DE102007030320A1

DE102007030320A1 - Laser micro-dissection involves placing biological object on carrier, which has biological material, by which biological object is to be separated

Info

Publication number: DE102007030320A1
Application number: DE102007030320A
Authority: DE
Inventors: Carsten LÜTHY; Reinold Wischnewski
Original assignee: PALM Microlaser Technologies GmbH
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date: 2007-06-29
Filing date: 2007-06-29
Publication date: 2009-01-02
Anticipated expiration: 2027-06-30
Also published as: DE102007030320B4

Abstract

Laser micro-dissection involves placing a biological object on a carrier (104), which has a biological material, by which the biological object is to be separated. A laser beam is produced with a laser source (103). The biological object, which is to be separated from the biological material, is irradiated automatically by multiple laser pulses. The laser pulses are irradiated on an identical range of the carrier in order to transport the biological object by a laser-induced transportation. Independent claims are included for: (1) a laser micro-dissection system, which comprises a laser source and a holder for receiving a carrier with a biological material; and (2) a computer readable storage medium, in which a control program is stored for computerized controlling of a laser micro-dissection system.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Laser-Mikrodissektionsverfahren und ein Laser-Mikrodissektionssystem. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Laser-Mikrodissektionsverfahren zum Separieren eines biologischen Objekts von einem biologischen Material, sowie ein Laser-Mikrodissektionssystem zum Durchführen des Laser-Mikrodissektionsverfahrens.The The present invention relates to a laser microdissection method and a laser microdissection system. In particular, the The present invention provides a laser microdissection method for separating a biological object of a biological material, as well a laser microdissection system for performing the laser microdissection method.

Mit einem Laser-Mikrodissektionssystem ist es möglich, ein biologisches Objekt von einer umgebenden biologischen Materie zu separieren, und zu einer Auffangvorrichtung zu transportieren. Der selektive Transport und das Auffangen des biologischen Objekts in einem Rezipienten ermöglichen eine Aufbewahrung, Weiterverarbeitung oder Analyse ausgewählter biologischer Objekte. So ist es beispielsweise möglich, Zellen mit einer besonderen Morphologie für eine Analyse gezielt zu isolieren.With It is possible to use a laser microdissection system biological object from a surrounding biological matter too to separate and transport to a collecting device. Of the selective transport and the capture of the biological object in a recipient allow a storage, further processing or analysis of selected biological objects. So is For example, it is possible to have cells with a particular morphology to selectively isolate for an analysis.

Als ein herkömmliches Verfahren zum Separieren von biologischen Objekten ist die Manipulation der biologischen Objekte mit einer Mikropipette bekannt. Jedoch ist dafür eine aufwändige Halterungsvorrichtung nötig, um die Mikropipette präzise zu platzieren. Auch erfolgt die Manipulation eines biologischen Objekts mit einer Mikropipette weder steril noch berührungslos. Weiterhin ist es mit einer solchen Technik überaus schwierig, Zellen beispielsweise aus einem histologischen Gewebepräparat zu lösen.When a conventional method for separating biological Objects is the manipulation of biological objects with a Micropipette known. However, this is an elaborate Retaining device needed to precise the micropipette to place. Also, the manipulation of a biological Object with a micropipette neither sterile nor non-contact. Furthermore, it is extremely difficult with such a technique For example, cells from a histological tissue preparation to solve.

In der WO 97/29355 A1 der Anmelderin wird ein Verfahren und eine Vorrichtung zur berührungslosen Mikroinjektion sowie zum Sortieren und zur Gewinnung von planar aufgebrachten biologischen Objekten mit Laserstrahlen beschrieben. Mit diesem Verfahren können aus einer sehr großen Anzahl von Objekten einzelne Objekte räumlich abgetrennt und aussortiert werden, insbesondere biologische Objekte. Die biologischen Objekte befinden sich auf einer Trägerfolie. Bei dem Verfahren wird ein Bereich der Trägerfolie mit einem Laserstrahl ausgeschnitten, auf dem sich das selektierte biologische Objekt befindet, und dieser Bereich wird durch Einstrahlen eines Laserpulses zu einem Rezipienten transportiert. Dieser durch Bestrahlung mit einem Laserpuls ausgelöste Transportprozess wird im Allgemeinen als Katapultieren bezeichnet. Für den Transport wird im Allgemeinen derselbe Laserstrahl wie für das Ausschneiden verwendet, jedoch wird er leicht defokussiert und die Laserenergie erhöht. Obwohl sich das Verfahren und die Vorrichtung sehr gut zum Ausschneiden von selektierten Bereichen von biologischem Material eignet, besteht jedoch der beträchtliche Nachteil, dass das Transportieren des ausgeschnittenen biologischen Materials zum Rezipienten in einer erheblichen Anzahl von Fällen nicht erfolgreich stattfindet. Der Transportvorgang muss vom Benutzer kontrolliert und bei Misserfolg gegebenenfalls wiederholt werden.In the WO 97/29355 A1 The applicant describes a method and a device for contactless microinjection as well as for sorting and obtaining planarly applied biological objects with laser beams. With this method, individual objects can be spatially separated and sorted out of a very large number of objects, in particular biological objects. The biological objects are located on a carrier foil. In the method, a portion of the base sheet is cut out with a laser beam on which the selected biological object is located, and this portion is transported by irradiating a laser pulse to a recipient. This transport process initiated by irradiation with a laser pulse is generally referred to as catapulting. For transport, the same laser beam is generally used as for cutting, but it is slightly defocused and the laser energy is increased. However, while the method and apparatus are very well suited for excision of selected areas of biological material, there is the considerable disadvantage that the transport of the excised biological material to the recipient does not succeed in a significant number of cases. The transport process must be checked by the user and repeated if necessary.

Die WO 03/036266 A1 der Anmelderin beschreibt ein Verfahren zur Bearbeitung einer Masse mittels Laserbestrahlung und ein Steuersystem zur Durchführung des Verfahrens. Bei dem Verfahren wird ebenfalls ein Bereich einer vorzugsweise biologischen Masse ausgeschnitten und/oder transportiert, wobei sowohl das Ausschneiden als auch das Transportieren rechnergestützt erfolgen. Es werden drei Verfahren zum Transport eines selektierten Bereichs angegeben. Bei einem Verfahren wird der selektierte Bereich durch den Laserstrahl komplett ausgeschnitten, und das ausgeschnittene Material wird durch Bestrahlung mit einem gezielt platzierten Laserpuls zum Rezipienten transportiert. Bei einem weiteren Verfahren wird das selektierte Objekt bis auf eine ca. 1–2 μm dünne Verbindung (Steg) ausgeschnitten. Das Einstrahlen des Laserpulses für den Transport erfolgt dann in dem Bereich der dünnen Verbindung am Rande des Objektes. Bei einem dritten Verfahren wird das Objekt direkt katapultiert, d. h. ohne den selektierten Bereich zuvor auszuschneiden. Durch Einstrahlen eines Laserpulses auf den ausgewählten Bereich wird die darauf befindliche biologische Materie direkt transportiert. Ist der transportierte Bereich kleiner als der selektierte Bereich, kann durch Verfahren des Substrathalters der selektierte Bereich abgerastert werden, wobei bei jeder Position ein Laserpuls eingestrahlt wird. Ein nicht erfolgreicher Transport muss von einem Benutzer festgestellt werden. In diesem Fall wird die Laserleistung erhöht und ein erneuter Laserbeschuss ausgeführt. Dieses Vorgehen ist unvorteilhaft, zum einen, da ein solches Vorgehen sehr zeitaufwändig ist, zum anderen, da das zu transportierende Material durch den mehrfachen Laserbeschuss stark durch die Laserstrahlung belastet werden kann. Insbesondere die erneute Bestrahlung eines nicht vollständig ausgeschnittenen Bereichs mit erhöhter Laserleistung führt zu einer unnötig hohen Belastung der Transportimpuls-Stelle, beispielsweise des Stegs zwischen dem ausgeschnittenen Material und dem restlichen Material. Diese Belastung ist vorwiegend thermischer Natur und kann sich beispielsweise durch Anschmelzen einer dem biologischen Objekt unterliegenden Substratfolie bemerkbar machen. Die thermische Belastung der Transportimpulsstelle des biologischen Objektes kann dazu führen, dass dieser Bereich beispielsweise für eine DNA-Extraktion nicht mehr verwendet werden kann, da DNA in diesem Bereich denaturiert ist.The WO 03/036266 A1 The applicant describes a method for processing a mass by means of laser irradiation and a control system for carrying out the method. In the method, a region of a preferably biological mass is also cut out and / or transported, wherein both the cutting and the transporting are computer-aided. Three methods for transporting a selected area are specified. In one method, the selected area is completely cut out by the laser beam, and the cut-out material is transported to the recipient by irradiation with a targeted laser pulse. In another method, the selected object is cut out to about a 1-2 micron thin connection (bridge). The irradiation of the laser pulse for transport then takes place in the region of the thin connection at the edge of the object. In a third method, the object is catapulted directly, ie without previously cutting out the selected area. By irradiating a laser pulse on the selected area, the biological matter on it is transported directly. If the transported area is smaller than the selected area, the selected area can be scanned by moving the substrate holder, wherein a laser pulse is irradiated at each position. An unsuccessful transport must be determined by a user. In this case, the laser power is increased and carried out a renewed laser bombardment. This approach is unfavorable, on the one hand, because such a procedure is very time-consuming, on the other hand, because the material to be transported by the multiple laser bombardment can be heavily loaded by the laser radiation. In particular, the re-irradiation of an incompletely cut-out region with increased laser power leads to an unnecessarily high load on the transport impulse location, for example the web between the cut-out material and the remaining material. This load is predominantly thermal in nature and can be felt, for example, by melting a substrate film underlying the biological object. The thermal stress on the transport impulse of the biological object may mean that this area can not be used for example for a DNA extraction, since DNA is denatured in this area.

Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Laser-Mikrodissektionsverfahren bereitzustellen, mit dem ein erfolgreicher Transport eines von einem biologischen Material zu separierenden biologischen Objekts gewährleistet wird, ohne dass dabei die thermische Belastung der Transportimpulsstelle des biologischen Objekts wesentlich erhöht wird, und ohne dass ein manuelles Eingreifen eines Benutzers nötig ist. Es ist weiterhin eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes Laser-Mikrodissektionssystem bereitzustellen, mit dem das Laser-Mikrodissektionsverfahren durchgeführt werden kann.It is therefore an object of the present invention to provide an improved laser microdissection method which allows successful transport of a biological object to be separated from a biological material is performed without thereby the thermal load of the transport impulse of the biological object is substantially increased, and without the need for manual intervention of a user is required. It is a further object of the present invention to provide an improved laser microdissection system with which the laser microdissection method can be performed.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Laser-Mikrodissektionsverfahren nach Anspruch 1 bzw. ein Laser-Mikrodissektionssystem nach Anspruch 14 gelöst. Die Unteransprüche definieren jeweils bevorzugte und vorteilhafte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung.These The object is achieved by a laser microdissection method according to claim 1 or a laser microdissection system according to claim 14 solved. The subclaims each define preferred and advantageous embodiments of the present invention Invention.

Erfindungsgemäß befindet sich ein biologisches Objekt auf einem Träger, der biologisches Material aufweist, von welchem das biologische Objekt separiert werden soll. Weiterhin wird mit einer Laserquelle ein Laserstrahl erzeugt. Das von dem biologischen Material zu separierende biologische Objekt wird automatisch von mehreren Laserpulsen nacheinander bestrahlt, wobei die Laserpulse auf einen im Wesentlichen gleichen Bereich des Trägers eingestrahlt werden, um das biologische Objekt mittels eines von den Laserpulsen ausgelösten laserinduzierten Transportprozesses von dem Träger zu einer Auffangvorrichtung transportieren. Durch das automatische Einstrahlen mehrerer Laserpulse nacheinander auf einen im Wesentlichen gleichen Bereich des Trägers kann mit dem erfindungsgemäßen Laser-Mikrodissektionsverfahren eine wesentlich höhere Erfolgsquote des Transports des biologischen Objekts erzielt werden als bei herkömmlichen Verfahren, die nur einen Laserpuls für den Transport verwenden. Aufgrund der erhöhten Erfolgsquote des laserinduzierten Transportes ist es in der Regel nicht nötig, manuell eine weitere Bestrahlung des biologischen Objekts vorzunehmen. Dadurch wird zum einen der Zeitaufwand für einen Anwender des Laser-Mikrodissektionsverfahrens verringert, zum anderen wird dadurch eine unnötig hohe Belastung der Transportimpulsstelle des zu separierenden biologischen Objekts vermieden. Bei herkömmlichen Verfahren erfolgt das erneute manuelle Einstrahlen eines Pulses im Allgemeinen mit einer höheren Energie, wohingegen bei dem erfindungsgemäßen Laser-Mikrodissektionsverfahren vorzugsweise Pulse mit einer gleichen Energie eingestrahlt werden, wodurch folglich die thermische Belastung des bestrahlten Bereichs geringer ist.According to the invention a biological object on a carrier, the biological Material from which the biological object separates shall be. Furthermore, with a laser source, a laser beam generated. The biological material to be separated from the biological material Object is automatically irradiated by several laser pulses in succession, wherein the laser pulses are at a substantially same range of the wearer are irradiated to the biological object by means of a laser induced by the laser pulses Transport process from the carrier to a collecting device transport. By the automatic irradiation of several laser pulses successively to a substantially same area of the carrier can with the laser Mikrodissektionsverfahren invention a much higher success rate of transport of the biological object can be achieved than conventional Procedures that use only one laser pulse for transport. by virtue of the increased success rate of laser-induced transport It is usually not necessary to manually apply another irradiation of the biological object. As a result, on the one hand, the time required for a user of the laser microdissection method reduced, on the other hand, this is an unnecessarily high Loading the transport impulse of the biological to be separated Object avoided. In conventional methods takes place the manual re-irradiation of a pulse in general with a higher energy, whereas in the inventive Laser microdissection methods preferably pulses with a same Energy are radiated, thus reducing the thermal load of the irradiated area is lower.

Vorzugsweise werden die nacheinander eingestrahlten Laserpulse für den Transport des biologischen Objekts auf ein und dieselbe Stelle des Trägers eingestrahlt. Während des Einstrahlens der Laserpulse wird also weder ein Halter verfahren, der den Träger hält, noch die Position des Laserstrahls verändert. Das Einstrahlen der Laserpulse auf ein und dieselbe Stelle des Trägers ermöglicht das Transportieren des biologischen Objekts mit einer hohen Erfolgsquote.Preferably be successively irradiated laser pulses for the Transport of the biological object to one and the same place of the Beam irradiated. During the irradiation The laser pulses will thus neither proceed a holder, which is the carrier stops, nor does the position of the laser beam change. The irradiation of the laser pulses on one and the same location of the carrier allows the transport of the biological object with a high success rate.

Die Laserpulse werden vorzugsweise durch Ansteuern der Laserquelle erzeugt. Die Laserquelle wird dabei so angesteuert, dass sie eine vorbestimmte Zahl von Laserpulsen mit einer vorbestimmten Energie emittiert. Die Energie der Laserpulse kann auch durch Ansteuern eines elektrisch verstellbaren Filters eingestellt werden. Beispielsweise kann ein neutraler Dichtefilter oder ein polarisationsabhängiger Filter im Strahlengang platziert werden. Durch diese Maßnahmen wird ein präzises Einstellen der Energie der Laserpulse ermöglicht. Vorzugsweise erfolgt das Ansteuern der Laserquelle und/oder des Filters derart, dass 2–10 Pulse mit einer Frequenz von 80–120 Hz und vorzugsweise 95–105 Hz eingestrahlt werden. Die Pulsenergie kann 1–20 μJ betragen. Die Pulsenergie bezieht sich dabei auf die auf den Träger eingestrahlte Pulsenergie, die im Allgemeinen aufgrund optischer Elemente zum Ablenken und Fokussieren des Laserstrahls geringer ist als die von der Laserquelle emittierte Pulsenergie. Die Wahl der Pulsparameter wie beispielsweise der Anzahl der Pulse und die Pulsenergie wird im Allgemeinen von der Art und Beschaffenheit des Präparats abhängen, das das biologische Material und das zu separierende biologische Objekt umfasst, sowie von den Mikroskopeinstellungen des Laser-Mikrodissektionssystems, wie beispielsweise dem für das Fokussieren des Laserstrahls verwendete Objektiv. Vorzugsweise werden vor dem Transport des biologischen Objekts Probetransporte durchgeführt, um eine Energie der Laserpulse zu bestimmen, die notwendig ist, um das biologische Objekt zu transportieren. Beispielsweise werden mehrere Bereiche des biologischen Materials mit jeweils unterschiedlichen Laserpulsenergien bestrahlt, wobei für einen nachfolgenden Transport des biologischen Objekts die geringste Laserpulsenergie verwendet wird, mit der ein Transport eines der Bereiche stattgefunden hat. Somit wird die thermische Belastung des biologischen Objekts gering gehalten. Es kann auch eine um 10–20% höhere als die vorab genannte Laserpulsenergie verwendet werden, um die Erfolgsquote weiter zu verbessern.The Laser pulses are preferably generated by driving the laser source. The laser source is driven so that it has a predetermined Number of laser pulses emitted with a predetermined energy. The energy of the laser pulses can also be controlled by driving an electric adjustable filter can be adjusted. For example, a Neutral density filter or a polarization-dependent Filters are placed in the beam path. Through these measures becomes a precise adjustment of the energy of the laser pulses allows. Preferably, the driving of the laser source takes place and / or the filter such that 2-10 pulses with a Frequency of 80-120 Hz and preferably 95-105 Hz are irradiated. The pulse energy can be 1-20 μJ be. The pulse energy refers to the on the carrier radiated pulse energy, which is generally due to optical Elements for deflecting and focusing the laser beam less is the pulse energy emitted by the laser source. The vote the pulse parameters such as the number of pulses and the Pulse energy is generally determined by the type and nature of the Depending on the biological material and the biological object to be separated, as well as from the Microscope settings of the laser microdissection system, such as the lens used for focusing the laser beam. Preferably, before the transport of the biological object trial transports performed to determine an energy of the laser pulses, which is necessary to transport the biological object. For example, multiple areas of the biological material each irradiated with different laser pulse energies, wherein for a subsequent transport of the biological object The lowest laser pulse energy is used, with a transport one of the areas has taken place. Thus, the thermal Stress on the biological object kept low. It can also a 10-20% higher than the previously mentioned laser pulse energy used to further improve the success rate.

Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die Energie aufeinander folgender Laserpulse, die für den Transport des biologischen Objekts automatisch nacheinander eingestrahlt werden, verändert. Beispielsweise ist es vorstellbar, dass ein biologisches Objekt, für dessen Transport eine Mindestenergie notwendig ist, mit einer Pulsfolge bestrahlt wird, bei der die Energie aufeinander folgender Laserpulse erhöht wird. Dadurch wird das Teilchen mit dem Puls transportiert, der eine Energie aufweist, die nur unwesentlich höher als die für den Transport benötigte Mindestenergie ist. Nachfolgend eingestrahlte Pulse mit höheren Energien treffen also nicht mehr auf das biologische Objekt, da dieses bereits von dem Träger wegtransportiert wurde. Dies hat den Vorteil, dass das biologische Objekt nicht mit Laserpulsen bestrahlt wird, deren Energie höher ist als die für den Transport des biologischen Objektes benötigte Mindestenergie. Gleichermaßen kann eine zu hohe thermische Belastung bei biologischen Objekten vermieden werden, die mit den ersten Pulsen bereits teilweise aus dem biologischen Material herausgelöst werden und anschließend nur noch Laserpulse geringerer Energie benötigen, um von dem Träger wegtransportiert zu werden. Für solch ein biologisches Objekt kann beispielsweise eine Pulssequenz verwendet werden, bei der die Energie aufeinander folgender Laserpulse erniedrigt wird.According to a further aspect of the invention, the energy of successive laser pulses, which are irradiated automatically in succession for the transport of the biological object, is changed. For example, it is conceivable that a biological object, for the transport of which a minimum energy is necessary, is irradiated with a pulse sequence in which the energy of successive laser pulses is increased. As a result, the particle is transported with the pulse, which has an energy that is only slightly higher than the minimum energy required for transport. Subsequent irradiated pulses with higher energies so no longer hit the biological object, since this already from the carrier was transported away. This has the advantage that the biological object is not irradiated with laser pulses whose energy is higher than the minimum energy required for the transport of the biological object. Similarly, too high a thermal load can be avoided in biological objects that are already partially dissolved out of the biological material with the first pulses and then only need laser pulses of lower energy in order to be transported away from the carrier. For such a biological object, for example, a pulse sequence can be used in which the energy of successive laser pulses is lowered.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das biologische Objekt vor dem Einstrahlen der Laserpulse für den Transport des biologischen Objekts mittels eines Laserstrahls vollständig aus dem biologischen Material ausgeschnitten, so dass das biologische Objekt im Wesentlichen freipräpariert ist. Als Träger kann beispielsweise ein mit einer UV-absorbierenden Polymerfolie beschichteter Glasobjektträger verwendet werden, wobei das sich auf dem Träger befindliche biologische Objekt mittels eines von einem gepulsten UV-Laser emittierten Laserstrahls aus dem biologischen Material entlang einer vorgegebenen geschlossenen Schnittkurve ausgeschnitten wird. Die Laserpulse für den Transport können nun beispielsweise in die Mitte des ausgeschnittenen biologischen Objektes platziert werden. Der Vorteil des Ausschneidens liegt darin, dass das biologische Objekt sauber von dem umgebenden biologischen Material abgetrennt werden kann, sowie dass geringere Pulsenergien für den Transport des biologischen Objekts verwendet werden können.According to one preferred embodiment of the invention is the biological Object before irradiation of the laser pulses for transport of the biological object by means of a laser beam completely cut out of the biological material, so that the biological Object is essentially free-prep. As a carrier For example, one with a UV-absorbing polymer film coated glass slides are used, wherein the biological object located on the support by means of a laser beam emitted by a pulsed UV laser the biological material along a predetermined closed Cut curve is cut. The laser pulses for transport can now, for example, cut into the middle of the biological object to be placed. The advantage of cutting out lies in the fact that the biological object clean from the surrounding biological material can be separated, and that lower Pulse energies for the transport of the biological object can be used.

Nach einer weiteren Ausführungsform wird das biologische Objekt mittels eines Laserstrahls bis auf einen Steg aus dem biologischen Material ausgeschnitten. Die Laserpulse für einen nachfolgenden Transport des biologischen Objekts werden vorzugsweise auf den Steg eingestrahlt. Indem beim Ausschneiden eine dünne Verbindung in Form des Stegs zwischen der umgebenden biologischen Masse und dem biologischen Objekt stehengelassen wird, kann ein ungewolltes Herausfallen oder Verschieben des ausgeschnittenen biologischen Objektes vor dem eigentlichen Transportvorgang vermieden werden.To In another embodiment, the biological object becomes by means of a laser beam down to a bridge from the biological Material cut out. The laser pulses for a subsequent transport of the biological object are preferably irradiated onto the land. When cutting a thin connection in the form of Footbridge between the surrounding biological mass and the biological Object is left standing, an accidental falling out or Moving the cut-out biological object before the actual Transport process can be avoided.

Zweckmäßig ist es, dass das biologische Objekt mit Laserpulsen von derselben Laserquelle ausgeschnitten und transportiert wird. Vorteilhaft wird nach dem Ausschneiden die Energie der Laserpulse derart eingestellt, dass die Energie der Laserpulse für den Transport geringer oder im Wesentlichen dieselbe ist wie die Energie der Laserpulse für das Ausschneiden. Im Gegensatz zu herkömmlichen Verfahren, bei welchen die Energie des Laserpulses für den Transport im Vergleich zu der Laserpulsenergie für das Ausschneiden erhöht ist, ergibt sich hier der Vorteil, dass eine geringere oder im Wesentlichen gleiche Laserpulsenergie für den Transport verwendet werden kann, wodurch wiederum die thermische Belastung des biologischen Objekts reduziert wird. Der Transport des biologischen Objekts mit einer geringeren Laserpulsenergie wird durch das Einstrahlen mehrerer Laserpulse auf einen im Wesentlichen gleichen Bereich ermöglicht.expedient it is that the biological object with laser pulses of the same Laser source is cut out and transported. Advantageously, after cutting the energy of the laser pulses adjusted in such a way that the energy of the laser pulses for transport is lower or substantially the same as the energy of the laser pulses for cutting out. Unlike traditional ones Method in which the energy of the laser pulse for the transport compared to the laser pulse energy for the Cut is increased, this gives the advantage that a lower or substantially equal laser pulse energy can be used for transportation, which in turn the thermal load of the biological object is reduced. The transport of the biological object with a lower laser pulse energy is due to the irradiation of a plurality of laser pulses to a substantially same range allows.

Es ist vorteilhaft, wenn die Laserpulse für den Transport in einer Ebene fokussiert werden, die 1–5 μm in axialer Richtung ober- oder unterhalb einer Objektebene liegt, in welcher sich das biologische Objekt befindet. Dadurch wird es möglich, das biologische Objekt im Gegensatz zum Ausschneiden, bei dem der Fokus des Laserstrahls in der Ebene des biologischen Objekts liegt und das biologische Objekt durchlöchert wird, mittels der eingestrahlten Laserpulse zu transportieren.It is advantageous if the laser pulses for transport be focused in a plane that is 1-5 μm in axial direction is above or below an object plane, in which is the biological object. This will make it possible the biological object as opposed to cutting, in which the Focus of the laser beam lies in the plane of the biological object and the biological object is perforated by means of to transport irradiated laser pulses.

Nach einer weiteren Ausführungsform wird das biologische Objekt mit mehreren Laserpulsen bestrahlt, die auf einen im Wesentlichen gleichen Bereich des Trägers eingestrahlt werden, um das biologische Objekt direkt aus dem biologischen Material herauszulösen und zu der Auffangvorrichtung zu transportieren. Bei dieser Ausführungsform erfolgt also kein Ausschneidevorgang vor dem Transport des biologischen Objekts. Vielmehr wird das biologische Objekt durch Einstrahlen der Laserpulse sowohl aus dem biologischen Material herausgelöst als auch zu der Auffangvorrichtung transportiert. Der Vorteil des Verfahrens liegt in der Geschwindigkeit, mit der das biologische Objekt von dem biologischen Material separiert werden kann. Biologische Objekte, die größer sind als der Bereich, der durch das Einstrahlen der Laserpulse transportiert wird, können durch rasterförmiges Abfahren in Teilen transportiert werden.To In another embodiment, the biological object becomes irradiated with several laser pulses, which is on a substantially same area of the beam to be irradiated to the liberate biological object directly from the biological material and to transport to the collecting device. In this embodiment So no cut-out occurs before the transport of biological Object. Rather, the biological object is irradiated the laser pulses both removed from the biological material as well as transported to the collecting device. The advantage of Procedure lies in the speed with which the biological Object can be separated from the biological material. biological Objects that are larger than the area that is transported by the irradiation of the laser pulses can be transported in part by grid-shaped departures.

Vorzugsweise erfolgt das Einstrahlen der Laserpulse rechnergestützt, wobei mehrere zuvor selektierte biologische Objekte mit jeweils mehreren Laserpulsen im selben Bereich bestrahlt werden, um diese biologischen Objekte zu einer Auffangvorrichtung zu transportieren. Somit können mehrere biologische Objekte zügig von einem biologischen Material separiert werden, ohne dass eine Benutzereingabe nach jedem Transportvorgang erforderlich ist. Von besonderem Vorteil ist dabei, dass die Erfolgsquote für den Transport der selektierten biologischen Objekte aufgrund des Einstrahlens mehrerer Laserpulse für den Transport jeweils eines biologischen Objekts erhöht ist, wodurch dem Benutzer eine Zeitersparnis entsteht, da er weniger fehlgeschlagene Transportvorgänge manuell wiederholen muss.Preferably the irradiation of the laser pulses is computer-aided, wherein several previously selected biological objects with each several laser pulses in the same area are irradiated to this transport biological objects to a collecting device. Thus, several biological objects can move quickly be separated from a biological material without a User input is required after each transport. Of special The advantage here is that the success rate for transport the selected biological objects due to the irradiation several laser pulses for the transport of a biological Object, which saves the user time, as he fewer failed transport operations manually must repeat.

Erfindungsgemäß wird weiterhin ein Laser-Mikrodissektionssystem bereitgestellt, mit einer Laserquelle und mit einem Halter zum Aufnehmen eines Trägers mit einem biologischen Material, das ein von dem biologischen Material zu separierendes biologisches Objekt umfasst, und die weiterhin eine Steuereinheit umfasst, welche derart ausgestaltet ist, dass sie das Einstrahlen von Laserpulsen derart steuert, dass das von dem biologischen Material zu separierende biologische Objekt automatisch von mehreren Laserpulsen nacheinander bestrahlt wird, wobei die Laserpulse auf einen im Wesentlichen gleichen Bereich des Trägers eingestrahlt werden, um das biologische Objekt mittels eines von den Laserpulsen ausgelösten laserinduzierten Transportprozesses von dem Träger zu einer Auffangvorrichtung zu transportieren. Das erfindungsgemäße Laser-Mikrodissektionssystem ermöglicht den erfolgreichen Transport des biologischen Objekts, ohne dass der Transportvorgang manuell von einem Benutzer wiederholt werden muss. Weiterhin wird eine starke Belastung der Transportimpulsstelle vermieden, da kein weiterer Laserpuls mit stark erhöhter Energie eingestrahlt werden muss. Vorzugsweise ist das Laser-Mikrodissektionssystem zum Durchführen eines der vorab genannten Verfahren ausgestaltet.According to the invention is still a La a microdissection system provided with a laser source and with a holder for receiving a carrier with a biological material which comprises a biological object to be separated from the biological material, and which further comprises a control unit which is designed such that it irradiates the Controlling laser pulses such that the biological object to be separated from the biological material is automatically irradiated successively by a plurality of laser pulses, wherein the laser pulses are irradiated to a substantially same region of the carrier to the biological object by means of a triggered by the laser pulses laser-induced transport process of the Carrier to transport to a collecting device. The laser microdissection system according to the invention enables the successful transport of the biological object without the need to manually repeat the transport process by a user. Furthermore, a heavy load on the transport impulse is avoided, since no further laser pulse must be irradiated with greatly increased energy. Preferably, the laser microdissection system is configured to perform one of the aforementioned methods.

Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein computerlesbares Speichermedium bereitgestellt, in dem ein Steuerprogramm zum rechnergestützten Steuern eines Laser-Mikrodissektionssystems gespeichert ist, wobei das Steuerprogramm zum Durchführen eines der vorab genannten Verfahren ausgestaltet ist.According to one Another aspect of the invention provides a computer-readable storage medium. in which a control program for computer-aided control a laser microdissection system is stored, wherein the control program for Performing one of the aforementioned methods configured is.

Die Erfindung wird nachfolgend näher unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen anhand eines bevorzugten Ausführungsbeispiels erläutert.The The invention will be described in more detail below with reference to FIGS accompanying drawings based on a preferred embodiment explained.

1 zeigt eine schematische Darstellung eines Laser-Mikrodissektionssystems, das eine Steuereinheit aufweist, die das Einstrahlen von Laserpulsen steuert. 1 shows a schematic representation of a laser microdissection system having a control unit which controls the irradiation of laser pulses.

2 zeigt ein Flussdiagramm einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Laser-Mikrodissektionsverfahrens. 2 shows a flowchart of one embodiment of the laser Mikrodissektionsverfahrens invention.

3 zeigt zwei Abbildungen von biologischem Material, aus dem Bereiche ausgeschnitten wurden, wobei auf die ausgeschnittenen Bereiche ein Laserpuls (a) bzw. mehrere Laserpulse (b) eingestrahlt wurden. 3 shows two images of biological material were cut out of the areas, wherein the cut-out areas a laser pulse (a) or more laser pulses (b) were irradiated.

Die in 1 gezeigte Ausführungsform eines Laser-Mikrodissektionssystems 100 umfasst ein Mikroskopsystem 101, eine Steuereinheit 102, eine Laserquelle 103, sowie einen Träger 104, der biologisches Material sowie ein von dem biologischen Material zu separierendes biologisches Objekt aufweist. Weiterhin ist das Laser-Mikrodissektionssystem 100 mit einer Eingabeeinheit 105 und einer Anzeigeeinheit 106 ausgestattet. Ein vergrößertes Abbild des sich auf dem Träger 104 befindenden biologischen Materials wird einem Benutzer des Laser-Mikrodissektionssystems 100 mittels der Anzeigeeinheit 106 zur Verfügung gestellt. Mittels der Eingabeeinheit 105 kann der Benutzer ein biologisches Objekt selektieren, das von dem biologischen Material separiert werden soll. Beispielsweise kann die Eingabeeinheit 105 eine Maus umfassen, mit der der Benutzer den Umriss des zu separierenden biologischen Objektes auswählt. Weiterhin kann der Benutzer über die Eingabeeinheit 105 Parameter festlegen, mit denen der Transport des biologischen Objekts erfolgen soll. Beispielsweise kann hier selektiert werden, ob ein Ausschneidevorgang oder ein direkter Transport des biologischen Objektes durchgeführt werden soll, oder es kann die Anzahl und die Energie der für den Transport verwendeten Laserpulse eingestellt werden. Die Steuereinheit 102 steuert dann die Laserquelle 103 derart an, dass diese die vorgegebene Anzahl an Laserpulsen emittiert. Der gepulste Laserstrahl, der von der Laserquelle 103 emittiert wird, ist in 1 als eine durchbrochene Linie gezeigt. Zum Einstellen der Energie der Laserpulse wird vorzugsweise ein Filter 107 verwendet. Als Filter kann beispielsweise ein elektrisch verstellbarer neutraler Dichtefilter, wie eine logarithmisch bedampfte und mit einem Schrittmotor gekoppelte Glasplatte verwendet werden, wobei die Steuereinheit 102 die Filterstärke und somit die Verringerung der Energie der Laserpulse steuert. Es können jedoch auch andere Filter verwendet werden, wie beispielsweise auf Polarisation basierende Filter. Wichtig ist nur, dass eine präzise Einstellung der Energie der Laserpulse ermöglicht wird. Der Laserstrahl tritt durch die Linse 113, wird von einem Objektiv 108 fokussiert und trifft auf den Träger 104. Im Strahlengang des Laserstrahls sind weitere optische Elemente vorgesehen, wie beispielsweise Spiegel oder Linsen, die hier aus Übersichtlichkeitsgründen nicht gezeigt sind. Der Träger 104 wird von einem Halter 109 gehalten, dessen Position mit der Steuereinheit 102 gesteuert werden kann. Zum Verfahren des Halters 109 können Schrittmotoren oder Piezoelemente eingesetzt werden, wodurch eine präzise Positionierung des Trägers 104 ermöglicht wird. Mittels des Halters 109 lässt sich so ein biologisches Objekt präzise relativ zu dem Laserstrahl positionieren.In the 1 shown embodiment of a laser microdissection system 100 includes a microscope system 101 , a control unit 102 , a laser source 103 , as well as a carrier 104 comprising biological material and a biological object to be separated from the biological material. Furthermore, the laser microdissection system 100 with an input unit 105 and a display unit 106 fitted. An enlarged image of himself on the carrier 104 The biological material in question will become a user of the laser microdissection system 100 by means of the display unit 106 made available. By means of the input unit 105 For example, the user may select a biological object to be separated from the biological material. For example, the input unit 105 comprise a mouse with which the user selects the outline of the biological object to be separated. Furthermore, the user can via the input unit 105 Define parameters with which the transport of the biological object should take place. For example, it can be selected here whether a cutting-out process or a direct transport of the biological object is to be carried out, or the number and energy of the laser pulses used for the transport can be set. The control unit 102 then controls the laser source 103 such that it emits the predetermined number of laser pulses. The pulsed laser beam coming from the laser source 103 is emitted in 1 shown as a broken line. For adjusting the energy of the laser pulses is preferably a filter 107 used. As a filter, for example, an electrically adjustable neutral density filter, such as a logarithmisch evaporated and coupled with a stepping motor glass plate can be used, wherein the control unit 102 controls the filter strength and thus the reduction of the energy of the laser pulses. However, other filters may be used, such as polarization based filters. The important thing is that a precise adjustment of the energy of the laser pulses is made possible. The laser beam passes through the lens 113 , is from a lens 108 focused and meets the wearer 104 , In the beam path of the laser beam further optical elements are provided, such as mirrors or lenses, which are not shown here for reasons of clarity. The carrier 104 is from a holder 109 held its position with the control unit 102 can be controlled. For the procedure of the holder 109 For example, stepper motors or piezoelectric elements can be used, ensuring precise positioning of the carrier 104 is possible. By means of the holder 109 allows a biological object to be precisely positioned relative to the laser beam.

Das Mikroskopsystem 101 kann als invertiertes oder aufrechtes Mikroskop ausgestaltet sein. Es weist die üblichen aber hier nicht näher beschriebenen Komponenten eines Mikroskops auf, wie beispielsweise eine Lichtquelle, einen Kondensor, eine Videokamera zum Aufnehmen eines durch das Objektiv 108 vergrößerten Abbildes eines Präparats, eine Vorrichtung für Fluoreszenzmikroskopie oder ähnliche Komponenten. Das Mikroskopsystem 101 weist des weiteren eine Auffangvorrichtung 110 auf, die mit einer Positioniervorrichtung 111 positioniert werden kann. Die Positioniervorrichtung 111 kann dabei sowohl für eine manuelle Kontrolle ausgebildet sein, als auch für ein automatisches von der Steuereinheit 102 kontrolliertes Positionieren. Die Auffangvorrichtung 110 kann einen oder mehrere Auffangbehälter 112 umfassen, beispielsweise in Form einer Mikrotiter-Platte, von Kappen von Eppendorfbehältern oder von Eppendorfbehältern selbst, oder von anderen Behältern, die zum Auffangen eines biologischen Objekts dienen können.The microscope system 101 can be designed as an inverted or upright microscope. It has the usual but unspecified components of a microscope, such as a light source, a condenser, a video camera for picking up a through the lens 108 enlarged image of a preparation, a device for fluorescence microscopy or similar components. The microscope system 101 further has a catching device 110 on, with a positioning device 111 can be positioned. The positioning device 111 can be designed both for a manual control, as well as for an automatic from the control unit 102 controlled positioning. The collecting device 110 can be one or more collection containers 112 include, for example, in the form of a microtiter plate, caps of Eppendorf containers or Eppendorf containers themselves, or other containers that can serve to capture a biological object.

Die Steuereinheit 102 kann beispielsweise als ein Computer ausgestaltet sein, wobei ein auf dem Computer ausgeführtes Computerprogrammprodukt die Komponenten des Laser-Mikrodissektionssystems 100 steuert.The control unit 102 For example, it may be configured as a computer, with a computer program product running on the computer including the components of the laser microdissection system 100 controls.

Anhand des Flussdiagrams in 2 soll eine Ausführungsform des Laser-Mikrodissektionsverfahrens genauer erläutert werden. In einem ersten Schritt 201 wählt ein Benutzer ein biologisches Objekt aus, das von einem biologischen Material separiert werden soll. Dem Benutzer wird beispielsweise das biologische Material mit der Anzeigeeinheit 106 in Form eines Bildschirms angezeigt, woraufhin der Benutzer mit einem Cursor, der von der Eingabeeinheit 105 in Form einer Maus oder ähnlichem gesteuert werden kann, ein zu separierendes biologisches Objekt auswählt. Es können aber auch mehrere biologische Objekte ausgewählt werden, wobei diese durch Verfahren des Trägers 104 mit dem Halter 109 angefahren werden können. In einem nächsten Schritt 202 wählt der Benutzer Transportparameter aus. Beispielsweise kann der Benutzer auswählen, ob vor dem Transportprozess ein Schneidevorgang erfolgen soll, oder wie viele Laserpulse für den Transport mit welcher Pulsenergie eingestrahlt werden sollen. Die Schritte 201 und 202 können auch in umgekehrter Reihenfolge erfolgen. Wurde ein Ausschneidevorgang gewählt, so wird in einem Schritt 203 der Ausschneidevorgang durchgeführt. Zum Ausschneiden des selektierten biologischen Objekts wird von der Laserquelle 103 ein gepulster Laserstrahl emittiert, und mit dem Objektiv 108 in der Ebene des biologischen Materials fokussiert. Die axiale Position des Laserfokus relativ zum biologischen Material kann dabei entweder durch axiales Verschieben des Objekts 108 oder des Trägers 104 erfolgen, oder durch axiales Verschieben der Linse 113, wobei die Positionierung des Laserfokus vorzugsweise rechnergestützt mittels der Steuereinheit 102 erfolgt. Der Laserfokus wird für den Ausschneidevorgang in die Ebene des biologischen Material oder einer dem biologischen Materials unterliegenden Membran gelegt. Der Halter 109 positioniert den Träger 104 derart, dass der Laserstrahl auf die Linie trifft, entlang welcher das biologische Objekt ausgeschnitten werden soll. Der Träger 104 wird mit dem Halter 109 anschließend derart verfahren, dass der Laserfokus entlang der Schnittlinie das biologische Objekt ausschneidet. Alternativ ist es auch möglich, die Position des Trägers 104 festzuhalten, und den Fokus des Laserstrahls entlang der Schnittlinie zum Ausschneiden des biologischen Objektes zu bewegen, beispielsweise durch das Ansteuern optischer Elemente im Strahlengang des Laserstrahls. Als Laserquelle 103 wird vorzugsweise im Frequenz-verdreifachter Nd:YAG-Laser mit einer Wellenlänge von 355 nm oder alternativ ein gepulster UV-Stickstofflaser verwendet. Es können jedoch auch andere Laser als Laserquelle verwendet werden, es ist nur wichtig, dass die emittierte Laserstrahlung geeignet ist, um biologisches Material mittels eines laserinduzierten Transportprozesses zu transportieren, und gegebenenfalls biologisches Material zu schneiden.Based on the flowchart in 2 an embodiment of the laser microdissection method will be explained in more detail. In a first step 201 a user selects a biological object to be separated from a biological material. The user becomes, for example, the biological material with the display unit 106 displayed in the form of a screen, whereupon the user with a cursor, by the input unit 105 in the form of a mouse or the like, selects a biological object to be separated. However, it is also possible to select a plurality of biological objects, these being obtained by methods of the carrier 104 with the holder 109 can be approached. In a next step 202 the user selects transport parameters. For example, the user can select whether a cutting operation is to take place before the transport process, or how many laser pulses are to be irradiated for the transport with which pulse energy. The steps 201 and 202 can also be done in reverse order. If a cut-out process has been selected, then in one step 203 the cutting process performed. To cut out the selected biological object is from the laser source 103 emitted a pulsed laser beam, and with the lens 108 focused in the plane of the biological material. The axial position of the laser focus relative to the biological material can be either by axial displacement of the object 108 or the carrier 104 done, or by axial displacement of the lens 113 wherein the positioning of the laser focus is preferably computer-aided by means of the control unit 102 he follows. The laser focus is placed in the plane of the biological material or a membrane underlying the biological material for the Ausschneidevorgang. The holder 109 positions the wearer 104 such that the laser beam strikes the line along which the biological object is to be cut out. The carrier 104 comes with the holder 109 then proceed in such a way that the laser focus cuts out the biological object along the cutting line. Alternatively, it is also possible to determine the position of the wearer 104 hold, and to move the focus of the laser beam along the cutting line for cutting out the biological object, for example by the driving of optical elements in the beam path of the laser beam. As a laser source 103 is preferably used in the frequency-tripled Nd: YAG laser with a wavelength of 355 nm or alternatively a pulsed UV nitrogen laser. However, other lasers may be used as the laser source, it is only important that the emitted laser radiation is suitable for transporting biological material by means of a laser-induced transport process and, if necessary, cutting biological material.

Nach dem Ausschneiden des biologischen Objektes wird das biologische Objekt in einem nächsten Schritt 204 derart positioniert, dass die Laserpulse für den Transport des biologischen Objekts auf einen vorbestimmten Bereich des biologischen Objekts eingestrahlt werden. Wurde das biologische Objekt vollständig aus dem umgebenden biologischen Material ausgeschnitten, wird das biologische Objekt beispielsweise mittig über dem Fokus des Laserstrahls platziert. Wurde das biologische Objekt bis auf einen Steg aus dem biologischen Material ausgeschnitten, so wird vorzugsweise der Bereich, in dem sich der Steg befindet, über dem Laserfokus platziert. Wurde kein Ausschneidevorgang vor dem Transport durchgeführt, so wird der zu transportierende Bereich mittig über dem Laserfokus platziert. Das Positionieren des biologischen Objekts kann durch Verfahren des Halters 109 erfolgen, vorzugsweise rechnergestützt durch die Steuereinheit 102. Alternativ kann der Laserfokus beispielsweise durch ansteuerbare optische Elemente wie die Linse 113 im Strahlengang des Laserstrahls positioniert werden. Weiterhin hängt die Stelle, an welcher die Laserpulse für den Transport des biologischen Objekts eingestrahlt werden sollen, auch von der Beschaffenheit des biologischen Objekts ab. Handelt es sich bei dem biologischen Objekt beispielsweise um lebende Zellen, oder um Zellen, von denen Chromosomen bzw. DNA extrahiert werden soll, so ist eine Einstrahlung am Rand der Zelle sinnvoll, um eine Beschädigung der DNA oder der Chromosomen zu vermeiden.After cutting out the biological object, the biological object becomes a next step 204 positioned such that the laser pulses for the transport of the biological object are irradiated onto a predetermined region of the biological object. For example, when the biological object has been completely excised from the surrounding biological material, the biological object is placed centrally over the focus of the laser beam. If the biological object has been cut out of the biological material except for a web, the area in which the web is located is preferably placed above the laser focus. If no cutting was carried out before transport, the area to be transported is placed in the middle above the laser focus. The positioning of the biological object may be accomplished by methods of the holder 109 take place, preferably computer-aided by the control unit 102 , Alternatively, the laser focus, for example, by controllable optical elements such as the lens 113 be positioned in the beam path of the laser beam. Furthermore, the location at which the laser pulses are to be irradiated for the transport of the biological object also depends on the nature of the biological object. If the biological object is, for example, living cells, or cells from which chromosomes or DNA are to be extracted, it is sensible to irradiate them at the edge of the cell in order to avoid damaging the DNA or the chromosomes.

Zweckmäßig wird vor dem Transport des biologischen Objektes die axiale Position des Laserfokus eingestellt, d. h. die Position des Laserfokus in z-Richtung senkrecht zur Ebene des Trägers. Für einen Ausschneidevorgang befindet sich der Fokus im Allgemeinen in der Ebene des biologischen Materials bzw. in der Ebene einer unter dem biologischen Material angeordneten Membran. Für den direkten Transport eines biologischen Objektes oder den Transport eines vollständig ausgeschnittenen biologischen Objektes ist es vorteilhaft, den Laserfokus 1–5 μm aus der Ebene heraus und vorzugsweise 1–2 μm nach unten, d. h. in Richtung der Laserquelle, zu verschieben. Wurde das biologische Objekt bis auf einen Steg ausgeschnitten, ist ein Defokussieren des Laserstrahls, d. h. ein Verschieben des Laserfokus in axialer Richtung, nicht immer notwendig. Die axiale Position des Laserfokus kann beispielsweise durch axiales Verschieben von Linse 113 im Strahlengang des Laserstrahls erreicht werden, oder durch axiales Verschieben des Objektivs 108 oder des Trägers 104.Appropriately, the axial position of the laser focus is adjusted before the transport of the biological object, ie the position of the laser focus in the z-direction perpendicular to the plane of the carrier. For a cut-out operation, the focus is generally in the plane of the biological material or in the plane of a membrane arranged below the biological material. For the direct transport of a biological object or the transport of a completely cut-out biological object, it is advantageous to use the laser focus 1-5 μ m out of the plane and preferably 1-2 microns down, ie to move in the direction of the laser source. If the biological object has been cut out to a web, it is not always necessary to defocus the laser beam, ie to shift the laser focus in the axial direction. The axial position of the laser focus, for example, by axial displacement of the lens 113 be achieved in the beam path of the laser beam, or by axial displacement of the lens 108 or the carrier 104 ,

In einem nächsten Schritt 205 werden Laserpulse eingestrahlt, um das zu separierende biologische Objekt zu der Auffangvorrichtung 110 zu transportieren. Eine vorgegebene Zahl von Laserpulsen wird durch Ansteuern der Laserquelle 103 erzeugt. Die Laserpulse passieren den Filter 107, der von der Steuereinheit 102 derart eingestellt wird, dass die Laserpulse eine vorgegebene Energie aufweisen. Im Allgemeinen wird die Energie der Laserpulse weiter durch die Optik des Mikroskopsystems 101 verringert. Insbesondere findet eine Abschwächung der Laserpulse beim Durchlaufen des Objektivs 108 statt. Vorzugweise wird ein Objektiv 108 verwendet, das eine möglichst hohe Transmission bei der Wellenlänge des von der Laserquelle 103 emittierten Laserstrahls aufweist. Entscheidend ist, welche Energie die Laserpulse in der Ebene des biologischen Objekts aufweisen. Je nach verwendetem Mikroskopsystem und verwendeter Laserquelle sind unterschiedliche Stellungen des Filters 107 notwendig, um eine geeignete Energie der Laserpulse in der Ebene des biologischen Objekts für den Transport des biologischen Objekts zu erreichen. Weiterhin ist die Energie der Laserpulse, die für den Transport des biologischen Objekts verwendet wird, abhängig von der Art der Anwendung und der Art des biologischen Objekts. Lebende Zellen werden beispielsweise mit einer anderen Energie der Laserpulse transportiert als Zellen eines histologischen Präparats. Vorzugsweise werden 2–10 Pulse mit einer Pulsenergie von 1–20 μJ und einer Frequenz von 95–105 Hz eingestrahlt.In a next step 205 Laser pulses are irradiated to the biological object to be separated to the collecting device 110 to transport. A predetermined number of laser pulses is generated by driving the laser source 103 generated. The laser pulses pass through the filter 107 coming from the control unit 102 is set such that the laser pulses have a predetermined energy. In general, the energy of the laser pulses continues through the optics of the microscope system 101 reduced. In particular, there is a weakening of the laser pulses when passing through the objective 108 instead of. Preferably, a lens 108 used the highest possible transmission at the wavelength of the laser source 103 having emitted laser beam. The decisive factor is which energy the laser pulses have in the plane of the biological object. Depending on the microscope system used and the laser source used are different positions of the filter 107 necessary to achieve an appropriate energy of the laser pulses in the plane of the biological object for the transport of the biological object. Furthermore, the energy of the laser pulses used to transport the biological object is dependent on the type of application and the nature of the biological object. For example, living cells are transported with a different energy of the laser pulses than cells of a histological preparation. Preferably, 2-10 pulses are irradiated with a pulse energy of 1-20 μJ and a frequency of 95-105 Hz.

Bei herkömmlichen Laser-Mikrodissektionssystemen wurde die Energie nach dem Ausschneiden für den Transport um beispielsweise 10–25% erhöht. Dies ist mit dem hier beschriebenen Laser-Mikrodissektionsverfahren nicht immer notwendig, es können auch Laserpulse mit gleicher oder geringerer Energie eingestrahlt werden. Somit wird eine Belastung der Transportimpulsstärke des biologischen Objekts verringert. Die Laserpulse werden von dem Objektiv 108 fokussiert und treffen auf das biologische Objekt, welches in einem nächsten Schritt 206 zu der Auffangvorrichtung 110 transportiert wird. Der Transport geschieht mittels eines von den Laserpulsen induzierten Transportprozesses. Die Laserpulse werden dabei auf einen im Wesentlichen gleichen Bereich des Trägers 104 eingestrahlt. Das heißt, dass weder die Position des Halters 109 noch die Position des Laserstrahls aktiv verändert wird. Aufgrund von Vibrationen können geringfügige Änderungen der relativen Position zwischen Laserstrahl und bestrahltem Bereich nicht ausgeschlossen werden. Solche Positionsänderungen sind jedoch für das hier beschriebene Verfahren unerheblich. Das biologische Objekt wird in einem Auffangbehälter 112 der Auffangvorrichtung 110 aufgefangen. Für das Auffangen mehrerer biologischer Objekte in unterschiedlichen Auffangbehältern kann die Auffangvorrichtung 110 mittels einer Positioniervorrichtung 111 verfahren werden. Durch das automatische Einstrahlen mehrerer Laserpulse auf einen im Wesentlichen gleichen Bereich wird ein erfolgreiches Transportieren des biologischen Objekts ermöglicht. Im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren, bei denen nur ein Laserpuls für den Transport eingesetzt wird, ist die Wahrscheinlichkeit eines erfolgreichen Transports des biologischen Objekts mit dem hier beschriebenen Verfahren wesentlich höher. Auch wenn im Vergleich zu den herkömmlichen Verfahren geringere Laserpulsenergien eingesetzt werden, können trotzdem höhere Erfolgsquoten erreicht werden. Somit stellt die vorliegende Erfindung ein Laser-Mikrodissektionsverfahren bereit, mit dem biologische Objekte erfolgreich und mit einer geringen thermischen Belastung der Transportimpulsstelle transportiert werden können.In conventional laser microdissection systems, energy has been increased by, for example, 10-25% after cut-out for transport. This is not always necessary with the laser microdissection method described here; laser pulses with the same or lower energy can also be irradiated. Thus, a burden of the transport momentum of the biological object is reduced. The laser pulses are from the lens 108 focused and meet the biological object, which in a next step 206 to the catcher 110 is transported. The transport takes place by means of a transport process induced by the laser pulses. The laser pulses are thereby applied to a substantially identical region of the carrier 104 irradiated. That means neither the position of the holder 109 still the position of the laser beam is actively changed. Due to vibrations, slight changes in the relative position between the laser beam and the irradiated area can not be excluded. However, such position changes are irrelevant to the method described here. The biological object is placed in a collection container 112 the collecting device 110 collected. For catching several biological objects in different collecting containers, the collecting device 110 by means of a positioning device 111 be moved. By automatically irradiating a plurality of laser pulses in a substantially same area, a successful transport of the biological object is made possible. Compared to conventional methods, where only one laser pulse is used for transport, the probability of a successful transport of the biological object with the method described here is much higher. Even though lower laser pulse energies are used compared to the conventional methods, higher success rates can nevertheless be achieved. Thus, the present invention provides a laser microdissection method by which biological objects can be successfully transported with a low thermal stress on the transport pulse site.

3 zeigt Abbildungen eines biologischen Materials 300, von dem ein biologisches Objekt separiert werden soll. 3 shows pictures of a biological material 300 from which a biological object is to be separated.

3a zeigt zwei biologische Objekte 301 und 301, die aus dem biologischen Material 300 entlang einer Schnittlinie 302 ausgeschnitten wurden. Des Weiteren wurde mit einem herkömmlichen Laser-Mikrodissektionsverfahren ein einzelner Laserpuls auf das biologische Objekt eingestrahlt, um das biologische Objekt zu einer Auffangvorrichtung zu transportieren. Bei beiden biologischen Objekten war der Versuch des Transports nicht erfolgreich, beide biologischen Objekte befinden sich nach dem Einstrahlen des Laserpulses noch auf dem Träger. Die Transportimpulsstelle 303, auf welche der Laserpuls eingestrahlt wurde, ist nach dem Einstrahlen deutlich verbreitert. Das biologische Objekt wurde mit dem Laserpuls nicht transportiert, jedoch fand eine Veränderung des biologischen Objekts aufgrund der hohen Belastung der Transportimpulsstelle statt, was eine weitere Verwendung des biologischen Objekts beeinträchtigen kann. 3a shows two biological objects 301 and 301 made of the biological material 300 along a cutting line 302 were cut out. Furthermore, with a conventional laser microdissection method, a single laser pulse was irradiated on the biological object to transport the biological object to a catcher. In both biological objects, the attempt of transport was not successful, both biological objects are still on the support after the laser pulse. The transport impulse 303 to which the laser pulse was irradiated, is significantly widened after irradiation. The biological object was not transported by the laser pulse, but a change in the biological object took place due to the high stress of the transport impulse, which may affect further use of the biological object.

3b zeigt ebenfalls ein biologisches Material 300, aus welchem entlang einer Schnittlinie 304 ein biologisches Objekt ausgeschnitten wurde. Anschließend wurden, wie im kennzeichnenden Teil des Hauptanspruchs beschrieben, mehrere Laserpulse auf einen im Wesentlichen gleichen Bereich des Trägers eingestrahlt. Mittels eines von den Laserpulsen induzierten Transportprozesses wurde das biologische Objekt zu einer Auffangvorrichtung transportiert. Dementsprechend bleibt in dem biologischen Material 300 eine Lücke 305 zurück. Für den Transport des biologischen Objekts wurden Laserpulse mit der gleichen Energie verwendet, die in 3a verwendet wurde. Wie ersichtlich wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren eine höhere Wahrscheinlichkeit eines erfolgreichen Transports des biologischen Objekts erreicht, als beim herkömmlichen Laser-Mikrodissektionsverfahren. Weiterhin sind entlang der Schnittlinie 304 in 3b keine Veränderungen der Transportimpulsstelle aufgrund des Einstrahlens der Laserpulse erkennbar, was darauf schließen lässt, dass die Belastung der Transportimpulsstelle geringer ist als bei herkömmlichen Laser-Mikrodissektionsverfahren. Experimente haben gezeigt, dass mit dem erfindungsgemäßen Verfahren beispielsweise für biologisches Material in Form von feuchten Kryo-Schnitten eine Verbesserung der Wahrscheinlichkeit eines erfolgreichen Transportes von 50%, und für fetthaltiges Gewebe, wie beispielsweise dicke Gehirnschnitte, sogar eine Verbesserung der Wahrscheinlichkeit eines erfolgreichen Transports von 100% erreicht wird. 3b also shows a biological material 300 from which along a cutting line 304 a biological object was cut out. Subsequently, as described in the characterizing part of the main claim, a plurality of laser pulses are irradiated to a substantially same area of the carrier. By means of one of the laser pulses induced transport process, the biological object was transported to a collecting device. Accordingly, it remains in the biological material 300 a gap 305 back. For the transport of the biological object laser pulses with the same energy were used 3a has been used. As can be seen, in the method according to the invention a higher probability of a successful transport of the biological object is achieved than in the conventional laser microdissection method. Furthermore, along the cutting line 304 in 3b no changes in the transport pulse due to the irradiation of the laser pulses can be seen, which suggests that the load of the transport impulse is less than in conventional laser microdissection methods. Experiments have shown that with the method according to the invention, for example for biological material in the form of wet cryosections, an improvement in the probability of a successful transport of 50%, and for fatty tissue, such as thick brain slices, even an improvement in the probability of successful transport of 100% is achieved.

100100: Laser-MikrodissektionssystemLaser microdissection
101101: Mikroskopsystemmicroscope system
102102: Steuereinheitcontrol unit
103103: Laserquellelaser source
104104: Trägercarrier
105105: Eingabeeinheitinput unit
106106: Anzeigeeinheitdisplay unit
107107: Filterfilter
108108: Objektivlens
109109: Halterholder
110110: Auffangvorrichtungcatcher
111111: Positioniervorrichtungpositioning
112112: Auffangbehälterreceptacle
113113: Linselens
201201: erster Verfahrensschrittfirst step
202202: zweiter Verfahrensschrittsecond step
203203: dritter Verfahrensschrittthird step
204204: vierter Verfahrensschrittfourth step
205205: fünfter Verfahrensschrittfifth step
206206: sechster Verfahrensschrittsixth step
300300: biologisches Materialbiological material
301301: biologisches Objektbiological object
302302: Schnittlinieintersection
303303: TransportimpulsstelleTransport pulse location
304304: Schnittlinieintersection
305305: Lückegap

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Zitierte PatentliteraturCited patent literature

WO 97/29355 A1 [0004]
WO 03/036266 A1 [0005]

Claims

Laser microdissection method, wherein a biological object is supported on a support ( 104 ) having biological material from which the biological object is to be separated and having a laser source ( 103 in that a laser beam is generated, characterized in that the biological object to be separated from the biological material is automatically irradiated successively by a plurality of laser pulses, the laser pulses being directed onto a substantially identical region of the carrier ( 104 ) are irradiated to the biological object by means of one of the laser pulses triggered laser-induced transport process from the carrier to a collecting device ( 110 ) to transport.

A method according to claim 1, characterized in that the laser pulses for the transport of the biological object to one and the same location of the carrier ( 104 ) are irradiated.

A method according to claim 1 or 2, characterized in that the laser pulses by driving the laser source ( 103 ) be generated.

Method according to one of the preceding claims, characterized in that the biological object before the irradiation the laser pulses for the transport of the biological object completely made of the biological material by means of a laser beam is cut out, so that the biological object in essence is free prepared.

Method according to one of claims 1-3, characterized in that the biological object before the irradiation the laser pulses for the transport of the biological object by means of a laser beam down to a bridge from the biological Material is cut out, with the laser pulses for a subsequent transport to the bridge are radiated.

A method according to claim 4 or 5, characterized in that the biological object with laser pulses from the same laser source ( 103 ) is cut and transported, wherein after cutting the energy of the laser pulses is adjusted such that the energy of the laser pulses for the transport is less or substantially the same as the energy of the laser pulses for the cutting.

Method according to one of claims 1-3, characterized in that the biological object is irradiated with a plurality of laser pulses, which on a substantially same region of the carrier ( 104 ) are irradiated to dissolve the biological object directly from the biological material and to the collecting device ( 110 ) to transport.

Method according to one of the preceding claims, characterized in that the energy of the successive Laser pulses necessary for the transport of the biological object automatically be successively irradiated, changed becomes.

Method according to one of the preceding claims, characterized in that the irradiation of the laser pulses in such a way It is controlled that 2-10 laser pulses with a frequency of 80-120 Hz and preferably 95-105 Hz become.

Method according to one of the preceding claims, characterized in that before the transport of biological Object sample transports are carried out to an energy to determine the laser pulses that is necessary to the biological Transport object.

Method according to one of the preceding claims, characterized in that the energy of the laser pulses by driving an electrically adjustable filter ( 107 ) is set.

Method according to one of the preceding claims, characterized in that the laser pulses focused in a plane be 1-5 microns in the axial direction above or lies below an object plane in which the biological Object is located.

Method according to one of the preceding claims, characterized in that the irradiation of the laser pulses is computer-assisted, and that a plurality of previously selected biological objects are each irradiated with a plurality of laser pulses in the same area to each of these biological objects to a collecting device ( 110 ) to transport.

Laser microdissection system, with a laser source ( 103 ), and with a holder ( 109 ) for picking up a carrier ( 104 ) comprising a biological material comprising a biological object to be separated from the biological material, characterized in that the laser microdissection system ( 100 ) a control unit ( 102 ), which is designed such that it controls an irradiation of laser pulses such that the biological object to be separated from the biological object is automatically irradiated by a plurality of laser pulses successively, wherein the laser pulses to a substantially same area of the carrier ( 104 ) are irradiated to the biological object by means of one of the laser pulses triggered laser-induced transport process from the carrier ( 104 ) to a collecting device ( 110 ) to transport.

Laser microdissection system according to claim 14, characterized in that the laser microdissection system ( 100 ) is configured to carry out a method according to claims 1-13.

Computer-readable storage medium in which a control program for the computerized control of a laser microdissection system ( 100 ), wherein the control program when executed in a computer system for carrying out a method according to claims 1-13 is configured.