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Stand der Technik
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Bei
Immunantworten des Körpers (Luke A. et al.; Spektrum
der Wissenschaft, August 2005, Seiten 68–75) gegen
eine infektiöse oder immunologische Herausforderung unterscheidet
man zwischen der angeborenen (innate immunity) und der erworbenen
Immunantwort (antigen-specific acquired immunity). Die erworbene
Immunabwehr wird erst bei einer Infektion mit Krankheitserregern
ausgebildet. Sie besitzt eine Art Gedächtnis, sodass es
bei einer zweiten Infektion durch denselben Erreger in der Regel
nicht mehr zum Ausbruch der Krankheit kommt. Auf diesem Prinzip
beruhen Impfstoffe.
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Gäbe
es nur diese Art der Immunabwehr wäre der Organismus vor
der ersten Infektion völlig ungeschützt. Das ist
jedoch nicht der Fall, da es noch eine weitere sehr ursprüngliche
Immunabwehr gibt, die als angeborene Immunabwehr bezeichnet wird
und von der Fliege Drosophila bis zu Säugetieren, ja sogar
bei Pflanzen gefunden wird. Diese Immunabwehr ist die erste Abwehrfront
gegen Krankheitserreger und stellt ein evolutionär sehr
altes System dar.
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Bei
der angeborenen Immunabwehr werden über so genannte Toll-like
Rezeptoren (TLR) (Heine H. et al.; Int. Arch. Allergy Immunol.
2003; 130; 180–192 und Uematsu S. et al.,
J. Biol. Chem. 2007, May 25; 282 (21); 15319–23) und
RIG-I-like Helikasen (RLH) die krankheitsassozierten molekularen
Muster, so genannte PAMPs (phatogen associated molecular patterns),
erkannt und entsprechende Entzündungs- sowie Immunreaktionen
eingeleitet. Dadurch kann der Organismus zwischen „selbst"
und „nicht selbst" unterscheiden. RLHs werden ubiquitär
im Zytosol exprimiert, wo sie in der Lage sind, die bei viraler
Infektion entstehende dsRNA zu erkennen. TLRs und RLHs gehören
zu einer Gruppe von Rezeptoren, die auch als RPPs (pattern recognition receptors)
bezeichnet werden.
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RIG-I-like Helikasen (RLH)
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RIG-I
(retinoic inducible gene I) ist ein intrazellulärer Rezeptor
des angeborenen Immunsystems (Perry A. K. et al; Cell Research
2005; 15 (6); 407–422 und Kawai T. et
al.; J. Biochem; 2007; 141; 137–145). Der Rezeptor
gehört zu den Helikasen und ist in der Lage, einzel- und
doppelsträngige RNS mit einem Triphosphatrest an 5'-Position
zu detektieren. Damit ist er in der Lage, zwischen zelleigenen und
viralen Ribonukleinsäuren zu unterscheiden. Wird fremde
RNA erkannt, wird über eine Signaltransduktionskaskade
eine Immunantwort ausgelöst und am Ende Interferon des
Typs I produziert. Wie diese Signaltransduktionskaskade genau funktioniert
ist noch nicht vollständig aufgeklärt. Man vermutet
jedoch die Beteiligung der Transkriptionsfaktoren NF-kB, IRF3, IRF7
und der Kinasen TBK1 und IKK-i. Eine Gruppe mit ähnlichen
Eigenschaften wird unter dem Begriff RIG-I-like Helikasen zusammengefasst.
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Toll-like Rezeptoren (TLR)
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Toll-like
Rezeptoren wurden erstmals in der Mitte der 1990er Jahre entdeckt
(Zimmer A. et al.; PNAS, 1999; 96 (10), 5780–5785).
Der Name ist abgeleitet von einem in Drosophila Melanogaster von
Christiane Nusslein-Volhard gefundenem Protein, das Sie „Toll"
nannte. TLR-Proteine ähneln diesem Typus und werden damit
als „Toll-like"-Proteine bezeichnet. Dabei handelt es sich
um Transmembranproteine mit einer extrazellulären, „leucin-reichen
repeat" Domäne (LRR) wie auch einer zytoplasmatischen Domäne,
die derjenigen der IL-1R Familie homolog ist. Die verschiedenen
TLRs reagieren selektiv auf verschiedene molekulare virale und bakterielle
Komponenten und steuern über eine Signal-Transduktionskaskade
eine entsprechende Aktivierung von Genen. Dies geschieht zunächst über
so genannte Adaptermoleküle und darauf folgend über
Kinasen, die schließlich Transkriptionsfaktoren durch Phosphorylierung
derselben oder entsprechender intrazellulärer Inhibitoren
dieser Transkriptionsfaktoren (z. B. NF-kB und die IRF-Familien)
aktivieren. Letztendlich werden neben einer Vielzahl spezifischer
Gene, die eine antimikrobielle Wirkung haben, so genannte Zytokine
produziert. Zytokine sind wiederum notwendige Stimulatoren für
die erworbene Immunabwehr und damit auch ein Bindeglied zwischen
angeborener und erworbener Immunabwehr. Die Prinzipien der Ligandenerkennung,
Signaltransduktion und Signalweiterleitung sind allerdings erst
in Ansätzen verstanden.
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Bisher
sind 13 verschiedene TLRs bekannt (davon 10 beim Menschen), deren
Anzahl ausreichend ist für die Erkennung aller pathogenen
Erreger, angefangen von Bakterien über Pilze bis zu den
Viren. Die Rezeptoren erkennen dabei allen Erregern gemeinsame Strukturen,
des Weiteren mitunter auch mehrere Bestandteile gleichzeitig, ohne
dass diese sich strukturell ähneln. Beispielsweise erkennt
das TLR4 Lipopolysaccharide, aber auch Taxol. Bisher ist nicht bekannt
wie die TLRs das leisten können. Die TLRs unterscheiden sich
von Spezies zu Spezies nur wenig.
- TLR1:
bildet mit
TLR2 ein Heterodimer, ist der Rezeptor von triacyliertem Lipoprotein
und Zymosan aus Hefen.
- TLR2:
ist der Rezeptor für bestimmte Peptidoglykane,
Lipopeptide, Glykolipide und verschiedener Bakterien.
- TLR3:
erkennt lange dsRNA, wie Sie bei einer Virusreplikation
in infizierten Zellen vorkommt.
- TLR4:
ist der Rezeptor für Lipopolysaccharide
(LPS, auch Endotoxine), verschiedene Hüllglykoproteine
(auch von Viren) und Taxol. LPS sind Bestandteile von Bakterienzellwänden.
- TLR5:
ist der Rezeptor von Flagellin, einem Hauptbestandteil
der Geiseln (Flagellae), mit welchen sich Bakterien fortbewegen.
- TLR6:
bildet mit TLR4 ein Heterodimer, ist der Rezeptor
von diacyliertem Lipoprotein und bestimmten Peptidoglykanen.
- TLR7&TLR8:
beide
codierenden Gene liegen auf dem X-Chromosom und weisen ein hohe
Homologie auf, es sind Rezeptoren für kurze ssRNA/dsRNA
z. B. von RNA-Viren. Es werden letztendlich auch dendritische Zellen
und T-Zellen aktiviert.
- TLR9:
Ist der Rezeptor für bakterielle DNA, bzw.
für nicht methylierte CpG Motive, die in bakterieller DNA
gehäuft (20 x häufiger als in Säugerzellen)
auftritt. Das CpG Motiv ist in Säugerzellen stark methyliert,
wodurch es unterschieden werden kann. Ähnliches wie für
bakterielle DNA gilt auch für virale DNA. Es konnte gezeigt
werden, dass TLR9 IL-12 aktiviert, das wiederum T-Helferzellen vom
Typ I stimuliert. Weiter wird die Induktion von Interferonen vermittelt.
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Über
die immunstimulatorische Eigenschaft von bakterieller DNA berichtete
schon Anfang der 80er Jahre die Gruppe um Dr. Tokunaga. Als zugehöriger
Rezeptor wurde von der Gruppe um Dr. Shizuo Akira der TLR9 Rezeptor
identifiziert (Aufklärung der Rollen von Toll-Rezeptoren
und ihrer Signaltransduktionskaskaden mittels Gen-Targeting, Robert-Koch-Vorlesung
von Dr. Shizuo Akira, Allgemeine Presseinformation 2002; www.robertkoch.stiftung.de).
- TLR10:
Ligand noch nicht bekannt
- TLR11:
Ist Rezeptor für das urpathogene Bakterium
Escherichia coli und dem Profilinähnlichen Protein des
Urtierchens Toxoplasma gondii
- TLR12:
Funktion und Ligand noch unbekannt
- TLR13:
Funktion und Ligand noch unbekannt
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Lokalisation der TLR:
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TLR2,
4, 5 und 6 sitzen insbesondere in den Plasmamembranen von Monozyten,
natürlichen Killerzellen, Mastzellen oder myaloiden dendritischen
Zellen., 7, 8, und 9 befinden sich insbesondere in Endosomen von
Immunzellen (Siegmund-Schultze N., www.aerzteblatt.de).
Die Aktivierung der Immunantwort erfordert daher eine intrazelluläre
Aufnahme über Endozytose und eine Reifung der Endosomen.
Die Signalweiterleitung beginnt hier in einem endosomalen Kompartiment.
Für TLR3 gibt es Hinweise, dass er sich in den Plasmamembranen
befindet, allerdings gibt es auch Darstellungen in der Literatur
die von einer endosomalen Lokalisation ausgehen. TLRs agieren häufig
paarweise und treten bei unterschiedlichen Zelltypen in unterschiedlichen
Kombinationen auf.
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Signaltransduktionskaskaden:
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Die
Signaltransduktionswege der unterschiedlichen TLRs (Perry
A. K. et al; Cell Research 2005; 15 (6); 407–422 und Kawai
T. et al.; J. Biochem; 2007; 141; 137–145) sind
teilweise zwar ähnlich, weisen aber durchaus auch größere
Unterschiede auf, sodass es am Ende zu einer unterschiedlichen Genexpression
und damit unterschiedlichen biologischen Reaktionen kommt. Mit Ausnahme
von TLR3 geben alle TLRs ihr Signal an das Adapterprotein MyD88
weiter. MyD88 spielt eine entscheidende Rolle bei der Signalübermittlung über den
TLR/Interleukin-1 Rezeptor. Die zytosolische Domäne der
TLRs zeigt hohe Ähnlichkeit zu der des Interleukin-1 Rezeptors
und wird daher auch als Toll/IR-1 Rezeptor Domäne (TIR)
bezeichnet. MyD88-defiziente Splenozyten zeigten z. B. keine Reaktionen
auf II-1, LPS oder CpG-DNA. Außerdem wurde bei MyD88 defizienten
Zellen in Reaktion auf TLR2, TLR7, TLR9-Liganden keine Aktivierung
von Signalmolekülen, wie NF-kB oder MAP Kinasen beobachtet.
Das ist ein deutlicher Hinweis auf die vollständige Abhängigkeit
der TLRs (außer TLR3 und TLR4) von MyD88 für deren
Signalweiterleitung. Andere Adaptermoleküle sind TIRAP
(Toll-Interleukin-1-Rezeptor(TIR)-Domäne enthaltendes Adapterprotein
(TLR2 und TLR4), Mal (MyD88-adapter-like), TRIF (TLR3 und TLR4)
und TRAM (TLR4).
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Welche
Proteine neben den Adaptermolekülen noch mitwirken hängt
vom jeweiligen TLR ab.
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Signaltransduktionskaskade über
TLR3:
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Aktiviert
nach Bindung passender Liganden die Transkriptionsfaktoren „interferone
regulating factor 3" (IRF3) und NF-kB durch das Adaptormolekül
TRIF. Die weitere Signaltransduktionkaskade nach TRIF ist inzwischen
bekannt. TRIF rekrutiert die IRF-Kinase TBK1 oder PKR (dsRNA activated
Protein Kinase). Nach der Phosphorylierung des Transkriptionsfaktors „interferone
regulatory factor 3" (IRF3) dimerisiert dieser und kann als solcher
in den Zellkern gelangen, wo er Zytokine (Interferone vom Typ 1
bzw. Interferon -beta) induziert (L. Martinez-Sobrido et al). Zur
vollen Aktivität von IRF sind zusätzlich die Phosphatidylinositol
3-Kinase und weitere „Downstreamkinasen" notwendig. PKR
gehört im Übrigen zu einer Klasse von 20 dsRNA
bindenden Proteinen. Sie wird auch durch diese Bindung aktiviert
und kann damit auch unabhängig von TLR3 zu einer Immunantwort
führen.
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Signaltransduktionskaskaden über
TLR7, TLR8 und TLR9
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Die
Induktion von Typ I Interferonen durch TLR7/8 und TLR9 läuft
hauptsächlich über das Adaptermolekül
MyD88. Letztendlich wird der Transkriptionsfaktor „Interferone
regulatory factor 7" (IRF7) über Phosphorylierung durch
Kinasen (IRAK-1, IRAK-4, IKK-alpha) aktiviert, worauf er in den
Zellkern wandert und die Transkription von Interferonen vom Typ
I induziert. Eine andere Variante erfolgt über den Transkriptionsfaktor
IRF1, allerdings ist hier der genaue Mechanismus noch nicht bekannt.
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TLRs
sind von großem therapeutischem Interesse. TLR Agonisten
werden z. B. als Adjuvantien in Impfstrategien oder in der Krebstherapie
eingesetzt. Beispiele sind die Behandlung von Basalzellkarzinom durch
die TLR7/8 Agonisten Imiquimod/Resiquimod oder von Blasenkrebs durch
einen TLR2 Agonisten. Der TLR9 Rezeptor wird durch ein synthetisches
CpG-haltiges Oligonukleotid (CpG 7909 und CpG 10101) für
die Therapie von Autoimmunerkrankungen, Krebs und Infektionskrankheiten
angesteuert. Kommerzialisiert werden TLR9 basierende Therapiestrategien
von der Firma Coley Pharmaceuticals.
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Aber
auch durch eine Überreaktion der angeborenen Immunabwehr
können zahlreiche Krankheiten ausgelöst werden,
beispielsweise Autoimmunerkrankungen wie rheumatische Arthritis
und systemischer Lupus erythematodes. Hier reagieren TLRs mit Zerfallsprodukten
körpereigener Zellen und leiten damit die Immunabwehr fehl.
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Die
TLRs stehen sogar im Verdacht, ursächlich mit Herz-Kreislauf-Erkrankungen
im Zusammenhang zu stehen. Entzündungsreaktionen am Herz
können zur Bildung von arteriosklerotischen Plaques beitragen, die
letztendlich durch Gefäßverschluss zum Infarkt
führen können.
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Zytokine/Cytokines:
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Zytokine
sind multifunktionale Signalstoffe. Es handelt sich dabei um zuckerhaltige
Proteine, die eine regulierende Funktion für das Wachstum
und die Differerenzierung von Körperzellen haben. Einige
von ihnen werden daher auch als Wachstumsfaktoren bezeichnet. Viele
Zytokine spielen zudem eine wichtige Rolle bei immunologischen Reaktionen
und werden daher auch Mediatoren genannt. Zytokine werden von den
Zellen durch Sekretion in das umgebende Medium abgegeben und stimulieren
andere Zellen, wenn diese einen passenden Rezeptor besitzen. Man
unterscheidet 5 Hauptgruppen von Zytokinen:
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1. Interferone (IFN)
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Interferone
weisen Zellen an, Proteine zu bilden, die eine virale Infektion
erschweren oder unterbinden. Auch können Interferone antitumorale
Wirkung haben.
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2. Interleukine (IL)
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Interleukine
dienen der Kommunikation von Immunabwehrzellen untereinander und
erhöhen dadurch die Koordination bei der Abwehr von Krankheitserregern
und der Tumorbekämpfung
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3. Koloniestimulierende Faktoren
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Koloniestimulierende
Faktoren werden in der Niere gebildet. Es handelt sich um Wachstumsfaktoren für
Blutkörperchen
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4. Tumornekrosefaktoren (TNF)
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Die
wichtigste Funktion von TNFs ist, die Aktivität verschiedener
Immunzellen zu regeln. Sie werden hauptsächlich von Makrophagen
ausgeschüttet. TNFs können den Zelltod (Apoptose),
Zellproliferation, Zelldifferenzierung und Ausschüttung
anderer Zytokine anregen.
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5. Chemokine
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Chemokine
sind Chemoattraktoren, die Zellen mit passenden Rezeptoren veranlassen
durch Chemotaxis zur Quelle der Chemokine zu wandern
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Von
besonderer Bedeutung als Mediatoren für immunologische
Prozesse sind die Interferone (IFN), insbesondere die Interferone
vom Typ I. Das erste Interferon dieser Art wurde 1957 von Isaacs
und Lindemann gefunden (Isaacs, A. et al.; J. Proc. R. Soc.
Lond. B. Biol. Sci. 147, 258–267). Der Name rührt
daher, dass dieses Protein mit der Replikation von Viren interferiert.
Typ I Interferone sind Schlüsselzytokine, die eine antivirale
Antwort von Zellen auslösen, einen „antiviralen
Status" etablieren und Zellen des Immunsystems zu einer antiviralen
Antwort stimulieren. Diese Gruppe bindet an einen Rezeptor, den
so genannten IFN-alpha Rezeptor (IFNAR), der aus zwei Proteinketten
(IFNAR1 und IFNAR2) besteht. Man unterscheidet verschiedene Untertypen.
Diese werden als IFN- alpha, IFN-beta, IFN-kappa, IFN-delta, IFN-epsilon,
IFN-tau, IFN-omega und IFN-zeta bezeichnet. Wiederum von besonderer
Bedeutung sind hier die Interferone des Typs alpha und beta, die
von vielen Zellen sekregiert werden, z. B. von Lymphozyten, Makrophagen,
Fibroblasten Endothelzellen, Osteoplasten und anderen.
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Die
IFN-alpha Proteine kommen in 13 Subtypen vor, die als IFNAX (x =
1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 13, 14, 16, 17 und 21) bezeichnet werden.
Alle ihre Gene liegen clusterartig auf dem Chromosom 9.
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Von
den IFN-beta Proteinen sind zwei beschrieben. Es handelt sich um
IFNB1 und IFNB3. Ein als IFNB2 beschriebenes Protein konnte später
als ein bekanntes Interleukin identifiziert werden.
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Über
eine Signaltransduktionskaskade wird nach der Bindung an den in
der äußeren Zellmembran liegenden Interferon-Typ-1-Rezeptor
der Transkriptionsfaktor „interferone stimulated gene factor
3" (ISGF3), ein Heterotrimer und Aktivator der Transkription der
Transkriptionsfaktoren STAT1, STAT2 und „IFN regulatory
factor 9 (IRF9), welche in den Zellkern wandern und dort die Transkription
von Hunderten von Effektormolekülen (über so genannte
IFN induzierbare Gene) induziert. Diese Effektormoleküle
beeinflussen direkt die Proteinsynthese, das Zellwachstum und das Überleben
im Prozess der Etablierung des so genannten „antiviralen
Status" (antiviral state). In diesem Status wird die Infektiösität
der Viren z. B. durch verringerte Replikationsraten abgewehrt oder
zumindest verringert.
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Zusätzlich
wird das adaptive Immunsystem aktiviert, indem die Reifung von dendritischen
Zellen ausgelöst, die Antikörperantwort der B
Zellen und die T Zellantwort aktiviert wird. Es werden Lymphozyten
und Monozyten durch induzierte Chemokine zum Ort der Infektion rekrutiert.
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Nicht virale Genliefermethoden
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Das
Einbringen von genetischem Material in eukariotische Zellen (Transfektion),
insbesondere Säugerzellen ist heute eine Methode, die aus
der modernen Forschung nicht mehr wegzudenken ist (Domb
A. J.; Review in Molecules; 2005; 10; 34 und Xiang
G; Keun-Sik K.; Dexi L.; Review in The AAPS Journal; 2007; 9
(1) Article 9; http://www.aapsj.org)). Ohne diese
Methode wäre eine Aufklärung der Funktion verschiedener Gene
wesentlich erschwert. Nicht zu vergessen ist die Möglichkeit,
auf diesem Wege Proteine eukariotischen Ursprungs originalgetreu
herzustellen, da die korrekte posttranslationale Modifikation durch
die eukariotischen Zellen, im Gegensatz zu früher häufig
verwendeten prokariotischen Zellen, sichergestellt wird. Des Weiteren wird
für die nahe Zukunft erwartet, dass insbesondere das Einbringen
von genetischem Material in humane Zellen, also die Gentherapie,
Einzug in die moderne Medizin in Form klinisch getesteter Verfahren
und Therapien halten wird. Das Einbringen von genetischem Material
ermöglicht es z. B. in eukariotischen Zellen zerstörte
DNA Bereiche zu ersetzen und somit Fehlfunktionen zu beheben. Des
Weiteren können Suizidgene eingeschleust werden, die beispielsweise
Krebszellen zum „Selbstmord" zwingen. Aber auch das Stilllegen (Knock-down)
von Genen kann erreicht werden, indem beispielsweise siRNA (small
interfering RNA) oder Antisense Moleküle zum Einsatz kommen.
Mit der Möglichkeit, auf den genetischen Steuerungsapparat
der Zelle zugreifen zu können, steht dem Menschen daher
ein wertvolles Mittel zur Verfügung, sein Verständnis
aber auch seinen Einfluss auf die natürlich ablaufenden
Prozesse in einer Zelle zu vermehren.
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Den
enormen Möglichkeiten, die das Einbringen von genetischem
Material in eukariotische Zellen mit sich bringt, steht ein Arsenal
von Methoden gegenüber, die nur unbefriedigende Leistungsfähigkeit
aufweisen. Die jeweils spezifisch auftretenden Mängel bis
dato vorhandener Methoden betreffen im Wesentlichen die wichtigen
Parameter Effizienz, Toxizität, Immunogenität,
Targeting, Restriktion bzgl. der Größe des genetischen
Materials, Möglichkeiten der in vivo/in vitro Anwendung,
Möglichkeit von High-Throughput-Anwendungen, Gefahrenpotential,
Einfachheit der Methode und Kosten der Methode. Kein Verfahren ist
in der Lage, alle diese Parameter ausreichend zu erfüllen
und so wird dem Fehlen eines geeigneten Gen-Carriersystems zugeschrieben,
dass sich bis heute trotz erheblicher Forschungsaufwendungen keine
auf Gentherapie beruhende medizinische Therapie etablieren konnte.
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In
den vergangenen Jahren erlangte die Erforschung so genannter Genliefermethoden
(Gene Delivery Systems), die sowohl in vitro als auch in vivo eingesetzt
werden können, enorme Bedeutung, da jenen große Chancen
eingeräumt werden, der Gentherapie zum Durchbruch zu verhelfen.
Ein Schwerpunkt der Gentherapieforschung besteht darin, Viren als
Carriersysteme zu nutzen. Da das Einbringen von DNA oder RNA in Fremdzellen
ein integraler Bestandteil des Vermehrungszyklus der Viren ist,
wurde diese Fähigkeit durch einen natürlichen,
evolutiven Prozess in der Entwicklungsgeschichte der Viren soweit
verfeinert, dass es bis heute keine effektiveren Gen-Carrier gibt.
Die natürlich vorkommenden Viren werden gentechnisch so
manipuliert, dass sie Ihre Fähigkeit zur Reproduktion und
ihre Pathogenität verlieren, jedoch eine Zelle mit rekombinant eingebrachtem
genetischem Material infizieren können. Da Viren außer
aus genetischem Material im Wesentlichen aus Proteinen bestehen,
bieten Sie dem Immunsystem allerdings eine große Angriffsfläche.
Dabei hat das Immunsystem in einem ebenso evolutionären
Anpassungsprozess Strategien entwickelt, sich diesen Eindringlingen
zur Wehr zu setzen. Daher wird die Immunantwort des Körpers
als ein besonders bedeutender Faktor bezüglich gescheiterter
Gentherapiestudien genannt.
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Die
gegenwärtig zur Verfügung stehenden Genliefermethoden
können in die zwei Hauptgruppen virale Systeme und nicht-virale
Systeme unterteilt werden. Die nicht viralen Systeme können
wiederum in chemische und physikalische Methoden unterschieden werden.
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Von
den nicht-viralen Systemen, die auf chemischen Methoden beruhen,
sind insbesondere solche erwähnenswert, die auf kationischen
Lipiden (sog. Lipofektion) oder kationischen Polymeren (sog. Polyfektion) beruhen.
Deren Effizienz liegt in der Regel weit hinter den viralen Systemen.
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Allseits
bekannte kationische Polymere sind beispielsweise Poly-L-Lysin (PLL),
(
EP 388758 ) Polyethylenimin
(PEI), (
J. P. Behr et al.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA; 1995;
92; 7297 (
WO 9602655 ),
Diethylaminoethyldextran (DEAE), (
S. C. De Smedt et al.;
Phar. Res.; 2000; 17; 113), Starburst Dendrimere (PAMAM),
(
F. C. Szoka et al.; Bioconjug. Chem.; 1996; 7; 703;
WO 9502397 ), Chitosanderivate
(
W. Guang Liu et al.; J. Control. Release; 2002; 83; 1)
oder auch Polydimethylaminoethylmethacrylate (
P. van de
Wetering et al.; J. Gene Med.; 1999; 1; 156;
WO 9715680 ). Auch die weit verbreitete
Ca-Phosphat-Präzipitationsmethode nutzt in weiterem Sinne
ein „kationisches Polymer" und kann daher zu dieser Gruppe
gezählt werden.
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Kommerziell
erhältliche Produkte solcher kationischer Polymere sind
z. B. Superfect, Polyfect (Qiagen), ExGen500 (Biomol) und jetPEI
(Qbiogene).
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Ebenso
bekannte kationische Lipide (
J. P. Behr; Bioconjugate Chem.;
1994; 5; 382) sind beispielsweise DOTMA (
US 4946787 ), DOTAP (
Leventis
et al.; Biochim. Biophys. Acta; 1990; 1023; 124), DOGS
(
EP 394111 ), DOSPA (
WO 9405624 ), DOSPER (
WO 97002419 ), DMRIE (
US 5264618 ) oder DC-Chol
(
Huang et al; Biochem. Biophys. Res. Commun.; 1991; 179;
280;
WO 9640067 ).
Solche oder ähnliche Lipide werden als solche oder in Kombination
mit so genannten Colipiden (z. B. DOPE) in der Regel in ethanolischen,
wässrigen Pufferlösungen als Micellen oder Liposomen
formuliert. Als solche, oder auch als Öl oder Festsubstanz
zur Eigenformulierung sind sie als kommerziell erhältliche
Reagenzien, wie Lipofectin, Lipofectamin, Lipofectamine 2000 (Invitrogen),
Fugene (Roche), Effectene (Qiagen), Transfectam (Promega), Metafectene
(Biontex) etc. erhältlich.
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Kationische
Lipide und kationische Polymere bilden in Anwesenheit von DNA oder
RNA aufgrund der gegenläufigen Ladungsverhältnisse
spontan so genannte Lipoplexe oder Polyplexe. Die DNA wird dabei
durch die Kompensation der negativen Ladung am Phosphatrest kondensiert,
also in ihrer Größe minimiert. Im Allgemeinen
hängt die Transfektionseffizienz von Lipoplexen oder Polyplexen
von einer Vielzahl von Parametern ab. Die wichtigsten sind das Mengenverhältnis
von genetischem Material zu kationischer Komponente bei der Herstellung
der Lipo/Polyplexe, Ionenstärke während der Herstellung
der Lipo/Polyplexe, Absolutmenge von Lipo/Polyplexen pro Zelle,
Zelltyp, Proliferationszustand der Zellen, physiologischer Status
der Zellen, Zellteilungsrate, Inkubationszeit etc. Diese Einflussparameter
sind Ausdruck eines komplizierten Transfektionsgeschehens, bei der
die Lipo/Polyplexe bzw. die enthaltenen genetischen Materialien
eine Vielzahl von zellulären Barrieren überwinden
müssen.
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Die
erste Barriere stellt die äußere negativ geladene
Zellmembran dar. Es wird angenommen, dass transfektionsaktive Lipoplexe,
die eine positive Nettoladung haben müssen, durch adsorptive
Endocytose oder Flüssigphasenendocytose in das Innere der
Zelle gelangen. Durch die Endocytose, die einen aktiven Transportprozess
der Zelle darstellt, wird Material auf der Zelloberfläche
mit Zellmembran ummantelt und als Vesikel (Endosom) internalisiert.
Durch Verschmelzung mit so genannten Lysosomen, die ein komplexes
Gemisch von Enzymen beinhalten, werden die in den Endosomen enthaltenen
Stoffe abgebaut.
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Da
zu diesem Abbau ein niedriger pH-Wert nötig ist, besitzen
Endosomen Protonenpumpen, die solange Protonen in die Endosomen
pumpen, bis ein entsprechender pH-Wert erreicht wird. Um Ladungsneutralität
zu wahren, strömen im gleichen Ausmaß Chloridionen
in die Endosomen.
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Viele
moderne kationische Lipide oder Polymere besitzen aus diesem Grund
Puffereigenschaften. Auf diese Weise wird der niedrige pH-Wert nicht
erreicht und es kommt zu einem Eintrag an Ionen in die Endosomen,
der die Endosomen durch den entstehenden osmotischen Druck zum Platzen
bringt. Auf diese Weise gelangen diese Lipo/Polyplexe in das Cytosol.
Da auch eine Reihe transfektionsaktiver Lipide und Polymere ohne
Puffereigenschaften bekannt sind, muss ein weiterer Mechanismus
existieren, der die Lipo/Polyplexe in das Cytosol gelangen lässt.
Man vermutet zumindest im Falle der Lipide eine Fusion der beteiligten
Membranen und damit einhergehend eine Destabilisierung. Ob dabei
vorwiegend der Lipoplex oder die enthaltende DNA/RNA als solches
in das Cytosol gelangt ist unklar. Es wird jedoch vermutet, dass
die DNA im Cytosol aus dem Lipoplex freigesetzt wird, da Versuche
scheiterten, durch Mikroinjektion von Lipoplexen direkt in den Zellkern
eine Proteinexpression zu erreichen. Es scheint, als ob die in den
Lipoplexen gebundene DNA dem Transkriptionsapparat nicht zugänglich
ist.
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Handelt
es sich um gegen mRNA gerichtete Antisense Moleküle oder
siRNA, ist der biologische Wirkort erreicht und die Dauer der Wirkung
hängt im wesentlichen von der Konzentration cytosolischer
RNasen und der Rate der Freisetzung aus den Lipo/Polyplexen ab.
DNA kann als solche nicht in den Zellkern eindringen, was als „Nuclear
Barrier" bezeichnet wird. Sie gelangt allerdings während
der Zellteilung an ihren Wirkort und führt so zur Expression
von Proteinen.
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Als
weitere nicht-virale Methoden, die auf chemischen Methoden basieren,
seien Systeme genannt, die ein DNA-bindenden Molekülteil
sowie einen Liganden tragen, der rezeptorvermittelte Endozytose
auszulösen vermag (Beispiele Transferrinfektion).
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Das
bedeutendste Beispiel einer nicht-viralen Methode, die auf einem
physikalischen Verfahren beruht, stellt die Elektroporation dar.
Dabei werden die zu transfizierenden Zellen zwischen zwei Elektroden
verbracht, an die ein typischer Spannungsverlauf angelegt wird.
Auf diese Weise werden die Zellen einem intensiven elektrischen
Stromstoß (Puls) ausgesetzt, der zur einer reversiblen Öffnung
(Poren) der Zellmembran führt. Durch diese Poren können
Substanzen, wie z. B. genetisches Material, die sich in unmittelbarer
Umgebung der Poren befinden in die Zelle eindringen. Der Puls (also
Spannungsverlauf) als einer der wichtigsten Erfolgsparameter muss
für jeden Zelltyp optimiert werden. Es gibt inzwischen
einige kommerzielle Anbieter für Elektroporatoren (z. B.
Eppendorf/Multiporator,
US 6008038 ,
Biorad/Genpulser,
US 4750100 ,
Genetronics Inc.,
US 5869326 ,
BTX/ECM Serie), die speziell für eukariotische Zellen entwickelt
wurden und eine Anpassung der Pulsparameter an den jeweiligen Zelltyp
erlauben. Tatsächlich gibt es inzwischen auch Vorrichtungen die
eine in vivo Applikation möglich machen. Bei der in vitro
Anwendung werden die Zellen in einem Elektroporationspuffer suspendiert,
zusammen mit der zu transfizierenden DNA/RNA in eine mit Elektroden
versehene Elektroporationsküvette verbracht und einem oder
mehreren Pulsen ausgesetzt. Neben dem Spannungsverlauf sind weitere
wichtige Parameter die Beschaffenheit des Puffers, die Temperatur,
die Zellkonzentration und die DNA-Konzentration. Nach dem die Zellen
dem Puls ausgesetzt wurden, lässt man ihnen eine kurze Zeit
zur Regeneration der Zellmembran. Anschließend werden die
Zellen in ein Kulturgefäß ausgesäht und
wie üblich kultiviert.
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Als
weitere physikalische Methoden seien Mikroinjektion, Hydrodynamische
Methoden, ballistische Methoden (Genegun) oder Methoden, die Ultraschall
benutzen genannt oder auch die Injektion nackter DNA in verschiedene
Organe, die zu geringer Expression der entsprechenden Gene führt.
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Zu
den Verfahren die physikalische Methoden als auch chemische Methoden
vereinen, zählt insbesondere auch die Magnetofektion, die
DNA-bindende Moleküle auf magnetischen Nanoteilchen nutzt
um über eine magnetischen Feldgradienten DNA auch der Oberfläche
von Zellen anzureichern und Endozytose auszulösen
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Beschreibung der Erfindung
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Mit
repetitiven Lipofektionsversuchen, bei denen zunächst eine
Transfektion mit einer spezifisch gegen ein bestimmtes Protein gerichteten
siRNA durchgeführt wurde und anschließend eine
Plasmidtransfektion mit einem Reportergen folgte, konnte festgestellt
werden, dass der Transfektionserfolg der Plasmidtransfektion ausblieb,
obwohl die Zellen einen gesunden Eindruck machten. Nur bei sehr geringen
siRNA Mengen konnte eine geringe Menge des Reporterproteins detektiert
werden.
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Um
auszuschließen, dass es sich um einen OFF-Target-Effekt
der spezifischen siRNA handelt, wurde der Versuch mit einer unspezifischen
siRNA wiederholt, die gegen das humane Erbgut „geblastet"
wurde. Das Ergebnis blieb jedoch dasselbe.
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Da
bekannt ist, dass auch die Proliferation der Zellen einen Einfluss
bei der Lipofektion hat, wurde untersucht, ob die Zellen in Ihrem
Proliferationsverhalten durch die Vortransfektion mit siRNA beeinträchtigt
wurden. Dabei konnte festgestellt werden, dass die Proliferationsraten
bei höheren siRNA Mengen sinken, jedoch eine ausreichende
Proliferation bei den Experimenten gegeben, war, als die der Vortransfektion
folgende Plasmidtransfektion fehlschlug. Es schien, als ob die Zellen
sich überraschenderweise gegen die zweite Transfektion
wehren können.
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Mit
repetitiven Transfektionsversuchen, bei denen zwei Plasmidtransfektionen
hintereinander geschaltet wurden, konnte ein ähnliches
Ergebnis erhalten werden, wenn auch nicht mit der oben genannten
Deutlichkeit. Der zweite Transfektionschritt war in der Regel entweder
sehr ineffizient oder kontraproduktiv. Auch hier wurden ähnliche
Untersuchungen, wie oben genannt, durchgeführt, um sicherzustellen,
dass es sich nicht um toxische Effekte handelt. Es stellt sich daher
die Aufgabe, die Transfektionseffizienz insbesondere bei wiederholter
Transfektion zu steigern.
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Diese
Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren
zur Steigerung der Transfektionseffizienz eines nicht viralen Genliefersystems
gelöst, bei dem das nicht virale Genliefersystem insbesondere
ein kationisches Lipid, ein kationisches Polymer, ein kationisches
Protein oder eine Verbindung umfasst, die eine DNA und/oder RNA-bindende
Domäne aufweist und rezeptorvermittelte Endozytose auslösen
kann, oder bei dem das nicht virale Genliefersystem insbesondere
auf einer physikalischen Methode wie Elektroporation, Mikroinjektion,
Ultraschall oder einer ballistischen oder hydrodynamischen Methode
beruht, dadurch gekennzeichnet, dass die angeborene Immunabwehr
verringert wird.
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Das
heißt, dass insbesondere die intrazelluläre Signaltransduktionskaskade
ausgehend von den TLRs, über die Adaptermoleküle, über
die entsprechenden Kinasen, die die Transkriptionsfaktoren phosphorylieren,
welche wiederum die Interferone induzieren, unterbrochen werden
kann. Weiter kann die Signalübertragung durch Botenstoffe
zwischen den Zellen unterbrochen werden. Da es sich dabei allesamt
um Proteine handelt, werden erfindungsgemäß vorzugsweise
aktivitätssteigernde oder aktivitätsmindernde
Effektoren wie Antikörper, Aptamere, Antagonisten oder
Inhibitoren gegen diese Proteine eingesetzt. Dabei können
die entsprechenden Wirkstoffe als solches oder mit entsprechenden
Hilfsmolekülen an oder in die Zellen verbracht werden,
je nach Zellgängigkeit oder Zielort. So können
z. B. Wirkstoffe über liposomale Carrier in die Endosomen
verbracht werden. Ist der Zielort das Zytosol, bieten sich insbesondere
Elektroporation oder spezielle Peptidsequenzen an, die in der Lage
sind, die Zellwände zu permeabilisieren. Handelt es sich
bei den Wirkstoffen um Peptide oder Proteine, so können
diese erfindungsgemäß auch durch Transfektion
geeigneten genetischen Materials intrazellulär gebildet
werden und falls nötig mit Lokalisationssequenzen zu den
entsprechenden Zellkompartimenten dirigiert werden. Will man über
siRNA Gene stilllegen, die für entscheidende Proteine des
Signatransduktionapparates kodieren, stehen erfindungsgemäß die
bekannten Transfektionssysteme zur Verfügung. Das erfindungsgemäße
Verfahren bzw. die erfindungsgemäße Verwendung
kann sowohl in vitro als auch in vivo eingesetzt werden bzw. erfolgen.
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Bei
dem erfindungsgemäßen Verfahren kann z. B. mindestens
einer der TLR3, 7, 8, 9, eine oder mehrere RIG-I Helikasen und/oder
eine oder mehrere RIG-I-like Helikasen blockiert werden.
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So
sind Antikörper gegen die Toll Like Rezeptoren TLR7, TLR8
und TLR9 bekannt und kommerziell erhältlich. Diese könnten
zusammen mit Endozytose auslösenden Lipo- oder Polyplexen
als solche oder verpackt in Liposomen in die Endosomen geschleust
werden und so die Rezeptoren blockieren. Auch gegen TLR3 ist ein
Antikörper bekannt und kommerziell erhältlich.
Da sich TLR3 nach bisherigen Erkenntnissen an der Oberfläche
der Zellen befindet, reicht in diesem Fall eine Zugabe zum extrazellulären
Raum. Die Wahl des zu blockierenden Rezeptors hängt erfindungsgemäß natürlich
von der Art des zu transfizierenden genetischen Materials ab.
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Aber
auch Inhibitoren bzw. Antagonisten für verschiedene TLRs
sind bekannt und werden erfindungsgemäß in bevorzugter
Weise eingesetzt. So hat man festgestellt, dass bestimmte DNA Sequenzen
viralen Ursprungs den TLR9 Rezeptor blockieren können (Krieg
A. M. et al; Proc. Natl. Acad. Sci. USA; 1998; 95 (21); 12631–6);
die entsprechende Offenbarung wird unter Bezugnahme aufgenommen.
Diese DNA Sequenz enthält das Motiv TTAGGG in der Regel
in wiederholter Form. Entsprechende Antisensemoleküle als
nukleaseresistente Phosphorthioate sind ebenfalls kommerziell erhältlich
bei der Firma InvivoGen (San Diego, USA). Dieselbe Firma bietet
auch Plasmide an, die gegen TLRs und TLR-bezogene Gene shRNA codiert
oder verschiedene Inhibitoren für Kinasen wie 2-AminoPurine
(Kaufman R. J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA; 1999; 96
(21); 11693–5) der gegen PKR (dsRNA activated
Protein Kinase) gerichtet ist oder LY294002, ein zellpermeabler
Inhibitor der Phosphatidylinositol 3-Kinase, der ebenfalls in die
Signaltransduktionskaskade nach TLR3 involviert ist.
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Auch
ist es möglich, durch Knock-down mit siRNA zumindest ein
Gen auszuschalten, das für ein zur Signaltransduktion notwendiges
Protein codiert.
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Aber
auch Inhibitoren, die das wichtige Adaptermolekül MyD88
und/oder TRIF attackieren, sind bekannt und auch kommerziell erhältlich
und werden erfindungsgemäß in bevorzugter Weise
eingesetzt. So bietet die Firma IMGENEX (San Diego, USA) ein Peptid
an, das die zur Wirkung von MyD88 notwendige Homodimerisierung unterbindet.
Das dafür bevorzugte Peptidmotiv ist RDVLPGT (Loiarro
M. et al.; J. Biol. Chem.; 2005; 16; 15809–14).
Das kommerziell angebotene Peptid enthält weiterhin eine
PTD Sequenz (Protein transduction sequence), welche das gesamte
Peptid zellpermeabel macht (Derossi D. at al. J. Biol. Chem.
1994, 269; 10444–10459). Dieselbe Firma bietet
im Übrigen auch gegen MyD88 gerichtete Antikörper
an, die erfindungsgemäß eingesetzt werden können.
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Weiter
kann die interzelluläre Signalweiterleitung erfindungsgemäß z.
B. durch Antikörper oder Aptamere unterbrochen werden,
die gegen Interferone oder deren Rezeptoren gerichtet sind. Entsprechende
Antikörper sind wiederum kommerziell erhältlich.
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Erfindungsgemäß kann
weiterhin zumindest eine der Kinasen IRF-Kinase TBK1, Phosphatidylinositol 3-Kinase,
IRAK-1, IRAK-4, IKK-alpha oder PKR oder zumindest einer der Transkriptionsfaktoren
IRF1, IRF3, IRF7, IRF9, IRF2, IRF4, IRF5, IRF6, IRF8, STAT1, STAT2,
ISGF3 oder NF-kB blockiert werden.
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Auch
ist es erfindungsgemäß möglich, zumindest
ein Zytokin, zumindest einen Tumornekrosefaktor, zumindest ein Interleukin
und/oder zumindest ein Interferon zu blockieren. Als zu blockierendes
Interferon kommt zum Beispiel ein Interferon des Typs I, insbesondere
ein Interferon–alpha oder Interferon-beta in Betracht.
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Auch
kann zumindest ein Rezeptor für Zytokine oder zumindest
ein Rezeptor für Interferone des Typs I blockiert werden.
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Erfindungsgemäß wird
ferner eine Zusammensetzung bereitgestellt, die zumindest zwei der
folgenden Komponenten umfasst:
- a) ein nicht
virales Genliefersystem,
- b) einen Wirkstoff, und
- c) ein Mittel zur Verringerung der angeborenen Immunabwehr.
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Auch
wird erfindungsgemäß ein Kit of Parts vorgesehen,
der zumindest zwei der folgenden Komponenten umfasst:
- a) ein nicht virales Genliefersystem,
- b) einen Wirkstoff, und
- c) ein Mittel zur Verringerung der angeborenen Immunabwehr.
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Dabei
umfasst das nicht virale Genliefersystem insbesondere ein kationisches
Lipid, ein kationisches Polymer, ein kationisches Protein und/oder
eine Verbindung, die eine DNA und/oder RNA-bindende Domäne aufweist
und rezeptorvermittelte Endozytose auslösen kann.
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Erfindungsgemäß kann
als Wirkstoff, wie z. B. ein Wirkstoff zur Reparatur eines Gendefekts,
z. B. genetisches Material wie modifizierte oder unmodifizierte
ssDNA, modifizierte oder unmodifizierte dsDNA, modifizierte oder
unmodifizierte ssRNA, modifizierte oder unmodifizierte dsRNS und/oder
modifizierte oder unmodifizierte siRNA eingesetzt werden.
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Das
Mittel zur Verringerung der angeborenen Immunabwehr kann einen aktivitätsmindernden
oder aktivitätssteigernden Effektor, oder einen Antikörper,
Intrabody, Aptamer, Antagonist, Inhibitor und/oder eine siRNA umfassen,
wobei der Antikörper, Intrabody, Aptamer, Antagonist, Inhibitor
und/oder die siRNA vorzugsweise zumindest eine Signaltransduktionskaskade
des angeborenen Immunsystems blockiert.
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Gemäß einer
besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst das Mittel
zur Verringerung der angeborenen Immunabwehr die Rasensequenz TTAGGG.
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Auch
kann das Mittel zur Verringerung der angeborenen Immunabwehr genetisches
Material umfassen, das einen Knock-down eines Proteins einer Signaltransduktionskaskade
des angeborenen Immunsystems bewirkt oder das zur Expression eines
Proteins führt, welches die Aktivität eines Proteins
einer Signaltransduktionskaskade des angeborenen Immunsystems blockiert.
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Insbesondere
kann ein Peptid mit dem Strukturmotiv RDVLPGT eingesetzt werden.
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Insbesondere
können die vorstehend genannten Komponenten auch jeweils
einzeln oder zu mehreren eingesetzt werden: So können zwei,
drei oder mehrere verschiedene Komponenten a) und/oder b) und/oder c)
eingesetzt werden.
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Bei
dem erfindungsgemäßen Kit of Parts können:
- – alle Komponenten getrennt voneinander
vorliegen, oder
- – die Komponenten a) und b) gemeinsam, oder
- – die Komponenten a) und c) gemeinsam, oder
- – die Komponenten b) und c) gemeinsam vorliegen.
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So
können die Komponenten entweder getrennt voneinander z.
B. in Glas- oder Plastikbehälter vorliegen, die gemeinsam
verpackt sind, oder die Komponenten können zu zweit oder
zu mehreren in entsprechenden Behältern bereitgestellt
werden.
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Die
erfindungsgemäße Zusammensetzung und/oder der
erfindungsgemäße Kit of Parts können
zur Durchführung eines erfindungsgemäßen
Verfahrens eingesetzt werden.
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Erfindungsgemäß wird
weiter die Verwendung einer erfindungsgemäßen
Zusammensetzung oder eines erfindungsgemäßen Kit
of Parts zur Behandlung von einer durch einen Gendefekt ausgelösten
Krankheit offenbart.
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Bei
der Krankheit kann es sich z. B. um cystische Fibrose, Muskeldystrophie,
Phenylketonurie, Ahornsirupkrankheit, Propionazidämie,
Methylmalonazidämie, Adenosindeaminasemangel, Hypercholesterinämie, Hämophilie, β-Thalassämie,
Krebs, eine Viruserkrankung, eine Degeneration der Macula, Amyotropische
Lateral-Sklerose und/oder eine Entzündungserkrankung handeln.
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Beispiel 1
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Material:
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- 1. Hela-Zellen
- 2. Metafectene Pro, Lot AD 2, Biontex Laborstories GmbH
- 3. 24-Well-Platte, TPP, Produktnummer 92024
- 4. DMEM, PAA, Kat-Nr. E15-883
- 5. FCS Mycoplex, PAA, Kat-Nr. E15-773
- 6. pCMV-lacZ, Lot PF462-060207, Plasmidfactory, c = 1 mg/ml
in WFI
- 7. Sheep Polyclonal Antibody against human IFNβ, FBI
Biomedical Laborstories, Product Number 31400-1, 0,25 mg/ml (estimate),
2 × 104 Units/ml.
- 8. β-Galaktosidase Assay Kit, Stratagene
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Detaillierte Versuchsbeschreibung:
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1. Tag:
-
Es
werden HeLa Zellen in eine 24 Well Platte ausgesät. Dabei
wird eine Zellzahl von 2,3·105 Zellen
in ein Well in 500 μl komplettem Medium (10% FCS) ausplattiert.
Anschließend wird 24 h in einem CO2-Inkubator (10%)
inkubiert.
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2. Tag:
-
Zunächst
wird der Antikörper (Sheep Polyclonal Antibody against
human IFNβ) aufgetaut. Anschließend wird er mit
400 μl PBS (Phosphate Buffered Saline) versetzt und sanft
gemischt. Er hat jetzt eine Konzentration von 0,05 μg/μl.
Anschließend werden die Wells der 24 Well Platte mit folgenden
Mengen Antikörper versorgt:
| | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| A | 0 μg
(0 μl) | 0,25 μg
(5 μl) | 0,5 μg
(10 μl) | 1 μg
(20 μl) | 1,5 μg
(30 μl) | 3 μg
(60 μl) |
| B | 0 μg
(0 μl) | 0,25 μg
(5 μl) | 0,5 μg
(10 μl) | 1 μg
(20 μl) | 1,5 μg
(30 μl) | 3 μg
(60 μl) |
| C | 0 μg
(0 μl) | 0,25 μg
(5 μl) | 0,5 μg
(10 μl) | 1 μg
(20 μl) | 1,5 μg
(30 μl) | 3 μl
(60 μl) |
| D | 0 μg
(0 μl) | 0,25 μg
(5 μl) | 0,5 μg
(10 μl) | 1 μg
(20 μl) | 1,5 μg
(30 μl) | 3 μg
(60 μl) |
-
Anschließend
wird im Inkubator für 0,5 h inkubiert. Derweilen werden
die Lipoplexe hergestellt. Dazu werden 26 μl DNA (pCMV-lacZ)
in 1300 μl PBS einpipettiert und durch sanftes Auf- und
Abpipettieren gemischt. 104 μl Metafectene Pro werden ebenfalls
in 1300 μl PBS einpipettiert und durch sanftes Auf und
Abpipettieren gemischt. Jetzt werden beide Lösungen gemischt
und 15 min inkubiert.
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Am
Ende werden jeweils 100 μl der Lipoplexlösung
in jedes Well gegeben. Anschließend wird 24 h in einem
CO2-Inkubator (10%) inkubiert.
-
3. Tag:
-
Am
dritten Tag wird das Medium der Zeilen C und D erneuert. Die Schritte
Lipoplexherstellung und Transfektion werden für diese Zeilen
wiederholt. Anschließend wird 24 h in einem CO2-Inkubator
(10%) inkubiert.
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4. Tag
-
Reportergenassay:
-
Die
Effizienz der Transfektion wird mit dem β-Galaktosidase
Assay Kit nach Vorgaben des Herstellers durchgeführt. Die
Platten werden so lange entwickelt bis im Mikroplate-Reader eine
Gelbfärbung mit einer Absorption von 1–2 gemessen
wird und anschließend sofort gestoppt. Die Inkubationszeit
wird anschließend notiert. Die Werte werden mit dem Mikroplate-Reader
ausgelesen, βund der Mittelwert gebildet.
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Ergebnis:
-
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Mittelwert von 3 Messungen:
| | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| A | 0,717 | 0,689 | 0,650 | 0,652 | 0,635 | 0,509 |
| B | 0,668 | 0,672 | 0,690 | 0,679 | 0,714 | 0,525 |
| C | 0,858 | 0,823 | 1,228 | 1,690 | 1,852 | 0,975 |
| D | 1,501 | 1,805 | 1,518 | 1,886 | 2,017 | 1,909 |
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Die
Zeilen A und B stellen Duplikate der Ergebnisse für eine
einfache Transfektion dar. Die Zeilen C und D stellen Duplikate
der Ergebnisse für eine repetitive Transfektion dar. Es
wird daher der Mittelwert gebildet:
| | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| A&B/2 | 0,6925 | 0,6805 | 0,6700 | 0,6655 | 0,6745 | 0,5170 |
| C&D/2 | 1,1810 | 1,3140 | 1,3730 | 1,7880 | 1,9345 | 1,4420 |
ABS/9,5
min Ab = Anti INFβ Antibody
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Beispiel 2
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Material:
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- 1. Hela-Zellen
- 2. Metafectene Pro, Lot AD 2, Biontex Laborstories GmbH
- 3. 24-Well-Platte, TPP, Produktnummer 92024
- 4. DMEM, PAA, Kat-Nr. E15-883
- 5. FCS Mycoplex, PAA, Kat-Nr. E15-773
- 6. pCMV-lacZ, Lot PF462-060207, Plasmidfactory, c = 1 mg/ml
in WFI
- 7. β-Galaktosidase Assay Kit, Stratagene
- 8. Mouse monoclonal Antibody against Human Interferone Alpha/Beta
Receptor Chain 2 (CD118), clone MMHAR-2, Isotype Ig2a, C = 0,5 mg/ml
in PBS (Phosphat buffered saline) containing 0,1% bovine serum albumin
(BSA), PBL Biomedical Laborstories, Product-No: 21385
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Detaillierte Versuchsbeschreibung:
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1. Tag:
-
Es
werden HeLa Zellen in eine 24 Well Platte ausgesäht. Dabei
wird eine Zellzahl von 2,3·105 Zellen in
ein Well in 500 μl komplettem Medium (10% FCS) ausplattiert.
Anschließend wird 24 h in einem CO2-Inkubator
(10%) inkubiert.
-
2. Tag:
-
Zunächst
wird der Antikörper (Mouse monoclonal Antibody against
Human Interferone Alpha/Beta Receptor Chain) aufgetaut. Anschließend
wird er mit 400 μl PBS (Phosphate Buffered Saline) versetzt
und sanft gemischt. Er hat jetzt eine Konzentration von 0,1 μg/μl.
Anschließend werden die Wells der 24 Well Platte mit folgenden
Mengen Antikörper versorgt:
| | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| A | 0 μg
(0 μl) | 0,5 μg
(5 μl) | 1 μg
(10 μl) | 2 μg
(20 μl) | 3 μg
(30 μl) | 6 μg
(60 μl) |
| B | 0 μg
(0 μl) | 0,5 μg
(5 μl) | 1 μg
(10 μl) | 2 μg
(20 μl) | 3 μg
(30 μl) | 6 μg
(60 μl) |
| C | 0 μg
(0 μl) | 0,5 μg
(5 μl) | 1 μg
(10 μl) | 2 μg
(20 μl) | 3 μg
(30 μl) | 6 μg
(60 μl) |
| D | 0 μg
(0 μl) | 0,5 μg
(5 μl) | 1 μg
(10 μl) | 2 μg
(20 μl) | 3 μg
(30 μl) | 6 μg
(60 μl) |
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Anschließend
wird im Inkubator für 5 h inkubiert.
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Darauf
folgend werden die Lipoplexe hergestellt. Dazu werden 26 μl
DNA (pCMV-lacZ) in 1300 μl PBS einpipettiert und durch
sanftes Auf- und Abpipettieren gemischt. 104 μl Metafectene
Pro werden ebenfalls in 1300 μl PBS einpipettiert und durch
sanftes Auf und Abpipettieren gemischt. Anschließend werden
beide Lösungen gemischt und 15 min inkubiert. Am Ende werden
jeweils 100 μl der Lipoplexlösung in jedes Well
gegeben. Anschließend wird 24 h in einem CO2-Inkubator
(10%) inkubiert.
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3. Tag:
-
Am
dritten Tag wird das Medium der Zeilen C und D erneuert. Die Schritte
Lipoplexherstellung und Transfektion werden für diese Zeilen
wiederholt.
-
Anschließend
wird 24 h in einem CO2-Inkubator (10%) inkubiert.
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4. Tag
-
Reportergenassay:
-
Die
Effizienz der Transfektion wird mit dem β-Galaktosidase
Assay Kit nach Vorgaben des Herstellers durchgeführt. Die
Platten werden so lange entwickelt bis im Microplate-Reader eine
Gelbfärbung mit einer Absorption von 1–2 gemessen
wird und anschließend sofort gestoppt. Die Inkubationszeit
wird anschließend notiert. Die Werte werden mit dem Mikroplate-Reader
ausgelesen, und der Mittelwert gebildet.
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Ergebnis:
-
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Mittelwert von 3 Messungen:
| | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| A | 1,269 | 1,113 | 1,163 | 1,185 | 1,214 | 1,084 |
| B | 1,132 | 1,102 | 1,088 | 1,229 | 1,113 | 1,154 |
| C | 1,127 | 1,438 | 1,533 | 1,378 | 1,504 | 1,367 |
| D | 1,395 | 1,393 | 1,377 | 1,417 | 1,459 | 1,467 |
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Die
Zeilen A und B stellen Duplikate der Ergebnisse für eine
einfache Transfektion dar. Die Zeilen C und D stellen Duplikate
der Ergebnisse für eine repetitive Transfektion dar. Es
wird daher der Mittelwert gebildet:
| | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| A&B/2 | 1,2005 | 1,1075 | 1,1255 | 1,2070 | 1,1635 | 1,1190 |
| C&D/2 | 1,2610 | 1,4155 | 1,4550 | 1,3975 | 1,4815 | 1,4170 |
ABS/4
min Ab = Anti INF-Rezeptor Type I Antibody
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Beispiel 3
-
Material:
-
- 1. Hela-Zellen
- 2. Metafectene Pro, Lot AD 2, Biontex Laborstories GmbH
- 3. 24-Well-Platte, TPP, Produktnummer 92024
- 4. DMEM, PAA, Kat-Nr. E15-883
- 5. FCS Mycoplex, PAA, Kat-Nr. E15-773
- 6. pCMV-lacZ, Lot PF462-060207, Plasmidfactory, c = 1 mg/ml
in WFI
- 7. β-Galaktosidase Assay Kit, Stratagene
- 8. ODN (Full PTO = Phosphothioatoligo): Seq.: 5'TTT AGG GTT
AGG GTT AGG GTT AGG G-3'; 0,2 μmol synthesis scale, Purification:
HPLC + NAP, lyophilisiert, 213,8 μg; TLR9 Antagonist
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Detaillierte Versuchsbeschreibung:
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1. Tag:
-
Es
werden HeLa Zellen in eine 24 Well Platte ausgesäht. Dabei
wird eine Zellzahl von 2,3·105 Zellen in
ein Well in 500 μl komplettem Medium (10% FCS) ausplattiert.
Anschließend wird 24 h in einem CO2-Inkubator
(10%) inkubiert.
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2. Tag:
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Zunächst
wird der TLR9 Antagonist (ODN). Anschließend wird es in
956 μl sterilem bidest Wasser gelöst. Er hat jetzt
eine Konzentration von 0,25 μg/μl.
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Lipoplexherstellung:
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Lipoplexe
folgender Zusammensetzung werden für die Zellen der jeweiligen
Wells der 24 Well Platte mit den Zellen hergestellt (DNA= pCMV-LacZ;
ODN= TLR9 Antagonist):
| | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| | 0,5 μg
(0,5 μl)
DNA
0,0 μg
(0,0 μl)
ODN
2,0 μl
M.
Pro | 0,5 μg
(0,5 μl)
DNA
0,1
g
(0,4)
ODN
2,4 μl
M. Pr | 0,5 μg
(0,5 μl) DNA 0,2 μg (0,8 μl) ODN 2,8 μl
M. Pro | 0,5 μg
(0,5 μl) DNA 0,3 μg (1,2 μl) ODN 3,2 μl
M. Pro | 0,5 μg
(0,5 μl) DNA 0,4 μg (1,6 μl) ODN 3,6 μl
M. Pro | 0,5 μg
(0,5 μl) DNA 0,5 μg (2,0 μl) ODN 4,0 μl
M. Pro |
| | 0,5 μg
(0,5 μl)
DNA
0,0 μg
(0,0 μl)
ODN
2,0 μl
M.
Pro | 0,5 μg
(0,5 μl)
DNA
0,1 μg
(0,4 μl)
ODN
2,4 μl
M.
Pro | 0,5 μg
(0,5 μl)
DNA
0,2 μg
(0,8 μl)
ODN
2,8 μl
M.
Pro | 0,5 μg
(0,5 μl)
DNA
0,3 μg
(1,2 μl)
ODN
3,2 μl
M.
Pro | 0,5 μg
(0,5 μl)
DNA
0,4 μg
(1,6 μl)
ODN
3,6 μl
M.
Pro | 0,5 μg
(0,5 μl)
DNA
0,5 μg
(2,0 μl)
ODN
4,0 μl
M.
Pro |
| | 0,5 μg
(0,5 μl)
DNA
0,0 μg
(0,0 μl)
ODN
2,0 μl
M.
Pro | 0,5 μg
(0,5 μl)
DNA
0,1 μg
(0,4 μl)
ODN
2,4 μl
M.
Pro | 0,5 μg
(0,5 μl)
DNA
0,2 μg
(0,8 μl)
ODN
2,8 μl
M.
Pro | 0,5 μg
(0,5 μl)
DNA
0,3 μg
(1,2 μl)
ODN
3,2 μl
M.
Pro | 0,5 μg
(0,5 μl)
DNA
0,4 μg
(1,6 μl)
ODN
3,6 μl
M.
Pro | 0,5 μg
(0,5 μl)
DNA
0,5 μg
(2,0 μl)
ODN
4,0 μl
M.
Pro |
| | 0,5 μg
(0,5 μl)
DNA
0,0 μg
(0,0 μl)
ODN
2,0 μl
M.
Pro | 0,5 μg
(0,5 μl)
DNA
0,1 μg
(0,4 μl)
ODN
2,4 μl
M.
Pro | 0,5 μg
(0,5 μl)
DNA
0,2 μg
(0,8 μl)
ODN
2,8 μl
M.
Pro | 0,5 μg
(0,5 μl)
DNA
0,3 μg
(1,2 μl)
ODN
3,2 μl
M.
Pro | 0,5 μg
(0,5 μl)
DNA
0,4 μg
(1,6 μl)
ODN
3,6 μl
M.
Pro | 0,5 μg
(0,5 μl)
DNA
0,5 μg
2,0 μl)
ODN
4,0 μl
M.
Pro |
-
Die
DNA für jedes Well wird in 100 μl PBS gelöst
und die entsprechende Menge ODN zupipettiert und gemischt. Anschließend
werden die entsprechenden Mengen Metafectene Pro zupipettiert und
nochmals gemischt. Danach wird für 15 min inkubiert und
die Lipoplexe auf die Zellen in den korrespondierenden Wells gegeben.
Anschließend wird 24 h in einem CO2-Inkubator
(10%) inkubiert.
-
3. Tag:
-
Am
dritten Tag wird das Medium der Zeilen C und D erneuert. Die Schritte
Lipoplexherstellung und Transfektion werden für diese Zeilen
wiederholt. Des Weiteren werden bei den Zeilen A und B je 500 μl
Medium in die Wells hinzugegeben.
-
Anschließend
wird 24 h in einem CO2-Inkubator (10%) inkubiert.
-
4. Tag
-
Reportergenassay:
-
Die
Effizienz der Transfektion wird mit dem β-Galaktosidase
Assay Kit nach Vorgaben des Herstellers durchgeführt. Die
Platten werden so lange entwickelt bis im Microplate-Reader eine
Gelbfärbung mit einer Absorption von 1–2 gemessen
wird und anschließend sofort gestoppt. Die Inkubationszeit
wird anschließend notiert. Die Werte werden mit dem Mikroplate-Reader
ausgelesen, und der Mittelwert gebildet.
-
Ergebnis:
-
-
Mittelwert von 3 Messungen:
| | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| A | 0,431 | 0,400 | 0,448 | 0,404 | 0,419 | 0,566 |
| B | 0,415 | 0,453 | 0,419 | 0,435 | 0,696 | 0,543 |
| C | 0,573 | 0,966 | 0,748 | 1,054 | 0,820 | 1,234 |
| D | 0,778 | 0,898 | 1,312 | 1,302 | 1,195 | 1,352 |
-
Die
Zeilen A und B stellen Duplikate der Ergebnisse für eine
einfache Transfektion dar. Die Zeilen C und D stellen Duplikate
der Ergebnisse für eine repetitive Transfektion dar. Es
wird daher der Mittelwert gebildet:
| | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| A&B/2 | 0,4230 | 0,4265 | 0,4335 | 0,4195 | 0,5570 | 0,5545 |
| C&D/2 | 0,6575 | 0,9320 | 1,0300 | 1,1780 | 1,0075 | 1,2930 |
ABS/80
min ODN = TLR9 Antagonist
-
Beispiel 4
-
Der
TLR7, 8 und 9 detektieren fremde RNA oder DNA in den Endosomen.
Auf deren cytosolischer Seite bindet das Adaptermolekül
MyD88. Dieses Protein besteht aus zwei Proteinketten, die durch
Homodimerierung das biologisch aktive Adaptormolekül bilden.
Peptide mit dem Sequenzmotiv RDVLPGT verhindern diese Homodimerisierung,
indem sie selbst an die Monomeren binden. Diese Peptide sind allerdings
in der Regel nicht zellgängig. Sie können aber
mit einer „Protein transduction sequence" (PTO) versehen
werden. Eine solche Sequenz ist z. B. DRQIKIWFQNRRMKWKK. Das komplette
Peptid ist damit in der Lage in Zellen einzudringen und die Signaltransduktion
der TLRs zu unterbindet. Ein solches komplettes Peptid wird von
der Firma Imgenex kommerziell angeboten.
-
Material:
-
- 9. Hela-Zellen
- 10. Metafectene Pro, Lot AD 2, Biontex Laborstories GmbH
- 11. 24-Well-Platte, TPP, Produktnummer 92024
- 12. DMEM, PAA, Kat-Nr. E15-883
- 13. FCS Mycoplex, PAA, Kat-Nr. E15-773
- 14. pCMV-lacZ, Lot FF462-060207, Plasmidfactory, c = 1 mg/ml
in WFI
- 15. β-Galaktosidase Assay Kit, Stratagene
- 16. Imgenex, MyD88 homodimerisation Inhibitory Peptide Set,
Product Nr. IMG, 2005-1, 2 mg, lyophilisiert, MW 3100, Sequence:
DRQIKIWFQNRRMKWKK RDVLPGT
-
Detaillierte Versuchsbeschreibung:
-
1. Tag:
-
Es
werden HeLa Zellen in eine 24 Well Platte ausgesäht. Dabei
wird eine Zellzahl von 1,5·105 Zellen in
ein Well in 200 μl komplettem Medium (10% FCS) ausplattiert.
Anschließend wird 24 h in einem CO2-Inkubator
(10%) inkubiert.
-
Vorbereiten des Inhibitors:
-
Von
dem MyD88-Homodimerisation-Inhibitor Peptid wird, den Angaben des
Herstellers folgend, eine 5 mM Lösung in PBS hergestellt.
-
Anschließend
werden die Wells mit folgenden Mengen Inhibitor versorgt, um die
entsprechenden Konzentrationen einzustellen:
| | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| A | 0 μl
(0 μM) | 2 μl
(50 μM) | 4 μl
(100 μM) | 8 μl
(200 μM) | 12 μl
(300 μM) | 16 μl
(400 μM) |
-
Anschließend
wird für 24 h im CO2-Inkubator
(10%) inkubiert.
-
2. Tag:
-
Zuerst
werden 3 μl komplettes Medium zu jedem Well gegeben.
-
Darauf
folgend werden die Lipoplexe hergestellt. Dazu werden 13 μl
DNA (pCMV-lacZ) in 650 μl PBS einpipettiert und durch sanftes
Auf- und Abpipettieren gemischt. 52 μl Metafectene Pro
werden ebenfalls in 650 μl PBS einpipettiert und durch
sanftes Auf und Abpipettieren gemischt. Anschließend werden
beide Lösungen gemischt und 15 min inkubiert. Am Ende werden
jeweils 100 μl der Lipoplexlösung in jedes Well
gegeben. Anschließend wird 24 h in einem CO2-Inkubator
(10%) inkubiert.
-
4. Tag
-
Reportergenassay:
-
Die
Effizienz der Transfektion wird mit dem β-Galaktosidase
Assay Kit nach Vorgaben des Herstellers durchgeführt. Die
Platten werden so lange entwickelt bis im Microplate-Reader eine
Gelbfärbung mit einer Absorption von 1–2 gemessen
wird und anschließend sofort gestoppt. Die Inkubationszeit
wird anschließend notiert. Die Werte werden mit dem Mikroplate-Reader
ausgelesen und der Mittelwert gebildet.
- Ergebnis: Inkubationszeit:
4 min
-
Mittelwert aller 3 Messungen:
| | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| A | 0,850 | 1,120 | 1,268 | 1,555 | 1,518 | 1,442 |
ABS/4
min; MHI = MyD88 Homodimerisation Inhibitor
-
Wie
bereits ausgeführt, kann die Erfindung zu Therapiezwecken
eingesetzt werden. Insbesondere kann die Erfindung für
die Gentherapie von zum Beispiel Cystischer Fibrose, Muskeldystrophie,
Phenylketonurie, Ahornsirupkrankheit, Propionazidämie,
Methylmalonazidämie, Adenosindeaminasemangel und Hypercholesterinämie,
Hämophilie, β-Thalassämie genutzt werden.
Gentherapeutische Behandlungsmethoden sind weiters interessant,
wenn Hormone, Wachstumsfaktoren, Cytotoxine oder immunomodulierend
wirkende Proteine im Organismus synthetisiert werden sollen. Für
die oben genannten Zwecke können DNA-Fragmente mittels
der Erfindung hocheffektiv in Zellen gebracht werden, in denen diese
DNA die gewünschte Wirkung entfalten soll. Die gewünschte
Wirkung kann der Ersatz fehlender oder defekter DNA-Bereiche oder
die Inhibition von DNA-Bereichen (zum Beispiel durch Antisense-DNA/RNA
oder siRNA), die die Erkrankung auslösen, im erkrankten
Zelltyp sein. Auf diese Weise können z. B. tumorunterdrückende
Gene in der Krebs-Therapie eingesetzt werden oder durch die Einführung
cholesterolregulierender Gene ein Beitrag zur Vorbeugung von Herz-
und Blutgefäßkrankheiten geleistet werden. Weiters
kann DNA, welche Ribozyme, siRNA oder shRNA kodiert, oder Ribozyme
oder siRNA selbst in erkrankte Zellen eingeschleust werden. Die
Translation jener DNA erzeugt aktive Ribozyme oder siRNA, die an
spezifischen Stellen m-RNA katalytisch spalten und auf diese Weise
die Transkription verhindern. Auf diese Weise kann zum Beispiel
virale m-RNA gespalten werden, ohne eine andere zelluläre
m-RNA in Mitleidenschaft zu ziehen. Der Vermehrungszyklus von Viren
(HIV, Herpes, Hepatitis B und C, respiratorisches Syncytial Virus)
kann auf diesem Wege unterbrochen werden. Weitere Erkrankungen,
die speziell über die Behandlung mit siRNA geheilt werden
sollen sind die altersbedingte Degeneration der Macula (Augenerkrankung),
Leberkrebs, solide Tumoren, Amyotropische Lateral-Sklerose und Entzündungserkrankungen
sind derzeit im Focus klinischer Studien.
-
Auch
in der Krebstherapie spielt Transfektion zur Herstellung von Krebsvakzinen
eine immer größer werdende Rolle. Damit ist jene
auch mögliches Anwendungsgebiet für die Erfindung.
-
Eine
weitere Anwendung kann die Erfindung zum Beispiel in Impfverfahren
finden, die auf der Basis der Expression von DNA, welche immunogene
Peptide kodiert, im Körper von Mensch und Tier funktionieren. Dazu
werden z. B. Lipid/DNA-Komplexe als Impfstoffe benutzt. Die Einschleusung
der DNA in die Körperzellen führt zur Expression
des immunogenen Peptids und löst somit die adaptive Immunantwort
aus.
-
Im
folgenden werden erfindungsgemäß beispielhafte,
aber keinesfalls beschränkende Definitionen aufgeführt:
-
Transfektion:
-
Einschleusen
von genetischem Material in eukariotische Zellen.
-
Transfektionseffizienz
-
Menge
einer Proteinexpression einer Zellpopulation in Folge von Transfektionsprozessen
mit genetischem Material, welches unter anderem dieses exprimierte
Protein codiert oder Ausmaß eines Knock-downs einer Proteinexpression
einer Zellpopulation in Folge von Transfektionsprozessen mit genetischem
Material, welches einen solchen Knock-Down auslösen kann,
insbesondere siRNA oder Ribozyme oder DNA, die für shRNA
oder Ribozyme codiert oder Anteil der Zellen einer Gesamtpopulation
von Zellen, die die biologische Wirksamkeit des eingeschleusten
genetischen Materials in Folge von Transfektionsprozessen zeigt.
-
Nicht virales Genliefersystem:
-
Nicht
virale Genliefersysteme werden nicht durch Rekombination genetischen
Materials von natürlich vorkommenden Viren erzeugt. Sie
sind in der Lage genetisches Material in eukariotische Zellen einzuschleusen.
Insbesondere handelt es sich bei den nicht viralen Genliefersystemen
um physikalische Methoden und chemische Methoden. Physikalische
Methoden lokalisieren mindestens das genetische Material in der
Nähe der Zelle, insbesondere nutzen physikalische Verfahren
jedoch Energiezufuhr insbesondere in Form von thermischer, kinetischer,
elektrischer oder sonstiger Energie um einen Transport des genetischen
Materials durch die Zellmembran zu vermitteln. Chemische Methoden
beruhen entweder auf einer chemischen Veränderung oder
Derivatisierung der Nukleinsäuren, die sie insbesondere
zellgängig machen oder bestehen insbesondere aus Stoffen,
die DNA binden und einen Transport durch die Zellmembran vermitteln
können. Insbesondere nutzen diese zur Bindung der Nukleinsäuren
elektrostatische Kräfte oder Wasserstoffbrückenbindungen.
Wiederum insbesondere geschieht der Transport der DNA durch die
Zellmembran durch einen aktiven Transportmechanismus der Zelle,
der Endozytose. Stoffe, die diese Eigenschaften aufweisen enthalten
insbesondere kationische Lipide, kationische Polymere, kationische
Peptide oder auch Moleküle die eine Domäne haben,
die DNA oder RNA binden kann und zugleich eine zweite Domäne
haben, die eine Liganden enthält, der von einem Rezeptor
auch der Zelloberfläche erkannt wird und durch diesen Erkennungsprozess
Endozytose auslöst. Die Stoffe können auch besonders
formuliert sein, insbesondere als Micellen oder Liposomen und auch
aus mehreren Komponenten insbesondere mit unterschiedlicher Funktion
bestehen.
-
Gentherapie
-
Therapie
zur Heilung oder Linderung von Krankheiten bei der als Wirkstoff
modifizierte oder unmodifizierte Nukleinsäuren eingesetzt
werden.
-
Angeborene Immunabwehr
-
Die
angeborene Immunabwehr grenzt sich von der erworbenen oder adaptiven
Immunabwehr dahingehen ab, dass sie einen Erreger abwehrt, ohne
dass es vorher jemals zu einem Kontakt mit dem Erreger gekommen
sein muss. Die angeborene Immunabwehr ist den meisten Zelltypen
zu eigen und nutzt die Erkennung von Pathogenen zuzuordnenden molekularen
Strukturen durch Rezeptoren. Diese Rezeptoren stoßen insbesondere
Signaltransduktionskaskaden an, die insbesondere durch Expression
vieler zelleigener Gene in einem „antiviralen Status" der
Zellen münden. Weiters ist das Auslösen eines „Antiviralen
Status" in anderen, insbesondere benachbarten Zellen durch Botenstoffe
(insbesondere Zytokine), die wiederum an Rezeptoren der anderen
Zellen andocken und wiederum eine Signaltransduktionskaskade auslösen,
Bestandteil der angeborenen Immunabwehr.
-
Antiviraler Status
-
Status
von Zellen, der sich dadurch auszeichnet, dass die Zelle versucht
die mögliche biologische Wirksamkeit von fremden genetischem
Material durch Gegenmaßnahmen zu unterbinden.
-
Transfektion in vivo
-
Das
Einschleusen von genetischem Material in eukariotische Zellen findet
in einem lebenden Organismus statt.
-
Transfektion in vitro
-
Das
Einschleusen von genetischem Material in eukariotische Zellen findet
außerhalb eines lebenden Organismus statt, insbesondere
in Gefäßen, die sich zur Kultivierung von eukariotischen
Zellen eignen.
-
Genetisches Material
-
Nukleinsäuren,
insbesondere Ribonukleinsäuren oder Desoxyribonukleinsäuren,
die insbesondere aus zwei wenigstens teilweise komplementären
Strängen (doppelsträngig = ds) bestehen z. B.
dsDNA und dsRNA, oder die insbesondere aus einem Strang (einzelsträngig
= ss) besteht, z. B. ssDNA und ssRNA, der teilweise komplentäre
Bereiche aufweisen kann, die über Wasserstoffbrückenbindung
miteinander verbunden sein können.
-
Modifiziertes genetisches Material
-
Natürliche
Nukleinsäuren die durch Modifikation in ihren Eigenschaften
verändert wurden. Dabei können diese Modifikationen
insbesondere chemische Veränderungen sein, die insbesondere
das Phaphatgerüst, die Zucker oder Basen betreffen, was
insbesondere die Stabilität der Nukleinsäuren
gegen Nukleasen und Ribonukleasen erhöhen soll. Weiters
können Moleküle (Labels) an die Nukleinsäuren
kovalent oder nicht-kovalent angeheftet werden, die zu neuen Eigenschaften
der Nukleinsäuren führen, insbesondere zu optischer
Verfolgbarkeit durch Fluoreszenzlabels oder Labels, die die Nukleinsäuren
zu einen bestimmen Ort in der Zelle dirigieren (Lokalisationselemente)
oder Labels, die den Durchtritt von Nukleinsäuren durch
Membranen vermitteln und so Nukleinsäuren beispielsweise
zellgängig machen.
-
siRNA (short interfering RNA):
-
Kurze
dsRNA (bis 28 bp) die durch RNA-Interferenz den Knock-Down eines
Proteins bewirken kann.
-
shRNA (short hairpin RNA):
-
Kurze
ssRNA, die am 3'-Ende und am 5'-Ende komplementäre Bereiche
besitzt und dadurch über Wasserstoffbrückenbindung
hybridisieren kann und eine Haarnadelstruktur ausbilden kann. shRNA
kann durch RNA-Interferenz den Knock-Down eines Proteins bewirken.
-
Rezeptor:
-
Molekül,
das in der Lage ist einen Stoff zu detektieren und damit eine biologische
Reaktion auslöst, Insbesondere handelt es sich bei Rezeptoren
um Proteine.
-
Blockierung:
-
Verhinderung
der biologischen Funktion, insbesondere von Proteinen.
-
DNA/RNA-bindende Domäne:
-
Bereich
in einem Molekül das DNA kovalent oder über nicht
kovalente Wechselwirkungen gebunden trägt, insbesondere
sind die nicht kovalenten Wechselwirkungen elektrostatische Kräfte
und Wasserstoffbrückenbindungen.
-
Signaltransduktionskaskade
-
Ausgehend
von einem Rezeptor, der die Anwesenheit eines Stoffes durch Anlagerung
dieses Stoffes an den Rezeptor detektiert, wird die Information über
die Anwesenheit dieses Stoffes in ein Signal umgewandelt und über
eine Kette von Molekülen durch Signaltransduktion weitergetragen.
Am Ende steht eine biologische Reaktion. Insbesondere wird das durch
den Rezeptor erzeugte Signal von Adaptermolekülen aufgenommen
und insbesondere über Kinasen insbesondere an Transkriptionsfaktoren
weitergetragen. Die Transkriptionsfaktoren stimulieren die Expression
von Genen, die die biologische Reaktion vermitteln.
-
Knock-down
-
Abschwächung
oder Ausschaltung der Expression eines Gens.
-
Antikörper
-
Moleküle,
insbesondere Proteine, die in der Lage sind molekulare Strukturen,
insbesondere andere Proteine, zu erkennen und durch Bindung dessen
biologische Wirkung beeinflussen.
-
Intrabodies
-
Intrazellular
exprimierte Antikörper.
-
Aptamere
-
RNA-Moleküle,
die durch Ausbildung einer Tertiärstruktur in der Lage
sind molekulare Strukturen, insbesondere Proteine, ähnlich
einem Antikörper zu erkennen und durch Bindung dessen biologische
Wirkung beeinflussen. Aptamere können aus modifizierter
oder unmodifizierter RNA bestehen.
-
Antagonist
-
Substanz,
die einen Agonisten durch Blockierung eines entsprechenden Rezeptors
in seiner Wirkung hemmt, ohne selbst einen Effekt auszulösen.
Ein Agonist ist im Gegenzug in der Lage durch Bindung an einen Rezeptor
eine biologische Wirkung zu erzielen.
-
Inhibitoren
-
Moleküle,
die die biologische Wirkung eines anderen Moleküls, insbesondere
von Proteinen inhibieren können. Insbesondere sind die
Inhibitoren selbst Proteine, modifizierte oder unmodifizierte Nukleinsäuren
oder kleine organische Moleküle.
-
TLRs, RIG-I-Helikase, RIG-I-like Helikase
-
Rezeptoren
die speziesübergreifend in Gruppen nach ihrer Funktion
zusammengefasst werden.
-
Adaptermoleküle
-
Moleküle
die ein Signal von Rezeptoren übernehmen und die speziesübergreifend
in Gruppen nach ihrer Funktion zusammengefasst werden.
-
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
-
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