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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Aufbereitung eines
Thrombozyten enthaltenden Mediums zwecks Verringerung der diesen
zugeordneten HLA-Antigene, umfassend mindestens einen Schritt, in
dem man das Medium einem schwach sauren Milieu aussetzt.
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Thrombozyten
(Blutplättchen) tragen verschiedene Arten von Antigenen
auf ihrer Oberfläche, insbesondere Blutgruppenmerkmale
(z. B. I), thrombozytenspezifische Antigene (Human Platelet Antigens
HPA), die zum Teil für physiologische Funktionen benötigt
werden und HLA-Klasse I Antigene (Human Leukocyte Antigens).
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Bei
polytransfundierten Patienten können Antikörper
gegen diese drei Antigenklassen auftreten. Am häufigsten
sind dabei HLA-Antikörper. Nach einer Thrombozytentransfusion
haften sich diese Antikörper an das entsprechende Antigen
und verursachen eine Beschleunigung des Abbaus der transfundierten
Thrombozyten. Diese Reaktion kann so heftig sein, dass Stunden nach
einer Thrombozytentransfusion die transfundierten Thrombozyten nicht
mehr nachweisbar sind („fehlendes Inkrement"). Letztendlich
können die Patienten verbluten, wenn keine passenden Thrombozyten
transfundiert werden können. „Passend” ist
dabei so definiert, dass die Thrombozyten das entsprechende Antigen,
wogegen Antikörper vorliegen, nicht tragen. Es ist daher
sehr mühsam, passende Spender für einen sensibilisierten
Patienten zu finden.
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Seit
Anfang der 80er Jahre wurden in der Literatur Methoden publiziert,
bei denen versucht wurde, HLA-Antigene durch Säurebehandlung
(Säureelution) von Zellen abzusprengen. A. Brand
et al. beschreiben in TRANSFUSION 1996, 36, S. 438–444 die
Behandlung von 2 Patienten, denen Thrombozyten transfundiert werden,
wobei zuvor die HLA-Antigene durch Säure-Elution von den
Thrombozyten entfernt wurden. Einer der Patienten konnte erfolgreich
behandelt werden, der andere Patient bekam eine Transfusionsreaktion.
Das in diesem Artikel beschriebene Verfahren zur Aufbereitung der
Thrombozyten ist jedoch sehr komplex und erfordert unter anderem
mehrere hochtourige Zentrifugationsschritte, die zu einem Zellverlust
und Qualitätsverlust führen. Die Thrombozyten
sind sehr empfindlich gegenüber den bei der Zentrifugation
auftretenden hohen Beschleunigungskräften. Dieses Verfahren
konnte sich daher in der Praxis nicht durchsetzen.
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Die
Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren
zur Aufbereitung eines Thrombozyten enthaltenden Mediums der eingangs genannten
Gattung zur Verfügung zu stellen, welches die rasche und
effektive Reduzierung der Antigene ermöglicht und dabei
gleichzeitig eine schonende Behandlung der Thrombozyten gewährleistet
und in einem geschlossenen System stattfinden kann.
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Die
Lösung dieser Aufgabe liefert ein Verfahren zur Aufbereitung
eines Thrombozyten enthaltenden Mediums der eingangs genannten Gattung
mit den kennzeichnenden Merkmalen des Hauptanspruchs.
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Erfindungsgemäß ist
vorgesehen, dass das Verfahren mindestens einen Schritt umfasst,
in dem das Medium durch eine Anordnung von Hohlfaser-Membranen filtriert
wird, wobei das aufbereitete Thrombozyten haltige Medium aus dem
Ablauf des Innenraums der Hohlfasern gewonnen wird.
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Die
erfindungsgemäße Lösung ermöglicht es,
ohne die vorgenannten für die Thrombozyten schädlichen
Zentrifugationsschritte auszukommen. Vorteilhaft ist, dass das aufbereitete
Thrombozyten haltige Produkt vergleichsweise rasch hergestellt werden
kann, in einem Verfahren, welches wesentlich weniger Aufwand erfordert,
als das zuvor beschriebene bekannte Verfahren. Das Produkt kann steril
hergestellt werden, indem beispielsweise sterile Beutel an einem
die Filtrationsvorrichtung mit den Hohlfasern umfassenden System
angeschlossen werden.
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Vorzugsweise
stellt man zunächst in einem vorgelagerten Verfahrensschritt
aus dem Ausgangsmedium ein Thrombozytenkonzentrat her, wozu man sich
ebenfalls einer Filtrationsvorrichtung mit einem Hohlfasersystem
bedienen kann. Dieser vorgelagerte Schritt ermöglicht es,
bereits einen Teil der HLA-Antigene, nämlich den löslichen
Teil, zu entfernen. Dieser Teil der Antigene wandert durch die Poren
in den Hohlfaser-Membranen und kann über einen mit deren
Außenraum in Verbindung stehenden Ablauf entfernt werden.
Aus dem Ablauf des Innenraums der Hohlfasern wird ein Thrombozytenkonzentrat
gewonnen.
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Vorzugsweise
inkubiert man das Thrombozyten haltige Medium oder das Thrombozytenkonzentrat
vor der Filtration durch die Anordnung von Hohlfaser-Membranen in
einem schwach sauren gepufferten Medium. Diese Maßnahme
dient dazu, an den Thrombozyten exprimierte Antigene von diesen abzulösen.
Man verwendet dazu vorzugsweise eine schwache organische physiologisch
verträgliche Säure wie zum Beispiel Zitronensäure,
beispielsweise in Verbindung mit einem PBS-Puffer-System.
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Beispielsweise
kann vorgesehen sein, dass man das die Thrombozyten enthaltende
Medium oder das bereits vorbehandelte Thrombozytenkonzentrat in
einem Medium inkubiert, welches einen pH-Wert von zwischen 2,5 und
3,5 aufweist, vorzugsweise einen pH-Wert von etwa 3. Nach Ablösung
der Antigene von den Thrombozyten gibt man dann diese Lösung
gegebenenfalls nach erneuter Hinzufügung von Pufferlösung
in das Filtrationssystem mit der Anordnung von Hohlfaser-Membranen,
um auf diese Weise die Trennung der HLA-Antigene von den Thrombozyten
vorzunehmen. Es kann ein Bündel von Hohlfasern eingesetzt
werden, die aus einem geeigneten polymeren Membranmaterial bestehen
und eine auf den Anwendungsfall abgestimmte Porengröße,
in der Regel im sub μ-Bereich aufweisen, die so gewählt
ist, dass die Antigene durch die Poren der Hohlfaser-Membran hindurch
in den Außenraum treten und dann in einem mit diesem verbundenen
Behältnis aufgefangen werden können. Die Thrombozyten überschreiten
die Größe der Poren der Hohlfaser-Membran und
verlassen daher die jeweilige Hohlfaser durch den kanalartigen Innenraum,
an den in der Regel eine geeignete Ablaufleitung angeschlossen wird,
welche dann zu einem vorzugsweise sterilen Auffangbehältnis
(zum Beispiel einem sterilen Blutbeutel oder dergleichen) führt,
wo sich das aufbereitete konzentrierte Thrombozytenmedium sammelt.
Die Anzahl der verwendeten Hohlfaser-Membranen wird nach der Größe
der benötigten gesamten Filteroberfläche gewählt
und kann beispielsweise mehrere hundert betragen. Diese Hohlfasern
können als Faserbündel vorliegen und beispielsweise
eine etwa U-förmige Anordnung aufweisen. Die Filtration
kann allein unter Ausnutzung der Schwerkraft erfolgen, so dass Pumpen
oder dergleichen nicht erforderlich sind, um das Medium durch die
Filtrationsanordnung zu fördern. Das das Thrombozyten enthaltende
Ausgangsmedium kann in einem Behältnis wie zum Beispiel
einem Aufnahmebeutel an einem Gestell oder dergleichen mit dem Auslass
nach unten aufgehängt werden, so dass das Medium aufgrund
der Schwerkraft über eine entsprechende Leitung zur Filtrationsvorrichtung
und durch diese hindurch fließen kann, wo dann die Auftrennung
erfolgt.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren benötigt keine
für die Thrombozyten schädliche Zentrifugationsschritte
und es kann in vergleichsweise kurzer Zeit und mit vertretbarem
Aufwand durchgeführt werden. Die Gewinnung des im Antigengehalt
reduzierten Mediums erfolgt für die Thrombozyten sehr schonend.
Da die gewonnenen Thrombozytenkonzentrate in der Regel nur eine
Haltbarkeit von wenigen Tagen haben, erfolgt die Aufbereitung nach
dem erfindungsgemäßen Verfahren regelmäßig
erst im Bedarfsfall relativ kurze Zeit vor der Verwendung.
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Eine
bevorzugte Variante der erfindungsgemäßen Aufgabenlösung
sieht vor, dass die Aufbereitung des die Thrombozyten enthaltenden
Mediums nach folgendem Verfahren erfolgt:
- – Filtration
eines bevorzugt mit einer Waschlösung (beispielsweise PBS)
aufgefüllten Thrombozytenkonzentrats durch eine Anordnung
von Hohlfaser-Membranen zwecks Auswaschung freier HLA-Antigene;
- – Inkubieren des Thrombozytenkonzentrats in einer Zitronensäure/Pufferlösung
zur Ablösung der Antigene von der Oberfläche der
Thrombozyten;
- – gegebenenfalls erneute Zugabe einer Pufferlösung
und
- – anschließend erneute Filtration der so gewonnenen
Lösung durch eine Anordnung von Hohlfaser-Membranen und
Gewinnung des aufbereiteten Thrombozyten haltigen Mediums aus dem
Ablauf des Innenraums der Hohlfasern.
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Vorzugsweise
ist weiterhin vorgesehen, dass die Aufbereitung des Thrombozyten
enthaltenden Mediums mindestens in einem der Filtrationsschritte in
einem geschlossenen System erfolgt, umfassend jeweils sterile Aufnahmebeutel
mit sterilen Anschlussvorrichtungen für die jeweiligen
Lösungen, die über Schläuche mit dem
Zulauf der Filtrationsvorrichtung bzw. mit dem Ablauf (den Abläufen)
der Filtrationsvorrichtung verbunden sind.
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Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist außerdem ein Thromobozyten
enthaltendes Medium für Transfusionen, welches nach einem
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1
bis 9 aufbereitet wurde.
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Die
in den Unteransprüchen genannten Merkmale betreffen bevorzugte
Weiterbildungen der erfindungsgemäßen Aufgabenlösung.
Weitere Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden
Detailbeschreibung.
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Nachfolgend
wird die vorliegende Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen
unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen näher
beschrieben.
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Dabei
zeigen:
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1 eine
schematisch vereinfachte Schnittdarstellung durch eine in dem erfindungsgemäßen
Verfahren verwendbare Filteranordnung;
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2 eine
schematische Darstellung einer Vorrichtung mit Filteranordnung zur
Aufbereitung eines Thrombozyten enthaltenden Mediums nach dem erfindungsgemäßen
Verfahren.
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Es
wird zunächst auf 1 Bezug
genommen. Diese zeigt einen senkrechten Schnitt durch eine Filteranordnung
in schematischer und teilweise durchbrochener Darstellung, die ein
etwa U-förmiges Bündel 1 aus einer größeren
Anzahl von Hohlfasern 21 aufweist, deren Enden in einer
gemeinsamen Lochplatte 5 luft- und keimdicht fixiert sind,
wobei sie dort einen Eingangsbereich 6 und einen Ausgangsbereich 7 ausbilden.
Die freie Länge jeder Hohlfaser ergibt sich aus deren Länge
von der Unterseite der Lochplatte 5 bis zum erneuten Erreichen
der Unterseite der Lochplatte 5. Die Gesamtlänge
jeder Hohlfaser ergibt sich durch doppelte Addition der Stärke der
Lochplatte 5 zur freien Länge. Die Lochplatte 5 kann
aus einem beliebigen geeigneten Material bestehen, beispielsweise
aus Quarz, und ist im dargestellten Fall im oberen Endbereich 8 eines
Gehäuses 9 luft- und keimdicht eingepasst, wobei
letzteres nur an einem seiner Enden, vorzugsweise am oberen, offen
ist. Auf der Lochplatte 5 und dem oberen Randbereich 8 ist
eine Verschlusskappe 10 angeordnet, die zwei Durchführungen 11, 12 aufweist,
die zum einen den Eingangsbereich 6 und zum anderen den Ausgangsbereich 7 mit
dem Außenraum des Gehäuses 9 verbinden.
Ansonsten ist die Verschlusskappe 10 ebenfalls luft- und keimdicht
mit der Lochgatte 5 und dem oberen Randbereich 8,
beispielsweise mittels Klebung verbunden.
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In
die Durchführung 11 führt eine Zuleitung 13 für
das die Thrombozyten enthaltende Medium. Aus der Durchführung 12 führt
eine Ablaufleitung 14 heraus, die mit dem Innenraum der
Hohlfasern verbunden ist und aus der somit das aufbereitete Thrombozytenmedium
austritt. Am unteren Ende führt aus dem Gehäuse 9 eine
luft- und keimdicht mit diesem verbundene Ablaufleitung 15 aus
der Auslasskammer 24 heraus, die quasi den Außenraum
aller Hohlfaser-Membranen 21 bildet. In diese Auslasskammer 24 können
nur die Bestandteile des Mediums gelangen, die durch die Poren der
Membranen austreten können. Dieses quasi Filtrat bilden
bei der Anwendung gemäß dem vorliegenden Verfahren
die Antigene, die mittels der Filteranordnung abzutrennen sind. Der
Transport des Mediums durch die Filteranordnung kann bei der gezeigten
Anordnung allein mittels der Schwerkraft erfolgen.
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Nachfolgend
wird unter Bezugnahme auf die 2 in schematischer
Darstellung eine mögliche Anordnung, bei der die zuvor
beschriebene Filtervorrichtung zur Anwendung kommen kann, beschrieben.
Das aufzubereitende Ausgangsmedium 45 befindet sich in
einem beutelartigen Behälter 31 aus Kunststofffolie,
der luft- und keimdicht einerseits mit einer Eingangsleitung 39 und
andererseits mit einer Zuleitung 13 zu einer Filteranordnung 30 der
zuvor unter Bezugnahme auf 1 beschriebenen
Art verbunden ist. Die in der Anordnung gezeigten Verbindungsleitungen
können sämtlich beispielsweise schlauchartige
Verbindungselemente aus elastischem Kunststoff sein. Die Eingangsleitung 39 trägt an
ihrem dem Sammelbehälter 31 abgewandten Ende ein
geeignetes Anschlusselement für die Zufuhr des aufzubereitenden
Mediums. Vom Behälter 31 aus führt die
Zuleitung 13 gegebenenfalls über eine zwischengeschaltete
Tropfkammer 42 zu der Filteranordnung 30. Die
Tropfkammer dient vorteilhafterweise zur Einschaltung und Kontrolle
der der Filteranordung 30 pro Zeiteinheit zugeführten
Menge des aufzubereitenden Mediums.
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Die
Filteranordnung 30 enthält ein Bündel von
Hohlfaser-Membranen der bereits oben beschriebenen Art. Die mit
dem Innenraum der Hohlfasern in Verbindung stehende Ablaufleitung 14 transportiert
das die Filteranordnung 30 verlassende aufbereitete Medium,
welches die Thrombozyten enthält. Diese Ablaufleitung 14 führt
zu einem beutelartigen Aufnahmebehälter 32, der
das aufbereitete Medium 46 aufnimmt. In der Regel ist eine
Klemme 43 oder dergleichen vorgesehen, um bei Bedarf die
Ablaufleitung 14 zu verschließen.
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An
den Außenraum der Hohlfaser-Membranen der Filteranordnung 30 ist
die Ablaufleitung 15 angeschlossen, so dass die die abgetrennten HLA-Antigene
enthaltende Lösung über die Ablaufleitung 15 in
einen entsprechenden beispielsweise ebenfalls beutelartigen Behälter 33 gelangt.
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Auf
diese Weise ist mittels der zuvor beschriebenen Vorrichtung mit
Filteranordnung eine schonende Trennung der HLA-Antigene von den Thrombozyten
möglich. Man kann die Vorrichtung auch dazu benutzen, zunächst
aus einem Thrombozyten enthaltenden Ausgangsmedium ein Thrombozytenkonzentrat
herzustellen, welches in dem Behälter 32 aufgefangen
wird, und danach eine weitere Behandlung des Konzentrats mit Säure/Pufferlösung vornehmen
und anschließend das Konzentrat erneut einer Aufbereitung
in der Filteranordnung unterziehen.
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Nachfolgend
wird anhand eines Beispiels die Behandlung eines für eine
Transfusion vorgesehenen Thrombozyten haltigen Ausgangsmediums exemplarisch
erläutert.
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Beispiel:
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- a) 225 ml eines Thrombozytenkonzentrates werden
mit 100 ml PBS Pufferlösung enthaltend (10 × Konzentrat:
1,57 g NaH2PO4 × H2O, 14,82 g Na2HPO4 × 12H2O,
81,00 g NaCl, 1000 ml Aqua Dest.) versetzt und anschließend
einer Filtration durch eine Filteranordnung mit einem Bündel
von Hohlfaser-Membranen der zuvor beschriebenen Art unterzogen.
Der gesamte Vorgang dauert ca. 2 Stunden. Dabei wird eine Lösung
enthaltend abgetrennte lösliche HLA-Antigene aus dem Außenraum
der Hohlfasern erhalten, die verworfen wird. Das aus dem mit dem
Innenraum der Filteranordnung verbundenen Ablauf erhaltene Thrombozytenkonzentrat
wird in einem sterilen Blutbeutel gewonnen und danach einer Säurebehandlung
gemäß nachfolgender Beschreibung unterzogen.
- b) ca. 100 ml eines gemäß Schritt a) gewonnenen Thrombozytenkonzentrats
werden in einem Gefäß mit 30 ml Zitronensäure
auf einen pH-Wert von ca. 3 eingestellt und in einem Kühlschrank
bei 4°C für eine Zeitdauer von 10 min inkubiert.
Bei dieser Behandlung werden nachfolgend durch Filtration ein Grossteil
der abzutrennenden HLA-Antigene von der Oberfläche der
Thrombozyten gelöst. Unmittelbar danach erfolgt der zweite
Filtrationsvorgang mittels der auch in Schritt a) verwendeten Filteranordnung.
- c) Es werden ca. 130 ml der gemäß Schritt
b) behandelten Lösung mit 200 ml PBS Pufferlösung versetzt
und in die Zuleitung einer Filtervorrichtung der oben unter Bezugnahme
auf die 1 und 2 beschriebenen
Art gegeben. Aus dem mit dem Ablauf der Filteranordnung verbundenen Behälterbeutel,
der mit dem Innenraum der Hohlfasern verbunden ist, werden ca. 150
ml einer aufbereiteten konzentrierten Thrombozytenlösung gewonnen,
die gegebenenfalls mit ca. 100 ml PBS-Pufferlösung verdünnt
wird und danach als Spendermedium für eine Thrombozytentransfusion
verwendet werden kann.
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- 1
- Faserbündel
- 5
- Lochpatte
- 6
- Eingangsbereich
- 7
- Ausgangsbereich
- 8
- Endbereich
- 9
- Gehäuse
- 10
- Verschlusskappe
- 11
- Durchführung
- 12
- Durchführung
- 13
- Zuleitung
- 14
- Ablaufleitung
- 15
- Ablaufleitung
- 21
- Hohlfaser-Membranen
- 24
- Auslasskammer
- 30
- Filteranordnung
- 32
- Aufnahmebehälter
- 33
- Behälter
- 39
- Eingangsleitung
- 42
- Tropfkammer
- 43
- Klemme
- 45
- Ausgangsmedium
- 46
- Medium
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- - A. Brand et
al. beschreiben in TRANSFUSION 1996, 36, S. 438–444 [0004]