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Die
Erfindung betrifft eine optische Anordnung zur Photomanipulation
einer Probe, umfassend eine Probenhalterung zur Aufnahme der Probe,
eine Beleuchtungseinrichtung, umfassend eine Beleuchtungslichtquelle
und einen Beleuchtungsstrahlengang zur Beleuchtung der Probe mit
einem Lichtblatt, eine Detektierungseinrichtung zur Detektierung
von Licht, das von der Probe abgestrahlt wird, eine Abbildungsoptik,
die die Probe über ein Abbildungsobjektiv in einem Abbildungsstrahlengang
mindestens teilweise auf die Detektierungseinrichtung abbildet,
wobei das Lichtblatt im Fokus des Abbildungsobjektivs im wesentlichen
eben ist und wobei das Abbildungsobjektiv eine optische Achse aufweist,
die die Ebene des Lichtblatts in einen von Null verschiedenen Winkel,
bevorzugt senkrecht, schneidet, eine Steuereinheit, sowie Mittel
zur Photomanipulation der Probe.
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Die
erfindungsgemäße optische Anordnung ist bezüglich
der Beobachtung der Probe insbesondere im Zusammenhang mit der Single-Plane-Illumination-Mikroskopie
(SPIM), auch als Selective-Plane-Illumination-Mikroskopie bezeichnet,
anwendbar. Während mit der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie
die Probe in mehreren unterschiedlich tiefen Ebenen Punkt für
Punkt abgetastet wird und daraus dreidimensionale Bildinformationen
der Probe gewonnen werden, so beruht die SPIM-Technologie auf der
Weitfeldmikroskopie und ermöglicht die dreidimensionale
bildliche Darstellung von Proben auf der Grundlage von optischen
Schnitten durch verschiedene Ebenen der Probe.
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Dabei
bestehen die Vorteile der SPIM-Technologie u. a. in der größeren
Geschwindigkeit, mit der die Bilderfassung er folgt, einem geringeren
Ausbleichen von biologischen Proben, sowie einer erweiterten Eindringtiefe
des Fokus in die Probe.
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Prinzipiell
werden bei der SPIM-Technologie Fluorophore, die in der Probe enthalten
oder in die Probe eingebracht sind, mit Laserlicht angeregt, das zu
einem sogenannten Lichtblatt geformt ist, bzw. auf eine Weise über
die Probe geführt wird, daß sich effektiv, d.
h. über den Zeitraum der Beobachtung die Form eines Lichtblattes
ergibt. Dabei wird mit jeweils einem Lichtblatt eine Ebene in der
Tiefe der Probe beleuchtet, mittels dieser Beleuchtung wird ein
Bild der Probe in dieser Ebene gewonnen. Wesentlich ist, daß Elemente
in der Lichtblattebene auf die Detektorebene abgebildet werden,
bzw. daß Lichtblatt- und Detektorebene zueinander konjugiert
sind. In herkömmlichen Mikroskopaufbauten, in denen die
Detektorebene senkrecht zur optischen Achse des Detektierungsstrahlengangs
steht, steht die Richtung, in der Licht detektiert wird, senkrecht
oder zumindest nahezu senkrecht auf der Ebene, in der beleuchtet wird.
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Die
SPIM-Technologie ist beispielsweise beschrieben in Stelzer et al.,
Optics Letter 31,1477 (2006), in Stelzer et al., Science 305, 1007
(2004), in der
DE
10257423A1 und in der
WO 2004/0530558A1 .
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Neben
der Beobachtung von Proben kommt auch der Manipulation biologischer,
lebender oder nicht lebender Materie sowie anorganischer Materie in
der Mikroskopie ein großer Stellenwert zu. Manche Proben
können beispielsweise photoaktiviert, photodeaktiviert
oder erwärmt werden. Die Manipulation umfaßt auch
die Bearbeitung von Proben, d. h. bei spielsweise die Polymerisation
von Proben oder beispielsweise das Trennen von Probenbereichen vom Rest
der Probe mittels Laser-Skalpellen. Manipulationsmethoden, die auf
der Wechselwirkung der zu manipulierenden Probe mit Licht beruhen,
wie beispielsweise Laser-Ablation, Bleichen, Photoaktivierung, sind
besonderes dann geeignet, wenn mechanischer Kontakt mit der Probe
vermieden werden soll. Bei entsprechend ausgestalteten Optiken können Bereiche
sehr präzise mit mikroskopischer Auflösung manipuliert
werden.
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Für
Proben, die im wesentlichen eine flache Form haben, wie beispielsweise
adhärente Zellen oder Grenzflächen, kann die Manipulation
auch mit Optiken, die axial keine hohe Auflösung bieten,
sehr präzise ausgeführt werden.
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Für
räumlich ausgedehnte, dreidimensionale Proben ist eine
räumlich präzise Manipulation jedoch sehr schwierig
und nur über technisch aufwendige Aufbauten zu lösen,
die häufig auch auf nichtlinearen Wechselwirkungen des
Manipulationslichtstrahls mit der Probe basieren.
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Die
Standardtechniken der Photomanipulation – um eine einige
Beispiele zu nennen: fluorescence loss in photobleaching (FLIP),
Photoaktivierung (PA GFP) reversible Photoaktivierung (Dronpa), Photokonversion
(Kaede), fluorescence localisation after photobleaching (FLAP),
Mikrodissektion, Uncaging – sind teilweise schon seit Jahrzehnten
in der Mikroskopie bekannt und dort etabliert. Meist wird ein Laserstrahl
mit entsprechender Leistung und Wellenlänge über
ein Beobachtungsobjektiv fokussiert und auf die Probe gelenkt. Der
Laserstrahl kann mit entsprechender Leistungsmodulierung auch zur
Anregung für Anwendungen in der Fluoreszenzmikroskopie
eingesetzt werden. Auch in der Augenheilkunde werden Manipulationstechniken
eingesetzt, beispielsweise die LASEC-Technik.
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Vorrichtungen,
die in dreidimensionalen Proben eine gezielte Manipulation durchführen
können und zugleich eine räumliche Bilddarstellung
der Probe erlauben, stehen jedoch nur eingeschränkt zur Verfügung.
Meist werden hierfür konfokale Laser-Scanning-Mikroskope
verwendet. Die Manipulation ist allerdings anregungsseitig nicht
konfokal, auch wenn dies für die Abbildung zutrifft. Somit
wird ein deutlich größerer Probenbereich ausgeleuchtet,
als eigentlich notwendig. Abhilfe bieten hier nur Scanning-Mikroskope,
die nichtlineare Wechselwirkungen auszunutzen, wie beispielsweise
die Zwei-Photonen-Anregung. Bei solchen Mikroskopen wird auch anregungsseitig
ein konfokaler Manipulationsbereich ausgebildet, der in der Probe
mit einiger Genauigkeit positioniert werden kann. Solche Lösungen
sind jedoch technisch sehr aufwendig, sie erfordern beispielsweise
den Einsatz von Kurzpulslasern und sind bezüglich der Wellenlängenauswahl
limitiert.
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Die
Manipulation von Proben mit Hilfe von Mikroskopen ist beispielsweise
in der
DE 102 33 549 beschrieben.
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Aufgabe
der Erfindung ist es daher, eine Anordnung zu entwickeln, mit der
auf einfache Weise die Manipulation in beschränkten Probenbereichen im
wesentlichen in der Fokusebene des Mikroskops durchgeführt
werden kann. Insbesondere sollte eine konfokale Probenmanipulation
auch ohne Verwendung von Mehrphotoneneffekten möglich sein.
Vorteilhaft sollte die Anordnung auch in der Lage sein, eine räumliche,
isotrope Abbildung der Probe vor, nach oder während der
Manipulation zu ermöglichen.
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Diese
Aufgabe wird bei einer optischen Anordnung der eingangs beschriebenen
Art dadurch gelöst, daß die Mittel zur Photomanipulation
eine erste Manipulationsoptik umfassen, mittels der Licht einer
ersten Manipulationslichtquelle in den Beleuchtungsstrahlengang
zur Formung eines im wesentlichen ebenen Manipulationslichtblattes
eingekoppelt wird.
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Zur
Photomanipulation wird die Probe also nicht in der üblichen
Weise mit zur SPIM-Untersuchung geeignetem Licht, welches zu einem
Lichtblatt geformt ist, beleuchtet, sondern mit Licht einer speziellen
Manipulationslichtquelle. Das Licht dieser Manipulationslichtquelle
wird jedoch in den gleichen Beleuchtungsstrahlengang eingekoppelt
und somit zu einem Lichtblatt geformt, wie es auch zur Beobachtung
im SPIM-Verfahren verwendet wird. Dabei kann das Licht auch durch
das Führen von Laserlicht über die Probe effektiv,
d. h. über den Zeitraum der Manipulation, zu einem Lichtblatt
geformt werden. Die Einkopplung des Lichts wird durch eine Steuereinheit gesteuert,
die entsprechende Einkoppelelemente, wie Blenden, halbdurchlässige
Spiegel, räumliche Lichtmodulatoren, beispielsweise galvanometrische Spiegel
steuern. Bei der Manipulationslichtquelle kann es sich um einen
Laser handeln, der Licht einer anderen Wellenlänge oder
eines anderen Wellenlängenbereichs aussendet, als die eigentliche
Beleuchtungslichtquelle. Je nach Art des Experiments kann aber auch
die Beleuchtungslichtquelle selbst als Manipulationslichtquelle
verwendet werden, in diesem Fall kann auf die Manipulationsoptik
und die Einkoppelelemente verzichtet werden. Auch die Zusammenfassung
mehrerer Laser in einem Lichtquellenmodul ist denkbar, wobei dann
je nach gewähltem Verfahren Beleuchtung oder Mani pulation,
eine oder mehre der Lichtquellen ausgewählt und in den
Beleuchtungsstrahlengang eingekoppelt werden.
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Neben
der Verwendung von ausgewählten Manipulationslichtquellen
kann die erste Manipulationsoptik darüber hinaus auch Mittel
zur Strukturierung des Lichtblatts umfassen. Das Lichtblatt selbst hat
eine im wesentlichen senkrecht zur optischen Achse des Mikroskopobjektivs
in den Koordinaten X und Y ausgedehnte, an das zu untersuchende
Probenfeld angepaßte Länge und Breite und eine
sich in Richtung der optischen Achse des Abbildungsobjektivs erstreckende
Dicke, die im Bereich von wenigen Mikrometern liegt. Dieses Lichtblatt
läßt sich räumlich beispielsweise mit
Hilfe einer Schlitzblende strukturieren, wobei die Schlitzblende
einen oder mehrere Schlitze zur räumlichen Strukturierung
umfaßt. Diese Schlitzblende wird in einer zur Objektebene
des Detektierungsobjektivs konjugierten Ebene im Beleuchtungsstrahlengang
eingebracht, das Lichtblatt ist dann in der Bildebene gitterförmig
durchmoduliert. Befindet sich beispielsweise eine fluoreszierende Probe
im Bereich des Lichtblattes, so ist die Fluoreszenz entsprechend über
das Bildfeld durchmoduliert. Anstelle einer Schlitzblende kann auch
ein Gitter verwendet werden.
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Die
Mittel zur Strukturierung des Lichtblattes umfassen bevorzugt auch
Mittel zur zeitlichen Modulation desselben. Beispielsweise kann
die Beleuchtungsintensität zeitlich moduliert werden. Auch
kann die Polarisation des Lichts beeinflußt werden.
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Wird
das Lichtblatt effektiv durch die Führung von Laserlicht über
die Probe während des Beobachtungszeitraums geformt, so
lassen sich in ähnlicher Weise Mittel zur zeitli chen Modulation
des Beleuchtungslichts auch dazu einsetzen, eine räumliche Strukturierung
zu erzielen.
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In
einer anderen Ausgestaltung der Erfindung weisen die Mittel zur
Strukturierung alternativ oder in Ergänzung auch Mittel
zur Erzeugung mehrerer, einander überlagerter Lichtblätter
auf.
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Die
Strukturierung der Lichtblätter durch Gitter, Blenden oder ähnliches
ermöglicht es beispielsweise, beschränkt auf die
hellen Bereiche Fotobleichprozesse auszulösen, und anschließend FRAP-Prozesse
zu beobachten, da in den dunklen Bereichen keine Bleichprozesse
ausgelöst wurden.
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Der
Vorteil bei der Verwendung der oben beschriebenen Anordnung liegt
darin, daß Manipulationen auf die Fokusebene beschränkt
bleiben, außerhalb der Fokusebene wird die Probe nicht
beeinträchtigt. Ein weiterer Vorteil der beschriebenen
Anordnung besteht darin, daß die Mittel zur Photomanipulation
einfach in schon bestehende Aufbauten für SPIM-Analysen
integriert werden können, beispielsweise in einem modularen
Aufbau.
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In
der Fokusebene jedoch wird die Probe über die Ausdehnung
eines ganzen Streifens oder einer Linie manipuliert, die Beschränkung
auf ein kleineres Gebiet ist nicht möglich. Das zu manipulierende
oder manipulierte Gebiet in der Probe läßt sich
allerdings weiter einschränken, wenn die Mittel zur Photomanipulation
eine zweite Manipulationsoptik umfassen, mittels der Licht einer
zweiten Manipulationslichtquelle in den Abbildungsstrahlengang eingekoppelt
und über das Abbildungsobjektiv auf die Probe gelenkt wird.
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In
dieser Ausgestaltung der Erfindung wird die Probe also nicht nur
mit dem Manipulationslichtblatt, sondern zusätzlich über
das Abbildungsobjektiv aus einer Richtung im wesentlichen senkrecht
zur Ebene des Lichtblatts beleuchtet.
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Neben
der ersten Manipulationslichtquelle kann auch die zweite Manipulationslichtquelle
als Laserlichtquelle ausgestaltet sein, die mindestens einen Laser
umfaßt. Auch hier lassen sich selbstverständlich
wieder mehrere Laser in einem Modul vereinen, so daß wahlweise
zwischen einem oder mehreren Lasern ausgewählt werden kann.
Erste und zweite Manipulationslichtquelle strahlen dabei bevorzugt
Licht unterschiedlicher Wellenlängen oder Wellenlängenbereiche
aus, sie können aber auch beide Licht der gleichen Wellenlänge
bzw. des gleichen Wellenlängenbereichs, je nach geforderter
Applikation ausstrahlen.
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Insbesondere
kann die zweite Manipulationsoptik als Laser-Scanning-Mikroskop
ausgestaltet sein. Auch solche Mikroskopeinheiten gibt es modular,
beispielsweise das LSM-DUO-Scan der Firma Carl Zeiss. Darüber
hinaus ist es möglich, mit einer einzigen Manipulationslichtquelle
beide Manipulationsoptiken zu speisen, indem der Strahl der Lichtquelle
entsprechend aufgeteilt wird. Erste und zweite Manipulationslichtquelle
sind in diesem Fall identisch. Im günstigsten Fall kann
daher die Beleuchtungsquelle sowohl zur Beleuchtung als auch zur
Manipulation über einen der beiden oder beide Manipulationsstrahlengänge
dienen.
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Bei
der Verwendung von zwei Manipulationsoptiken, wie eben beschrieben,
deren Strahlengänge in der Probe im wesentlichen senkrecht
aufeinandertreffen, ist es daher ohne großen Aufwand bezüglich Umbau
und Kosten möglich, die Manipulati an auf eine kleines Gebiet
der Probe zu beschränken, nämlich auf das Gebiet,
in dem sich die Lichtstrahlen der Manipulationsoptiken kreuzen.
Auf diese Weise wird eine konfokale Probenmanipulation möglich,
ohne daß man jedoch dabei aufwendige Anordnungen zur Ausnutzung
von Mehrphotoneneffekten benötigt. Bei der Verwendung von
beiden Manipulationslichtstrahlen ist jedoch ohne weiteres auch
die Ausnutzung von Mehrphotoneneffekten bei der Untersuchung möglich.
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Ein
wesentlicher Vorteil der SPIM-Technologie ist die Möglichkeit,
räumliche Bilder der Probe zu erzeugen, auch in der vorliegenden
Anordnung ist daher die Probe und/oder die Probenhalterung zweckmäßigerweise
beweglich, bevorzugt rotier- und verschiebbar gelagert. Auf diese
Weise können alle Bereiche der Probe einer Manipulation,
insbesondere auch einer räumlich streng lokalisierten Manipulation
zugänglich gemacht werden. Die Steuereinheit ist dabei
zweckmäßig zur Ansteuerung von beiden Manipulationsoptiken
ausgelegt. Außerdem weist die Anordnung zweckmäßig
eine Auswerteeinheit auf, die das – beispielsweise auf
einem flächenförmigen CCD-Detektor pixelweise – detektierte
Licht in Daten, d. h. digitale Signale umwandelt und auch auswertet, wobei
die Signalumwandlung häufig auch in der Detektierungseinrichtung
selbst vorgenommen wird. Die Steuereinheit steuert die Bewegung
der Probe und/oder der Probenhalterung, bevorzugt in Abhängigkeit
von der Auswertung der Daten. Aber auch eine Steuerung nach einem
vorgegebenen Programm, bei der die Probe beispielsweise vollständig durchleuchtet
wird und immer wieder die gleichen Manipulationsprozeduren durchgeführt
werden, ist mit entsprechender Ansteuerung möglich.
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Insbesondere
läßt sich die erfindungsgemäße
optische Anordnung zur Photomanipulation mit einer oder mehrerer
der Manipulationsmethoden FRAP, iFRAP, FLIP, FLAP, Photokonversion,
Photoaktivierung, Photoinaktivierung, Mikrodissektion, Polymerisation,
Ablation, Schmelzen, Erwärmung sowie Manipulation von Anregung-
und Emissionseigenschaften von Farbstoffen verwenden. Auch zur räumlich
lokalisierten Manipulation einer räumlich ausgedehnten
Probe läßt sich die erfindungsgemäße
Anordnung ohne weiteres verwenden.
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Die
Erfindung soll im folgenden anhand von Zeichnungen, die auch erfindungswesentliche
Merkmale aufweisen, näher erläutert werden. In
den dazugehörigen Zeichnungen zeigt:
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1 eine
optische Anordnung zur Photomanipulation mit einer normalen Beleuchtungslichtquelle
und einer Manipulationslichtquelle,
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2 eine ähnliche
optische Anordnung, bei der die Beleuchtungslichtquelle als Manipulationslichtquelle
verwendet wird,
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3 die
optische Anordnung aus 1, jedoch mit einer zusätzlichen
zweiten Manipulationsoptik und zwei Manipulationslichtquellen,
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4 die
optische Anordnung aus 1, jedoch mit einem zweiten
Manipulationsstrahlengang und einer gemeinsamen Manipulationslichtquelle.
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In 1 ist
eine optische Anordnung zur Photomanipulation einer Probe 1 gezeigt.
Die Probe 1 wird von einer Probenhalterung 2 aufgenommen. Die
Probe 1 kann beispielsweise in einen Gelzylinder aus Agarose
eingebettet werden, der in der Probenhalterung 2 befestigt
wird. Bevorzugt ist die Probenhalterung 2 rotierbar gelagert,
was hier durch den Pfeil angedeutet wird. Bevorzugt ist die Probenhalterung 2 außerdem
verschiebbar gelagert, d. h. in allen drei Raumrichtungen verfahrbar,
so daß alle Bereiche der Probe 1 beleuchtet und
detektiert werden können. Alternativ kann auch die Probe 1 beweglich gelagert
und die Probenhalterung 2 fest konstruiert sein, so daß die
Bewegungen von Probe 1 und Probenhalterung 2 entkoppelt
sind. Die Anordnung verfügt über eine Beleuchtungseinrichtung
mit einer Beleuchtungslichtquelle 3 und einen Beleuchtungsstrahlengang,
gekennzeichnet durch zwei Linsen 4 und 5. Mittels
der Beleuchtungseinrichtung kann die Probe 1 mit einem
Lichtblatt gemäß der SPIM-Technologie beleuchtet
werden. Das Licht wird im vorliegenden Fall vorzugsweise parallel
zur Rotationsachse der Probenhalterung 2 auf die Probe 1 gelenkt. Die
Anordnung weist außerdem eine Detektierungseinrichtung
zur Detektierung von Licht auf, welches von der Probe 1 abgestrahlt
wird. Wesentlicher Bestandteil der Detektierungseinrichtung ist
ein zeilen- oder flächenförmiger Detektor, der
im vorliegenden Beispiel als CCD-Kamera 6 ausgestaltet
ist. Auch andere Detektoren, beispielsweise auf CMOS-Basis sind
verwendbar, sofern sich die registrierten Intensitätssignale
ohne weiteres in digitale Informationen umwandeln lassen. Die Probe 1 bzw.
Licht, das von der Probe 1 kommt, wird durch eine Abbildungsoptik mit
einem Abbildungsobjektiv 7, welches sich in einem Abbildungsstrahlengang
befindet, mindestens teilweise auf die Detektierungseinrichtung,
d. h. die CCD-Kamera 6, abgebildet. Das Lichtblatt zur
Beleuchtung ist im Fokus des Abbildungsobjektivs 7 im wesentlichen
eben. Die optische Achse des Abbildungsobjektivs 7 schneidet
außerdem die Ebene des Lichtblatts in einem von Null verschiedenen
Winkel, bevorzugt senkrecht, wie in 1 dargestellt.
Die optische Anordnung weist außerdem eine Steuereinheit 8 auf,
die im Beispiel mit einer optio nalen Auswerteeinheit 9 kombiniert
ist. In der Auswerteeinheit 9 wird das detektierte Licht
in Daten umgewandelt und ausgewertet. Die Richtung, in der Licht
detektiert wird, ist durch den mit „D" gekennzeichneten
Pfeil zwischen Abbildungsobjektiv 7 und CCD-Kamera 6 gekennzeichnet.
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Die
optische Anordnung verfügt darüber hinaus über
Mittel zur Photomanipulation der Probe 1. Diese Mittel
zur Photomanipulation umfassen eine erste Manipulationsoptik, mittels
der Licht einer ersten Manipulationslichtquelle 10 in den
Beleuchtungsstrahlengang zur Formung eines im wesentlichen ebenen
Manipulationslichtblatts eingekoppelt wird. Die Richtung, in der
Manipulationslicht auf die Probe gelenkt wird, ist durch den mit „M"
gekennzeichneten Pfeil zwischen der Linse 5 und der Probenhalterung 2 gekennzeichnet.
Im vorliegenden Fall umfaßt die Manipulationsoptik neben
einer Linse 11, die ebenso wie die Linse 4 und 5 selbstverständlich
Anordnungen von mehreren Linsen symbolisieren kann, auch einen Umlenkspiegel 12 und,
zum Einkoppeln in den Beleuchtungsstrahlengang, ein entsprechendes
Einkoppelelement 13, welches beispielsweise als halbdurchlässiger
Spiegel oder als Polarisationsstrahlteiler oder auch als galvanometrischer
Spiegel ausgestaltet sein kann. In Ergänzung kann außerdem
eine als Shutter ausgestaltete Blende 14, beispielsweise eine
Irisblende, vorgesehen sein, die Licht durchläßt oder
blockiert, je nachdem, wie sie von der Steuereinheit 8 angesteuert
wird. Auch das Einkoppelelement 13 bzw. der Umlenkspiegel 12 können
ggf. von der Steuereinheit 8 angesteuert werden, beispielsweise
wenn das Einkoppelelement 13 als galvanometrischer Spiegel
ausgestaltet ist, oder wenn anstelle der Blende 14 der
Umlenkspiegel 12 gedreht wird, um das Licht in eine Lichtfalle
zu lenken und zu blockieren. Wesentlich ist nur, daß Mittel
zum Einkop peln in den Beleuchtungsstrahlengang vorgesehen sind,
sowie die Möglichkeit, diese zu steuern. Diese Verbindungen
von der Steuereinheit 8 zu den angesteuerten Elementen
der optischen Anordnungen sind der Übersicht halber nicht
eingezeichnet. Die erste Manipulationslichtquelle 10 kann
beispielsweise als Laserlichtquelle ausgestaltet sein. Sie kann auch
mehrere einzeln oder zusammen schaltbare Laser verschiedener Wellenlängen
umfassen.
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Die
Anordnung weist darüber hinaus auch mittel zur Strukturierung
des Lichtblattes auf. Im gezeigten Beispiel umfassen die Mittel
zur Strukturierung des Lichtblatts eine in den Strahlengang einschiebbare
Schlitzblende 15 mit einem oder mehreren Schlitzen zur
räumlichen Strukturierung des Lichtblattes.
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Während
mit der in 1 gezeigten Anordnung eine Beobachtung
der Probe und eine Manipulation der Probe alternierend oder ggf.
auch gleichzeitig möglich ist, so ist die in 2 gezeigte
Anordnung, die im wesentlichen die gleichen Elemente wie die in 1 gezeigte
Anordnung umfaßt, einfacher ausgestaltet. Als erste Manipulationslichtquelle 10 ist hier
die Beleuchtungslichtquelle 3 vorgesehen. Dabei hängt
von der jeweiligen Anwendung ab, d. h. von den verwendeten Wellenlängen
bzw. Wellenlängenbereichen, in denen die erste Manipulationslichtquelle 10 Licht
abstrahlt, ob die Probe 1 mit diesem Licht auch in üblicherweise
beobachtet werden kann, oder ob mit der Anordnung nur eine Manipulation
möglich ist. Auch hier sind wieder Mittel zur Strukturierung des
Lichtblattes vorgesehen, neben einer Schlitzblende 15 können
diese Mittel außerdem Mittel zur zeitlichen Modulation
des Lichtblatts umfassen, beispielsweise eine Steuerung der Intensität
oder Wellenlänge oder auch Mittel zur Erzeugung mehrerer, einander überlagerter
Lichtblätter.
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In 3 ist
eine ähnliche Anordnung wie in 1 gezeigt,
jedoch weisen die Mittel zur Photomanipulation der Probe 1 hier
zusätzlich noch eine zweite Manipulationsoptik auf. Licht
einer zweiten Manipulationslichtquelle 16 wird in den Abbildungsstrahlengang
eingekoppelt und über das Abbildungsobjektiv 7 auf
die Probe 1 gelenkt. Zur Einkopplung sind auch hier ein
Umlenkspiegel 12, und eine Blende 14 vorgesehen,
sowie ein Strahlteiler 17 zur endgültigen Einkopplung
des Manipulationslichtes in den Abbildungsstrahlengang, der jedoch
in Detektierungsrichtung von der Probe 1 kommendes Licht
zur CCD-Kamera 6 durchläßt. Auch die
zweite Manipulationslichtquelle 16 kann als Laserlichtquelle,
die mindestens einen Laser umfaßt, ausgestaltet sein. Die
erste Manipulationslichtquelle und die zweite Manipulationslichtquelle 16 können
dabei auch Licht unterschiedlicher Wellenlängen oder Wellenlängenbereiche
ausstrahlen. Außerdem kann die zweite Manipulationsoptik
als Laser-Scanning-Mikroskop ausgestaltet sein. Dies ermöglicht
die konfokale Beleuchtung der Probe über den Abbildungsstrahlengang. Werden
die Umlenkspiegel 12 nicht als vollreflektierende, sondern
als teildurchlässige Spiegel ausgestaltet, so kann auch
Licht der ersten Manipulationslichtquelle 10 – wie
durch die gestrichelte Linie angedeutet – in den Abbildungsstrahlengang
eingekoppelt werden. Bei entsprechender Ausgestaltung des Einkoppelelementes 13 kann
sogar Licht aus der Beleuchtungsquelle 3 in den Abbildungsstrahlengang eingekoppelt
werden und ermöglicht so eine normale Beobachtung im Auflicht.
Darüber hinaus ist auch eine Kombination der zweiten Manupulationsoptik, wie
sie in 3 gezeigt ist, mit einer Anordnung gemäß 2 möglich.
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Eine
andere Variante ist in 4 gezeigt, hier sind erste Manipulationslichtquelle 10 und
zweite Manipulationslichtquelle 16 identisch. Statt eines Umlenkspiegels 12 kommt
hier jedoch ein weiteres Einkoppelelement 13 zum Einsatz,
das beispielsweise als Strahlteiler ausgestaltet sein kann, so daß beide
Manipulationsstrahlengänge gleichzeitig mit Licht gespeist
werden, oder aber auch als schaltbarer Spiegel, der alternierend
oder nach Bedarf einen der beiden Strahlengänge speist.
Auf den Beleuchtungsstrahlengang mit der Beleuchtungslichtquelle 3 kann – ebenso
wie bei der in 3 gezeigten Anordnung – ggf.
auch verzichtet werden, wenn eine Beleuchtung nicht notwendig ist,
sondern die Anordnung auf die reine Manipulation beschränkt
werden soll. Alternativ können auch alle Lichtquellen zu
einer einzigen Lichtquelle zusammengefaßt sein, oder mindestens in
einem Lichtquellenmodul zusammengefaßt sein, so daß der
Aufbau weiter vereinfacht wird.
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Mit
den gezeigten Anordnungen ist es möglich, in einem beschränkten
Bereich der Probe Photomanipulationen durchzuführen, wobei
der Aufwand, sowohl hinsichtlich der Konstruktion als auch der Kosten
gegenüber anderen Anordnungen, die räumlich begrenzt
photomanipulieren, gering ausfällt. Im Falle der Anordnung
mit einer Manipulationsoptik, bei der das Manipulationslicht zu
einem Lichtblatt geformt wird, bleibt der Bereich der Probe 1,
der manipuliert wird, auf die Fokusebene des Abbildungsobjektivs 7 beschränkt.
Der Bereich ist dabei jedoch noch relativ groß und unflexibel,
da entweder nur ganze Linien oder – bei räumlicher
Strukturierung des Lichtblattes – Streifen manipuliert
werden können.
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Mit
den in 3 und 4 gezeigten Anordnungen, bei
denen jeweils zwei Manipulationsoptiken bzw. zwei Manipulationsstrahlengänge
vorgesehen sind, lassen sich auch räumlich stark lokalisierte
Gebiete in der Probe manipulieren, ohne daß beispielsweise
auf aufwendige Mehrphotoneneffekte zurückgegriffen werden
muß. Bei entsprechender Auswahl von Proben und Manipulationstechnik
ist es möglich, daß Manipulationsgebiet in der
Probe auf den Bereich zu beschränken, der vom Licht beider
Manipulationsstrahlengänge in der Überlappung
erfaßt wird.
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Beispielsweise
lassen sich Proben mit Farbstoffen einfärben, deren Antwortverhalten
(Response) in bezug auf die eingestrahlte Leistungsdichte nichtlinear
ist. So kann man beispielsweise einen Farbstoff verwenden, dessen
Antwortverhalten quadratisch auf die eingestrahlte Leistungsdichte
reagiert. Doppelte Leistungsdichte würde die Stärke
des Signals vervierfachen. Falls beide Manipulationsoptiken mit
der gleichen Leistungsdichte auf die Probe strahlen, so wird ein
Beobachter in dem Gebiet der Probe 1, in dem sich die Strahlen
kreuzen, die vierfache Signalintensität beobachten, in
den übrigen Gebieten nur die einfache. Die Auswahl findet
hier also nicht mit Mehrphotonen-Effekten statt, sondern durch die
Addition der Leistungsdichten. Selbstverständlich ist auch
eine Kombination mit Mehrphotonen-Techniken denkbar.
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Ein
anderes Anwendungsbeispiel ist eine Probe, die unterhalb eines Schwellwertes
für die Leistungsdichte überhaupt keine Antwort
zeigt, sondern erst dann, wenn oberhalb dieser Schwelle angeregt
wird. Falls die Leistungsdichte des Lichtes der beiden Manipulationslichtquellen
beim Auftreffen auf die Probe jeweils geringer ist als der Schwellwert, in der
Summe aber über diesem liegt, so kann auf diese Weise auch
ein lokal sehr eng begrenztes Gebiet ausgewählt werden.
Weist die Probe einen absoluten Schmelzpunkt im Bereich der addierten
Leistungsdichten der Manipulationslichtquellen auf, so läßt sich
die Probe 1 an diesem Punkt beispielsweise durch die Überlagerung
der beiden Strahlen aufbrechen. Dies kann beispielsweise zur Mikrodissektion verwendet
werden. Die Lichtquelle kann in den beiden eben geschilderten Fällen
jeweils dieselbe sein.
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Auch
unterschiedliche Lichtquellen lassen sich selbstverständlich
verwenden. Bestrahlt man eine Probe, die mit Farbstoffen des Typs
Dronpa 3 markiert ist, so regen beispielsweise weder die Bestrahlung
mit Licht einer Wellenlänge von 405 nm, noch die Bestrahlung
mit Licht einer Wellenlänge von 488 nm Emissionen an. Erst
bei einer simultanen Kombination beider Anregungswellenlängen
zeigen sich helle Emissionen. Diese Emissionen treten jedoch in
der Probe 1 nur in der Region auf, in der sich die beiden
Strahlen überlappen bzw. kreuzen, also in einem räumlich
sehr geschränkten Gebiet, auch wenn die Manipulationsoptiken
für sich genommen jeweils ein größeres
Gebiet beleuchten.
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Die
optische Anordnung läßt sich außer in den
eben beschriebenen Beispielen auch bei einer Vielzahl anderer Manipulationsverfahren,
insbesondere solchen, die die Fluoreszenz analysieren, beispielsweise
FRAP, FLIP, FLAP, etc. anwenden.
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Mit
den oben beschriebenen optischen Anordnungen zur Photomanipulation
ist es nicht nur möglich, auf die Verwendung von Anordnungen
zur Ausnutzung von Mehrphotoneneffekten zu verzichten, was weniger
aufwendig und kostengünstiger ist, darüber hinaus
ist es auch möglich kleinere Probenvolumen als bei der
Verwendung von Mehrphotonentechniken zu untersuchen.
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- 1
- Probe
- 2
- Probenhalterung
- 3
- Beleuchtungslichtquelle
- 4,
5
- Linsen
- 6
- CCD-Kamera
- 7
- Abbildungsobjektiv
- 8
- Steuereinheit
- 9
- Auswerteeinheit
- 10
- erste
Manipulationslichtquelle
- 11
- Linse
- 12
- Umlenkspiegel
- 13
- Einkoppelelement
- 14
- Blende
- 15
- Schlitzblende
- 16
- zweite
Manipulationslichtquelle
- 17
- Strahlteiler
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
-
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Zitierte Patentliteratur
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- - DE 10257423
A1 [0005]
- - WO 2004/0530558 A1 [0005]
- - DE 10233549 [0011]