenbestimmung, die mit ausgesuchten Proben durchgeführt wurden. Bei Unstimmigkeiten wurde als weitere Referenzmethode die Dunkelfeldmikroskopie herangezogenThe associated frozen sample was then sorted by genus Diagnostic PCR was investigated, with one for the Borrelia SP. Specific band as positive and a missing band as negative was designed. Previous counted Borrelia cultures served as controls and for the purpose of establishing the identity with selected samples. In case of discrepancies was as a further reference method the dark field microscopy was used
46 Zecken war laut der Referenzmethode Labor-PCR positiv, wovon das immunologische Vor-Ort-Schnelltestkit 44 Proben als positiv identifizierte. 49 von 52 Zecken konnen mit dem immunologischen Vor-Ort-Schnelltestkit als richtig negativ identifiziert werden.46 According to the reference method, ticks were laboratory PCR positive, of which the on-site rapid test kit identified 44 samples as positive. 49 out of 52 ticks can be treated with the on-site immunological rapid test kit be identified as being really negative.
Diese Daten zeigen, dass der immunologische Vor-Ort-Schnelltestkit eine schnell durchführbare Alternative zu dem PCR-Nachweisverfahren darstellt.These Data show that the immunological on-site rapid test kit a fast-acting alternative to the PCR detection method represents.
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Zitierte PatentliteraturCited patent literature
- - US 6087097 [0009] - US 6087097 [0009]
- - US 6051382 [0009] - US 6051382 [0009]
Zitierte Nicht-PatentliteraturCited non-patent literature
- - Magid et al., N. Engl. J. Med. 327, (1992), 534–541 [0008] Magid et al., N. Engl. J. Med. 327, (1992), 534-541 [0008]
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