DE102007058558A1

DE102007058558A1 - Phasenkontrastmikroskop mit einer Anordnung zur Variation der Phase des Lichtes

Info

Publication number: DE102007058558A1
Application number: DE200710058558
Authority: DE
Inventors: Arne Dr. Tröllsch
Original assignee: Carl Zeiss MicroImaging GmbH
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date: 2007-12-05
Filing date: 2007-12-05
Publication date: 2009-06-25

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Phasenkontrastmikroskop, im wesentlichen umfassend: eine Lichtquelle (6), eine zu beobachtende Probe (9), optische Mittel zur Erzeugung eines auf die Probe (9) gerichteten Beleuchtungsstrahlengangs aus dem von der Lichtquelle (6) kommenden Licht, optische Mittel zur Erzeugung eines Abbildungsstrahlengangs (12) aus dem von der Probe (9) transmittierten, reflektierten oder gestreuten Licht, eine Empfangseinrichtung, auf die der Abbildungsstrahlengang (12) gerichtet ist, und eine in den Abbildungsstrahlengang (12) eingeordnete optische Anordnung zur Veränderung der Phase des Lichtes. Die erfindungsgemäße Anordnung zur Veränderung der Phase des Lichtes weist ein erstes optisches Element auf mit einer Struktur zur Veränderung der Phase der n-ten Beugungsordnung des Lichtes, mit n einer ganzen Zahl, sowie ein zweites optisches Element (2) mit einer Struktur zur Veränderung der Phase der 0-ten Beugungsordnung des Lichtes, wobei mindestens das zweite optische Element (2) mit einer Ansteuerschaltung (3) zur Veränderung der Phase des Lichtes während der Beobachtung der Probe (9) verbunden ist.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Phasenkontrastmikroskop, im wesentlichen umfassend: eine Lichtquelle, eine zu beobachtende Probe, optische Mittel zur Erzeugung eines auf die Probe gerichteten Beleuchtungsstrahlengangs aus dem von der Lichtquelle kommenden Licht, optische Mittel zur Erzeugung eines Abbildungsstrahlengangs aus dem von der Probe transmittierten, reflektierten oder gestreuten Licht, eine Empfangseinrichtung, auf die der Abbildungsstrahlengang gerichtet ist, und eine in den Abbildungsstrahlengang eingeordnete optische Anordnung zur Veränderung der Phase des Lichtes.
Zur mikroskopischen Analyse einer Probe anhand der Phase des von der Probe beeinflußten Lichtes sind im wesentlichen folgende Verfahren bekannt:

– Die Methode der „Quantitative Phase Microscopy", bei welcher im Hellfeldverfahren Bildinformationen von der Probe aus einer fokussierten und mindestens zwei defokussierten Mikroskopeinstellungen gewonnen werden und anschließend mit Hilfe mathematischer Methoden aus diesen Bildinformationen eine Abbildung der Probe rekonstruiert wird;
– Holographische Verfahren auf der Basis von auf die Probe gerichtetem kohärentem Beleuchtungslicht;
– Eine Verfahrensweise unter Verwendung eines sogenannten "Rotated Lateral Shearing Interferometer", bei dem ein C-DIC-Prisma in Rotation versetzt und während einer Umdrehung des Prismas Bildinformationen der Probe aufgenommen werden, aus denen anschließend eine Abbildung der Probe mit Hilfe mathematischer Methoden rekonstruiert wird. Das C-DIC-Prisma ist dabei in zirkular polarisiertem Licht angeordnet;
– Das Spiralphasenkontrast-Verfahren, bei dem eine Spiralphasenmaske in die Objektivpupille oder in die Abbildungsebene der Objektivpupille eingebracht wird. In dieses Sachgebiet ist auch die nachfolgend beschriebene Erfindung einzuordnen.

Die Spiralphasenmaske ist ein optisches Element mit einer Phasenstruktur Φ(r, ϕ) nach der Funktion Φ(r, ϕ) = e^–iϕ, die sich spiralförmig um sein Zentrum erstreckt. Das Zentrum liegt in der optischen Achse des Mikroskopstrahlengangs. Dadurch wird dem durch dieses optische Element hindurchtretenden Licht eine Phasenverzögerung aufgeprägt, wobei diese Verzögerung unabhängig vom Abstand des Lichtes zum Zentrum des optischen Elementes bzw. zur optischen Achse des Mikroskopstrahlengangs ist.
Die n-te Beugungsordnung und die -n-te Beugungsordnung treten zentralsymmetrisch durch die Spiralphasenmaske hindurch und werden dabei um 180° gegeneinander verzögert, was in der Bildebene zu einer destruktiven Interferenz führt.
Weist die Probe einen Phasengradienten auf, kommen die n-te und -n-te Beugungsordnung, abhängig von Größe und Richtung des Phasengradienten, gegeneinander verzögert an der Spiralphasenmaske an und können nicht mehr destruktiv in der Bildebene interferieren.
Es entsteht ein reliefartiges Bild. Wird die Spiralphasenmaske um ihr Zentrum bzw. um die optische Achse des Mikroskopstrahlengangs gedreht, ändert das Relief seine Richtung. Dieser Effekt wird zur mikroskopischen Analyse einer Probe anhand der Phase genutzt.
Die Spiralphasenmaske ist so gestaltet, daß die 0-te Beugungsordnung durch das Zentrum der Spiralphasenmaske hindurchtritt und dabei stets um einen konstanten Betrag in der Phase verzögert wird. Die 0-te Beugungsordnung ist also bei der aus dem Stand der Technik bekannten Spiralphasenmaske nachteiligerweise nicht an der Probenanalyse beteiligt.
Ein weiterer Nachteil der bisher bekannten Nutzung einer Spiralphasenmaske besteht darin, daß mechanische Antriebselemente zur Erzeugung der Drehbewegung um die optische Achse und hochpräzise Drehlagerungen für die Spiralphasenmaske erforderlich sind. Derartige mechanische Funktionselemente unterliegen dem Verschleiß, sind dadurch kostenintensiv und müssen häufig zeitaufwendig nachjustiert werden.
Davon ausgehend liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, eine optische Anordnung für ein Phasenkontrastmikroskop anzugeben, mit welcher die Nachteile des Standes der Technik behoben sind und so das Spiralphasenkontrast-Verfahren mit höherer Effizienz ausgeführt werden kann.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe bei einem Phasenkontrastmikroskop der eingangs genannten Art gelöst, indem die Anordnung zur Veränderung der Phase des Lichtes

– ein erstes optisches Element aufweist mit einer Struktur zur Veränderung der Phase der n-ten Beugungsordnung des Lichtes, mit n einer ganzen Zahl, und
– ein zweites optisches Element aufweist mit einer Struktur zur Veränderung der Phase der 0-ten Beugungsordnung des Lichtes, wobei

Als erstes optisches Element kann eine in Drehung versetzbare Spiralphasenmaske vorgesehen sein, die lediglich in ihrer Peripherie der Spiralphasenmaske entspricht, wie sie weiter oben anhand des Standes der Technik beschrieben wurde. Das Zentrum dieser Spiralphasenmaske ist ausgespart und erfindungsgemäß einem zweiten optischen Element vorbehalten.
Das zweite optische Element ist erfindungsgemäß vorteilhaft als nematisches Liquid Crystal Display (LCD) ausgebildet, das mit einer elektronischen Ansteuerschaltung verbunden ist. In Abhängigkeit von der Ansteuerung wird der Brechungsindex der Flüssigkristalle dieses Liquid Crystal Displays geändert und dadurch die Ausbreitungsgeschwindigkeit des Lichtes so beeinflußt, daß die Phase der 0-ten Beugungsordnung um einen vorgegebenen Phasenwinkel innerhalb eines Phasenwinkelbereichs φ > 0 verzögert wird.
Zu diesem Zweck ist das zweite optische Element im Zentrum des ersten optischen Elementes positioniert.
Mit einer solchen in den Abbildungsstrahlengang eingeordneten optischen Anordnung gemäß der Erfindung wird vorteil haft erreicht, daß auch die Phase der 0-ten Beugungsordnung steuerbar verändert und das Spiralphasenkontrast-Verfahren mit höherer Effizienz ausgeführt werden kann.
Alternativ dazu kann in einer besonders bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung als erstes optisches Element ebenfalls mindestens ein nematisches Liquid Crystal Display (LCD) vorgesehen und ebenfalls mit einer Ansteuerschaltung verbunden sein. Hierbei wird in Abhängigkeit von der Ansteuerung die Ausrichtung der Flüssigkristalle auch dieses Liquid Crystal Displays variiert, dadurch der Brechungsindex dieser Flüssigkristalle verändert und so die Ausbreitungsgeschwindigkeit des Lichtes beeinflußt, wodurch die Phase der n-ten Beugungsordnung mit n einer ganzen Zahl um einen vorgegebenen Phasenwinkel innerhalb eines Phasenwinkelbereichs φ > 0 verzögert wird.
So wird in vorteilhafter Weise ein Spiralphasenkontrast erzeugt, der eine quantitative Bestimmung der Phase ohne ein mechanisch bewegtes, in Drehung versetztes optisches Element ermöglicht.
Da sich der Brechungsindex mit der Veränderung der Ausrichtung der Flüssigkristalle der nematischen LCD's nur in einer Polarisationsrichtung des Lichtes ändert, sollte in den Mikroskopstrahlengang ein Polarisator eingeordnet sein. Bevorzugt ist der Polarisator in den Beleuchtungsstrahlengang eingeordnet, im Rahmen der vorliegenden Erfindung liegt aber auch dessen Einordnung in den Abbildungsstrahlengang.
Im Hinblick auf eine raumsparende Bauweise empfiehlt es sich, den Polarisator auf einer optisch wirksamen Oberflä che einer ohnehin im Strahlengang vorhandenen Linse anzuordnen.
Die Spiralphasenmaske liegt in oder nahe einer Objektivpupille. So kann beispielsweise vorgesehen sein, die LCD's bzw. die Spiralphasenmaske auf einer optisch wirksamen Oberfläche einer Linse im Objektiv anzuordnen.
Weiterhin bevorzugt ist das erfindungsgemäße Phasenkontrastmikroskop als Weitfeldmikroskop ausgebildet, und die Empfangseinrichtung umfaßt eine Kamera zur Bildaufnahme und Mittel zur Bildauswertung.
Im Rahmen der Erfindung liegen auch Ausgestaltungen, bei denen die Ansteuerschaltung für die Flüssigkristalle der LCD's so ausgebildet ist, daß die Ansteuerung die Flüssigkristalle in Abhängigkeit von der Wellenlänge des von der Lichtquelle kommenden Lichtes erfolgt. Damit können sowohl Laser, LCD's oder auch Weißlichtquellen als Lichtquellen für das Beleuchtungslicht vorgesehen werden.
Die Erfindung soll nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden. In den zugehörigen Zeichnungen zeigen:
1 eine erste Ausführungsvariante der erfindungsgemäßen Anordnung zur Veränderung der Phase des Lichtes mit einem zentrisch zur optischen Achse eines Mikroskopobjektivs angeordneten kreisrunden optischen Element zur ansteuerbaren Veränderung der Phase der 0-ten Beugungsordnung und einer konzentrisch dazu drehbar angeordneten Spiralphasenmaske mit einer Struktur zur Veränderung der Phase von n-ten Beugungsordnungen,
2 eine zweite Ausführungsvariante, bei der abweichend von der Ausführungsvariante nach 1 anstelle der drehbaren Spiralphasenmaske ein optisches Element zur ansteuerbaren Veränderung der Phase der n-ten Beugungsordnungen vorhanden ist,
3 ein Beispiel für die Einordnung der erfindungsgemäßen Anordnung nach 1 oder nach 2 in ein Mikroskopobjektiv,
4 ein Beispiel für die Verwendung eines Mikroskopobjektivs nach 3 in einem Weitfeldmikroskop für das Durchlichtverfahren,
5 ein Beispiel für die Verwendung eines Mikroskopobjektivs nach 3 in einem Weitfeldmikroskop für das Auflichtverfahren.
In 1 ist die erfindungsgemäße Anordnung zur Veränderung der Phase des Lichtes in einer ersten Ausführungsvariante dargestellt. Die Anordnung weist hier eine um die optische Achse eines Abbildungsstrahlenganges drehbar angeordnete Spiralphasenmaske 1 auf, die zur Beeinflussung der Phase des hindurchtretenden Lichtes dient.
Wie bereits weiter oben dargelegt, ist die Spiralphasenmaske 1 ein optisches Element, das eine fest vorgegebenen Phasenstruktur aufweist, die sich in Umfangsrichtung U nach der Funktion Φ(r, ϕ) = e^–1ϕ spiralförmig ausbreitet. Dem durch diese Spiralphasenmaske 1 hindurchtretenden Licht wird demzufolge unabhängig vom Abstand zur optischen Achse eine Phasenverzögerung aufgeprägt, wobei jeweils die n-te und die -n-te Beugungsordnung zentralsymmetrisch durch die Spiralphasenmaske 1 hindurchtreten und dabei um 180° gegeneinander verzögert werden, allerdings außer der 0-ten Beugungsordnung.
Die 0-te Beugungsordnung tritt durch das Zentrum hindurch und wird unabhängig von der Drehung der Spiralphasenmaske 1 um die optische Achse um einen konstanten Betrag in der Phase verzögert. Diese Verzögerung der Phase um einen konstanten Betrag hat den Nachteil, daß der Kontrast von Kantenstrukturen geschwächt wird.
Diesbezüglich ist erfindungsgemäß vorgesehen, die Spiralphasenmaske 1 im ihrem Zentrum mit einer kreisrunden Aussparung zu versehen, in dieser Aussparung ein beispielsweise als nematisches Liquid Crystal Display (LCD) ausgeführtes optisches Element 2 zu positionieren und dieses mit einer Ansteuerschaltung 3 zu verbinden, die in Abhängigkeit von der Größe einer an die Flüssigkristalle gelegten Ansteuerspannung den Brechungsindex der Flüssigkristalle ändert, dadurch die Ausbreitungsgeschwindigkeit des Lichtes und so die Phase der 0-ten Beugungsordnung beeinflußt. Die Beeinflussung erfolgt dabei innerhalb eines Phasenwinkelbereichs von mindestens φ bis φ + 2π.
Mit einer solchen in den Abbildungsstrahlengang eines Phasenkontrastmikroskops eingeordneten optischen Anordnung wird vorteilhaft erreicht, daß das Spiralphasenkontrast-Verfahren mit höherer Effizienz ausgeführt werden kann, da nun auch die Phase der 0-ten Beugungsordnung steuerbar und somit gezielt veränderbar ist.
2 zeigt eine zweite Ausführungsvariante der erfindungsgemäßen Anordnung. Hier ist im Zentrum der Spiralphasenmaske 1 wiederum ein beispielsweise als nematisches Liquid Crystal Display (LCD) ausgeführtes optisches Element 2 positioniert und mit einer Ansteuerschaltung 3 verbunden, die vermittels einer an die Flüssigkristalle gelegten Ansteuerspannung die Phase der 0-ten Beugungsordnung innerhalb eines Phasenwinkelbereichs von mindestens φ bis φ + 2π beeinflussen kann.
Der Übersichtlichkeit halber werden in 2 für Baugruppen, die prinzipiell dem gleichen Zweck dienen wie die Baugruppen in 1, auch dieselben Bezugszeichen wie in 1 verwendet. Das gilt auch für die weiteren Darstellungen in 3 bis 5.
Im Unterschied zu der Spiralphasenmaske 1 nach der Ausführungsvariante in 1 ist die Spiralphasenmaske 1 in 2 nicht mit einer fest vorgegebenen, sich in Umfangsrichtung U spiralförmig ausbreitenden Phasenstruktur versehen, sondern sie besteht aus einzelnen, in Umfangsrichtung U aneinandergereihten kreisausschnittförmigen nematischen LCD-Elementen.
Sowohl diese nematischen LCD-Elemente als auch das im Zentrum positionierte nematische LCD-Element sind mit einer Ansteuerschaltung 3 verbunden, die so ausgebildet ist, daß jede der nematischen LCD-Elemente gesondert und gezielt angesteuert werden kann.
Die Phasenstruktur der Spiralphasenmaske 1 nach 1 ändert sich damit stufenweise in Abhängigkeit von der Ansteuerung und von der Größe, in der die kreisausschnittförmigen nematischen LCD-Elemente ausgeführt sind.
Dabei erfolgt die Ansteuerung der peripher angeordneten kreisausschnittförmigen nematischen LCD-Elemente stets so, daß die Phase der n-ten Beugungsordnung und die der -n-ten Beugungsordnung (mit n einer ganzen Zahl) wie bei der Spiralphasenmaske 1 nach 1 auch um 180° gegeneinander verzögert werden.
Hierbei besteht gegenüber der Ausführungsvariante nach 1 zusätzlich der Vorteil, daß die Spiralphasenmaske 1 nicht um ihr Zentrum rotieren muß, sondern die Rotation und damit auch die Rotation der Spiralstruktur wird mit der Ansteuerung der peripheren LCD-Elemente simuliert. Es sind also keine mechanisch bewegten und damit einem Verschleiß unterliegenden Baugruppen erforderlich.
Die Ansteuerung des im Zentrum angeordneten LCD-Elementes 2 erfolgt ebenso wie in der Ausgestaltungsvariante nach 1 so, daß die 0-te Beugungsordnung in einem Phasenwinkelbereich von mindestens φ bis φ + 2π verzögert wird.
3 zeigt ein Beispiel für die Einordnung einer erfindungsgemäßen Anordnung nach der ersten oder zweiten Ausführungsvariante in die Pupillenebene 4 eines Mikroskopobjektivs 5, und zwar zentrisch zu dessen optischer Achse 14. Symbolisch ist auch hier die Verbindung der erfindungsgemäßen Anordnung mit einer Ansteuerschaltung 3 dargestellt.
4 zeigt ein Beispiel für die Verwendung eines mit der erfindungsgemäßen Anordnung ausgestatteten Mikroskopobjektivs nach 3 im Durchlichtverfahren.
Angedeutet sind hier die Spiralphasenmaske 1 (ausgeführt entweder nach der in 1 oder 2 beschriebenen Ausgestaltungsvariante), das im Zentrum der Spiralphasenmaske 1 angeordnete nematische LCD-Element 2, die Ansteuerschaltung 3 und die Pupillenebene 4 des Mikroskopobjektivs.
Weiterhin sind zu erkennen eine Lichtquelle 6, ein Polarisator 7, eine Lochblende 8, eine zu untersuchende Probe 9, eine als Empfangseinrichtung dienende Kamera 10, auf die ein Abbildungsstrahlengang 12 trifft, sowie ein Rechner 11, der mit einer Software zur Bildauswertung ausgestattet ist und sowohl mit der Kamera 10 als auch mit der Ansteuerschaltung 3 in Verbindung steht.
Abweichend von der Darstellung nach 4 ist in 5 ein Beispiel für die Verwendung eines mit der erfindungsgemäßen Anordnung ausgestatteten Mikroskopobjektivs nach 3 im Auflichtverfahren dargestellt. Hier sind im wesentlichen die gleichen Funktionsbaugruppen wie in 4 zu erkennen. Dabei sind die Funktionsbaugruppen jedoch dem Auflichtverfahren entsprechend einander zugeordnet. Zusätzlich ist ein Strahlteiler 13 vorgesehen, der zur Auskopplung eines Abbildungsstrahlengangs 12 dient.

1: Spiralphasenmaske
2: optisches Element/LCD-Element
3: Ansteuerschaltung
4: Pupillenebene
5: Mikroskopobjektiv
6: Lichtquelle
7: Polarisator
8: Lochblende
9: Probe
10: Kamera
11: Rechner
12: Abbildungsstrahlengang
13: Strahlteiler
14: optische Achse
U: Umfangsrichtung

Claims

Phasenkontrastmikroskop, umfassend – eine Lichtquelle (6), – eine zu beobachtende Probe, – optische Mittel zur Erzeugung eines auf die Probe gerichteten Beleuchtungsstrahlengangs aus dem von der Lichtquelle (6) kommenden Licht, – optische Mittel zur Erzeugung eines Abbildungsstrahlengangs (12) aus dem von der Probe transmittierten, reflektierten oder gestreuten Licht, – eine Empfangseinrichtung, auf die der Abbildungsstrahlengang gerichtet ist, und – eine in den Abbildungsstrahlengang eingeordnete optische Anordnung zur Veränderung der Phase des Lichtes, dadurch gekennzeichnet, daß – die Anordnung zur Veränderung der Phase des Lichtes – ein erstes optisches Element aufweist mit einer Struktur zur Veränderung der Phase der n-ten Beugungsordnung des Lichtes, mit n einer ganzen Zahl, und – ein zweites optisches Element (2) aufweist mit einer Struktur zur Veränderung der Phase der 0-ten Beugungsordnung des Lichtes, wobei – mindestens das zweite optische Element mit einer Ansteuerschaltung (3) zur Veränderung der Phase des Lichtes während der Beobachtung der Probe verbunden ist.
Phasenkontrastmikroskop nach Anspruch 1, bei dem als zweites optisches Element (2) ein nematisches Liquid Crystal Display (LCD) vorgesehen und dieses mit einer Ansteuerschaltung (3) verbunden ist, wobei in Abhängigkeit von der Ansteuerung der Brechungsindex der Flüs sigkristalle und damit die Ausbreitungsgeschwindigkeit des Lichtes beeinflußt und so die Phase der 0-ten Beugungsordnung innerhalb eines Phasenwinkelbereichs von mindestens φ bis φ + 2π verzögert wird.
Phasenkontrastmikroskop nach Anspruch 1 oder 2, bei dem das zweite optische Element (2) im Zentrum des ersten optischen Elementes positioniert ist.
Phasenkontrastmikroskop nach Anspruch 3, bei dem als erstes optisches Element eine um die optische Achse drehbare Spiralphasenmaske (1) vorgesehen ist.
Phasenkontrastmikroskop nach Anspruch 3, bei dem als erstes optisches Element mindestens ein weiteres nematisches Liquid Crystal Display (LCD) vorgesehen und dieses mit der Ansteuerschaltung (3) verbunden ist, wobei in Abhängigkeit von der Ansteuerung der Brechungsindex der Flüssigkristalle, damit die Ausbreitungsgeschwindigkeit des Lichtes beeinflußt und so die Phase der n-ten Beugungsordnung verzögert wird, mit n einer ganzen Zahl.
Phasenkontrastmikroskop nach einem der vorgenannten Ansprüche, bei dem ein Polarisator, vorzugsweise im Beleuchtungsstrahlengang, vorhanden ist.
Phasenkontrastmikroskop nach Anspruch 6, bei dem der Polarisator auf einer optisch wirksamen Linsenoberfläche angeordnet ist.
Phasenkontrastmikroskop nach einem der vorgenannten Ansprüche, bei dem die Liquid Crystal Displays (LCD's) und/oder die Spiralphasenmaske (1) in oder nahe einer Objektivpupille angeordnet sind.
Phasenkontrastmikroskop nach Anspruch 8, bei dem die Liquid Crystal Displays (LCD's) und/oder die Spiralphasenmaske (1) auf einer optisch wirksamen Linsenoberfläche nahe der Objektivpupille angeordnet sind.
Phasenkontrastmikroskop nach einem der vorgenannten Ansprüche, ausgebildet als Weitfeldmikroskop.
Phasenkontrastmikroskop nach einem der vorgenannten Ansprüche, bei dem die Empfangseinrichtung eine Kamera (10) zur Bildaufnahme und Mittel zur Bildauswertung umfaßt.
Phasenkontrastmikroskop nach einem der vorgenannten Ansprüche, bei dem als Lichtquelle (6) jeweils mindestens ein Laser, eine LED oder eine Weißlichtquelle vorgesehen ist.
Phasenkontrastmikroskop nach einem der vorgenannten Ansprüche, ausgestattet mit einer Ansteuerschaltung für die Flüssigkristalle der Liquid Crystal Displays (LCD's), die so ausgebildet ist, daß die Flüssigkristalle in Abhängigkeit von der Wellenlänge des von der Lichtquelle (6) kommenden Lichtes angesteuert werden.