DE102007044940A1

DE102007044940A1 - Method of magnetic resonance measurement of water-soluble sample molecules in molecular containers

Info

Publication number: DE102007044940A1
Application number: DE102007044940A
Authority: DE
Inventors: Claudio Prof. Luchinat; Tony Dr. Keller; Antonio Dr. Gianotti
Original assignee: Bruker Biospin GmbH
Current assignee: Bruker Biospin GmbH
Priority date: 2007-09-20
Filing date: 2007-09-20
Publication date: 2009-04-16
Also published as: WO2009036741A1

Abstract

Ein Verfahren zur Vermessung der magnetischen Resonanz von in einem polaren Lösungsmittel löslichen Probenmolekülen (1), wobei ein elektromagnetisches Hoch(= HF)-Feld auf die Probenmoleküle (1) einwirkt, ist dadurch gekennzeichnet, dass die Probenmoleküle (1) während der Vermessung in einer Messemulsion (4) vorliegen, wobei in der Messemulsion (4) die Probenmoleküle (1) in molekularen Behältern, insbesondere inversen Mizellen (2), eingeschlossen sind, und die molekularen Behälter in einem unpolaren Lösungsmittel (3) verteilt sind. Die Erfindung ermöglicht die Vermessung der magnetischen Resonanz wasserlöslichen Probenmaterials mit geringem apparativen Aufwand bei gutem Signal-zu-Rausch-Verhältnis auch bei hohen Frequenzen der eingestrahlten HF-Felder.A method for measuring the magnetic resonance of polar solvent-soluble sample molecules (1), wherein an electromagnetic high (= HF) field acts on the sample molecules (1), is characterized in that the sample molecules (1) during the measurement in in a measuring emulsion (4), in the measuring emulsion (4) the sample molecules (1) are enclosed in molecular containers, in particular inverse micelles (2), and the molecular containers are distributed in a nonpolar solvent (3). The invention makes it possible to measure the magnetic resonance of water-soluble sample material with little expenditure on equipment with a good signal-to-noise ratio even at high frequencies of the radiated RF fields.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Vermessung der magnetischen Resonanz von in einem polaren Lösungsmittel löslichen Probenmolekülen, wobei ein elektromagnetisches Hochfrequenz(=HF)-Feld auf die Probenmoleküle einwirkt.The The invention relates to a method for measuring the magnetic Resonance of soluble in a polar solvent Sample molecules, wherein an electromagnetic high frequency (= HF) field acting on the sample molecules.

Ein solches Verfahren ist zum Beispiel durch J. A. Weil et al, Electron Paramagnetic Resonance, John Wiley & Sons, New York, 1994 , bekannt geworden.Such a method is for example by JA Weil et al, Electron Paramagnetic Resonance, John Wiley & Sons, New York, 1994 , known.

In der Magnetresonanz(=MR) wird ein elektromagnetisches Hochfrequenz(=HF)-Feld auf eine Probe eingestrahlt, die sich in einem starken, statischen Magnetfeld B₀ befindet. Die Wechselwirkung der Probe mit dem HF-Feld gibt Rückschlüsse auf die Probeneigenschaften, etwa in der Probe vorhandene Molekülgruppen. Wichtige Anwendungen der Magnetresonanz sind Kernspinresonanz(=NMR)-Spektroskopie und Elektronenspinresonanz(=ESR)-Spektroskopie.In magnetic resonance (= MR), an electromagnetic high-frequency (= HF) field is irradiated onto a sample which is in a strong, static magnetic field B ₀ . The interaction of the sample with the RF field gives information about the sample properties, such as molecule groups present in the sample. Important applications of magnetic resonance are nuclear magnetic resonance (= NMR) spectroscopy and electron spin resonance (= ESR) spectroscopy.

Viele Probenmaterialien, deren Eigenschaften mit Magnetresonanz vermessen werden sollen, liegen in einem polaren Lösungsmittel, insbesondere in wässriger Lösung, vor (da Wasser das weitaus häufigste polare Lösungsmittel ist, wird im Folgenden der Einfachheit halber von „Wasser" und „wässriger Lösung" gesprochen. Es versteht sich, dass dies auch andere polare Lösungsmittel und Gemische polarer Lösungsmittel einschließt). In der Regel wird dann eine wässrige Probe (bestehend aus Wasser und dem im Wasser gelösten Probenmaterial) in ein Probengefäß eingefüllt, und das Probengefäß wird in einen Resonator verbracht, der die HF-Felder in die Probe einstrahlt. Typische HF-Felder, die im Rahmen von Magnetresonanz-Messungen in eine Probe eingestrahlt werden, werden jedoch von in der Probe enthaltenem Wasser absorbiert. Die Absorption steigt mit der Frequenz der HF-Felder an, insbesondere die in der ESR benötigten Mikrowellen werden von Wasser stark absorbiert.Lots Sample materials whose properties are measured with magnetic resonance are in a polar solvent, especially in aqueous solution, before (as water is by far the most common is polar solvent, below is simplicity half of "water" and "aqueous solution" spoken. It is understood that these are also other polar solvents and mixtures of polar solvents). As a rule, an aqueous sample (consisting of Water and the sample material dissolved in the water) into a sample vessel, and the sample vessel is placed in a resonator, which radiates the RF fields into the sample. Typical RF fields that irradiated in a sample as part of magnetic resonance measurements but are absorbed by water contained in the sample. The absorption increases with the frequency of the RF fields, in particular the microwaves required in the ESR are water strongly absorbed.

Infolge der Absorption wird nur Probenmaterial im Randbereich einer wässrigen Probe voll von HF-Feldern bestrahlt; das Probeninnere wird bei größeren Probendurchmessern gar nicht erreicht, so dass das vermessbare Probenmaterial einer wässrigen Probe effektiv verringert ist. Durch die Absorption sinkt auch die Güte eines Resonators, der eine wässrige Probe enthält. Durch diese beiden Effekte verschlechtert der Wassergehalt einer Probe das Signal-zu-Rausch-Verhältnisses(=SNR) eines MR-Messignals des Probenmaterials in der Probe. Bei starker Absorption besteht auch die Gefahr, dass der Resonator gar nicht mehr ankoppelt, und eine Messung damit nicht mehr möglich ist.As a result The absorption is only sample material in the edge region of an aqueous Sample fully irradiated by RF fields; the inside of the sample becomes larger Sample diameters not reached, so that the measurable sample material an aqueous sample is effectively reduced. By the Absorption also decreases the quality of a resonator, the one contains aqueous sample. Through these two effects the water content of a sample deteriorates the signal-to-noise ratio (= SNR) an MR measurement signal of the sample material in the sample. With strong absorption there is also the danger that the resonator will no longer be coupled, and a measurement is no longer possible.

Der Stand der Technik begegnet dieser Problematik im Wesentlichen durch eine besondere Geometrie der Gefäße für die wässrigen Proben, die in einem Resonator angeordnet werden, vgl. dazu beispielsweise J. A. Weil et al , aaO.. Wenn ein Probengefäß bzw. dessen Probenraum in der Richtung parallel zum elektrischen Feld des HF-Felds sehr viel kleiner ist als die Wellenlänge des HF-Feldes, ist die Absorptionsproblematik stark vermindert bzw. tritt nicht auf. Die Probengefäße bzw. deren Probenräume werden daher in einer Dimension entsprechend kurz ausgebildet und in die Nullstellen der elektrischen Feldverteilung positioniert. Die räumlich Ausdehnung der E-Feld Nullstellen ist durch die Wellenlänge des HF-Felds bestimmt. Je höher die Frequenz des HF-Felds, desto kleiner ist die räumliche Ausdehnung der Nullstelle. Als Gefäße für wässrige Proben sind insbesondere Flachzellen, dünne Kapillaren oder auch Mehrfachkapillaranordnungen bekannt geworden. Eine Mehrfachkapillaranordnung für die EPR (=electron proton resonance) ist beispielsweise durch die „AquaX sample cell" von der Firma Bruker bekannt geworden, oder auch durch US 7,088,101 B2 .The prior art addresses this problem essentially by a special geometry of the vessels for the aqueous samples, which are arranged in a resonator, see. for example JA Weil et al If a sample vessel or its sample space in the direction parallel to the electric field of the RF field is much smaller than the wavelength of the RF field, the absorption problem is greatly reduced or does not occur. The sample vessels or their sample chambers are therefore designed to be correspondingly short in one dimension and positioned in the zero points of the electric field distribution. The spatial extent of the E field zeros is determined by the wavelength of the RF field. The higher the frequency of the RF field, the smaller the spatial extent of the zero point. As vessels for aqueous samples in particular flat cells, thin capillaries or Mehrfachkapillaranordnungen have become known. A multiple capillary arrangement for the EPR (= electron proton resonance) has become known, for example, by the "AquaX sample cell" from Bruker, or else by US 7,088,101 B2 ,

Als weitere Maßnahme sind aus der NMR sogenannte „E-free"-Resonatoren bekannt, bei denen das elektrische Feld im Zentrum der wässrigen Probe minimiert wird, vgl. beispielsweise P. L. Gor'kov et al., J. Magn. Reson. 185 (2007), Seiten 77–93 , oder auch C. Li et al., J. Magn. Reson. 180 (2006), Seiten 51–57 .As a further measure, so-called "E-free" resonators are known from NMR, in which the electric field in the center of the aqueous sample is minimized, cf., for example PL Gor'kov et al., J. Magn. Reson. 185 (2007), pages 77-93 , or too Li, C., et al., J. Magn. Reson. 180 (2006), pages 51-57 ,

Die Dimensionsvorgabe an das Probengefäß begrenzt grundsätzlich das Volumen an Probe, welches im Resonator vermessen werden kann. Dies wiederum begrenzt das SNR der MR-Messung. Auch können Probengefäße bzw. deren Probenräume nicht beliebig eng gefertigt werden, so dass bei höheren Frequenzen des HF-Feldes die Absorption nicht mehr durch die Dimensionierung des Probengefäßes reduziert werden kann. Die im Stand der Technik eingesetzten speziellen Probengefäße und speziellen Resonatoren machen die Vermessung von wässrigen Proben im übrigen apparativ aufwändig und teuer.The Dimensional specification limited to the sample vessel basically the volume of sample which is in the resonator can be measured. This in turn limits the SNR of the MR measurement. Also, sample containers or their sample chambers can not can be made arbitrarily tight, so that at higher frequencies of the RF field, the absorption is no longer due to the sizing of the sample vessel can be reduced. The im State of the art used special sample containers and special resonators make the measurement of aqueous Samples otherwise expensive and expensive.

Aufgabe der ErfindungObject of the invention

Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Vermessung der magnetischen Resonanz von in einem polaren Lösungsmittel löslichem Probenmaterial vorzustellen, mit dem bei geringem apparativen Aufwand ein gutes Signal-zu-Rausch-Verhältnis auch bei hohen Frequenzen der HF-Felder erzielbar ist.It The object of the present invention is a method for measuring the magnetic resonance of soluble in a polar solvent Introduce sample material, with the low equipment cost a good signal-to-noise ratio even at high frequencies the RF fields is achievable.

Kurze Beschreibung der ErfindungBrief description of the invention

Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren der eingangs genannten Art, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Probenmoleküle während der Vermessung in einer Messemulsion vorliegen, wobei in der Messemulsion die Probenmoleküle in molekularen Behältern eingeschlossen sind, und die molekularen Behälter in einem unpolaren Lösungsmittel verteilt sind.This task is solved by a procedure ren of the aforementioned type, which is characterized in that the sample molecules are present during the measurement in a Messemulsion, wherein in the measuring emulsion, the sample molecules are enclosed in molecular containers, and the molecular containers are distributed in a non-polar solvent.

Gemäß der vorliegenden Erfindung werden die (in der Regel wasserlöslichen) Probenmoleküle mittels molekularer Behälter, beispielsweise inverser Mizellen, in einem unpolaren Lösungsmittel verteilt. In jedem molekularen Behälter ist mindestens ein Probenmolekül eingeschlossen. Der molekulare Behälter kann (bezogen auf das Probenmolekül) so klein sein, dass er genau ein Probenmolekül einschließt, ohne dieses zu zerstören. In einer weiteren bevorzugten Variante sind die molekularen Behälter jedoch größer und schließen jeweils mehrere Probenmoleküle in polarer Lösung ein. Eine bevorzugte lineare Ausdehnung des molekularen Behälters liegt im Bereich von einigen zehn Nanometern, kann jedoch auch bis zu einigen Mikrometern reichen. Die molekularen Behälter werden wiederum insgesamt vom unpolaren Lösungsmittel umgeben. Das unpolare Lösungsmittel absorbiert das HF-Feld bei der MR-Messung nicht merklich, selbst wenn das HF-Feld längere Strecken im unpolaren Lösungsmittel zurücklegen muss. Das unpolare Lösungsmittel nimmt dabei einen Großteil des Volumens einer erfindungsgemäßen Probe ein. Im Vergleich zu einer wässrigen Probe ist in der erfindungsgemäßen Probe nur eine geringe Menge Wasser enthalten (im Extremfall ist praktisch gar kein Wasser mehr in der Probe enthalten); dieses Wasser befindet sich im Inneren der molekularen Behälter. Allein schon durch den verringerten Wassergehalt verbessert sich das SNR bei der Vermessung einer erfindungsgemäßen Probe im Vergleich zu einer wässrigen Probe bei gleicher Stoffmenge an Probenmolekülen, gleichem Probenvolumen und gleichem Probengefäß. Bevorzugt enthält eine erfindungsgemäße Probe nur so viel Wasser, dass die Probenmoleküle im Inneren der molekularen Behälter gerade in Lösung bleiben können.According to the present invention, the (usually water-soluble) Sample molecules by means of molecular containers, for example inverse micelles, distributed in a non-polar solvent. In Each molecular container has at least one sample molecule locked in. The molecular container may (based on the sample molecule) should be so small that it contains exactly one sample molecule includes without destroying this. In a however, the molecular containers are more preferred variant larger and each include several Sample molecules in polar solution. A preferred linear Expansion of the molecular container is in the range of a few tens of nanometers, but it can also be up to a few microns pass. The molecular containers are in turn of the total surrounded by nonpolar solvents. The nonpolar solvent does not noticeably absorb the RF field during MR measurement, itself if the RF field extends longer distances in the nonpolar solvent must go back. The non-polar solvent decreases while a large part of the volume of an inventive Sample. Compared to an aqueous sample is in the sample according to the invention only a small amount Contain water (in extreme cases, practically no water is left contained in the sample); this water is inside the molecular container. Alone by the reduced Water content improves the SNR in the measurement of an inventive Sample compared to an aqueous sample with the same amount of substance on sample molecules, same sample volume and the same Sample vessel. Preferably contains an inventive Sample only so much water that the sample molecules are inside the molecular container just stay in solution can.

Zudem wirkt die Verteilung des Wassers in der erfindungsgemäßen Probe der Absorption des HF-Feldes entgegen. Die größte Länge, die das elektrische Feld in einer erfindungsgemäßen Probe am Stück zu durchdringen hat, entspricht dem Durchmesser eines molekularen Behälters. Der Durchmesser eines molekularen Behälters ist auf jeden Fall kleiner als der Innendurchmesser des Probengefäßes, in dem die erfindungsgemäße Probe enthalten ist. Durch die Verkleinerung des am Stück in Wasser zurückzulegenden Absorptionswegs, insbesondere im Vergleich zur Wellenlänge des HF-Feldes, wird die Absorption in der Probe ebenfalls verringert. Der Durchmesser eines molekularen Behälters wird durch geeignete Wahl der chemischen Reagenzien und die Prozessführung eingestellt bzw. ausgewählt. Der Durchmesser inverser Mizellen kann beispielsweise durch geeignete Wahl des unpolarem Lösungsmittels (bzw. Lösungsmittelgemisches), der grenzflächenaktiven Substanz (bzw. Substanzgemischen), den Mengenverhältnissen von unpolarem Lösungsmittel, polarem Lösungsmittel (in der Regel Wasser) und grenzflächenaktiver Substanz, pH-Einstellung sowie durch mechanische Bearbeitung (Schütteln, Ultraschallbehandlung oder dergleichen) und gegebenenfalls weiteren Parametern eingestellt werden. Insbesondere können auch Durchmesser der molekularen Behälter eingestellt bzw. ausgewählt werden, die weit unter der minimal möglichen Dimension von Probengefäßen bzw. deren Probenräumen liegen.moreover affects the distribution of water in the inventive Sample against the absorption of the RF field. The largest Length which is the electric field in an inventive Sample has to penetrate in one piece, corresponds to the diameter a molecular container. The diameter of a molecular Container is definitely smaller than the inside diameter the sample vessel in which the inventive Sample is included. By the reduction of the piece absorption path to be taken in water, in particular in the Comparing to the wavelength of the RF field, the absorption becomes also reduced in the sample. The diameter of a molecular Container is determined by appropriate choice of chemical reagents and the process control is set or selected. Of the Diameter of inverse micelles, for example, by suitable Choice of the nonpolar solvent (or solvent mixture), the surfactant (or mixtures of substances), the proportions of nonpolar solvent, polar solvent (usually water) and more surface-active Substance, pH adjustment and by mechanical treatment (shaking, Sonication or the like) and optionally further Parameters are set. In particular, too Diameter of the molecular containers are set or selected, far below the minimum possible dimension of sample vessels or their sample rooms are located.

Die Durchmesser inverser Mizellen liegen typischerweise im Bereich von einigen zehn Nanometern. Die Größe von Proteinen liegt im Bereich von typischerweise 3 bis 6 Nanometern, d. h. Proteine können sich in der wässrigen Lösung innerhalb der inversen Mizelle frei bewegen.The Inverse micelle diameters are typically in the range of a few tens of nanometers. The size of proteins is in the range of typically 3 to 6 nanometers, i. H. proteins can be in the aqueous solution within move the inverse micelle freely.

Da die molekularen Behälter in der Regel nicht – zumindest nicht exakt – kugelförmig sind, soll im Folgenden der Begriff „Durchmesser" oder „effektiver Durchmesser" der größten linearen Ausdehnung des Innenraums des molekularen Behälters entsprechen.There the molecular containers are not usually - at least are not exact - spherical, shall in the following the term "diameter" or "effective diameter" the largest linear extent of the interior correspond to the molecular container.

Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens können praktisch beliebige Probengefäße verwendet werden, ohne dass die Gefäßform bzw. die Dimensionierung des Probenraums merklichen Einfluss auf das SNR der MR-Messung hätte. Erfindungsgemäß können auch einfache Gefäße mit großem Probenraum und ohne Einschränkung der Gefäßdimension in der Richtung parallel zum elektrischen Feld verwendet werden. Dadurch kann das vermessbare Volumen an Probe, und damit auch die vermessbare Menge an Probenmaterial bzw. Probenmolekülen, vergrößert werden. Insbesondere können konventionelle Probenröhrchen mit einem Innendurchmesser ≥ 1 mm, bevorzugt 3 mm, verwendet werden. Diese Maße gelten für das X-Band der ESR. Im W-Band bei 94 GHz sind die entsprechenden Maße dann ≥ 0.1 mm, bevorzugt etwa 1 mm.in the Within the scope of the method according to the invention virtually any sample containers are used, without the vessel shape or the dimensioning of the sample space would have a significant influence on the SNR of the MR measurement. According to the invention can also be simple Vessels with large sample space and without Limitation of the vessel dimension in the Direction parallel to the electric field can be used. Thereby can measure the measurable volume of sample, and thus the measurable Amount of sample material or sample molecules, enlarged become. In particular, conventional sample tubes with an inner diameter ≥ 1 mm, preferably 3 mm used become. These dimensions apply to the X-band of the ESR. In the W band at 94 GHz, the corresponding dimensions are then ≥ 0.1 mm, preferably about 1 mm.

Molekulare Behälter, die für die vorliegende Erfindung grundsätzlich geeignet sind, beinhalten inverse Mizellen, Carcerand-Komplexe (carcerands), Hemi-Carcerand-Komplexe (hemi-carcerands), molekulare Körbe (molecular baskets), Fullerene, molekulare Nanokapseln (molecular nanocapsules) oder auch selbstorganisierende Kapselungen (self-assembled capsules). Verschiedene Arten von solchen molekularen Behältern sind beispielsweise bekannt geworden durch:

– Donald J. Cram, Nature 356 (1992), S. 29–36
– Ralf Warmuth, Journal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry 37 (2000), S. 1–38 ;
– Min Wie et al., J. Mater. Chem. 2005 (15), S. 1197–1203 ;
– Ryo E. H., Zhao Y., Org. Lett. 6(18), 2004, S. 3187–3189 .
– Ryo E. H. et al., J. Org. Chem. 2006 (19), S. 7205–7213

Molecular containers that are basically suitable for the present invention include inverse micelles, carcerands, hemi-carcerand complexes, molecular baskets, fullerenes, molecular nanocapsules, or also self-assembled capsules. For example, various types of such molecular containers have become known by:

- Donald J. Cram, Nature 356 (1992), p. 29-36
- Ralf Warmuth, Journal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry 37 (2000), p. 1-38 ;
- Min Wie et al., J. Mater. Chem. 2005 (15), pp. 1197-1203 ;
- Ryo EH, Zhao Y., Org. Lett. 6 (18), 2004, pp. 3187-3189 ,
- Ryo EH et al., J. Org. Chem. 2006 (19), pp. 7205-7213

Bevorzugte VerfahrensvariantenPreferred process variants

Bei einer besonders bevorzugten Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das polare Lösungsmittel Wasser. Wasser ist für die meisten zu untersuchenden Probenmoleküle als Lösungsmittel gut geeignet und entspricht in der Regel der natürlichen Umgebung des Probenmoleküls.at a particularly preferred variant of the invention Process is the polar solvent water. water is for most sample molecules to be examined as a solvent well suited and usually corresponds the natural environment of the sample molecule.

Vorteilhaft ist eine Verfahrensvariante, bei der die molekularen Behälter jeweils genau ein Probenmolekül enthalten. Typischerweise und bevorzugt enthält der molekulare Behälter dann auch keine oder allenfalls sehr wenige Moleküle des polaren Lösungsmittels (in der Regel Wasser). Dadurch kann die Absorption des HF-Feldes besonders stark verringert werden.Advantageous is a variant of the process in which the molecular container each contain exactly one sample molecule. typically, and preferably contains the molecular container then no or at most very few molecules of the polar solvent (usually water). This allows the Absorption of the RF field are particularly reduced.

Bei einer vorteilhaften, alternativen Verfahrensvariante enthalten die molekularen Behälter jeweils mehrere Probenmoleküle gelöst in dem polaren Lösungsmittel. Durch das Halten der Probenmoleküle im polaren Lösungsmittel werden Beschädigungen und Reaktionen (etwa eine Denaturierung) der Probenmoleküle vermieden; die Vermessung der Eigenschaften der Probenmoleküle wird durch die Probenaufbereitung für die MR-Messung nicht verfälscht.at an advantageous, alternative process variant include the molecular containers each have multiple sample molecules dissolved in the polar solvent. By the Keep the sample molecules in the polar solvent damage and reactions (such as denaturation) the sample molecules avoided; the measurement of the properties The sample molecules are analyzed by the sample preparation for the MR measurement is not corrupted.

Bevorzugt ist weiterhin eine Verfahrensvariante, bei der das polare Lösungsmittel und/oder das unpolare Lösungsmittel deuteriert sind, insbesondere wobei das polare Lösungsmittel und/oder das unpolare Lösungsmittel vollständig deuteriert sind.Prefers is also a process variant in which the polar solvent and / or the non-polar solvent are deuterated, in particular where the polar solvent and / or the nonpolar solvent are completely deuterated.

Bei einer bevorzugten Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst die Vermessung der magnetischen Resonanz eine

– Elektronenspinresonanz(=ESR)-Messung
– und/oder eine Kernspinresonanz(=NMR)-Messung. Diese beiden Verfahren sind in der spektroskopischen Praxis besonders wichtig. Besonders bei den in der ESR benötigten HF-Feld-Frequenzen (typisch ca. 9–100 GHz, etwa X-Band mit ca. 9 GHz oder Q-Band mit ca. 34 GHz) kann es bei wässrigen Proben zu erheblichen Absorptionsproblemen kommen, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung beseitigt werden können.

In a preferred variant of the method according to the invention, the measurement of the magnetic resonance comprises a

- Electron spin resonance (= ESR) measurement
- and / or a nuclear magnetic resonance (= NMR) measurement. These two methods are particularly important in spectroscopic practice. Particularly at the RF field frequencies required in the ESR (typically about 9-100 GHz, about X-band with about 9 GHz or Q-band with about 34 GHz) can occur in aqueous samples to considerable absorption problems, which can be eliminated in the context of the present invention.

Bevorzugt ist auch eine Weiterentwicklung dieser Verfahrensvariante, bei der die Vermessung der magnetischen Resonanz eine

– Elektron-Kern-Doppelresonanz(=ENDOR)-Messung
– und/oder eine Dynamische Kernspinpolarisation(=DNP)-Messung umfasst.

Also preferred is a further development of this process variant, in which the measurement of the magnetic resonance a

- electron-nuclear double resonance (= ENDOR) measurement
And / or a dynamic nuclear spin polarization (= DNP) measurement.

Bei diesen Methoden wird die Magnetisierung der Elektronenspins auf die Spins der Atomkerne übertragen; ENDOR und DNP sind insofern kombinierte ESR/NMR-Experimente. Durch die vorliegende Erfindung wird die Elektronenspin-Anregung im ESR-Teil verbessert, so dass auch ein verbessertes NMR-Spektrum erhalten wird.at These methods are the magnetization of the electron spins on transmit the spins of the atomic nuclei; ENDOR and DNP are insofar combined ESR / NMR experiments. By the present Invention improves the electron spin excitation in the ESR part, so that an improved NMR spectrum is obtained.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden als unpolares Lösungsmittel Isooktan, Benzol, Toluol, Tetrachlorkohlenstoff, Chloroform, Mineralöl und/oder Silikonöl eingesetzt. Diese unpolaren Lösungsmittel sind in der Praxis bewährt. Das unpolare Lösungsmittel ist erfindungsgemäß im Wesentlichen transparent für das HF-Feld der MR-Messung.at a preferred embodiment are called non-polar Solvent isooctane, benzene, toluene, carbon tetrachloride, Chloroform, mineral oil and / or silicone oil used. These nonpolar solvents have been proven in practice. The nonpolar solvent is according to the invention in Substantially transparent to the RF field of MR measurement.

Bevorzugt ist auch eine Verfahrensvariante, bei der die Probenmoleküle Proteine und/oder paramagnetische Moleküle umfassen. Die Untersuchung von Proteinen ist in der Praxis besonders wichtig. Paramagnetische Moleküle sind der ESR zugänglich.Prefers is also a variant of the method in which the sample molecules Proteins and / or paramagnetic molecules include. The Investigation of proteins is particularly important in practice. Paramagnetic molecules are accessible to ESR.

Bevorzugt ist eine Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei der für die Vermessung der effektive Durchmesser DM der molekularen Behälter in einem Bereich 10 nm ≤ DM ≤ 10 μm, vorzugsweise 10 nm ≤ DM ≤ 110 nm, insbesondere DM etwa 30 nm eingestellt ist. Diese Größen von molekularen Behältern haben sich in der Praxis bewährt, insbesondere bei inversen Mizellen.Prefers is a variant of the method according to the invention, when measuring the effective diameter DM the molecular container in a range 10 nm ≦ DM ≦ 10 μm, preferably 10 nm ≤ DM ≤ 110 nm, in particular DM is set to about 30 nm. These sizes of molecular containers have proven themselves in practice, especially with inverse micelles.

Bei einer besonders bevorzugten Verfahrensvariante ist vorgesehen, dass für die Vermessung der effektive Durchmesser DM der molekularen Behälter so eingestellt ist, dass gilt:
DM << ET, mit ET: Eindringtiefe des HF-Feldes im polaren Lösungsmittel. Die Eindringtiefe ET entspricht dabei einem Weg, auf dem eine 1/e-Abschwächung der Intensität des HF-Feldes eintritt (e: Eulersche Zahl, ca. 2, 7183). Dabei gilt bevorzugt 100·DM ≤ ET. Bei dieser Behälterdimensionierung sind Absorptionsverluste durch das polare Lösungsmittel (in der Regel Wasser) besonders gering. Die so definierte ET beträgt in Wasser ca. 0.8 mm im X-Band und 0.25 mm im W-Band und ist damit um ein Vielfaches größer als zum Beispiel der Durchmesser einer inversen Mizelle von einigen 10 Nanometern.In a particularly preferred variant of the method, provision is made for the measurement of the effective diameter DM of the molecular container to be such that the following applies:
DM << ET, with ET: Penetration depth of the RF field in the polar solvent. The penetration depth ET corresponds to a path on which a 1 / e attenuation of the intensity of the RF field occurs (e: Euler number, ca. 2, 7183). In this case, preferably 100 · DM ≦ ET. In this container dimensioning absorption losses by the polar solvent (usually water) are particularly low. The thus defined ET in water is about 0.8 mm in the X-band and 0.25 mm in the W-band and is thus many times larger than, for example, the diameter of an inverse micelle of several tens of nanometers.

Ganz besonders bevorzugt ist eine Verfahrensvariante, bei der als molekulare Behälter inverse Mizellen eingesetzt werden. Bei inversen Mizellen kann die Einstellung von deren Größe (etwa des Durchmessers) bei der Probenpräparation in der Regel auf einfache Weise variiert werden; die Zahl der Probenmoleküle je inverse Mizelle kann dadurch ebenfalls einfach eingestellt werden. Weiterhin können inverse Mizellen relativ kostengünstig hergestellt werden.Very particular preference is given to a process variant in which inverse micelles are used as molecular containers. For inverse micelles, the adjustment of their size (such as diameter) can usually be easily varied during sample preparation; the number of sample molecules per inverse micelle can thereby also easy to set. Furthermore, inverse micelles can be produced relatively inexpensively.

Eine bevorzugte Weiterentwicklung dieser Verfahrensvariante sieht vor, dass als grenzflächenaktive Substanz für die inversen Mizellen

– Na(AOT) = Natrium-2bis(2ethylhexyl)sulfosuccinat
– und/oder CTAB = Hexadecyltrimethylammonium-Bromid

eingesetzt wird. Diese grenzflächenaktiven Substanzen haben sich in der Praxis bewährt. Die grenzflächenaktiven Substanzen besitzen einen polaren Endabschnitt und einen unpolaren Endabschnitt und bilden die Wände der inversen Mizellen aus.A preferred further development of this process variant provides that as a surface-active substance for the inverse micelles

Na (AOT) = sodium 2bis (2ethylhexyl) sulfosuccinate
- and / or CTAB = hexadecyltrimethylammonium bromide

is used. These surfactants have been proven in practice. The surfactants have a polar end portion and a nonpolar end portion and form the walls of the inverse micelles.

Besonders bevorzugt ist auch eine Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei der während der Vermessung die Messemulsion in einem Probengefäß angeordnet wird, wobei das Probengefäß eine kleinste Dimension KD des Probenvolumens aufweist, wobei gilt:
KD ≥ (1/20)·λ, mit λ: Vakuum-Wellenlänge des HF-Feldes. Die kleinste Dimension KD des Probenvolumens (Probenraums) liegt dabei typischerweise in der Richtung parallel zum elektrischen Feld des HF-Felds im Resonator. Ebenso besonders bevorzugt ist eine Verfahrensvariante, bei der während der Vermessung die Messemulsion in einem Probengefäß angeordnet wird, wobei das Probengefäß eine Dimension DPE des Probenvolumens parallel zum elektrischen Feld des HF-Felds aufweist, wobei gilt:
DPE ≥ (1/20)·λ, mit λ: Vakuum-Wellenlänge des HF-Feldes.Particularly preferred is also a variant of the method according to the invention, in which the measuring emulsion is arranged in a sample vessel during the measurement, wherein the sample vessel has a smallest dimension KD of the sample volume, where:
KD ≥ (1/20) · λ, where λ: the vacuum wavelength of the RF field. The smallest dimension KD of the sample volume (sample space) is typically in the direction parallel to the electric field of the RF field in the resonator. Equally particularly preferred is a process variant in which the measurement emulsion is arranged in a sample vessel during the measurement, the sample vessel having a dimension DPE of the sample volume parallel to the electric field of the RF field, where:
DPE ≥ (1/20) · λ, where λ: the vacuum wavelength of the RF field.

Solche Probengefäße können mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erfolgreich und ohne nennenswerte Absorptionsverluste eingesetzt werden. Hingegen würden bei Einsatz herkömmlicher wässriger Proben erhebliche Absorptionsverluste auftreten, da die kleinste Dimension KD bzw. die Dimension DPE parallel zum elektrischen Feld nicht mehr ausreichend klein wäre gegenüber der Wellenlänge λ. Bevorzugt gilt im Rahmen der Erfindung KD ≥ (1/5)·λ oder sogar KD ≥ (1/2)·λ bzw. DPE ≥ (1/5)·λ oder sogar DPE (1/2)·λ; dann können auch sehr große Probenräume eingerichtet und entsprechend große Probenmengen vermessen werden.Such Sample containers can with the inventive Procedure successful and without significant absorption losses be used. On the other hand would be when using conventional aqueous samples considerable absorption losses occur because the smallest dimension KD or the dimension DPE parallel to the electrical Field no longer sufficiently small would be opposite the wavelength λ. Preferably applies in the context of Invention KD ≥ (1/5) · λ or even KD ≥ (1/2) · λ or DPE ≥ (1/5) · λ or even DPE (1/2) · λ; then you can also have very large sample rooms set up and measure correspondingly large sample quantities become.

In den Rahmen der vorliegenden Erfindung fällt auch eine Verwendung einer Emulsion, umfassend ein unpolares Lösungsmittel und im unpolaren Lösungsmittel verteilte molekulare Behälter, insbesondere inverse Mizellen, wobei in den molekularen Behältern Moleküle eingeschlossen sind, insbesondere in wässriger Lösung, als zu vermessende Probe in einer Magnetresonanz-Messung.In The scope of the present invention also includes a use an emulsion comprising a non-polar solvent and molecular containers distributed in the non-polar solvent, especially inverse micelles, being in the molecular containers Molecules are included, especially in aqueous Solution, as a sample to be measured in a magnetic resonance measurement.

Weitere Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der Beschreibung und der Zeichnung. Ebenso können die vorstehend genannten und die noch weiter ausgeführten Merkmale erfindungsgemäß jeweils einzeln für sich oder zu mehreren in beliebigen Kombinationen Verwendung finden. Die gezeigten und beschriebenen Ausführungsformen sind nicht als abschließende Aufzählung zu verstehen, sondern haben vielmehr beispielhaften Charakter für die Schilderung der Erfindung.Further Advantages of the invention will become apparent from the description and the Drawing. Likewise, the above and the still further features according to the invention in each case individually for yourself or for several in any combination use Find. The embodiments shown and described are not meant to be an exhaustive list but rather have exemplary character for the Description of the invention.

Zeichnung und detaillierte Beschreibung der ErfindungDrawing and detailed description the invention

Die Erfindung ist in der Zeichnung dargestellt und wird anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert. Es zeigt:The The invention is illustrated in the drawing and is based on embodiments explained in more detail. It shows:

1 eine schematische Darstellung einer Messemulsion gemäß der Erfindung; 1 a schematic representation of a measuring emulsion according to the invention;

2 eine schematische Darstellung eines Messaufbaus für das erfindungsgemäße Verfahren. 2 a schematic representation of a measurement setup for the inventive method.

3a ein EPR-Spektrum einer Probe (a) mit paramagnetischen Probenmolekülen in einer Messemulsion gemäß der Erfindung; 3a an EPR spectrum of a sample (a) with paramagnetic sample molecules in a measuring emulsion according to the invention;

3b ein EPR-Spektrum einer Probe (b) mit paramagnetischen Probemolekülen in einer wässrigen Probe, bei gleicher Stoffmenge an Probenmolekülen und gleichem Probengefäß wie bei der Messung von 3a; 3b an EPR spectrum of a sample (b) with paramagnetic sample molecules in an aqueous sample, with the same amount of substance in sample molecules and the same sample vessel as in the measurement of 3a ;

4 ein EPR-Spektrum einer Probe (c) mit paramagnetischen Probenmolekülen in einer Messemulsion gemäß der Erfindung; 4 an EPR spectrum of a sample (c) with paramagnetic sample molecules in a measuring emulsion according to the invention;

5 ein EPR-Spektrum einer Probe (d) mit paramagnetischen Probenmolekülen in einer Messemulsion gemäß der Erfindung. 5 an EPR spectrum of a sample (d) with paramagnetic sample molecules in a measuring emulsion according to the invention.

Die vorliegende Erfindung beschäftigt sich mit der Verbesserung der Vermessbarkeit von in polaren Lösungsmitteln (und insbesondere in Wasser) löslichen Probenmolekülen im Rahmen von Magnetresonanz-Messungen wie ESR und NMR.The The present invention is concerned with the improvement the measurability of in polar solvents (and in particular in water) soluble sample molecules in the frame from magnetic resonance measurements such as ESR and NMR.

Wasser absorbiert die für MR-Messungen erforderlichen HF-Felder, was die Vermessung von wässrigen Proben erschwert, insbesondere das SNR verschlechtert, oder gar eine Vermessung der wässrigen Probe unmöglich macht. Gleiches gilt bei Verwendung vieler anderer polarer Lösungsmittel (einschließlich Gemische verschiedener polarer Lösungsmittel); im Folgenden wird zur Vereinfachung stellvertretend nur noch auf Wasser Bezug genommen.water absorbs the RF fields required for MR measurements, which makes the measurement of aqueous samples difficult, in particular the SNR deteriorates, or even a measurement of the aqueous Sample impossible. The same applies when using many other polar solvents (including Mixtures of various polar solvents); hereinafter is for convenience only representative on water taken.

Wird Wasser in einem HF-Resonator angeordnet, so sinkt die Resonatorgüte ab. Aufgrund dielektrischer Verluste gilt bei einem üblichen, mit einer wässrigen Probe gefüllten Probenröhrchen mit Innenradius r 1/QE ~ rm wobei Q_E der Güteanteil des Resonators aufgrund dielektrischer Verluste ist, und m eine natürliche Zahl ist. Bei einem zylindrischen Probenröhrchen in einem TE₁₀₂ Resonator (ein Rechteckresonator) beträgt beispielsweise m = 4. Grundsätzlich können Güteverluste durch einen kleineren Innenradius des Probenröhrchens verringert werden; gleichzeitig sinkt dabei aber das Volumen an vermessbarer Probe. Bei Anordnung von mehreren Probenröhrchen im Resonator kann das vermessbare Probenvolumen wiederum gesteigert werden (Mehrfachkapillaranordung), was aber apparativ aufwändig ist. Außerdem kann der Innenradius von Probenröhrchen nur in einem begrenzten Bereich gefertigt werden.Is water in an RF resonator attached orders, then the resonator quality decreases. Due to dielectric losses, in a conventional sample tube filled with an aqueous sample with inner radius r 1 / Q e ~ r m where Q _{E is} the part of the resonator due to dielectric loss, and m is a natural number. For example, for a cylindrical sample tube in a TE ₁₀₂ resonator (a rectangular resonator), m = 4. Basically, quality losses can be reduced by having a smaller inner radius of the sample tube; At the same time, however, the volume of measurable sample drops. If several sample tubes are arranged in the resonator, the measurable sample volume can in turn be increased (multiple capillary arrangement), which is expensive in terms of apparatus. In addition, the inner radius of sample tubes can be made only in a limited range.

Die Erfindung schlägt hingegen vor, wasserlösliche Probenmoleküle in einer besonderen Art der Aufbereitung der Proben zu vermessen. Als Basis dafür wird ein unpolares Lösungsmittel eingesetzt. Um die wasserlöslichen Probenmoleküle in dem unpolaren Lösungsmittel verteilen zu können, werden die Probenmoleküle in molekularen Behältern eingeschlossen. Im Inneren des molekularen Behälters befindet sich dazu ein Hohlraum, der ein oder mehrere Probenmoleküle in der Regel zusammen mit etwas Wasser aufnehmen kann. Die Wandung des molekularen Behälters wird gebildet durch ein Molekül oder mehrere zusammengelagerte Moleküle. Diese molekularen Behälter sind im unpolaren Lösungsmittel gut (d. h. gleichmäßig) verteilbar, in der Regel aufgrund ihrer äußeren Oberflächeneigenschaften.The In contrast, the invention proposes water-soluble Sample molecules in a special kind of preparation to measure the samples. The basis for this is a non-polar one Solvent used. To the water-soluble Sample molecules in the nonpolar solvent be able to distribute the sample molecules included in molecular containers. Inside the Molecular container is to a cavity, the one or more sample molecules usually together can absorb with a little water. The wall of the molecular container is formed by one or more molecules Molecules. These molecular containers are non-polar Solvent good (i.e., uniform) distributable, usually due to their external Surface properties.

Eine Probe, die bereit ist für eine Vermessung in einem erfindungsgemäßen Verfahren zeigt schematisch die 1 anhand eines Beispiels basierend auf inversen Mizellen als molekulare Behälter.A sample ready for measurement in a method according to the invention schematically shows the 1 by way of example based on inverse micelles as molecular containers.

Die zu vermessenden wasserlöslichen Probenmoleküle 1, beispielsweise paramagnetische Proteinmoleküle, sind in sogenannten inversen Mizellen 2 eingeschlossen. Die inversen Mizellen 2 enthalten außer den Probenmolekülen 1 auch Wasser. Das Innere der inversen Mizellen 2 ist also von einer wässrigen Lösung der Probenmoleküle 1 erfüllt. Die inversen Mizellen 2 sind wiederum in einem unpolaren Lösungsmittel 3 verteilt. Unpolares Lösungsmittel 3 liegt also nur außerhalb der inversen Mizellen 2 vor. Die Gesamtheit von unpolarem Lösungsmittel 3 und den darin verteilten inversen Mizellen 2 wird als Messemulsion 4 bezeichnet.The water-soluble sample molecules to be measured 1 For example, paramagnetic protein molecules are in so-called inverse micelles 2 locked in. The inverse micelles 2 contain except the sample molecules 1 also water. The inside of the inverse micelles 2 is therefore from an aqueous solution of the sample molecules 1 Fulfills. The inverse micelles 2 are again in a nonpolar solvent 3 distributed. Nonpolar solvent 3 So it's just outside the inverse micelles 2 in front. The totality of nonpolar solvent 3 and the inverse micelles distributed therein 2 is used as a mess emulsion 4 designated.

Die Messemulsion 4 wird für die MR-Messung als Probe im Probenvolumen (Probenraum) eines Probengefäßes angeordnet (siehe dazu auch 2); der Rand des Probengefäßes ist in 1 mit Bzz. 5 versehen.The measuring emulsion 4 is arranged for the MR measurement as a sample in the sample volume (sample space) of a sample vessel (see also 2 ); the edge of the sample vessel is in 1 with Bzz. 5 Mistake.

Die inversen Mizellen 2 weisen jeweils eine Wand auf, die gebildet wird durch eine Vielzahl von Molekülen einer grenzflächenaktiven Substanz 6. Die Moleküle der grenzflächenaktiven Substanz 6 weisen jeweils einen nach innen gerichteten, hydrophilen Endabschnitt („Kopf", in 1 als Kreis dargestellt) und einen nach außen gerichteten, hydrophoben Endabschnitt („Schwanz", in 1 als Wellenlinie dargestellt) auf. Die Köpfe werden beispielsweise durch Carboxylat-Gruppen ausgebildet, die Schwänze werden beispielsweise durch Alkyl-Gruppen ausgebildet.The inverse micelles 2 each have a wall formed by a plurality of molecules of a surfactant 6 , The molecules of the surfactant 6 each have an inwardly directed, hydrophilic end portion ("head", in FIG 1 shown as a circle) and an outwardly directed, hydrophobic end portion ("tail", in FIG 1 shown as a wavy line). The heads are formed for example by carboxylate groups, the tails are formed for example by alkyl groups.

Die Moleküle der grenzflächenaktiven Substanz 6 lagern sich bei geeigneten Bedingungen, insbesondere Mischungsverhältnissen, spontan (von selbst) zu inversen Mizellen 2 zusammen, wobei sie das vorhandene Wasser und die darin gelösten Probenmoleküle 1 in ihrem Inneren einschließen. Man beachte, dass die Anzahl der Probenmoleküle 1, die in jeweils einer inversen Mizelle 2 eingeschlossen ist, von der Größe der inversen Mizelle 2 abhängt. Die Größe der inversen Mizellen 2 kann durch an sich bekannte Maßnahmen eingestellt werden, insbesondere die Auswahl des unpolaren Lösungsmittels 3, der grenzflächenaktiven Substanz 6, den Mischungsverhältnissen in der Messemulsion 4, und mechanischer Behandlung der Messemulsion. Die Größe der inversen Mizellen 2 wird im Rahmen der Erfindung durch den effektiven Durchmesser DM beschrieben; im Falle einer nicht vernachlässigbaren Wandstärke wird DM als der Innendurchmesser der inversen Mizelle (bzw. des molekularen Behälters) bestimmt (siehe 1).The molecules of the surfactant 6 store under suitable conditions, especially mixing ratios, spontaneously (by itself) to inverse micelles 2 together, where they are the existing water and the sample molecules dissolved therein 1 to include in their interior. Note that the number of sample molecules 1 , each in an inverse micelle 2 is included, the size of the inverse micelle 2 depends. The size of the inverse micelles 2 can be adjusted by measures known per se, in particular the selection of the nonpolar solvent 3 , the surfactant 6 , the mixing ratios in the emulsion 4 , and mechanical treatment of the emulsion. The size of the inverse micelles 2 is described in the context of the invention by the effective diameter DM; in the case of a non-negligible wall thickness, DM is determined as the internal diameter of the inverse micelle (or of the molecular container) (see 1 ).

In der Regel stehen die zu vermessenden Probenmoleküle 1 zunächst als reine wässrige Lösung (Probenmoleküle in Wasser gelöst) zur Verfügung, und werden im Rahmen der Erfindung insbesondere durch Zusatz von unpolarem Lösungsmittel 3 und grenzflächenaktiver Substanz 6 in eine Messemulsion 4 überführt.As a rule, the sample molecules to be measured stand 1 initially as a pure aqueous solution (sample molecules dissolved in water) available, and are in the context of the invention, in particular by the addition of nonpolar solvent 3 and surfactant 6 in a measuring emulsion 4 transferred.

Man beachte, dass für die erfindungsgemäße Vermessung die Probenmoleküle 1 in lokal wässriger Umgebung, nämlich innerhalb der inversen Mizellen 2, verbleiben können. Dies ist insbesondere von Vorteil, wenn die Probenmoleküle 1 durch einen Entzug des Wassers verändert oder zerstört werden würden.Note that for the measurement of the invention, the sample molecules 1 in locally aqueous environment, namely within the inverse micelles 2 , can remain. This is particularly advantageous when the sample molecules 1 would be changed or destroyed by withdrawal of the water.

2 zeigt schematisch einen Messaufbau für die erfindungsgemäße Vermessung der magnetischen Resonanz wasserlöslicher Probenmoleküle. 2 schematically shows a measurement setup for the inventive measurement of the magnetic resonance of water-soluble sample molecules.

Die zu vermessenden wasserlöslichen Probenmoleküle sind erfindungsgemäß in einer Messemulsion verteilt, welche als Probe 14 in das Probenvolumen (den Probenraum) 11 eines Probengefäßes 12 eingefüllt ist. Das Probengefäß 12 ist in einem Resonator 13 angeordnet, der ein Hochfrequenz(=HF)-Feld in die Probe 14 einstrahlen kann. Das HF-Feld umfasst ein elektrisches Feld E_HF, welches sich in 2 in Pfeilrichtung 15 von links nach rechts erstreckt, und ein magnetisches Feld B_HF, welches sich von unten nach oben erstreckt, vgl. Pfeilrichtung 16. Man beachte, dass das HF-Feld im Resonator 13 als eine räumliche stehende Welle vorliegt, bei der das Maximum von B_HF dem Minimum von E_HF entspricht. (Anmerkung. Eine konventionelle wässrige Probe kann nur im Minimum von E_HF positioniert werden und wird dadurch in ihrer Größe stark eingeschränkt.)The water-soluble sample molecules to be measured according to the invention are in a trade fair mulsion distributed, which as a sample 14 into the sample volume (the sample space) 11 a sample vessel 12 is filled. The sample vessel 12 is in a resonator 13 arranged a high frequency (= HF) field in the sample 14 can radiate. The RF field comprises an electric field E _HF , which is located in 2 in the direction of the arrow 15 extending from left to right, and a magnetic field B _HF extending from the bottom to the top, cf. arrow 16 , Note that the RF field in the resonator 13 is present as a spatial standing wave wherein the maximum of B _HF corresponds to the minimum of E _HF. (Note: A conventional aqueous sample can only be positioned in the minimum of E _HF , which greatly limits its size.)

Das Probengefäß 12 ist röhrchenförmig mit einem kreisrunden Querschnitt (senkrecht zur Zeichenebene von 2) aufgebaut. Der Probenraum 11 weist somit insbesondere parallel der Pfeilrichtung 15 seine kleinste Dimension KD auf. Diese kleinste Dimension KD ist im gezeigten Messaufbau identisch mit der Dimension DPE des Probenraums 11 gemessen parallel zur Richtung 15 des elektrischen Feldes E_HF.The sample vessel 12 is tubular with a circular cross section (perpendicular to the plane of 2 ) built up. The rehearsal room 11 Thus, in particular, has the direction of the arrow in parallel 15 his smallest dimension KD on. In the measurement setup shown, this smallest dimension KD is identical to the dimension DPE of the sample space 11 measured parallel to the direction 15 of the electric field E _HF .

Der Resonator 13 strahlt beispielsweise im Rahmen einer ESR-Messung ein HF-Feld mit einer Frequenz von 100 GHz in die Probe 14 ein. Die Vakuumwellenlänge λ des HF-Felds beträgt dann ca. 3 mm. Als Probengefäß 12 wird im Rahmen der Erfindung ein Röhrchen mit einem Innendruchmesser von 1 mm eingesetzt, so dass in diesem Fall gilt KD ≈ λ/3 bzw. DPE ≈ λ/3. Obwohl die Dimension des Probenraums 11 parallel zum elektrischen Feld nicht mehr als klein gegenüber der Wellenlänge λ des HF-Felds angesehen werden kann, sind durch die erfindungsgemäße Probenaufbereitung MR-Messungen an der Probe 14 gut möglich. Insbesondere absorbiert das in der Probe enthaltene unpolare Lösungsmittel das HF-Feld nur unwesentlich.The resonator 13 For example, in the context of an ESR measurement, an RF field with a frequency of 100 GHz radiates into the sample 14 one. The vacuum wavelength λ of the RF field is then about 3 mm. As a sample vessel 12 In the context of the invention, a tube with an inner diameter of 1 mm is used, so that in this case KD ≈ λ / 3 or DPE ≈ λ / 3 applies. Although the dimension of the sample space 11 parallel to the electric field can no longer be regarded as small compared to the wavelength λ of the RF field, are by the sample preparation according to the invention MR measurements on the sample 14 quite possible. In particular, the nonpolar solvent contained in the sample absorbs the RF field only insignificantly.

Die verbesserten Vermessungsmöglichkeiten der magnetischen Resonanz wasserlöslicher Probenmoleküle durch die Erfindung im Vergleich zum Stand der Technik verdeutlichen ESR-Vergleichsmessungen, die in den 3a und 3b dargestellt sind.The improved measurement capabilities of the magnetic resonance of water-soluble sample molecules by the invention compared to the prior art illustrate ESR comparative measurements, which in the 3a and 3b are shown.

Folgende Abkürzungen werden verwendet:

NaAOT:: Natrium-2bis(2-ethylhexyl)sulfosuccinat
GdDTPA:: Gadolinium-Diethylen-Triamin-Pentaacetat
EPR:: Elektronen-paramagnetische Resonanz (electron paramagnetic resonance)

The following abbreviations are used:

NaAOT:: Sodium 2bis (2-ethylhexyl) sulfosuccinate
GdDTPA:: Gadolinium diethylene triamine pentaacetate
EPR:: Electron paramagnetic resonance (electron paramagnetic resonance)

I. Herstellung der erfindungsgemäßen Probe (a)I. Preparation of the Inventive Sample (a)

In Isooktan als unpolarem Lösungsmittel wurde NaAOT als grenzflächenaktive Substanz unter starkem Schütteln zugesetzt, bis eine völlig transparente Mikroemulsion mit einer Konzentration von 200 Millimol NaAOT pro Liter Isooktan erhalten wurde. Weiterhin wurde GdDTPA als paramagnetisches Probenmaterial in Wasser gelöst; hierbei wurde mit verdünnter Natronlauge (NaOH) ein pH von 7,2 und weiterhin eine Konzentration von 3,81 Millimol GdDTPA pro Liter Wasser eingestellt. 200 μl der wässrigen GdDTPA-Lösung wurden zu 2 ml der Mikroemulsion zugesetzt, und die neue Mikroemulsion wurde geschüttelt, bis völlige Transparenz erreicht war. Die geschüttelte neue Mikroemulsion dient als Messemulsion. Es ergibt sich eine Konzentration von 346 Mikromol GaDTPA pro Liter Messemulsion.In Isooctane as a nonpolar solvent was NaAOT as a surfactant Add substance with vigorous shaking until completely transparent microemulsion with a concentration of 200 millimoles NaAOT per liter of isooctane was obtained. Furthermore, GdDTPA as paramagnetic sample material dissolved in water; in this connection was with dilute sodium hydroxide solution (NaOH) a pH of 7.2 and further a concentration of 3.81 millimoles of GdDTPA per liter Water adjusted. 200 μl of the aqueous GdDTPA solution were added to 2 ml of the microemulsion and the new microemulsion was shaken until complete transparency was achieved was. The shaken new microemulsion serves as a measuring emulsion. The result is a concentration of 346 micromoles of GaDTPA per liter Measuring emulsion.

Aufgrund der Löslichkeitseigenschaften der wässrigen Lösung in der Mikroemulsion befinden sich die Moleküle des paramagnetischen Probenmaterials anschließend innerhalb von inversen AOT-Mizellen.by virtue of the solubility properties of the aqueous solution in the microemulsion are the molecules of paramagnetic Sample material subsequently within inverse AOT micelles.

II. Herstellung der Vergleichsprobe (b)II. Preparation of the comparative sample (b)

GdDTPA wurde in Wasser gelöst, bis eine Konzentration von 346 Mikromol pro Liter Wasser erreicht war. Diese wässrige GdDTPA-Lösung wird für die Vergleichsprobe verwendet.GdDTPA was dissolved in water until a concentration of 346 Micromoles per liter of water was reached. This watery GdDTPA solution is used for the comparison sample.

III. VergleichsmessungIII. comparative measurement

Baugleiche Probenkapillaren mit einem Innendurchmesser von 1 mm wurden mit jeweils gleichen Volumina der Messemulsion (Probe (a)) und der wässriger GdDTPA-Lösung (Probe (b)) vollständig gefüllt.identical Sample capillaries with an inner diameter of 1 mm were with each equal volumes of Messemulsion (sample (a)) and the aqueous GdDTPA solution (sample (b)) completely filled.

Von beiden Proben (a) und (b) wurden sodann EPR-Messungen im X-Band (ca. 9,8 GHz) durchgeführt.From Both samples (a) and (b) then became EPR measurements in the X-band (about 9.8 GHz).

Das Ergebnis der beiden Messungen ist in den Diagrammen der 3a und 3b dargestellt. Es ist jeweils in identischem Maßstab nach rechts das statische Magnetfeld B₀ in Gauß, und nach oben die Intensität des EPR-Signals aufgetragen.The result of the two measurements is in the diagrams of 3a and 3b shown. The static magnetic field B ₀ in Gauss is applied to the right in each case on an identical scale, and the intensity of the EPR signal is plotted upwards.

Das EPR-Signal der erfindungsgemäß präpariert vermessenen Probe (a) (Messemulsion) ist ca. 5-mal stärker als das EPR-Signal der Vergleichsprobe (b) (wässrige Probe), obwohl in beiden Proben (a) und (b) identische Stoffmengen der paramagnetischen Probenmoleküle vorliegen. Durch die erfindungsgemäße Propenpräparation kann also das SNR deutlich verbessert werden.The EPR signal prepared according to the invention Measured sample (a) (measuring emulsion) is about 5 times stronger as the EPR signal of the comparative sample (b) (aqueous sample), although in both samples (a) and (b) identical molar amounts of the paramagnetic Sample molecules are present. By the invention Propene preparation can thus significantly improve the SNR become.

Die 4 und 5 zeigen ebenfalls die Verbesserungen in der Vermessung wässriger Probenmoleküle durch die Erfindung anhand der Proben (c) und (d).The 4 and 5 also show the Improvements in the measurement of aqueous sample molecules by the invention using samples (c) and (d).

Die Messemulsion für die Proben (c) und (d) wurden analog Probe (a) präpariert, wobei jedoch abweichend 400 μl (statt 200 μl) von wässriger GaDTPA-Lösung in 2 ml Mikroemulsion gelöst wurden. Es ergibt sich eine Konzentration von 635 Mikromol GdDTPA pro Liter Messemulsion.The Messemulsion for the samples (c) and (d) were analog sample (a) prepared, but deviating 400 ul (instead of 200 μl) of aqueous GaDTPA solution were dissolved in 2 ml of microemulsion. It results in a Concentration of 635 micromoles of GdDTPA per liter of emulsion emulsion.

Mit dieser Messemulsion wurde für Probe (c) in ein Probenröhrchen mit 3 mm Innendurchmesser befüllt, und für Probe (d) wurde eine Kapillare mit 1 mm Innendurchmesser befüllt. An Probe (c) wurde eine EPR-Messung im X-Band (ca. 9,8 GHz) durchgeführt, und an Probe (d) wurde eine EPR-Messung im Q-Band (34 GHz) durchgeführt.With This mess emulsion was for sample (c) in a sample tube filled with 3 mm inner diameter, and for sample (d) a capillary was filled with 1 mm inner diameter. On sample (c) an EPR measurement in the X-band (about 9.8 GHz) was performed, and on sample (d) an EPR measurement in the Q band (34 GHz) was performed.

Die erfindungsgemäß präpariert vermessenen Proben (c), siehe 4, und (d), siehe 5, gestatten beide eine qualitativ akzeptable Vermessung des EPR-Signals der enthaltenen paramagnetischen Probenmoleküle. Es ist wiederum nach rechts das statische Magnetfeld B₀ nach oben die Signalintensität aufgetragen.The samples prepared according to the invention (c), see 4 , and (d), see 5 Both allow a qualitatively acceptable measurement of the EPR signal of the contained paramagnetic sample molecules. Again, to the right, the static magnetic field B _{0 is} plotted up the signal intensity.

Hingegen haben die Erfinder festgestellt, dass reine wässrige Proben (GdDTPA gelöst in Wasser) mit gleicher Konzentration von 635 Mikromol GdPTDA pro Liter Wasser unter sonst gleichen Bedingungen (bezüglich Probe (c): Röhrchen-Innendurchmesser 3 mm und X-Band, bezüglich Probe (d): Kapillar-Innendurchmesser 1 mm und Q-Band) keine EPR-Messungen mehr erlauben. Unter den Bedingungen von Probe (c) zerstört die große Wassermenge die EPR-Tauglichkeit des Resonators. Unter den Bedingungen von Probe (d) macht sich die mit zunehmender Messfrequenz abnehmende Wasserverträglichkeit des Resonators bemerkbar.On the other hand The inventors have found that pure aqueous samples (GdDTPA dissolved in water) with equal concentration of 635 micromoles of GdPTDA per liter of water under otherwise identical conditions (regarding sample (c): tube inner diameter 3 mm and X-band, with respect to sample (d): capillary inner diameter 1 mm and Q-band) no longer allow EPR measurements. Under the conditions of sample (c) the large amount of water destroys the EPR suitability of the resonator. Under the conditions of sample (d) the decreasing water compatibility as the measuring frequency increases the resonator noticeable.

Mit dem erfindungsgemäßen Messverfahren können bei den üblichen Frequenzen des HF-Felds (etwa in der ESR im Bereich ca. 1–100 GHz) konventionelle Probengefäße und Resonatoren eingesetzt werden, oder auch höhere Messfrequenzen als bisher üblich (etwa in der ESR im Bereich ca. 100–600 GHz) für wasserlösliche Probenmoleküle erschlossen werden. Besonders bei gekoppelten ESR/NMR-Experimenten sind oft hohe HF-Feldfrequenzen einzustrahlen, beispielsweise beträgt beim B₀-Feld eines 400 MHz NMR-Magneten die entsprechende ESR-Einstrahlfrequenz 263 GHz. Bei Übergang zu leistungsstärkeren NMR-Magneten (wie etwa 800 MHz oder 1000 MHz) muss dann die Probe auch entsprechend höhere ESR-Einstrahlfrequenzen für gekoppelte ESR/NMR-Frequenzen geeignet sein, um von der Kopplung voll zu profitieren. Dies kann mit der vorliegenden Erfindung geleistet werden.With the measuring method according to the invention conventional sample vessels and resonators can be used at the usual frequencies of the RF field (for example in the ESR in the range about 1-100 GHz), or even higher measurement frequencies than previously customary (for example in the ESR in the range ca. 100-600 GHz) for water-soluble sample molecules. Particularly in coupled ESR / NMR experiments, high RF field frequencies are often to be irradiated; for example, in the B ₀ field of a 400 MHz NMR magnet, the corresponding ESR irradiation frequency is 263 GHz. When transitioning to more powerful NMR magnets (such as 800 MHz or 1000 MHz), then the sample must also be capable of correspondingly higher ESR beam frequencies for coupled ESR / NMR frequencies to take full advantage of the coupling. This can be done with the present invention.

Zusammenfassend beschreibt die Erfindung eine Präparation von wasserlöslichem Probenmaterial, das einer Magnetresonanz-Messung unterzogen werden soll. Im Rahmen der Präparation wird das Probenmaterial in wässriger Lösung in molekularen Behältern eingeschlossen. Bevorzugt werden als molekulare Behälter inverse Mizellen eingesetzt. Hierbei wird das Probenmaterial in einer kleinen Menge Wasser gelöst und zusammen mit einer grenzflächenaktiven Substanz (Tensid) in ein unpolares, für die HF-Felder der MR-Messung transparentes Lösungsmittel gegeben. Es stellen sich inverse Mizellen ein, deren Wand durch das Tensid gebildet wird. Im Inneren der inversen Mizellen ist das wasserlösliche Probenmaterial zusammen mit der geringen Menge Wasser eingeschlossen, und die inversen Mizellen sind ihrerseits im unpolaren Lösungsmittel gelöst. Eine solchermaßen präparierte erfindungsgemäße Probe wird der Vermessung unterzogen. Durch die erfindungsgemäße Probenpräparation kann das SNR von MR-Messungen verglichen mit Probenmaterial in reiner Wasserlösung erheblich gesteigert werden. Insbesondere kann mehr Probenraum im Resonator eingerichtet werden, ohne dass Güteverluste des Resonators die Vermessbarkeit beeinträchtigen würden.In summary the invention describes a preparation of water-soluble Sample material subjected to magnetic resonance measurement should. As part of the preparation, the sample material in aqueous solution in molecular containers locked in. Preferred are molecular containers used inverse micelles. Here, the sample material is in a small amount of water dissolved and together with a surfactant Substance (surfactant) in a non-polar, for the RF fields of the MR measurement given transparent solvent. Put it inverse micelles whose wall is formed by the surfactant. Inside the inverse micelles is the water-soluble Enclosed sample material together with the small amount of water, and the inverse micelles are themselves in the non-polar solvent solved. Such a prepared Inventive sample is subjected to the measurement. By the sample preparation according to the invention The SNR of MR measurements can be compared to sample material in pure Water solution can be increased significantly. Especially can more sample space in the resonator be set up without quality losses of the resonator would affect the measurability.

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Claims

Method for measuring the magnetic resonance of sample molecules soluble in a polar solvent ( 1 ), with an electromagnetic radio frequency (= HF) field on the sample molecules ( 1 ), characterized in that the sample molecules ( 1 ) during the measurement in a measuring emulsion ( 4 ), wherein in the emulsion ( 4 ) the sample molecules ( 1 ) in molecular containers, and the molecular containers in a nonpolar solvent ( 3 ) are distributed.

Method according to claim 1, characterized in that that the polar solvent is water.

Method according to one of claims 1 or 2, characterized in that the molecular container each exactly one sample molecule ( 1 ) contain.

Method according to one of claims 1 or 2, characterized in that the molecular containers each have a plurality of sample molecules ( 1 ) dissolved in the polar solvent.

Method according to one of the preceding claims, characterized in that the polar solvent and / or the non-polar solvent ( 3 ) are deuterated, in particular where the polar solvent and / or the non-polar solvent ( 3 ) are completely deuterated.

Method according to one of the preceding claims, characterized in that the measurement of the magnetic resonance a - Electron spin resonance (= ESR) measurement - and or a nuclear magnetic resonance (= NMR) measurement includes.

Method according to Claim 6, characterized that the measurement of the magnetic resonance a - electron-nuclear double resonance (= ENDOR) measurement - and or a dynamic nuclear spin polarization (= DNP) measurement includes.

Method according to one of the preceding claims, characterized in that as nonpolar solvent ( 3 ) Iso-octane, benzene, toluene, carbon tetrachloride, chloroform, mineral oil and / or silicone oil is used.

Method according to one of the preceding claims, characterized in that the sample molecules ( 1 ) Comprise proteins and / or paramagnetic molecules.

Method according to one of the preceding claims, characterized in that for the measurement of the effective Diameter DM of the molecular containers in one area 10 nm ≦ DM ≦ 10 μm, preferably 10 nm ≦ DM ≦ 100 nm, in particular DM is set about 30 nm.

Method according to one of the preceding claims, characterized in that for the measurement of the effective Diameter of DM molecular containers so set is that applies: DM << ET, with ET: penetration depth of the RF field in the polar solvent.

Method according to one of the preceding claims, characterized in that as molecular containers inverse micelles ( 2 ) are used.

A method according to claim 12, characterized in that as surface-active substance ( 6 ) for the inverse micelles ( 2 ) - Na (AOT) = sodium 2bis (2ethylhexyl) sulfosuccinate - and / or CTAB = hexadecyltrimethylammonium bromide is used.

Method according to one of the preceding claims, characterized in that, during the measurement, the measuring emulsion ( 4 ) in a sample vessel ( 12 ), the sample vessel ( 12 ) a smallest dimension KD of the sample volume ( 11 ), where: KD ≥ (1/20) · λ, where λ: vacuum wavelength of the RF field.

Method according to one of the preceding claims, characterized in that, during the measurement, the measuring emulsion ( 4 ) in a sample vessel ( 12 ), the sample vessel ( 12 ) a dimension DPE of the sample volume ( 11 ) parallel to the electric field of the RF field, where: DPE ≥ (1/20) · λ, where λ: is the vacuum wavelength of the RF field.

Use of an emulsion ( 4 ) comprising a non-polar solvent ( 3 ) and in the non-polar solvent ( 3 ) distributed molecular containers, in particular inverse micelles ( 2 ), where in the molecular containers molecules ( 1 ), especially in aqueous solution, as the sample to be measured ( 14 ) in a magnetic resonance measurement.