DE102008019957A1

DE102008019957A1 - Verfahren zum Bestrahlen einer Probe mit Licht und Fluoreszenzlichtmikroskop mit einer Beleuchtungseinheit zum Bestrahlen einer Probe mit Licht

Info

Publication number: DE102008019957A1
Application number: DE200810019957
Authority: DE
Inventors: Stefan Prof. Dr. Hell; Alexander Dr. Egner; Roman Schmidt
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 2008-04-21
Filing date: 2008-04-21
Publication date: 2009-11-26
Anticipated expiration: 2028-04-22
Also published as: DE102008019957B4

Abstract

Bei einem Fluoreszenzlichtmikroskop (1) mit einer Beleuchtungseinheit zum Bestrahlen einer Probe (13) mit Licht weist die Beleuchtungseinheit auf: eine erste Lichtquelle (7) für einen ersten kohärenten Eingangslichtstrahl (13) einer ersten Polarisation; eine zweite Lichtquelle (8) für einen zweiten kohärenten Eingangslichtstrahl (14) einer zweiten Polarisation; einen Polarisationsstrahlteiler (24), der den ersten Eingangslichtstrahl in zwei erste Teilstrahlen und den zweiten Eingangslichtstrahl in zwei zweite Teilstrahlen aufteilt; zwei Objektive (28, 29) mit einer gemeinsamen Fokalebene (30), die jeweils einen der beiden ersten Teilstrahlen und einen der beiden zweiten Teilstrahlen in einen selbens Fokuspunkt (22) in der gemeinsamen Fokalebene (30) fokussieren; und zwischen dem Polarisationsstrahlteiler und die Objektive geschaltete optische Elemente (26, 27, 36), die die optischen Weglängen und die Polarisationen der beiden ersten Teilstrahlen zueinander und der beiden zweiten Teilstrahlen zueinander einstellen; wobei die erste Polarisation des ersten Eingangslichtstrahls so auf den Polarisationsstrahlteiler (24) abgestimmt ist und die optischen Weglängen und die Polarisation der beiden ersten Teilstrahlen mit den zwischen den Polarisationsstrahlteiler (24) und die Objektive (28, 29) geschalteten optischen Elementen (26, 27, 36) so zueinander eingestellt sind, dass die beiden ersten Teilstrahlen in dem gemeinsamen Fokuspunkt (22) mit einer ersten relativen Phase ...

Description

TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Bestrahlen einer Probe mit Licht, das die Merkmale des Oberbegriffs des unabhängigen Patentanspruchs 1 aufweist. Weiterhin bezieht sich die Erfindung auf ein Fluoreszenzlichtmikroskop mit einer Beleuchtungseinheit zum Bestrahlen einer Probe mit Licht, das die Merkmale des Oberbegriffs des unabhängigen Patentanspruchs 12 aufweist.
Ein erfindungsgemäßes Verfahren ist in der Fluoreszenzlichtmikroskopie, insbesondere bei Techniken der SIED-, GSD- oder RESOLFT-Fluoreszenzlichtmikroskopie einsetzbar. Es sind aber auch andere Anwendungen möglich, beispielsweise beim räumlich hoch aufgelösten Schreiben von Daten in einen Datenträger. Verwiesen sei hierzu beispielhaft auf die Verfahren, die aus der WO 2004/090950 A2 hervorgehen.
STAND DER TECHNIK
In der aus der DE 40 40 441 A1 bekannten, sogenannten 4Pi-Fluoreszenzlichtmikroskopie wird eine Probe über zwei Objektive, die eine gemeinsame Fokalebene im Bereich der Probe aufweisen, aus entgegen gesetzten Richtungen mit kohärentem, d. h. interferenzfähigem Licht bestrahlt, das in einen selben Fokuspunkt in der gemeinsamen Fokalebene fokussiert wird. Dabei bildet sich um den Fokuspunkt ein Interferenzmuster aus, das in dem Fokuspunkt ein Intensitätsmaximum aufweist. Das aus den entgegen gesetzten Richtungen kommende Licht wird mit einem Strahlteiler aus einem kohärenten Eingangslichtstrahl generiert und auf das Anregen eines Fluorophors in der Probe abgestimmt. Das von dem Fluorophor im Bereich des Intensitätsmaximums am Fokuspunkt emittierte Fluoreszenzlicht kann zwar aufgrund der Beugungsgrenze selbst mit einem konfokal zu dem Fokuspunkt angeordneten Detektor nicht getrennt von Fluoreszenzlicht gemessen werden, dass von dem Fluorophor im Bereich von Intensitätsmaxima zweiter Ordnung des Interferenzmusters auf beiden Seiten der gemeinsamen Fokalebene der Objektive emittiert wird, diese Anteile des Fluoreszenzlicht können aber aus der Räumlichen Verteilung der Fluoreszenzlichtintensität herausgerechnet werden.
Ein Verfahren mit den Merkmalen des Oberbegriffs des unabhängigen Patentanspruchs 1 und ein Fluoreszenzlichtmikroskop mit den Merkmalen des Oberbegriffs des unabhängigen Patentanspruchs 12 sind als Variante der 4Pi-Fluoreszenzlichtmikroskopie aus der WO 03/040706 A1 bekannt. Bei dieser sogenannten 4Pi-STED-Fluoreszenzlichtmikroskopie wird das Anregungslicht für den Fluorophor nur durch eines der beiden Objektive in die Probe fokussiert. Die sich dabei von dem Fokuspunkt auf beide Seiten der Fokalebene erstreckenden Bereiche erhöhter Intensität des Anregungslichts werden mit einem Interferenzmuster überlagert, das sich durch Interferenz von aus beiden Objektiven kommenden Anteilen wieder abregenden Lichts ausbildet. Dieses Interferenzmuster des wieder abregenden Lichts weist am Fokuspunkt ein Intensitätsminimum, vorzugsweise eine Nullstelle der Intensität auf, um am Fokuspunkt selbst die Anregung des Fluorophors in der Probe zur Emission von messbarem Fluoreszenzlicht nicht zu unterdrücken. Die Wellenfronten des wieder abregenden Lichts sind aber derart aberriert, dass die Intensitätsmaxima erster und zweiter Ordnung auf beiden Seiten der Fokalebene ineinander übergehen, um den Fluorophor dort möglicht lückenlos wieder abzuregen.
Um die zueinander kohärenten Anteile des wieder abregenden Lichts, die durch die beiden Objektive in denselben Fokuspunkt fokussiert werden, bereitzustellen, ist auch gemäß der WO 03/040706 A1 der Einsatz eines Strahlteilers vorgesehen, der einen kohärenten Eingangslichtstrahl in zwei Teilstrahlen aufteilt. Diese Teilstrahlen sind, wenn sie im Rahmen der Kohärenzlängen des Eingangslichtstrahls gleich lange optische Wege von dem Strahlteiler zu der gemeinsamen Fokalebene der Objektive zurücklegen, grundsätzlich miteinander interferenzfähig. Ob sie dabei am Fokuspunkt konstruktiv oder destruktiv interferieren, hängt davon ab, ob sich die Längen ihrer optischen Wege um ein ganzzahliges Vielfaches ihrer Wellenlänge, das auch null sein kann, unterscheiden oder ob der Unterschied ein ganzzahliges Vielfaches ihrer Wellenlänge plus eine halbe Wellenlänge beträgt. Hieraus ergibt sich, dass es nicht ohne Weiteres möglich ist, einen einzigen Strahlteiler sowohl für einen Eingangslichtstrahl zu verwenden, der in zwei Teilstrahlen aufgespalten werden soll, die in dem Fokuspunkt konstruktiv interferieren, als auch für einen Eingangslichtstrahl derselben Wellenlänge, der in Teilstrahlen aufgespalten werden soll, die in dem gemeinsamen Fokuspunkt destruktiv interferieren. Vielmehr müssen die optischen Wege zwischen dem Strahlteiler und den beiden Objektiven für die Teilstrahlen des einen Eingangslichtstrahls anders gestaltet werden als für die Teilstrahlen des anderen Eingangslichtstrahls. Dies ist in jedem Fall aufwändig und verlangt ausreichende Unterschiede zwischen den Teilstrahlen der beiden Eingangslichtstrahlen, die in derselben Richtung von dem Strahlteiler abgehen. Solche Unterschiede können zum Beispiel bei der Polarisationsrichtung dieser Teilstrahlen vorliegen. Polarisationsrichtungsunterschiede erlauben es, die Teilstrahlen der beiden Eingangslichtstrahlen unterschiedliche optische Wege laufen zu lassen oder relativ zueinander zu verzögern. Es versteht sich aber, dass dies nicht nur einen großen apparativen Aufwand sondern auch aufgrund der sich überschneidenden optischen Wege, die getrennt einzustellen sind, einen größeren Justageaufwand zur Folge hat. Zudem leidet die Abbildungsqualität des optischen Aufbaus.
Aus der allgemeinen SIED-Fluoreszenzlichtmikroskopie ist es bekannt, die Wellenfronten eines kohärenten Abregungslichtstrahls, der mit demselben Objektiv wie eine Anregungslichtstrahl in eine Probe fokussiert wird, mit einer eine zentrale Singularität aufweisenden helikalen Phasenrampe zu aberrieren. Das hieraus resultierende Interferenzmuster des abregenden Lichts weist eine Intensitätsnullstelle am Fokuspunkt auf, die in der Fokalebene des Objektivs von einem Doughnut-förmigen Intensitätsmaximum umgeben ist. Mit einer derartigen Intensitätsverteilung des abregenden Lichts ist die laterale Auflösung bei der STED-Fluoreszenzlichtmikroskopie erhöht, während bei der 4Pi-(SIED-)Fluoreszenzlichtmikroskopie die axiale Auflösung erhöht ist. Gewünscht wäre natürlich sowohl eine axiale als auch eine laterale Auflösungserhöhung.
Eine spezielle Form von Strahlteilern sind Polaristationsstrahlteiler, die auch als polarisierende Strahlteiler bezeichnet werden. Ein Polarisationsstrahlteiler teilt einen linear polarisierten Eingangslichtstrahl in zwei Teilstrahlen auf, deren Polarisationsrichtungen senkrecht zueinander verlaufen. Dabei ist die relative Intensität der Teilstrahlen von der Polarisationsrichtung des Eingangslichtstrahls, d. h. deren Winkel zu der strahlteilenden Ebene des Strahlteilers, abhängig. Diese Abhängigkeit wird ausgenutzt, um die Intensität der beiden Teilstrahlen, in die ein Eingangslichtstrahl aufgeteilt wird, genau gleich groß einzustellen, indem die Polarisationsrichtung des Eingangslichtstrahls variiert wird. Damit die beiden Teilstrahlen eines derart mit einem Polarisationsstrahlteiler aufgezeigten Eingangslichtstrahls miteinander interferieren können, muss Ihre Polarisation wieder zur Übereinstimmung gebracht werden. Dies kann dadurch geschehen, dass in einem Teilstrahl ein eine Lambda/2-Verzögerungsplatte angeordnet wird, so dass sich bei beiden Teilstrahlen lineare Polarisierung in die gleiche Richtung ergeben, oder dass in beiden Teilstrahlen Lambda/4-Verzögerungsplatten angeordnet werden, die beiden aus einander entgegen gesetzten Richtungen aufeinander treffenden Teilstrahlen gegensinnig zirkular polarisieren.
AUFGABE DER ERFINDUNG
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum Bestrahlen einer Probe mit Licht, das die Merkmale des Oberbegriffs des unabhängigen Patentanspruchs 1 aufweist, und ein Fluoreszenzlichtmikroskop mit einer Beleuchtungseinheit zum Bestrahlen einer Probe mit Licht, das die Merkmale des Oberbegriffs des unabhängigen Patentanspruchs 12 aufweist, aufzuzeigen, mit denen mit geringen apparativen und Justieraufwand Teilstrahlen beliebiger Wellenlängen im Bereich der gemeinsamen Fokalebene sowohl destruktiv als auch konstruktiv überlagert werden können.
LÖSUNG
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch ein Verfahren zum Bestrahlen einer Probe mit Licht, das die Merkmale des unabhängigen Patentanspruchs 1 aufweist, und ein Fluoreszenzlichtmikroskop mit einer Beleuchtungseinheit zum Bestrahlen einer Probe mit Licht, das die Merkmale des unabhängigen Patentanspruchs 12 aufweist, gelöst. Die abhängigen Patentansprüche 2 bis 11 betreffen bevorzugte Ausführungsbeispiele des neuen Verfahrens, während die abhängigen Patentansprüche 13 bis 22 bevorzugte Ausführungsbeispiele des neuen Fluoreszenzlichtmikroskops betreffen.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Bei dem neuen Verfahren zum Bestrahlen einer Probe mit Licht wird ein erster kohärenter Eingangslichtstrahl einer ersten Polarisation mit einem Polarisationsstrahler in zwei erste Teilstrahlen aufgeteilt. Diese beiden ersten Teilstrahlen werden mit je einem Objektiv in einen selben Fokuspunkt in einer gemeinsamen Fokalebene der beiden Objektive fokussiert. Dabei wird die erste Polarisation so auf dem Polarisationsstrahlteiler abgestimmt und werden die optischen Wellenlängen und die Polarisation der beiden ersten Teilstrahlen zwischen dem Polarisationsstrahler und den Objektiven so zueinander eingestellt, dass die beiden ersten Teilstrahlen in dem gemeinsamen Fokuspunkt mit einer ersten relativen Phase, beispielsweise konstruktiv, interferieren. Weiter wird bei dem neuen Verfahren ein zweiter kohärenter Eingangslichtstrahle einer zweiten, sich von der ersten Polarisation des ersten Eingangslichtstrahls unterscheidenden Polarisation mit demselben Polarisationsstrahlteiler in zwei zweite Teilstrahlen aufgeteilt. Diese beiden zweiten Teilstrahlen werden mit denselben Objektiven wie die beiden ersten Teilstrahlen in denselben gemeinsamen Fokuspunkt fokussiert. Dabei wird die zweite Polarisation des zweiten Eingangslichtstrahls so auf den Polarisationsstrahlteiler abgestimmt, dass, obwohl die optischen Weglängen und die Polarisationen der beiden zweiten Teilstrahlen zwischen dem Polarisationsstrahlteiler und den Objektiven in derselben Weise wie bei den beiden ersten Teilstrahlen zueinander eingestellt werden, die beiden zweiten Teilstrahlen in dem gemeinsamen Fokuspunkt mit einer gegenüber der ersten relativen Phase der ersten Teilstrahlen um π verschobenen zweiten relativen Phase, d. h. im schon angesprochenen Beispiel destruktiv, interferieren. Es versteht sich, dass bei dem neuen Verfahren zusätzlich dafür zu sorgen ist, dass die ersten Teilstrahlen und die zweiten Teilstrahlen im Bereich der gemeinsamen Fokalebene nicht miteinander interferieren.
Das neue Verfahren erfordert für das Erreichen des gewünschten Ziels, ein Paar der Teilstrahlen des einen Eingangslichtstrahls in dem gemeinsamen Fokuspunkt konstruktiv zur Interferenz zu bringen, während das andere Paar der Teilstrahlen des anderen Eingangslichtstrahls in dem gemeinsamen Fokuspunkt zu destruktiver Interferenz gebracht wird, nur einen Polarisationsstrahlteiler und unterschiedliche Polarisationen der beiden Eingangslichtstrahlen. Konkret geht es um derart unterschiedliche Polarisationen der beiden Eingangslichtstrahlen, dass der eine erste Teilstrahl und der eine zweite Teilstrahl eine gleiche Polarisationsebene und gleiche Phasen aufweisen, während der andere erste Teilstrahl und der andere zweite Teilstrahl eine gleiche Polarisationsebene und um 180° verschobene Phasen aufweisen. Dabei ist die Polarisationseben der Teilstrahlen, die an dem Polarisationsstrahlteiler reflektiert werden, ebenso wenig beeinflussbar wie die Polarisationsebene der Teilstrahlen, die von dem Polarisationsstrahlteiler transmittiert werden. Beeinflussbar ist jedoch die Phasenbeziehung der reflektierten bzw. der transmittierten Teilstrahlen zueinander. Je nachdem welche unterschiedlichen Richtungen die Polarisationsebenen der Eingangslichtstrahlen zu der Strahlteilerebene des Polarisationsstrahlteilers aufweisen, die von den Eingangslichtstrahlen und deren Teilstrahlen aufgespannt wird, ergibt sich bei den transmittierten oder den reflektierten Teilstrahlen die Gleich- oder Gegenphasigkeit. Bei Betrachtung der relativen ersten Phase der ersten Teilstrahlen und der relativen Phase der zweiten Teilstrahlen an jedem beliebigen Ort ergibt sich hieraus eine Verschiebung zwischen den relativen Phasen um π. Bei dem neuen Verfahren wird gezielt ausgenutzt, dass diese Verschiebung zwischen den relativen Phasen um π einem Längenunterschied der optischen Weglängen von Lambda/2 entspricht. Trotz sich an den Polarisationsstrahlteiler anschließender identischer optischer Wege für den einen ersten Teilstrahl und den einen zweiten Teilstrahl einerseits und den anderen ersten Teilstrahl und den anderen zweiten Teilstrahl andererseits resultieren hieraus zum Beispiel einmal eine konstruktive Interferenz und einmal eine destruktive Interferenz der jeweiligen aus einander entgegen gesetzten Richtungen kommenden Teilstrahlen in dem gemeinsamen Fokuspunkt.
Bei dem neuen Verfahren ist es nicht zwingend, dass die zweite relative Phase, mit der die beiden zweiten Teilstrahlen in dem Fokuspunkt interferieren, um genau 180° gegenüber der ersten relativen Phase, mit der die ersten Teilstrahlen in dem Fokuspunkt interferieren, verschoben ist. Es sind sogar relativ deutliche Abweichungen bei der Verschiebung der relativen Phasen von 180° möglich. Eine Verschiebung der relativen Phasen von 180° ergibt sich bei jeweils linear polarisierten Eingangslichtstrahlen oder bei jeweils zirkular polarisierten Eingangslichtstrahlen mit entgegen gesetzter Drehrichtung des Lichtfeldes. Wenn aber beispielsweise ein zirkular polarisierter Eingangslichtstrahl und ein linear polarisierter Eingangslichtstrahl miteinander kombiniert werden, resultiert eine zweite relative Phase, die gegenüber der ersten relativen Phase um 90° bzw. 270° verschoben ist, weil die in dem Polarisationsstrahlteiler einlaufenden Anteile der Eingangslichtstrahlen mit p- bzw. n-Polarisation bereits einen Phasenversatz zueinander aufweisen. Auch diese Fälle sollen hier mit der Formulierung der um π gegenüber der ersten relativen Phase der ersten Teilstrahlen verschobenen zweiten relativen Phase der zweiten Teilstrahlen abgedeckt sein.
Es versteht sich, dass auch bei dem neuen Verfahren die Polarisationen der Teilstrahlen, die in unterschiedlichen Richtungen von dem Polarisationsstrahlteiler abgehen, noch aufeinander abgestimmt werden müssen, damit es überhaupt zu einer Interferenz im Bereich der gemeinsamen Fokalebene der Objektive kommen kann. Diese Abstimmung mit einer Lambda/2-Platte im Strahlengang zwischen den Polarisationsstrahlteiler und einem der Objektive führt bei gleichen Weglängen bis zu dem gemeinsamen Fokuspunkt zum Beispiel bei den ersten Teilstrahlen zu in dem Fokuspunkt gleichphasigen Lichtfeldern und bei den zweiten Teilstrahlen zu in dem Fokuspunkt gegenphasigen Lichtfeldern, die mit einem Weglängenunterschied von Lambda/2 gleichwirkend sind. Jeweils eine Lambda/4-Platte in beiden Strahlengängen zwischen dem Polarisationsstrahlteiler und beiden Objektiven führt zum Beispiel zu gegensinnigen und in dem Fokuspunkt gleichphasigen zirkular polarisierten Lichtfeldern der beiden ersten Teilstrahlen und zu gegensinnigen und in der Fokalebene gegenphasigen zirkular polarisierten Lichtfeldern der beiden zweiten Teilstrahlen, was ebenfalls gleichwirkend mit einem Weglängenunterschied von Lambda/2 ist, und damit zu dem entgegen gesetzten Interferenzverhalten in dem gemeinsamen Fokuspunkt.
Konkret wird bei dem neuen Verfahren die zweite Polarisation des zweiten Eingangslichtstrahls zumindest im Wesentlichen orthogonal zu der ersten Polarisation des ersten Eingangslichtstrahls ausgerichtet werden. Dabei bedeutet orthogonal bei linearen Polarisierungen, dass sie senkrecht zueinander verlaufen, und bei zirkularen Polarisierungen der Eingangslichtstrahlen, dass sie gegensinnig sind. Eine Abweichung von einer exakt orthogonalen Ausrichtung der Polarisierung der Eingangslichtstrahlen kann sich dadurch ergeben, dass sowohl die erste Polarisation des ersten Eingangslichtstrahls als auch die zweite Polarisation des zweiten Eingangslichtstrahls so zu der strahlteilenden Ebene des Polarisationsstrahlteiler ausgerichtet wird, dass die beiden ersten Teilstrahlen und die beiden zweiten Teilstrahlen an der gemeinsamen Fokalebene jeweils gleiche Intensitäten aufweisen.
Wenn die Wellenfronten des ersten Eingangslichtstrahls so aberriert werden, dass sich aus Interferenz bei gleichen Phasen der beiden ersten Teilstrahlen in dem Fokuspunkt ein Intensitätsminimum an dem Fokuspunkt ausbildet, das in der Fokalebene von Intensitätsmaxima umgeben ist, wozu eine helikal lineare Phasenrampe einsetzbar ist, weisen die Interferenzmuster beider Paare von Teilstrahlen an dem Fokuspunkt ein Intensitätsminium auf, und die Intensitätsmaxima der Interferenzmuster beider Eingangslichtstrahls schließen den Fokuspunkt von allen Raumrichtungen her ein. Dabei können der erste Eingangslichtstrahl und der zweite Eingangslichtstrahl, solange sie nicht miteinander interferieren können, identische Wellenlängen aufweisen.
Überdies können die Wellenfronten des zweiten Eingangslichtstrahls so aberriert werden, dass sich aus Interferenz bei entgegen gesetzten Phasen der zweiten Teilstrahlen in dem gemeinsamen Fokuspunkt ein Intensitätsminimum an dem Fokuspunkt ausbildet, das auf beiden Seiten der gemeinsamen Fokalebene von ineinander über gehenden Intensitätsmaxima 1. und 2. Ordnung umgeben ist. Auf diese Weise ist der gesamte Erfassungsbereichs eines konfokal zu dem Fokuspunkt angeordneten Detektors bis auf den Fokuspunkt selbst vollständig mit Intensität des Lichts des ersten und des zweiten Eingangslichtstrahls abdeckbar.
Ein dritter Eingangslichtstrahl, der eine andere Wellenlänge als der erste Eingangslichtstrahl und der zweite Eingangslichtstrahl aufweist, kann mit demselben Polarisationsstrahlteiler in zwei dritte Teilstrahlen aufgespalten werden, wobei die beiden dritten Teilstrahlen mit denselben Objektiven in denselben gemeinsamen Fokuspunkt fokussiert werden und wobei die optischen Wellenlängen und die Polarisation der beiden dritten Teilstrahlen zwischen dem Polarisationsstrahlteiler und den Objektiven so zueinander eingestellt werden, dass sich aus einer konstruktiven Interferenz der dritten Teilstrahlen in dem Fokuspunkt ein Intensitätsmaximum an dem Fokuspunkt ausbildet, das überall außerhalb des Fokuspunkt selbst durch die Intensitätsmaxima aus dem Licht des ersten und des zweiten Eingangslichtstrahl überlagert wird. Damit sind die Voraussetzungen für ein die räumliche Auflösung sowohl in lateraler als auch in axialer Richtung verbesserndes SIED-, GSD- oder RESOLFT-Fluoreszenzlichtmikroskopieverfahren gegeben. Zu dessen Umsetzung ist die Wellenlänge des dritten Eingangslichtstrahls auf eine Anregung eines Fluorophors zur Emission von Fluoreszenzlicht abzustimmen, während die Wellenlängen des ersten Eingangslichtstrahls und des zweiten Eingangslichtstrahls auf die Verhinderung von spontaner Emission von Fluoreszenzlicht durch den angeregten Fluorophor abzustimmen sind.
Es ist aber auch möglich, das Anregungslicht nur durch eines der Objektive in den gemeinsamen Fokuspunkt zu fokussieren und den anderen dritten Teilstrahl mit einem wellenlängenselektiven optischen Element, wie beispielsweise einem Farbfilter abzublocken. Das Anregungslicht kann auch, erst hinter dem Polarisationsstrahlteiler, beispielsweise über einen dichroitischen Spiegel in den Strahlengang zu einem der Objektive eingekoppelt werden.
Bei Anwendung des neuen Verfahrens in der Fluoreszenzlichtmikroskopie kann das aus dem Fokuspunkt kommende Fluoreszenzlicht mit einem von dort aus gesehen hinter dem Polarisationsstrahlteiler liegenden Detektor über beide Objektive registriert werden. Mit anderen Worten laufen dann Teilstrahlen von drei Eingangslichtstrahlen und des Fluoreszenzlichts durch den Polarisationsstrahlteiler und werden von diesem aufgeteilt bzw. zusammengeführt. Auch bei dem rücklaufenden Fluoreszenzlicht kann die Interferenzfähigkeit der Teilstrahlen – hier bei ihrer Zusammenführung mit dem Polarisationsstrahlteiler – genutzt werden.
Ein Detektor für das Fluoreszenzlicht kann beispielsweise aber auch hinter einem das Fluoreszenzlicht zwischen einem der Objektive und dem Polarisationsstrahlteiler auskoppelnden dichroitischen Spiegel angeordnet sein.
Es versteht sich, dass ein erfindungsgemäßes Verfahren auch multifokal durchgeführt werden kann, d. h. mit mehren Fokuspunkte gleichzeitig, um den Gesamtzeitaufwand für das vollständige Vermessen einer Probe entsprechend zu reduzieren. Dabei kann als Detektor ein zweidimensionales Bildsensorarray verwendet werden.
Das neue Verfahren lässt sich mit weiteren in der Fluoreszenzmikroskopie bekannten Kontrastverfahren wie beispielsweise Fluorescence lifetime imaging oder FREI kombinieren. Des Weiteren ist das neue Verfahren vorteilhaft mit spektroskopischen Messmethoden wie beispielsweise Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie kombinierbar.
Ein erfindungsgemäßes Fluoreszenzlichtmikroskop zeichnet sich durch eine Beleuchtungseinheit mit folgenden Komponenten aus: eine erste Lichtquelle für einen ersten kohärenten Eingangslichtstrahl einer ersten Polarisation; eine zweite Lichtquelle für einen zweiten kohärenten Eingangslichtstrahl einer zweiten Polarisation, wobei die beiden Lichtquellen gemeinsame Komponenten aufweisen können; einen Polarisationsstrahlteiler, der den ersten Eingangslichtstrahl in zwei erste Teilstrahlen und den zweiten Eingangslichtstrahl in zwei zweite Strahlstrahlen aufteilt; zwei Objektive mit einer gemeinsamen Fokalebene, die jeweils einen der beiden ersten Teilstrahlen und einen der beiden zweiten Teilstrahlen in einen selben Fokuspunkt in der gemeinsamen Fokalebene fokussieren; und zwischen den Polarisationsstrahlteiler und die Objektive geschaltete optische Elemente, die die optischen Weglängen und die Polarisationen der beiden ersten Teilstrahlen zueinander und der beiden zweiten Teilstrahlen zueinander einstellen; wobei die erste Polarisation des ersten Eingangslichtstrahls so auf den Polarisationsstrahlteiler abgestimmt ist und die optischen Weglängen und die Polarisation der beiden ersten Teilstrahlen mit den zwischen den Polarisationsstrahlteiler und die Objektive geschalteten optischen Elementen so zueinander eingestellt sind, dass die beiden ersten Teilstrahlen in dem gemeinsamen Fokuspunkt mit einer ersten relativen Phase interferiert, und wobei die sich von der ersten Polarisation des ersten Eingangslichtstrahls unterscheidende zweite Polarisation des zweiten Eingangslichtstrahls so auf den Polarisationsstrahlteiler abgestimmt ist, dass die beiden zweiten Teilstrahlen in dem gemeinsamen Fokuspunkt mit einer zu der ersten relativen Phase um π verschobenen zweiten relativen Phase interferieren. Es versteht sich, dass auch hier die ersten Teilstrahlen und die zweiten Teilstrahlen im Bereich der gemeinsamen Fokalebene nicht interferieren dürfen, was durch geeignete Maßnahmen zu verhindern ist.
Zum Zusammenführen des ersten Eingangslichtstrahls und des zweiten Eingangslichtstrahls auf eine gemeinsame optische Achse vor dem sie jeweils aufteilenden Polarisationsstrahlteiler kann ein weiterer Polarisationsstrahlteiler vorgesehen sein, zu dessen inhärenten Eigenschaften es gehört, dass die zweite Polarisation des zweiten Eingangslichtstrahls senkrecht zu der ersten Polarisation des ersten Eingangslichtstrahls ausgerichtet ist, wenn die beiden Eingangslichtstrahlen zusammengeführt sind. Dem Fachmann sind aber auch andere Weisen der Zusammenführung von Eingangslichtstrahlen bekannt.
Die Ausrichtung der Polarisationsrichtungen der aus dem sie zusammenführenden Polarisationsstrahlteiler austretende Teilstrahlen zu der Strahiteilerebene des sie jeweils in Teilstrahlen aufspaltenden Polarisationsstrahlteiler kann durch Drehen des zusammenführenden Strahlteilers gegenüber dem aufteilenden Strahlteiler oder durch eine geeignet ausgerichtete Lambda/2-Verzögerungsplatte erreicht werden.
Für alle Eingangslichtstrahlen kann eine Strahlverlagerungseinrichtung vorgesehen sein, die sie relativ zur Strahlachse verkippt, um den Fokuspunkt, in den sie gemeinsam fokussiert werden, in der gemeinsamen Fokalebene der beiden Objektive zu verschieben. Auf diese Weise kann eine Probe im Bereich der Fokalebene mit dem Fokuspunkt abgescannt werden. Für ein zu diesem lateralen Abscannen zusätzliches axiales Abscannen in senkrechter Richtung zu der gemeinsamen Fokalebene der Objektive ist die Probe selbst gegenüber den Objektiven zu verschieben. Auch die laterale Relativverschiebung zwischen Probe und Fokuspunkt kann durch eine Verschiebung der Probe bewirkt werden.
Bei dem neuen Fluoreszenzlichtmikroskop können die erste Lichtquelle und die zweite Lichtquelle einen gemeinsamen Laser aufweisen. Dabei ist aber eine die Interferenz des ersten Eingangslichtstrahls und des zweiten Eingangslichtstrahls verhindernde Einrichtung vorzusehen. Dazu kann die Interferenzfähigkeit der beiden Eingangslichtstrahlen trotz gleicher Wellenlänge zum Beispiel mit einem Delay in einem der Eingangslichtstrahlen, das über die Kohärenzlänge des gemeinsamen Lasers hinausgeht, beseitigt werden. Dem Fachmann sind hier auch andere Möglichkeiten der Kohärenzverhinderung bekannt.
Auch eine dritte Lichtquelle kann auf demselben gemeinsamen Laser aufbauen, wenn dieser z. B. mehrere Linien, d. h. Laserlicht unterschiedlicher Wellenlängen bereitstellt. Jedweder Laser der verschiedenen Lichtquellen kann bei dem neuen Fluoreszenzlichtmikroskop grundsätzlich ein Dauerstrichlaser sein, obwohl gepulste Laser, wie sie in der STED-Fluoreszenzlichtmikroskopie vielfach üblich sind, bevorzugt sein können.
Weitere bevorzugte Ausführungsbeispiele des neuen Fluoreszenzlichtmikroskops sind von dem bereits beschriebenen neuen Verfahren übertragbar. Hier nicht erläuterte Details des neuen Fluoreszenzlichtmikroskops können bekannten Details von 4Pi-Fluoreszenzlichtmikroskopen entsprechen.
Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich aus den Patentansprüchen, der Beschreibung und den Zeichnungen. Die in der Beschreibungseinleitung genannten Vorteile von Merkmalen und von Kombinationen mehrerer Merkmale sind lediglich beispielhaft und können alternativ oder kumulativ zur Wirkung kommen, ohne dass die Vorteile zwingend von erfindungsgemäßen Ausführungsformen erzielt werden müssen. Weitere Merkmale sind den Zeichnungen – insbesondere den dargestellten Geometrien und den relativen Abmessungen mehrerer Bauteile zueinander sowie deren relativer Anordnung und Wirkverbindung – zu entnehmen. Die Kombination von Merkmalen unterschiedlicher Ausführungsformen der Erfindung oder von Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche ist ebenfalls abweichend von den gewählten Rückbeziehungen der Patentansprüche möglich und wird hiermit angeregt. Dies betrifft auch solche Merkmale, die in separaten Zeichnungen dargestellt sind oder bei deren Beschreibung genannt werden. Diese Merkmale können auch mit Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche kombiniert werden. Ebenso können in den Patentansprüchen aufgeführte Merkmale für weitere Ausführungsformen der Erfindung entfallen.
KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
Die Erfindung wird im Folgenden anhand von Ausführungsbeispielen unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen näher erläutert und beschrieben.
1 zeigt schematisch den Aufbau eines Fluoreszenzlichtmikroskops in einer ersten Ausführungsform.
2 illustriert die durch ein optisches Element bei einem Eingangslichtstrahl des Fluoreszenzmikroskops gemäß 1 verursachte Aberration der Wellenfronten.
3 bis 7 geben die Polarisationen von Eingangslichtstrahlen und Teilstrahlen dieser Eingangslichtstrahlen an verschiedenen Positionen in dem Fluoreszenzlichtmikroskop gemäß 1 wieder. Dabei sind diese Positionen in 1 markiert und die entsprechenden Markierungen in den 3 bis 7 wiederholt.
8 zeigt eine gegenüber der Ausführungsform gemäß 1 abgewandelte Ausführungsform eines Fluoreszenzlichtmikroskops.
9 bis 14 skizzieren die sich dadurch ändernden Polarisationen an den markierten Positionen des Fluoreszenzlichtmikroskops; und
15 gibt die Verteilung der Intensitäten des Lichts der verschiedenen Eingangslichtstrahlen in axialen Schnitten durch die Fokalebene wieder.
FIGURENBESCHREIBUNG
1 skizziert den Aufbau eines Fluoreszenzlichtmikroskops 1. Dabei sind in 1 Positionen längs der Strahlengänge in dem Fluoreszenzlichtmikroskop 1 mit Nummern 1 bis 5 bzw. 3* bis 5* markiert. Diese Markierungen 2 sind keine Bezugszeichen, sondern auf sie wird in den 3 bis 7 Bezug genommen. Das Fluoreszenzlichtmikroskop 1 dient zum Abbilden einer mit einem Fluorophor in einer Probe 3 markierten Struktur. Dazu wird der Fluorophor mit Anregungslicht 4 bestrahlt, um ihn zur spontanen Emission von Fluoreszenzlicht 5 anzuregen. Das spontan emittierte Fluoreszenzlicht 5 von der Probe 3 wird mit einem Detektor 38 detektiert. Um das Volumen, aus dem das Fluoreszenzlicht 5, das mit dem Detektor 38 registriert wird, zu verkleinern, wird der Fluorophor in der Probe 3 außerhalb eines aktuell interessierenden Messpunkts mit Licht bestrahlt, das die spontane Emission von Fluoreszenzlicht verhindert. Insbesondere kann es sich dabei um Abregungslicht 6 handeln, das den Fluorophor durch stimulierte Emission wieder abregt, bevor er das Fluoreszenzlicht 5 spontan emittieren kann. Um dieses Grundprinzip umzusetzen, sind bei dem Fluoreszenzlichtmikroskop 1 drei Lichtquellen 7 bis 9 vorgesehen, die jeweils einen Laser 10 bis 12 umfassen. Dabei stellt der Laser 12 der Lichtquelle 9 das Anregungslicht 4 in Form eines Eingangslichtstrahls 15 bereit, der durch einen dichroitischen Spiegel 16 zu einer Strahlverlagerungseinrichtung 17 hin umgelenkt wird und dabei durch einen weiteren dichroitischen Spiegel 18 hindurch tritt. Der Laser 11 der Lichtquelle 8 stellt Abregungslicht 6 in Form eines Eingangslichtstrahls 14 in das Fluoreszenzlichtmikroskop 1 bereit, der über einen Spiegel 19, einen Polarisationsstrahlteiler 20 und den dichroitischen Spiegel 18 auf die Strahlverlagerungseinrichtung 17 gerichtet wird. Das Abregungslicht 6 von dem Laser 10 in Form eines weiteren Eingangslichtstrahls 13 tritt zunächst durch ein optisches Element 21 in Form einer linear helikalen Phasenrampe hindurch, die die zunächst ebenen Wellenfronten des Eingangslichtstrahls 13 um die Strahlachse herum aberriert, wie in 2 angedeutet ist. D. h., den Wellenfronten des Eingangslichtstrahls 13 wird eine um die Strahlachse herum von null auf 2π zunehmende Phasenverzögerung aufgeprägt. Dann tritt der Eingangslichtstrahl 13 durch den Polarisationsstrahlteiler 20 hindurch und wird von dem dichroitischen Spiegel 18 auf die Strahlverlagerungseinrichtung 17 gerichtet. Ab dem dichroitischen Spiegel 18 verlaufen alle Eingangsstrahlen 13 bis 15, obwohl sie hier der Übersichtlichkeit halber nebeneinander gezeichnet sind, koaxial. Von der Strahlverlagerungseinrichtung 17 werden sie gemeinsam verlagert, d. h. in der Regel gegenüber der optischen Achse des Fluoreszenzlichtmikroskops 1 verkippt, um die Probe 3 lateral abzuscannen. Vor der Probe 3 treten die Eingangsstrahlen 13 bis 15 jedoch zunächst durch eine Lambda/2-Verzögerungsplatte 23 hindurch und werden dann von einem Polarisationsstrahlteiler 24 jeweils in zwei Teilstrahlen aufgeteilt, von denen einer im wesentlichen gerade durch den Polarisationsstrahlteilers 24 hindurchläuft und ein anderer von dem Polarisationsstrahlteiler 24 abgelenkt wird. Die aus dem Polarisationsstrahlteiler 24 so in zwei Richtungen austretenden Teilstrahlen der Eingangslichtstrahlen 13 bis 15 werden von zwei Umlenkspiegeln 26 und 27 in zwei einander gegenüberliegende Objektive 28 und 29 gerichtet, die eine gemeinsame Fokalebene 30 aufweisen. In dieser gemeinsamen Fokalebene 30 werden die Teilstrahlen von beiden Objektiven 28 und 29 in einen selben Fokuspunkt 22 fokussiert. Dieser Fokuspunkt 22 ist mit Hilfe der Strahlverlagerungseinrichtung 17 zum Abscannen der Probe 3 in der gemeinsamen Fokalebene 30 verlagerbar. In dieser lateralen und in axialer Richtung ist die Probe mit dem Fokuspunkt 22 auch durch Verschieben der Probe gegenüber den Objektiven 28 und 29 abscannbar. Die optischen Weglängen der Teilstrahlen zwischen dem Polarisationsstrahlteiler 24 und der gemeinsamen Fokalebene 30 der Objektive 28 und 29 sowie ihre Polarisation werden dabei in einer im Folgenden noch näher erläutert werdenden Weise aufeinander abgestimmt. Zur Abstimmung der relativen Weglängen der Teilstrahlen von dem Polarisationsteilstrahler 24 bis zu der Fokalebene 30 kann einer oder können beide Umlenkspiegel 26, 27 verlagert werden, was in 1 bei dem Umlenkspiegel 27 durch einen Doppelpfeil 35 angedeutet ist. Auch der Polarisationsstrahlteiler 24 selbst kann zu diesem Zweck verschoben werden. Die Polarisationen der beiden Teilstrahlen werden hier jeweils durch eine Lambda/2-Verzögerungslatte 36 aufeinander abgestimmt, die zwischen dem Polarisationsstrahlteiler 24 und dem Umlenkspiegel 26 angeordnet ist. Alle Teilstrahlen aller Eingangslichtstrahlen 13 bis 15 werden dabei in identischer Weise hinsichtlich ihrer Weglängen und Polarisationen manipuliert. Es gibt bei dem Fluoreszenzlichtmikroskop 1 zwischen dem Polarisationsstrahlteiler 24 und den Objektiven 28 und 29 weder ein wellenlangen- noch ein polarisationsselektives optisches Element, mit dem beispielsweise gezielt unterschiedliche Weglängen für Teilstrahlen unterschiedlicher Wellenlängen realisiert würden. Die Polarisations- bzw. Lichtfeldebenen werden von dem Polarisationsstrahlteiler 24 für alle reflektierten Teilstrahlen einerseits und alle transmittierten Teilstrahlen andererseits fest vorgegeben, so dass eine Selektion der Teilstrahlen der einzelnen Eingangslichtstrahlen nach unterschiedlichen Polarisationen sowieso ausscheidet. Die üblichen Dispersionen sind bei den optischen Elementen 26, 27 und 36 sowie den Objektiven 28 und 29 des Fluoreszenzlichtmikroskops 1 hingegen durchaus vorhanden. Das Fluoreszenzlicht 5 von der Probe 3 gelangt hier, wenn auch in entgegen gesetzter Richtung, ebenfalls durch die Objektive 28 und 29, über die Umlenkspiegel 26 und 27 durch die Lambda/2-Platte 36, den Polarisationsstrahlteiler 24, die Lambda/2-Platte 23, die Strahlverlagerungseinrichtung 17 und dann durch die dichroitischen Spiegel 18 und 16 sowie über einen Umlenkspiegel 31 und durch eine konfokal zu dem gemeinsamen Fokuspunkt 22 in der gemeinsamen Fokalebene 30 angeordnete Blende 32 in den Detektor 38. D. h. der Strahlengang zwischen dem Polarisationsstrahlteiler 24 und der Probe 3 ist für das Anregungslicht 4, das Fluoreszenzlicht 5 und beide Komponenten des Abregungslichts 6 identisch.
Konkret sind bei dem Fluoreszenzlichtmikroskop 1 die optischen Weglängen zwischen dem Polarisationsstrahlteiler 24 und dem gemeinsamen Fokuspunkt 22 gleich. D. h., sie unterscheiden sich gar nicht oder um ein ganzzahliges Vielfaches aller beteiligten Wellenlängen. Damit sind die Voraussetzungen geschaffen, dass die Teilstrahlen in dem gemeinsamen Fokuspunkt 22 konstruktiv interferieren. Damit dies nicht durch unterschiedliche Polarisationen der jeweiligen Teilstrahlen verhindert wird, ist die Lambda/2-Platte 36 vorgesehen, die die Polarisationsrichtung des jeweils durchlaufenden Teilstrahls auf die Polarisationsrichtung des abgelenkten Teilstrahls dreht. Zumindest gilt dies für die Teilstrahlen, die aus dem Eingangslichtstrahl 14 ausgebildet werden, und deren Polarisationsrichtung in den folgenden 3 bis 7 jeweils mit einem gefüllten Pfeil angezeigt ist. Der Pfeil in den 3 bis 7, der nur als Umriss dargestellt ist, gibt demgegenüber die Polarisationsrichtungen der Eingangslichtstrahlen 13 und 15 bzw. deren Teilstrahlen an den mit den Markierungen 2 markierten Stellen des Fluoreszenzlichtmikroskops 1 gemäß 1 wieder. Anzumerken ist in diesem Zusammenhang, dass die Eingangslichtstrahlen 13 und 14 zwar eine annähernd gleich oder sogar identische Wellenlänge aufweisen, dass sie aber nicht zur Interferenz miteinander fähig sind. Aufgrund des Zusammenführens der Eingangslichtstrahlen 13 und 14 mit dem Polarisationsstrahlteiler 20 weisen sie zueinander senkrechte Polarisationsrichtungen auf. Die Polarisationsrichtung des Eingangslichtstrahls 15 wird durch den dichroitischen Spiegel 16, der auch linear polarisierende Eigenschaften aufweist, im vorliegenden Beispiel parallel zu der linearen Polarisierung des Eingangslichtstrahls 13 ausgerichtet. Diese Polarisationszustände gibt 3 wieder. In 3 ist wie in den 4 bis 7 und 9 bis 14 mit p die Polarisationsrichtung in der Zeichenebene gemäß 1 bzw. 8, d. h. in der Strahlteilerebene, in der der Polarisationsstrahlteiler die Eingangslichtstrahlen 13 bis 15 in Teilstrahlen aufteilt, bezeichnet, während n die dazu senkrechte Polarisationsrichtung ist. In 3 ist die Ausrichtung der Lambda/2-Platte 23 angedeutet, die alle Polarisationen vor dem Polarisationsstrahlteiler 24 um 45° dreht. 4 zeigt diese gedrehten Polarisationen. Die 5 und 6 geben demgegenüber die Polarisationen der Teilstrahlen hinter dem Polarisationsstrahlteiler 24 wieder. Während die abgelenkten Teilstrahlen aller Eingangslichtstrahlen 13 bis 15 jetzt in Richtung und Phase übereinstimmende Polarisationen aufweisen, sind die Polarisationen der durchlaufenden Teilstrahlen gemäß 6 zwar gleichgerichtet aber gegenphasig. In 6 ist weiterhin die Orientierung der Lambda/2-Platte 36 angedeutet, die diese Polarisationen um 90° dreht, woraus die Polarisationszustände gemäß 7 resultieren. Unter Berücksichtigung der Polarisationszustände der jeweiligen Teilstrahlen gemäß den 5 und 7 und unter Zugrundelegung gleicher Weglängen zu der gemeinsamen Fokalebene 30, interferieren die Teilstrahlen der Eingangslichtstrahlen 13 und 15 in dem gemeinsamen Fokuspunkt 22 tatsächlich konstruktiv, während die Teilstrahlen der Eingangslichtstrahls 14 aufgrund entgegen gesetzter Phase in dem gemeinsamen Fokuspunkt 22 destruktiv interferieren. In Kombination mit ebenen Wellenfronten des Eingangslichtstrahls 14 führt dies dazu, dass das Abregungslicht 6 des Eingangslichtstrahls 14 am jeweiligen Fokuspunkt 22 eine Nullstelle ausbildet, die auf beiden Seiten der Fokalebene 30 durch Intensitätsmaxima umgeben ist. Das Anregungslicht 4 des Eingangslichtstrahls 15 bildet hingegen sein Intensitätsmaximum erster Ordnung in dem Fokuspunkt 22 aus. Das Abregungslicht 6 des Eingangslichtstrahls 13 interferiert zwar grundsätzlich auch konstruktiv im Bereich der gemeinsamen Fokoalebene 30. Die Aberration seiner Wellenfronten gemäß 2 durch das optische Element 21 führt aber dazu, dass sich dennoch im Fokuspunkt 22 selbst eine Nullstelle der Intensität ausbildet, die in der Fokalebene 30 von einem Ring maximaler Intensität umgeben ist. In der Summe grenzen die beiden Komponenten des Abregungslichts 6 in Form des Eingangslichtstrahls 13 und des Eingangslichtstrahls 14 das Volumen um den Fokuspunkt 22, in dem der Fluorophor in der Probe 3 mit dem Anregungslicht 4 effektiv zu der spontanen Emission des Fluoreszenzlichts 5 angeregt wird, sowohl axial (durch das Licht des Eingangslichtstrahls 14) als auch lateral (durch das Licht des Eingangslichtstrahls 13) ein. Hierdurch wird die Ortsauflösung des Fluoreszenzlichtmikroskops 1 in allen Raumrichtungen erhöht. Das Besondere ist dabei, dass alle durchlaufenden und abgelenkten Teilstrahlen aller drei Eingangslichtstrahlen 13 bis 15 dieselben optischen Wege zurücklegen und nur durch geschickte Einstellung ihrer Polarisationszustände vor dem Polarisationsstrahlteiler 24 unterschiedliche Formen der Interferenz in dem gemeinsamen Fokuspunkt 22 erreicht werden. Dabei wird ausgenutzt, dass einander entgegen gesetzte Polarisationsrichtungen bei der Interferenz gleichwirkend mit um Lambda/2 unterschiedlich langen optischen Weglängen sind.
Bei der Ausführungsform des Fluoreszenzlichtmikroskops 1 gemäß 8 sind statt der Lambda/2-Verzögerungsplatte 36 zwei Lambda/4-Verzögerungsplatten 33 und 34 in den Strahlengängen sowohl der durchlaufenden als auch der abgelenkten Teilstrahlen vorgesehen. Diese führen zu einer zirkularen Polarisation der Teilstrahlen ausgehend von der zunächst identischen Polarisation wie bei dem Fluoreszenzmikroskop 1 gemäß 1 direkt nach dem Polarisationsstrahlteiler 24, wie in den 9 und 10 illustriert ist, die auch die Ausrichtungen der Lambda/4-Verzögerungsplatten 33 und 34 illustrieren. Die Drehrichtungen der resultierenden zirkularpolarisierten Teilstrahlen direkt nach den Lambda/4-Verzögerungsplatten sind in den 11 und 12 wiedergegeben. Während die Teilstrahlen 13 und 15 in gegensinnige, aber gleichphasige zirkulare Polarisationen polarisiert wurden, sind die Teilstrahlen des Eingangslichtstrahls 14 gegensinnig und gegenphasig zirkular polarisiert. Durch die Reflektion an den Umlenkspiegeln 26 und 27 dreht sich die Umlaufrichtung der zirkularen Polarisationen noch einmal in die Polarisationszustände gemäß den 13 und 14, wobei die Phasenbeziehung der zirkularen Polarisationen gleich bleibt. Dass die Teilstrahlen trotz gegenläufiger Drehrichtung ihrer zirkularen Polarisation überhaupt miteinander interferieren können, liegt an ihrer unterschiedlichen Ausbreitungsrichtung beim Auftreffen auf die gemeinsame Fokalebene 30. Weiterhin ist in 8 ein Polarisator 25 in dem Strahlengang der von dem Polarisationsstrahlteiler 24 reflektierten Teilstrahlen vorgesehen, um kleinere Anteile der Eingangslichtstrahlen 13 bis 15 mit p-Polarisation, die in unerwünschter Weise von dem Polarisationsstrahlteiler 24 reflektiert werden, auszublenden. Ein solcher Polarisator 25 kann aus Symmetriegründen auch in dem Strahlengang der von dem Polarisationsstrahlteiler 24 transmittierten Teilstrahlen vorgesehen sein, obwohl sich hier keine relevanten Anteile der Eingangslichtstrahlen 13 bis 15 mit n-Polarisation finden. Mit beiden Polarisatoren 25 können zudem die relativen Intensitäten der reflektierten und transmittierten Teilstrahlen an dem gemeinsamen Fokuspunkt 22 aufeinander eingestellt werden. Derartige Polarisatoren 25 könnten aus denselben Gründen auch bei dem Fluoreszenzlichtmikroskop 1 gemäß 1 verwendet werden. Die grundsätzliche Verteilung der Intensitätsmaxima der einzelnen Lichtkomponenten um den jeweiligen Fokuspunkt 22 in der Fokalebene 30 unterscheidet sich zwischen den Fluoreszenzlichtmikroskopen der 1 und 8 nicht.
Diese Verteilung der einzelnen Lichtkomponenten illustriert 15, wobei λ die Wellenlänge der jeweils interferierenden Teilstrahlen und ϕ die relative Phase der Teilstrahlen im Fokuspunkt 22 wiedergibt. Der horizontale Maßstabsbalken in 15a ist 250 nm lang. In den zweidimensionalen Schnitten der 15a bis d sind die unterschiedlichen Lichtintensitäten durch unterschiedliche Grautöne symbolisiert, wobei je dunkler desto mehr Intensität gilt. In 15e sind zwei Intensitätsprofile entlang einer vertikalen Linie durch den Fokuspunkt 22 in 15b und entlang einer horizontalen Linie durch den Fokuspunkt 22 in 15c aufgetragen. 15a zeigt die Intensitätsverteilung des Anregungslichts 4, d. h. des von den Teilstrahlen des Eingangslichtstrahls 15 gemäß 1 oder 8 ausgebildeten Interferenzmusters. Innerhalb eines Erfassungsbereichs 37 des konfokalen Detektors 38 gemäß 1 bzw. 8 finden sich dabei das Maximum erster Ordnung am Fokuspunkt 22 und die Maxima zweiter Ordnung auf beiden Seiten der Fokalebene 30. 15b zeigt die Intensitätsverteilung des Teils des Abregungslichts 6 aus dem Eingangslichtstrahl 13, dessen Wellenfronten mit dem optischen Element 21 aberriert sind. Das Interferenzmuster der Teilstrahlen des Eingangslichtstrahls 13 weist eine Nullstelle am Fokuspunkt 22 auf, die in der Fokalebene 30 von einem ringförmigen Maximum erster Ordnung umgeben ist. 15c zeigt die Intensitätsverteilung des Teils des Abregungslichts 6 aus dem Eingangslichtstrahl 14, dessen Wellenfronten hier nicht aberriert, d. h. eben sind. Das Interferenzmuster der Teilstrahlen des Eingangslichtstrahls 14 weist eine Nullstelle am Fokuspunkt 22 auf, die beiderseits der Fokalebene 30 von einem Maximum erster Ordnung begrenzt ist. 15d zeigt die Überlagerung der Intensitätsverteilungen gemäß 15b und c, bei der die deckungsgleiche Nullstelle am Fokuspunkt allseitig von Abregungslicht 6 umschlossen ist. Dabei würde die Intensitätsverteilung des Abregungslicht den Detektionsbereich 37 außerhalb des Fokuspunkts in axialer (z-)Richtung noch weiter ausfüllen, wenn die Wellenfronten des Eingangslichtstrahls 14 in an sich bekannter Weise aberriert wären, um die Maxima erster und zweiter Ordnung bei dem Interferenzmuster seiner Teilstrahlen miteinander zu verschmelzen. Die Profile gemäß 15e zeigen, dass bei geeigneter Wahl der Intensitäten der Eingangslichstrahlen 13 und 14 der Fokuspunkt 22 sowohl lateral durch I_STED (x) als auch axial durch I_STED (z) von etwa gleich stark ansteigenden Intensitätsflanken begrenzt ist.
Eine Erprobung eines Fluoreszenzlichtmikroskops mit dem in 1 skizzierten Aufbau ergab die erwartete hohe räumliche Auflösung sowohl lateral als auch axial. Konkret wurde mit vergleichsweise geringem apparativem Aufwand eine räumliche Auflösung in allen Richtungen von kleiner gleich 45 nm erreicht.

1: Fluoreszenzlichtmikroskop
2: Markierung
3: Probe
4: Anregungslicht
5: Fluoreszenzlicht
6: Abregungslicht
7: Lichtquelle
8: Lichtquelle
9: Lichtquelle
10: Laser
11: Laser
12: Laser
13: Eingangslichtstrahl
14: Eingangslichtstrahl
15: Eingangslichtstrahl
16: dichroitischer Spiegel
17: Strahlverlagerungseinrichtung
18: dichroitischer Spiegel
19: Umlenkspiegel
20: Polarisationsstrahlteiler
21: optisches Element
22: Fokuspunkt
23: Lambda/2-Verzögerungsplatte
24: Polarisationsstrahlteiler
25: Polarisator
26: Umlenkspiegel
27: Umlenkspiegel
28: Objektiv
29: Objektiv
30: gemeinsame Fokalebene
31: Umlenkspiegel
32: Blende
33: Lambda/4-Platte
34: Lambda/4-Platte
35: Doppelpfeil
36: Lambda/2-Platte
37: Detektionsbereich
38: Detektor

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

- WO 2004/090950 A2 [0002]
- DE 4040441 A1 [0003]
- WO 03/040706 A1 [0004, 0005]

Claims

Verfahren zum Bestrahlen einer Probe mit Licht, – wobei ein erster Eingangslichtstrahl mit einem Strahlteiler in zwei erste Teilstrahlen aufgeteilt wird, – wobei die beiden ersten Teilstrahlen mit je einem Objektiv in einen selben Fokuspunkt in einer gemeinsamen Fokalebene der Objektive fokussiert werden, – wobei die optischen Weglängen der beiden ersten Teilstrahlen zwischen dem Polarisationsstrahlteiler und den Objektiven so zueinander eingestellt werden, dass die beiden ersten Teilstrahlen in dem gemeinsamen Fokuspunkt mit einer ersten relativen Phase interferieren, – wobei ein zweiter Eingangslichtstrahl mit demselben Strahlteiler in zwei zweite Teilstrahlen aufgeteilt wird, und – wobei die ersten Teilstrahlen und die zweiten Teilstrahlen im Bereich der gemeinsamen Fokalebene nicht miteinander interferieren, dadurch gekennzeichnet, als Strahlteiler ein Polarisationsstrahlteiler (24) verwendet wird, – wobei die Polarisationen der beiden ersten Teilstrahlen und die Polarisationen der beiden zweiten Teilstrahlen zwischen dem Polarisationsstrahlteiler (24) und den Objektiven (28, 29) so zueinander eingestellt werden, dass im Bereich der gemeinsamen Fokalebene (30) die ersten Teilstrahlen interferieren und die zweiten Teilstrahlen interferieren, – wobei eine erste Polarisation des ersten Eingangslichtstrahls (13) und eine sich von der ersten Polarisation unterscheidende Polarisation des zweiten Eingangslichtstrahls (14) so auf den Polarisationsstrahlteiler (24) abgestimmt werden, dass die beiden zweiten Teilstrahlen in dem gemeinsamen Fokuspunkt (22) mit einer mit einer zu der ersten relativen Phase um π verschobenen zweiten relativen Phase interferieren.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Polarisation des ersten Eingangslichtstrahls (13) und die zweite Polarisation des zweiten Eingangslichtstrahls (14) so zu der Strahlteilerebene des Polarisationsstrahlteilers (24) ausgerichtet werden, dass der eine erste Teilstrahl und der eine zweite Teilstrahl gleichgerichtete und gleichphasige Lichtfelder aufweisen, während der andere erste Teilstrahl und der andere zweite Teilstrahl gleichgerichtete und gegenphasige Lichtfelder aufweisen.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Polarisation des zweiten Eingangslichtstrahls (14) orthogonal zu der ersten Polarisation des ersten Eingangsstrahls (13) ausgerichtet wird.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Polarisation des ersten Eingangslichtstrahls (13) und die zweite Polarisation des zweiten Eingangslichtstrahls (14) so zu der Strahlteilerebene des Polarisationsstrahlteilers (24) ausgerichtet werden, dass die beiden ersten Teilstrahlen und die beiden zweiten Teilstrahlen jeweils gleiche Intensitäten aufweisen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Wellenfronten des ersten Eingangslichtstrahls (13) so aberriert werden, dass sich bei gleichen Phasen der ersten Teilstrahlen in dem gemeinsamen Fokuspunkt (22) ein Intensitätsminimum an dem Fokuspunkt (22) ausbildet, das in der gemeinsamen Fokalebene (30) von Intensitätsmaxima umgeben ist.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass sich bei einander entgegen gesetzten Phasen der zweiten Teilstrahlen in dem gemeinsamen Fokuspunkt (22) ein Intensitätsminimum an dem Fokuspunkt (22) ausbildet, das auf beiden Seiten der gemeinsamen Fokalebene (30) von Intensitätsmaxima umgeben ist.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Wellenfronten des zweiten Eingangslichtstrahls (14) so aberriert werden, dass das Intensitätsminimum an dem Fokuspunkt (22) auf beiden Seiten der gemeinsamen Fokalebene (30) von ineinander über gehenden Intensitätsmaxima 1. und 2. Ordnung umgeben ist.
Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Eingangslichtstrahl (13) und der zweite Eingangslichtstrahl (14) gleiche Wellenlängen aufweisen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass ein dritter Eingangslichtstrahl (15), der eine andere Wellenlänge als der erste Eingangslichtstrahl und der zweite Eingangslichtstrahl aufweist, mit demselben Polarisationsstrahlteiler (24) in zwei dritte Teilstrahlen aufgeteilt wird, wobei die beiden dritten Teilstrahlen mit denselben Objektiven (28, 29) in denselben gemeinsamen Fokuspunkt (22) fokussiert werden und wobei die optischen Weglängen und die Polarisationen der beiden dritten Teilstrahlen zwischen dem Polarisationsstrahlteiler (24) und den Objektiven (28, 29) so zueinander eingestellt werden, dass sich aus einer Interferenz der dritten Teilstrahlen in dem gemeinsamen Fokuspunkt (22) ein Intensitätsmaximum an dem Fokuspunkt (22) ausbildet.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Wellenlänge des dritten Eingangslichtstrahls (15) auf eine Anregung eines Fluorophors zur Emission von Fluoreszenzlicht (5) abgestimmt wird, während die Wellenlängen des ersten Eingangslichtstrahls (13) und des zweiten Eingangslichtstrahls (14) auf die Verhinderung von spontaner Emission von Fluoreszenzlicht (5) durch den angeregten Fluorophor abgestimmt werden.
Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass aus dem Fokuspunkt (22) kommendes Fluoreszenzlicht (5) mit einem von dort aus gesehen hinter dem Polarisationsstrahlteiler (24) liegenden Detektor (38) über beide Objektive (28, 29) registriert wird.
Fluoreszenzlichtmikroskop mit einer Beleuchtungseinheit zum Bestrahlen einer Probe mit Licht aus zwei Richtungen, wobei die Beleuchtungseinheit aufweist: – eine erste Lichtquelle für einen ersten Eingangslichtstrahl; – eine zweite Lichtquelle für einen zweiten Eingangslichtstrahl; – einen Strahlteiler, der den ersten Eingangslichtstrahl in zwei erste Teilstrahlen und den zweiten Eingangslichtstrahl in zwei zweite Teilstrahlen aufteilt; – zwei Objektive mit einer gemeinsamen Fokalebene, die jeweils einen der beiden ersten Teilstrahlen in einen selben Fokuspunkt in der gemeinsamen Fokalebene fokussieren und von denen mindestens eines auch einen der beiden zweiten Teilstrahlen in denselben Fokuspunkt fokussiert; und – zwischen den Polarisationsstrahlteiler und die Objektive geschaltete optische Elemente, die die optischen Weglängen der beiden ersten Teilstrahlen so zueinander einstellen, dass die beiden ersten Teilstrahlen in dem gemeinsamen Fokuspunkt mit einer ersten relativen Phase interferieren, wobei die ersten Teilstrahlen und die zweiten Teilstrahlen im Bereich der gemeinsamen Fokalebene nicht miteinander interferieren, dadurch gekennzeichnet, als der Strahlteiler ein Polarisationsstrahlteiler (24) ist, – wobei die Polarisationen der beiden ersten Teilstrahlen und die Polarisationen der beiden zweiten Teilstrahlen zwischen dem Polarisationsstrahlteiler (24) und den Objektiven (28, 29) mit den zwischen den Polarisationsstrahlteiler (24) und die Objektive (28, 29) geschalteten optischen Elementen (26, 27 sowie 36 bzw. 33 und 34), so zueinander eingestellt sind, dass im Bereich der gemeinsamen Fokalebene (30) die ersten Teilstrahlen interferieren und die zweiten Teilstrahlen interferieren, – wobei eine erste Polarisation des ersten Eingangslichtstrahls (13) und eine sich von der ersten Polarisation unterscheidende Polarisation des zweiten Eingangslichtstrahls (14) so auf den Polarisationsstrahlteiler (24) abgestimmt sind, dass die beiden zweiten Teilstrahlen in dem gemeinsamen Fokuspunkt (22) mit einer zu der ersten relativen Phase um π verschobenen zweiten relativen Phase interferieren.
Fluoreszenzlichtmikroskop nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Polarisation des ersten Eingangslichtstrahls (13) und die zweite Polarisation des zweiten Eingangslichtstrahls (14) so zu der Strahlteilerebene des Polarisationsstrahlteilers (24) ausgerichtet sind, dass der eine erste Teilstrahl und der eine zweite Teilstrahl gleichgerichtete und gleichphasige Lichtfelder aufweisen, während der andere erste Teilstrahl und der andere zweite Teilstrahl gleichgerichtete und gegenphasige Lichtfelder aufweisen.
Fluoreszenzlichtmikroskop nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass ein weiterer Polarisationsstrahlteiler (20) vorgesehen ist, der den ersten Eingangslichtstrahl (13) und den zweiten Eingangslichtstrahl (14) vor dem diese aufteilenden Polarisationsstrahlteiler (24) zusammenführt, so dass die zweite Polarisation des zweiten Eingangslichtstrahls (14) orthogonal zu der ersten Polarisation des ersten Eingangsstrahls (13) ausgerichtet ist.
Fluoreszenzlichtmikroskop nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Ausrichtung der ersten Polarisation des ersten Eingangslichtstrahls (13) und der zweiten Polarisation des zweiten Eingangslichtstrahls (14) so zu der Strahlteilerebene des Polarisationsstrahlteilers (24) einstellbar sind, dass die beiden ersten Teilstrahlen und die beiden zweiten Teilstrahlen jeweils gleiche Intensitäten aufweisen.
Fluoreszenzlichtmikroskop nach einem der Ansprüche 12 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die erste relative Phase der ersten Teilstrahlen auf null eingestellt ist und dass in dem ersten Eingangslichtstrahl (13) ein dessen Wellenfronten derart aberrierendes optisches Element (21) angeordnet ist, dass sich aus der Interferenz der ersten Teilstrahlen in dem gemeinsamen Fokuspunkt (22) ein Intensitätsminimum an dem Fokuspunkt (22) ausbildet, das in der gemeinsamen Fokalebene (30) von Intensitätsmaxima umgeben ist.
Fluoreszenzlichtmikroskop nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass sich aus der Interferenz der zweiten Teilstrahlen in dem gemeinsamen Fokuspunkt (22) ein Intensitätsminimum an dem Fokuspunkt (22) ausbildet, das auf beiden Seiten der gemeinsamen Fokalebene (30) von Intensitätsmaxima umgeben ist.
Fluoreszenzlichtmikroskop nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass in dem zweiten Eingangslichtstrahl (14) ein dessen Wellenfronten derart aberrierendes optisches Element angeordnet ist, dass das Intensitätsminimum an dem Fokuspunkt (22) auf beiden Seiten der gemeinsamen Fokalebene (30) von ineinander übergehenden Intensitätsmaxima erster und zweiter Ordnung umgeben ist.
Fluoreszenzlichtmikroskop nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Lichtquelle (7) und die zweite Lichtquelle (8) einen gemeinsamen Laser aufweisen, wobei eine die wechselseitige Kohärenz des ersten Eingangslichtstrahls (13) und des zweiten Eingangslichtstrahls (14) verhindernde Einrichtung vorgesehen ist.
Fluoreszenzlichtmikroskop nach einem der Ansprüche 16 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass eine dritte Lichtquelle (9) für einen dritten kohärenten Eingangslichtstrahl (15) vorgesehen ist, der ebene Wellenfronten und eine andere Wellenlänge als der erste Eingangslichtstrahl (13) und der zweite Eingangslichtstrahl (14) aufweist und den derselbe Polarisationsstrahlteiler (24) in zwei dritte Teilstrahlen aufteilt, wobei die beiden dritten Teilstrahlen von denselben Objektiven (18, 29) in denselben gemeinsamen Fokuspunkt (22) fokussiert werden und wobei die optischen Weglängen und die Polarisationen der beiden dritten Teilstrahlen von den zwischen den Polarisationsstrahlteiler (24) und die Objektive (28, 29) geschalteten optischen Elementen (26, 27, 36) zueinander eingestellt werden, so dass sich aus der Interferenz der dritten Teilstrahlen in dem gemeinsamen Fokuspunkt (22) ein Intensitätsmaximum an dem Fokuspunkt (22) ausbildet.
Fluoreszenzlichtmikroskop nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass ein von dem Fokuspunkt (22) aus gesehen hinter dem Polarisationsstrahlteiler (24) liegender Detektor (38) aus dem Fokuspunkt (22) über beide Objektive und die zwischen den Polarisationsstrahlteiler (24) und die Objektive (28) geschalteten optischen Elemente (26, 27, 36) kommendes Licht (5) einer bestimmten Wellenlänge registriert.
Fluoreszenzlichtmikroskop nach einem der Ansprüche 16 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass eine Strahlverlagerungseinrichtung (17) vorgesehen ist, die alle Eingangsstrahlen (13–15) gemeinsam verlagert, um den gemeinsamen Fokuspunkt (22) in der gemeinsamen Fokalebene (30) zu verschieben.