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DE102007039429A1 - Verfahren zur Aktivierung regulatorischer T-Zellen - Google Patents

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DE102007039429A1
DE102007039429A1 DE102007039429A DE102007039429A DE102007039429A1 DE 102007039429 A1 DE102007039429 A1 DE 102007039429A1 DE 102007039429 A DE102007039429 A DE 102007039429A DE 102007039429 A DE102007039429 A DE 102007039429A DE 102007039429 A1 DE102007039429 A1 DE 102007039429A1
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Germany
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cells
radical
regulatory
treg cells
inhibitor
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DE102007039429A
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English (en)
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Siegfried Ansorge
Ute Bank
Uwe Lendeckel
Janine Tadje
Michael TÄGER
Carmen Wolke
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Original Assignee
IMTM GmbH
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Publication date
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Priority to CA2691368A priority patent/CA2691368A1/en
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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Aktivierung regulatorischer T-Zellen (Treg-Zellen) des menschlichen oder tierischen Körpers, umfassend einen Schritt des Inkontaktbringens der regulatorischen T-Zellen (Treg-Zellen) in einem geeigneten flüssigen Medium mit einem oder mehreren Inhibitoren von Alanyl-Aminopeptidase (Aminopeptidase N; APN) und/oder mit einem oder mehreren Inhibitoren von Peptidasen gleicher Substratspezifität unter Induktion einer suppressiven Wirkung der regulatorischen T-Zellen (Treg-Zellen).

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Aktivierung von regulatorischen T-Zellen (Treg-Zellen; CD4+CD25+-Zellen). Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Ex-situ-Aktivierung von regulatorischen T-Zellen unter Verwendung von Inhibitoren der Alanyl-Aminopeptidase (Aminopeptidase N; APN; CD13; EC 3.4.11.2) oder unter Verwendung von Inhibitoren von Enzymen mit analoger enzymatischer Wirkung. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von Inhibitoren der Alanyl-Aminopeptidase und/oder von Inhibitoren von Enzymen mit analoger enzymatischer Wirkung zur Aktivierung von regulatorischen T-Zellen.
  • Es ist bereits bekannt, daß Erkrankungen mit Autoimmunpathogenese, wie beispielsweise Typ I Diabetes mellitus oder Multiple Sklerose, eine Aktivierung und Proliferation von autoreaktiven, d. h. gegen körpereigene Antigene gerichteten Immunzellen, insbesondere von autoreaktiven T-Lymphozyten, zugrunde liegt bzw. die Aktivierung und Proliferation derartiger Immunzellen diesen Krankheitsprozeß ausmachen.
  • Ähnliche Mechanismen kommen bei der Entstehung von Abstossungsepisoden nach einer Organtransplantation zum Tragen, mit dem Unterschied, dass hier nicht primär "Autoantigene", sondern "Fremdantigene" aus dem Spenderorgan für die Entwicklung der fatalen Immunantwort verantwortlich sind.
  • In beiden Fällen, d. h. sowohl bei Autoimmunerkrankungen als auch bei Abstossungsreaktionen, kommt es zu einem unerwünschten Bruch der "Toleranz" des Immunsystems gegen die körpereigenen oder vom Transplantat herrührenden Antigene. Ähnliches gilt für die überschiessende Immunantwort bei Allergien.
  • Erkenntnisse der letzten Jahre zeigen, dass im gesunden Organismus diese "Toleranz" aktiv aufrechterhalten wird, indem autoreaktive T-Lymphozyten aktiv in ihrer Funktion und ihrem Wachstum unterdrückt werden. Dies wird durch eine spezielle, supprimierende T-Zell-Population, die sogenannten natürlichen regulatorischen T-Zellen (Treg, CD4+CD25+-Zellen), erreicht. Treg-Zellen entstehen im Thymus [Kawahata K. et al., J. Immunol. 168: 4399–4405, 2002] und machen im peripheren Blut einen Anteil von 5 bis 10% der T-Zellen aus. Sie wirken auf CD4+-T-Zellen der gleichen Antigen-Spezifität über direkten Zell-Kontakt inhibitorisch. Diese inhibitorische Wirkung wird über eine starke Expression von TGF-β1 in/auf den Treg erreicht. Das TGF-β1 ist dabei auf der Oberfläche der Treg präsentiert und bindet an den TGF-β1-Rezeptor auf autoreaktiven T-Zellen, was einen völlig neuen Wirkungsmechanismus dieses starken immunsuppressiven Zytokins darstellt [Nakamura et al., J. Exp. Med. 194: 629–644, 2001].
  • Treg-Zellen hemmen die Autoimmunität effizienter als die Immunantwort gegen "Fremd"-Antigene [Romagnoli, P. et al., J. Immunol. 168: 1644-1648, 2002]. Daher haben Einschränkungen oder Verluste der Funktion von Treg-Zellen besondere pathogenetische Bedeutung bei der Entstehung von Autoimmunerkrankungen. Ein direkter Zusammenhang zwischen Zahl/Funktion von Treg-Zellen und der Manifestation von Autoimmunerkrankungen ist für den Typ I-Diabetes [Boudaly, S. et al., Eur. Cytokine Netw. 13: 29–37, 2002; Gregori, S. et al., Diabetes 51: 1367–1374, 2002], die Autoimmun-Enzephalomyelitis (Tiermodell der Multiplen Sklerose) [Furtado, G. C. et al., Immunol. Rev. 182: 122–134, 2001; Muhallab, S. et al., Scand. J. Immunol. 55: 264–273, 2002; Hamilton, N. H. et al., Scand. J. Immunol. 55: 171–177, 2002], für die "autoimmune ovarian disease" (AOD) [Tung, K. S. et al., Immunol. Rev. 182: 135–148, 2001], sowie für den Morbus Crohn [Neurath, M. F. et al., J. Exp. Med. 195: 1129–1143, 2002] nachgewiesen worden.
  • Darüber hinaus sind Treg-Zellen auch für die Unterdrückung intestinaler oder pulmonaler Entzündungen verantwortlich [Singh, B. et al., Immunol. Rev. 182: 190–200, 2001; Hori, S. et al., Eur. J. Immunol. 32: 1282–1291, 2002]. Ebenso eindeutig belegt ist die Rolle von Treg-Zellen für die Unterdrückung von Abstossungsepisoden nach allogener(Fremd-)Organtransplantation [Kingsley, Cl. et al., J. Immunol. 168: 1080–1086, 2002; Taylor, P. A. et al., Blood 99: 3493–3499, 2002; Chiffoleau, E. et al., J. Immunol. 168: 5058–5069, 2002]. All diesen immunsupprimierenden Funktionen der Treg-Zellen ist gemeinsam, dass sie sich durch eine hohe Antigenspezifität auszeichnen, d. h. jeder Treg-Zell-Klon ist gegen ein spezielles Antigen gerichtet und inhibiert autoreaktive T-Zellen der gleichen Antigenspezifität unter normalen physiologischen Bedingungen. Im Falle von Autoimmunerkrankungen geht diese Funktion der Treg verloren, und autoreaktive T-Zell-Klone, wie sie im Falle des Typ I Diabetes gegen Proteine der pankreatischen Beta-Zelle gerichtet sind, führen zum Ausbruch der Autoimmunerkrankung.
  • Diese Antigenspezifität kann auf der anderen Seite auch therapeutisch ausgenutzt werden, indem durch gezielte "antigen-spezifische" Aktivierung in vivo oder ex vivo von Treg-Zellen (bzw. von diese Zellen aktivierenden dendritischen Zellen) die Zahl/Funktion dieser Zellen erhöht bzw. wieder hergestellt wird. Dazu ist auch die orale Applikation von "Antigenen" geeignet [Zhang et al., J. Immunol. 167: 4245–4253, 2001]. Die Herstellung solcher Antigene ist jedoch technisch äußerst zeit- und kostenintensiv und auf Antigen-spezifische T-Zell-Klone beschränkt.
  • Die besondere Rolle von TGF-β1 für die Regulation der immunologischen Hyperreaktivität wird durch zwei jüngere Publikationen unterstrichen, die zeigen, dass die durch genetische Manipulation bewirkte Überproduktion von TGF-β1 in CD4+-Zellen das Krankheitsgeschehen zu unterdrücken vermag. Da im Falle des Asthma Th2-Zellen an der Pathogenese entscheidend beteiligt sind, kann durch transgene Überproduktion von TGF-β1 demzufolge die Funktion pathogener Th2-Zelt-Klone wirksam inhibiert werden [Hansen, G. et al., J. Clin. Invest. 105: 61-70, 2000; Thorbecke, G. J. et al., Cytokine Growth Factor Rev. 11: 89–96, 2000]. Der Nachteil dieser Verfahren zur Induktion der Produktion von TGF-β1 in CD4+- bzw. Treg-Zellen ist, daß sie eine genetische Manipulation erforderlich machen, die zum einen sehr aufwendig und zum anderen für eine pharmakologische Anwendung am Menschen oder Tier ungeeignet ist.
  • Die Druckschrift DE-A 102 30 381 betrifft die Verwendung von einem Inhibitor oder mehreren Inhibitoren von Alanyl-Aminopeptidasen und/oder einem oder mehreren Inhibitoren von Enzymen gleicher Substratspezifität zur Induktion der Produktion von TGF-β1 und Expression von TGF-β1 in und/oder auf Treg-Zellen und die Verwendung zur Vorbeugung und/oder Behandlung von Autoimmunerkrankungen, Allergien, Arteriosklerose und zur Unterdrückung von Transplantat-Abstossungen.
  • Es wurde nun überraschend gefunden, dass es der aktivierenden Wirkung von einem oder mehreren Inhibitoren von Alanyl-Aminopeptidasen und/oder von einem oder mehreren Inhibitoren von Peptidasen gleicher Substratspezifität auf Treg-Zellen zuzuschreiben ist, dass die suppressive Aktivität der Treg-Zellen und die Expression von TGF-β1 durch diese Treg-Zellen gefördert werden. Insbesondere wurde überraschend gefunden, dass es möglich ist, Treg-Zellen außerhalb des menschlichen oder tierischen Körpers (ex vivo) durch einen oder mehrere Inhibitoren von Alanyl-Aminopeptidasen und/oder durch einen oder mehrere Inhibitoren von Peptidasen gleicher Substratspezifität zu aktivieren und mittels der aktivierten Treg-Zellen im menschlichen oder tierischen Körper eine Toleranz gegen Alloantigene und Autoantigene zu erzeugen oder sogar eine überschießende Immunantwort im Körper zu überwinden.
  • Die Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Aktivierung regulatorischer T-Zellen (Treg-Zellen) des menschlichen oder tierischen Körpers, umfassend einen Schritt des In-Kontakt-Bringens der regulatorischen T-Zellen (Treg-Zellen) in einem geeigneten flüssigen Medium mit einem oder mehreren Inhibitoren von Alanyl-Aminopeptidase (Aminopeptidase N; APN) und/oder mit einem oder mehreren Inhibitoren von Peptidasen gleicher Substratspezifität unter Induktion einer suppressiven Wirkung der regulatorischen T-Zellen (Treg-Zellen).
  • Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Ex-vivo-Aktivierung regulatorischer T-Zellen (Treg-Zellen) des menschlichen oder tierischen Körpers, umfassend die Schritte:
    • (a) Gewinnen mindestens einer Treg-Zellen umfassenden Körperflüssigkeit aus mindestens einem menschlichen oder tierischen Körper;
    • (b) Isolieren der regulatorischen T-Zellen (Treg-Zellen) aus der/den so gewonnenen menschlichen oder tierischen Körperflüssigkeit(en);
    • (c) In-Kontakt-Bringen der so isolierten und gereinigten regulatorischen T-Zellen in einem geeigneten fluiden oder semifluiden Medium mit einem oder mehreren Inhibitoren von Alanyl-Aminopeptidase (Aminopeptidase N; APN) und/oder mit einem oder mehreren Inhibitoren von Peptidasen gleicher Substratspezifität für eine für eine Aktivierung ausreichende Zeit; und
    • (d) Rückführen der so behandelten regulatorischen T-Zellen (Treg-Zellen) in einem geeigneten Medium in mindestens einen menschlichen oder tierischen Körper.
  • Bevorzugte Ausführungsformen dieses Verfahrens sind in den abhängigen Ansprüchen 3 bis 16 beansprucht.
  • Die Erfindung betrifft auch aktivierte regulatorische T-Zellen (Treg-Zellen), erhältlich nach einem Verfahren, wie es nachfolgend im Detail beschrieben wird.
  • Die Erfindung betrifft weiter eine Zubereitung, die aktivierte regulatorische T-Zellen (Treg-Zellen), wie sie nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt werden, umfasst, gegebenenfalls zusammen mit üblichen Trägern, Hilfsstoffen und/oder Adjuvantien.
  • Die Erfindung betrifft weiter die Verwendung aktivierter regulatorischer T-Zellen (Treg-Zellen) gemäß der nachfolgenden detaillierten Beschreibung und/oder die Verwendung von Zubereitungen, die derartige regulatorische T-Zellen (Treg-Zellen) umfassen, zur Prävention, Milderung oder Therapie von Transplantat-Abstoßungsreaktionen, Autoimmunerkrankungen, Allergien, Asthma bronchiale und COPD, Erkrankungen chronisch entzündlicher Genese, einschließlich Arteriosklerose, neuronalen Erkrankungen und cerebralen Schädigungen, Hauterkrankungen, vorzugsweise Psoriasis, Akne oder Kelloiden, und anderen hyperproliferativen Zuständen, Fibrosen, Tumorerkrankungen und Sepsis.
  • Bevorzugte Verwendungen sind in den abhängigen Ansprüchen 27 bis 38 beansprucht.
  • Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die Figuren näher erläutert. In den Figuren zeigen:
  • 1 eine graphische Darstellung, aus der sich quantitativ die Aktivierung humaner regulatorischer T-Zellen in Gegenwart von Actinonin als Inhibitor der Aminopeptidase N ergibt;
  • 2 eine graphische Darstellung, aus der sich quantitativ die Aktivierung humaner regulatorischer T-Zellen in Gegenwart von PAQ22 als Inhibitor der cytosolischen Aminopeptidase (cAAP) ergibt;
  • 3 eine graphische Darstellung, aus der sich quantitativ die Aktivierung humaner regulatorischer T-Zellen in Gegenwart von IP10.C8 als dualem Inhibitor der Alanyl-Aminopeptidase (APN) und Dipeptidylpeptidase IV (DPIV) ergibt;
  • 4 eine graphische Darstellung, aus der sich quantitativ die Aktivierung muriner regulatorischer T-Zellen in Gegenwart von Phebestin als Inhibitor der Alanyl-Aminopeptidase (APN) ergibt; und
  • 5 eine graphische Darstellung, aus der sich quantitativ der Effekt von ex-situ mit einem Inhibitor der APN (Phebestin) aktivierten regulatorischen T-Zellen (Treg-Zellen) im Colitis-Modell an der Maus ergibt.
  • Die Erfindung wird nun weiter im Einzelnen unter Bezugnahme auf die bevorzugten Ausführungsformen und die Beispiele, in denen die praktische Anwendung bevorzugter Ausführungsformen beschrieben ist, näher erläutert. Es versteht sich jedoch, dass die Erfindung nicht auf die bevorzugten Ausführungsformen, die lediglich zur beispielhaften Erläuterung angegeben werden, beschränkt ist.
  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Aktivierung regulatorischer T-Zellen (Treg-Zellen, CD4+CD25+-Zellen). In der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen werden unter „regulatorischen T-Zellen" solche T-Lymphocyten verstanden, die die Fähigkeit besitzen, pathogene T-Zell-Antworten zu kontrollieren. Treg-Zellen differenzieren sich im Thymus und werden dann in die Körper-Peripherie transportiert. Die Hauptaufgabe von Treg-Zellen im menschlichen bzw. tierischen Organismus besteht darin, die Effektor-Funktion autoreaktiver reifer T-Zellen zu blockieren (Sakaguchi, S. et al., J. Immunol. 155: 1151–1164 (1995); Roncarolo, M. G. et al., J. Exp. Med. 193:, F5–F9).
  • In dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung werden die Treg-Zellen aktiviert. Unter „Aktivierung" wird in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen verstanden, dass eine suppressive Wirkung der Treg-Zellen induziert wird, was sich in einer starken Expression des Transforming Growth Factor β1 (TGF-β1) und des Transskriptions-Faktors FoxP3 äußert. Der Begriff „Aktivierung" umfasst erfindungsgemäß auch eine Reaktivierung von Treg-Zellen. Diese kann beispielsweise erfolgen nach einer Inaktivierung von Treg-Zellen unter inflammatorischen Bedingungen in vitro wie in vivo, z. B. durch längere Einwirkung inflammatorischer Cytokine.
  • Unter dem Begriff „Inhibitor" werden in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen solche Verbindungen natürlichen Ursprungs, synthetischen Ursprungs oder natürlichen Ursprungs mit synthetischer Modifikation verstanden, die eine regulierende Wirkung, insbesondere eine hemmende Wirkung, auf ein Enzym oder auf eine Gruppe von Enzymen haben. Die regulierende Wirkung kann auf unterschiedlichsten Effekten beruhen, ohne dass von der vorstehenden breiten Definition des Begriffs „Inhibitor" beschränkende Abstriche gemacht werden müssen. Bevorzugte Inhibitoren gemäß der Erfindung sind Inhibitoren mit hemmender Wirkung auf Enzyme, weiter bevorzugt auf Gruppen bestimmter Enzyme, beispielsweise Inhibitoren mit hemmender Wirkung auf Alanyl-Aminopeptidase N (APN) und auf Peptidasen mit Alanyl-Aminopeptidase N-gleicher Substratspezifität bzw. Inhibitoren mit hemmender Wirkung auf Dipeptidylpeptidase IV (DP IV) und auf Peptidasen mit Dipeptidylpeptidase IV-gleicher Substratspezifität.
  • Bei dem Schritt den In-Kontakt-Bringens der regulatorischen T-Zellen (Treg-Zellen) mit einem oder mehreren Inhibitoren) der Alanyl-Aminopeptidase und/oder mit einem oder mehreren Inhibitoren) von Peptidasen mit gleicher Substratspezifität kann ein einziger Inhibitor verwendet werden. Alternativ dazu können mehrere Inhibitoren verwendet werden. Besonders bevorzugt ist erfindungsgemäß die Verwendung eines Inhibitors. Der/die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete(n) Inhibitoren) kann/können ein oder mehrere Inhibitor(en) der Alanyl-Aminopeptidase sein. Alternativ dazu kann/können der/ die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete(n) Inhibitor(en) ein oder mehrere Inhibitor(en) von Peptidasen sein, der/die die gleiche Substratspezifität aufweisen wie die Alanyl-Aminopeptidase. Als weitere Alternative kann/können der/die verwendeten(n) Inhibitor(en) ein oder mehrere Inhibitor(en) sowohl der Alanyl-Aminopeptidase als auch von Peptidasen mit gleicher Substratspezifität sein. In einer weiteren alternativen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens können mehrere Inhibitoren verwendet werden, von denen ein oder mehrere Inhibitor(en) der Gruppe der Inhibitoren der Alanyl-Aminopeptidase und ein oder mehrere weitere(r) verwendete(r) Inhibitor(en) der Gruppe der Inhibitoren von Peptidasen mit gleicher Substratspezifität wie die Alanyl-Aminopeptidase entstammt/entstammen.
  • Der verwendete Inhibitor oder – wenn mehrere Inhibitoren verwendet werden – die verwendeten Inhibitoren kann/können ein Inhibitor (wie er nachfolgend in bevorzugten Ausführungsformen näher spezifiziert wird) der Alanyl-Aminopeptidase (Aminopeptidase N; APN; CD13; EC 3.4.11.2) sein, oder der Inhibitor kann ein Inhibitor einer Peptidase sein, die die gleiche Substratspezifität wie die Alanyl-Aminopeptidase hat.
  • Der Begriff „Inhibitor der Alanyl-Aminopeptidase (APN)", wie er in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen verwendet wird, bezieht sich auf solche Substanzen, die die Enzymaktivität der APN und anderer Peptidasen mit gleicher Substratspezifität spezifisch zu hemmen vermögen. Bekanntlich können diese Inhibitoren verschiedenen Strukturtypen angehören. Gemeinsames Charakteristikum der APN-Inhibitoren ist ihre Affinität zum aktiven Zentrum (active site) der APN und der Peptidasen mit gleicher Substratspezifität. Dieses ist charakterisiert durch ein Zn2+-Ion, ein Zink bindendes Motiv mit der Sequenz HEXXH-(X18)-E und das Exopeptidase-Motiv GXMEN. Zu den essentiellen Aminosäure-Resten, die für die Bindung von allen bekannten APN-Inhibitoren im aktiven Zentrum der APN verantwortlich sind, zählen E355, H388, E389, H392, E411 und Y477.
  • Diese molekularen Grundlagen der spezifischen Wechselwirkung von APN-Inhibitoren mit der Alanyl-Aminopeptidase und mit Peptidasen mit gleicher Substratspezifität begründen die von der speziellen Struktur eines Inhibitors unabhängige Verallgemeinerung zur Wirkung und biologischen Rolle der Inhibitoren der APN und der Enzyme mit gleicher Substratspezifität, abgeleitet aus Ergebnissen etablierter Inhibitoren [Xu, W. et al., Curr. Med. Chem. – Anti-Cancer Agents 5: 285–301 (2005); Bouvois, B. et al., Med. Res. Reviews 26: 88–130 (2006)].
  • Der Begriff „Inhibitoren von Peptidasen mit gleicher Substratspezifität (wie Alanyl-Aminopeptidase)", wie er in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen verwendet wird, bezieht sich im Sinne der voranstehenden Ausführungen auf Inhibitoren solcher Peptidasen, deren Wirkung unter Einbezug des hoch-konservierten Zink-Bindungsmotivs und des Exopeptidase-Motivs definiert werden kann. Beispiele solcher Peptidasen sind cytosolische Aminopeptidase (cAAP; EC 3.4.11.14), Aminopeptidase A (APA; EC 3.4.11.7), Thyrotropin-releasing Hormone-degrading Ectoenzyme (TRH-DE; EC 3.4.19.6), Adipocyte-derived Leucine Aminopeptidase (A-LAP; EC 3.4.11.x), Insulin-Regulated Aminopeptidase (IRAP; EC 3.4.11.3), Aminopeptidase B (APB; EC 3.4.11.6), Leukotriene A4 Hydrolase (LTA4H; EC 3.3.2.6) und Leukocyte-Derived Arginine Aminopeptidase (L-RAP; EC 3.4.11.x), ohne auf die vorgenannten Beispiele beschränkt zu sein [Albiston, A.L. et al., Protein and Peptide Letters, Band XI, Nr. 5, 491–500 (2004)].
  • Erfindungsgemäß ist die Verwendung von Inhibitoren der Alanyl-Aminopeptidase (Aminopeptidase N; APN; CD13; EC 3.4.11.2.) besonders bevorzugt.
  • In dem erfindungsgemäß aufgrund der unerwarteten Aktivierungsergebnisse besonders bevorzugten Verfahren zur Aktivierung regulatorischer T-Zellen (Treg-Zellen) findet der Schritt der Aktivierung ex-vivo statt. Darunter wird im Rahmen der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen verstanden, dass das erfindungsgemäß bevorzugte Verfahren kein am menschlichen oder tierischen (lebenden) Organismus durchgeführtes Verfahren ist. Vielmehr wird der Aktivierungsschritt mit vom lebenden menschlichen oder tierischen Körper entnommener Substanz in vitro durchgeführt, und die erfindungsgemäß behandelte Substanz wird anschließend in geeigneter Form dem menschlichen oder tierischen Körper wieder zugeführt. Wie sich den weiter unten aufgezeigten Beispielen anhand besonders bevorzugter Ausführungsformen entnehmen lässt, werden auf diesem Wege Aktivierungsergebnisse der Treg-Zellen erhalten, die für den Fachmann unerwartet sind.
  • Im ersten Schritt des erfindungsgemäß bevorzugten Ex-vivo-Verfahrens zur Aktivierung regulatorischer T-Zellen (Treg-Zellen) des menschlichen oder tierischen Körpers wird aus mindestens einem, bevorzugt aus genau einem, menschlichen oder tierischen Körper mindestens eine Körperflüssigkeit gewonnen, die der Gewinnung von Treg-Zellen dienen kann, die also Treg-Zellen umfaßt. Es kann eine Treg-Zellen umfassende Körperflüssigkeit aus einem menschlichen oder tierischen Körper gewonnen werden, oder es können mehrere Treg-Zellen umfassende Körperflüssigkeiten aus einem menschlichen oder tierischen Körper gewonnen werden. Dies kann aus an sich dem Fachmann bekannten Weg am bzw. vom lebenden menschlichen oder tierischen Körper geschehen und hängt hinsichtlich der Technik der Gewinnung von der infrage kommenden Körperflüssigkeit ab. Es kann als Weg der Gewinnung einer oder mehrerer Körperflüssigkeit(en) ein Weg der Abgabe der Körperflüssigkeit(en) durch den menschlichen oder tierischen Körper (beispielsweise bei Exsudaten) oder ein Weg der Abnahme der Körperflüssigkeit(en) (beispielsweise bei Blut) durch einen Fachmann infrage kommen.
  • In besonders bevorzugten, die Erfindung jedoch nicht beschränkenden Ausführungsformen des Verfahrens gewinnt man aus einem menschlichen oder tieri schen Körper eine oder mehreren Körperflüssigkeiten, die gewählt sind aus Blut, Fraktionen von Blut, Lymphe, Exsudaten oder lokalen Kompartimenten. Praktischerweise gewinnt man eine einzige Körperflüssigkeit, die aus den vorgenannten Körperflüssigkeiten ausgewählt ist. Wenn aus einem menschlichen oder tierischen Körper Blut isoliert wird, wählt man vorzugsweise peripheres Blut, noch weiter bevorzugt intravenöses Blut. Als lokale Kompartimente können beispielsweise bevorzugt Pleura oder Peritoneum isoliert werden. Besonders bevorzugt wird aus einem menschlichen oder tierischen Körper peripheres Blut, mit besonderem Vorteil intravenöses Blut, gewonnen. In intravenösem bzw. peripherem Blut sind Treg-Zellen natürlicherweise in Konzentrationen vorhanden, die die im Folgeschritt erfolgende Isolierung praktisch erleichtern.
  • Aus der/den im ersten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens gewonnenen Körperflüssigkeit(en), vorzugsweise also aus einer der vorgenannten Körperflüssigkeiten, insbesondere aus einer der vorgenannten, aus einem menschlichen oder tierischen Körper gewonnenen Körperflüssigkeiten, ganz besonders aus Blut und mit besonderem Vorteil aus peripherem Blut, beispielsweise aus intravenösem Blut, werden regulatorische T-Zellen (Treg-Zellen) im nachfolgenden Verfahrensschritt isoliert. Dies kann in jeder denkbaren, dem Fachmann für das Isolieren von Treg-Zellen bekannten Verfahrensweise geschehen, ohne dass die Erfindung diesbezüglich Beschränkungen unterworfen ist. Insbesondere sind für die Isolierung von Treg-Zellen Trenn-Kits kommerziell erhältlich, mit deren Hilfe ein Isolieren von Treg-Zellen aus einer der vorgenannten Körperflüssigkeiten zuverlässig erfolgen kann.
  • Ausgehend von den Körperflüssigkeiten bzw. von der speziellen, im ersten Verfahrensschritt gewonnenen Körperflüssigkeit, beispielsweise von peripherem Blut bzw. von intravenösem Blut, werden durch geeignete Trennverfahren Zellfraktionen abgetrennt, die auch die regulatorischen T-Zellen (Treg-Zellen) umfassen. Beispielsweise kann man in an sich bekannter Weise durch Dichtegradienten-Zentrifugation aus peripherem Spenderblut mononukleare Zellen und aus diesen angereicherte T-Zellen durch unterschiedliche, dem Fachmann allgemein bekannte Verfahren gewinnen, die Treg-Zellen umfassen. Aus der so erhaltenen Zellfraktion lassen sich regulatorische T-Zellen (Treg-Zellen) durch den Eigenschaften der Treg-Zellen Rechnung tragende Trennverfahren gewinnen, z. B. (ohne Beschränkung) unter Nutzung von Zell-typischen Antikörpern, die an Magnet-Partikel geknüpft sind. Erfindungsgemäß hat sich eine zweistufige Magnetseparation bewährt. In deren erstem Verfahrensschritt kann die im vorangehenden Verfahrensschritt gewonnene Zell-Population an CD4–-Zellen abgereichert werden, wobei erfindungsgemäß CD4+-Zellen zurückbleiben. Dies kann beispielsweise mittels kommerziell erhältlicher Trenn-Kits geschehen, beispielsweise mit einem CD4–-Separations-Kit, wie es von der Firma Miltenyi Biotech, Bergisch-Gladbach, Deutschland, vertrieben wird. Damit lassen sich CD4+-T-Zellen bereits mit einer Reinheit von > 95% gewinnen. Im zweiten Magnetsäulen-Separations-Schritt wird dann die verbliebene Zell-Population mit anti-CD25-MicroBeads (Firma Miltenyi Biotech, Bergisch-Gladbach, Deutschland) behandelt und mittels CD25-Markierung CD4+CD25+-T-Zellen (regulatorische T-Zellen; Treg-Zellen) durch Magnetsäulen-Separation gewonnen. Auf diesem Weg lassen sich hochreine regulatorische T-Zellen (Treg-Zellen) isolieren. Mit anderen Worten: Der Schritt der Isolierung der Treg-Zellen ist von einer Reinigung der Treg-Zellen begleitet, also einer Beseitigung anderer Zellen, Zell-Komponenten oder anderer Materialien, die der späteren Aktivierung der Treg-Zellen entgegenstehen oder diese behindern oder gar verhindern könnten. Die Erfindung ist jedoch nicht auf dieses lediglich als Beispiel angegebene Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Treg-Zellen beschränkt.
  • Im nächsten Verfahrens-Schritt werden die so gewonnenen und gereinigten regulatorischen T-Zellen in einem geeigneten fluiden Medium mit einem oder mehreren Inhibitoren von Alanyl-Aminopeptidase (Aminopeptidase N; APN) und/oder mit einem oder mehreren Inhibitoren von Peptidasen gleicher Substratspezifität für eine für eine Aktivierung ausreichende Zeit in Kontakt gebracht. Dies kann in jeder beliebigen, dem Fachmann auf diesem Gebiet be kannten und geläufigen Art geschehen, ohne dass die Erfindung diesbezüglich Beschränkungen unterliegt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt das In-Kontakt-Bringen von Treg-Zellen und einem oder mehreren Inhibitor(en) gemäß der nachfolgenden spezifischen, auf die Inhibitoren gerichteten Beschreibung in einem geeigneten fluiden Medium.
  • Unter einem „fluiden Medium" werden in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen in erster Linie flüssige Zellkultur-Medien verstanden, wie sie in unterschiedlicher Form mit und ohne Eiweiß- und Serum-Bestandteile kommerziell erhältlich sind; dies stellt jedoch keine Beschränkung der Erfindung dar, sondern nur eine Konzentration auf die praktisch vordringlichen Möglichkeiten. Bevorzugt sind natürlicherweise wässrige Medien, denen gemeinsam ist, dass sie physiologisch annehmbar sein sollten, und zwar nicht nur aus praktischen Gründen der späteren Reinfundierbarkeit der Treg-Zellen in einen menschlichen oder tierischen Körper, sondern auch im Hinblick auf einen natürlich ablaufbaren Aktivierungsprozeß unter Bedingungen, die den in vivo vorhandenen Bedingungen möglichst nahe kommen. Die besonders bevorzugt verwendeten Medien sind also gewählt aus physiologisch annehmbaren Lösungen, Zellkulturmedien und Nährmedien. Noch mehr bevorzugt sind diese Medien gewählt aus der Gruppe, die besteht aus physiologisch annehmbaren wässrigen Lösungen, wässrigen Zellkulturmedien und wässrigen Nährmedien. In besonders bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens wird für den Aktivierungsprozeß als Medium serumfreies AIMV-Medium gewählt. Die vorgenannten Medien können einzeln oder in Kombinationen von zwei oder mehreren von ihnen gewählt werden. Besonders bevorzugt ist die Verwendung von Medien, die zum überwiegenden Teil Wasser enthalten oder im Wesentlichen aus Wasser bestehen.
  • Weiter ist es gemäß der vorliegenden Erfindung bevorzugt, einem für den Aktivierungsprozeß vorgesehenen fluiden Medium in einer Zellkultur und/oder Zelltherapie übliche Zusatzstoffe zuzusetzen, die ein Fachmann aufgrund seines Fachwissens kennt. Beispielhaft seien Antibiotika, Aminosäure-Supplemente, Vitamin-Supplemente und Spurenelement-Supplemente genannt, die einzeln oder in Kombination von zwei oder mehreren der genannten Substanzgruppen in dem für den Aktivierungsprozess vorgesehenen Medium bzw. den vorgesehenen Medien.
  • Die wie oben beschrieben isolierten (und gereinigten) regulatorischen T-Zellen (Treg-Zellen) werden mit einem oder mehreren Inhibitoren, wie sie nachfolgend im Einzelnen beschrieben werden, für eine für eine Aktivierung ausreichende Zeit in Kontakt gebracht. Gegebenenfalls ist der Zusatz von Interleukin-2, vorzugsweise 20 bis 100 U/ml, zum Kulturmedium förderlich und/oder ist eine Stimulation mit Hilfe von Mitogenen wie PHA oder PWM und/oder mit Hilfe von anti-CD3-Antikörpern förderlich. Die Inkubationszeit kann vom Fachmann im Rahmen orientierender Experimente für ein bestimmtes System leicht ermittelt werden. Sie liegt erfahrungsgemäß im Bereich von 24 bis 48 h, ohne auf diesen Bereich beschränkt zu sein.
  • Erfindungsgemäß werden die wie oben beschrieben isolierten regulatorischen T-Zellen mit einem oder mehreren Inhibitoren von Alanyl-Aminopeptidase (Aminopeptidase N; APN) und/oder mit einem oder mehreren Inhibitoren von Peptidasen mit gleicher Substratspezifität in Kontakt gebracht. Es kann ein Inhibitor in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden, um die Treg-Zellen zu aktivieren, oder es können mehrere Inhibitoren eingesetzt werden. Ein einzelner Inhibitor kann ein Inhibitor der Alanyl-Aminopeptidase sein, oder ein einzelner Inhibitor kann ein Inhibitor einer Peptidase mit gleicher Substratspezifität sein. Bei Verwendung mehrerer Inhibitoren können zwei oder noch mehr Inhibitoren in Kombination verwendet werden. Diese zwei oder mehreren Inhibitoren können alle Inhibitoren der Alanyl-Aminopeptidase sein oder können alle Inhibi toren von Peptidasen mit gleicher Substratspezifität sein, oder die zwei oder mehreren Inhibitoren können Inhibitoren sein, die zum Teil der Gruppe der Inhibitoren der Alanyl-Aminopeptidase und zum Teil der Gruppe der Inhibitoren von Peptidasen mit gleicher Substratspezifität entstammen, oder die Inhibitoren der Alanyl-Aminopeptidase und gleichzeitig auch Inhibitoren von (einer oder mehreren) Peptidasen mit gleicher Substratspezifität wie Alanyl-Aminopeptidase sind. Besonders bevorzugt wird ein einzelner Inhibitor einer der beiden vorgenannten Gruppen verwendet, und die Verwendung eines Inhibitors der Alanyl-Aminopeptidase ist ganz besonders bevorzugt.
  • In erfindungsgemäß bevorzugten Ausführungsformen des Verfahrens verwendet man als den mindestens einen Inhibitor der Alanyl-Aminopeptidase und/oder als den mindestens einen Inhibitor von Peptidasen mit gleicher Substratspezifität einen oder mehrere bekannte Inhibitoren aus der Gruppe Actinonin, Leuhistin, Phebestin, Amastatin, Bestatin, Probestin, Arphamenin A, Arphamenin B, MR 387A, MR 387B, β-Aminothiole, α-Aminophosphinsauren und deren Ester und Salze, α-Aminophosphonate, α-Aminoboronsäuren, α-Aminoaldehyde, Hydroxamate von α-Aminosäuren, N-Phenylphthalimide, N-Phenylhomophthalimide, α-Ketoamide, Thalidomid und dessen Derivate. Die vorgenannten Namen stellen allgemein übliche, dem Fachmann geläufige Namen von Inhibitoren bzw. von Substanzgruppen dar, die als Inhibitoren in dem erfindungsgemäßen Aktivierungsverfahren verwendbar sind.
  • Die Bezeichnung „MR 387A" steht bekanntermaßen für die Substanz
    Figure 00160001
    mit dem systematischen Namen C(2S,3R)-3-amino-2-hydroxy-4-phenylbutanoyl-L-valyl-L-prolyl-L-leucin, und die Bezeichnung „MR 387B" steht bekanntermaßen für die Substanz
    Figure 00170001
    mit dem systematischen Namen C(2S,3R)-3-amino-2-hydroxy-4-phenylbutanoyl-L-valyl-L-prolyl-(R)-hydroxy-L-prolin.
  • Rein beispielhaft, und ohne die vorliegende Erfindung hierauf zu beschränken, können als geeignete Inhibitoren der Alanyl-Aminopeptidase folgende Verbindungen genannt werden, die allein oder in Kombination von mehreren von ihnen zur Aktivierung von Treg-Zellen verwendet werden können:
    Figure 00170002
    Figure 00180001
    Arphamenin A = 5-Amino-8-{[amino-(imino-)methyl-]amino-}2-benzyl-4-oxooctansäure
    Figure 00190001
    Arphamenin B = 5-Amino-8-{[amino-(imino-)methyl-]amino-}2-(4-hydroxybenzyl)-4-oxooctansäure
    Figure 00190002
    β-Aminothiole: (Compd. = Verbindung)
    Figure 00200001
    Figure 00210001
    Figure 00220001
    Figure 00230001
    α-Aminoboronsäuren: (Compd. = Verbindung)
    Figure 00240001
    α-Aminoaldehyde: (Compd. = Verbindung)
    Figure 00250001
    N-Phenylphthalimide und -homophthalimide: (Compd. = Verbindung)
    Figure 00260001
    α-Ketoamide: (Compd. = Verbindung)
    Figure 00270001
  • Die Verbindungen sind in der Druckschrift „Xu, W. et al.; Curr. Med. Chem. – Anti-Cancer Agents 5: 281 bis 301 (2005)" im Detail genannt und hinsichtlich ihrer inhibitorischen Wirkung auf Alanyl-Aminopeptidase beschrieben; der Inhalt dieser Druckschrift wird durch die Inbezugnahme in die Offenbarung der vorliegenden Anmeldung übernommen.
  • Mehr bevorzugt ist es in dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Aktivierung von regulatorischen T-Zellen (Treg-Zellen), als den mindestens einen Inhibitor der Alanyl-Aminopeptidase und/oder als den mindestens einen Inhibitor von Peptidasen mit gleicher Substratspezifität einen oder mehrere bekannte Inhibi toren aus der Gruppe α-Ketoamide, α-Aminophosphinsäuren, N-Phenylhomophthalimide und α-Aminophosphonate zu verwenden. Werden α-Ketoamide verwendet, kann besonders bevorzugt eine Verbindung aus der Gruppe der 3-Amino-2-oxo-4-phenyl-butansäureamide zum Einsatz kommen. Werden α-Aminophosphinsäuren verwendet, kann besonders bevorzugt D-Pheγ[PO(OH)-CH2]-Phe-Phe zum Einsatz kommen. Werden N-Phenylhomophthalimide verwendet, kann besonders bevorzugt PAQ-22 zum Einsatz kommen. Werden α-Aminophosphonate verwendet, können besonders bevorzugt RB3014 und/oder Phebestin zum Einsatz kommen. Von den genannten bevorzugten Verbindungen werden als der mindestens eine Inhibitor der Alanyl-Aminopeptidase und/oder als der mindestens eine Inhibitor von Peptidasen mit gleicher Substratspezifität ganz besonders bevorzugt PAQ-22, RB3014 und/oder Phebestin verwendet. Mit besonderem Vorteil kann man unter Erhalt außergewöhnlich guter Aktivierungsergebnisse für die zu aktivierenden Treg-Zellen außergewöhnlich bevorzugt als den mindestens einen Inhibitor der Alanyl-Aminopeptidase und/oder als den mindestens einen Inhibitor von Peptidasen mit gleicher Substratspezifität PAQ-22 verwenden oder kann mehrere bekannte Inhibitoren verwendet, die PAQ-22 umfassen (also von denen einer PAQ-22 ist). Dabei steht die Kurzbezeichnung RB3014 für die Substanz
    Figure 00290001
    mit dem systematischen Namen 2-{3[(1-Aminoethyl-)hydroxyphosphinoyl]-2-benzyl-propionylamino-}3-phenylpropionsäure. PAQ-22 steht für die Substanz
    Figure 00300001
    mit dem systematischen Namen 3-(2,6-Diethylphenyl-)chinazolin-2,4(1H3H)dion.
  • In einer weiteren, erfindungsgemäß ebenfalls bevorzugten Ausführungsform verwendet man als den mindestens einen Inhibitor der Alanyl-Aminopeptidase und/oder als den mindestens einen Inhibitor von Peptidasen mit gleicher Substratspezifität einen oder mehrere bekannte Inhibitoren aus der Gruppe dualer Inhibitoren der Alanyl-Aminopeptidase oder von Peptidasen mit gleicher Substratspezifität und der Dipeptidylpeptidase (IV) oder von Peptidasen mit gleicher Substratspezifität aus der Gruppe der Verbindungen der allgemeinen Formeln (1) und (2) A-B-D-B'-A' (1)und A-B-D-E (2),worin
    • – A und A' gleich oder verschieden sein können und für den Rest
      Figure 00300002
      stehen, worin X für S, O, CH2, CH2CH2, CH2O oder CH2NH steht und Y für H oder CN steht und * ein chirales Kohlenstoff-Atom vorzugsweise in der S- bzw. L-Konfiguration bezeichnet;
    • – B und B' gleich oder verschieden sein können und für einen O, N oder S enthaltenden oder nicht enthaltenden, unsubstituierten oder substituierten, unverzweigten oder verzweigten Alkylen-Rest, Cycloalkylen-Rest, Aralkylen-Rest, Heterocycloalkylen-Rest, Heteroarylalkylen-Rest, Arylamidoalkylen-Rest, Heretoarylamidoalkylen-Rest, unsubstituierten oder einfach oder mehrfach substituierten Arylen-Rest oder Heteroarylen-Rest mit einem oder mehreren fünf-, sechs- oder siebengliedrigen Ring(en) stehen;
    • – D für -S-S- oder -Se-Se- steht; und
    • – E für die Gruppe -H2-CH(NH2)-R9 bzw. -CH2-*CH(NH2)-R9 steht, worin R9 für einen O, N oder S enthaltenden oder nicht enthaltenden unsubstituierten oder substituierten unverzweigten oder verzweigten Alkyl-Rest, Cycloalkyl-Rest, Aralkyl-Rest, Heterocycloalkyl-Rest, Heteroarylalkyl-Rest, Arylamidoalkyl-Rest, Heteroarylamidoalkyl-Rest, unsubstituierten oder einfach oder mehrfach substituierten Aryl-Rest oder Heteroaryl-Rest mit einem oder mehreren fünf-, sechs- oder siebengliedrigen Ringen steht und * ein chirales Kohlenstoff-Atom vorzugsweise in der 5- bzw. L-Konfiguration bezeichnet;
    • – oder deren Säureadditionssalze mit organischen und/oder anorganischen Säuren.
  • Unter „dualen Inhibitoren" werden in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen Inhibitoren verstanden, die Inhibitoren sowohl der Alanyl- Aminopeptidase und/oder Inhibitoren von Peptidasen mit gleicher Substratspezifität (gemäß der obigen Definition) sind, als auch Inhibitoren der Dipeptidylpeptidase IV (DP IV; CD26; EC 3.4.14.5) und/oder Inhibitoren von Peptidasen mit gleicher Substratspezifität sind.
  • Unter dem Begriff „Inhibitoren der Dipeptidylpeptidase IV (DP IV)" werden in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen solche Substanzen verstanden, die in der Lage sind, die Enzymaktivität der DP IV und anderer Peptidasen mit gleicher Substratspezifität spezifisch zu hemmen. Dabei können diese DP IV-Inhibitoren verschiedenen Strukturgruppen angehören. Gemeinsames Charakteristikum dieser Inhibitoren ist ihre Affinität zum aktiven Zentrum (active site) der DP IV und der Peptidasen mit gleicher Substratspezifität. Dieser molekulare Bereich der DP IV und anderer Peptidasen mit gleicher Substratspezifität ist gekennzeichnet durch die Aminosäure-Reste S630, D708, H740 („katalytische Triade"), E205, E206 und Y547. Darüber hinaus gehören zu den Inhibitor-bindenden Aminosäure-Resten die Reste Y666, F357 und R358.
  • Diese molekularen Grundlagen der spezifischen Wechselwirkung von DP IV-Inhibitoren und der Inhibitoren von Peptidasen mit gleicher Substratspezifität begründen von der speziellen Struktur der Inhibitoren unabhängige Verallgemeinerungen zur Wirkung und biologischen Rolle dieser Inhibitoren, die aus den Ergebnissen der Bindung etablierter Inhibitoren abgeleitet sind [vgl. Sedo, A. et al.;, Biochimica et Biophysica Acta 1550: 107–116 (2001)].
  • Der vorgenannten Druckschrift sind auch zahlreiche Beispiele der Peptidasen zu entnehmen, die eine mit der Dipeptidylpeptidase IV gleiche Substratspezifität aufweisen (in einem analogem Sinn zu der oben bereits definierten Peptidasen mit der APN gleichen Substratspezifität). Darunter fallen beispielsweise (ohne Beschränkung) Fibroblasten-Aktivierendes Protein α, Dipeptidylpeptidase IV β, Dipeptidyl-Aminopeptidase-ähnliches Protein (DPPX), NAALADase (N-acetylierte α-verknüpfte saure Dipeptidase), QPP (Quiescent Cell Proline Di peptidase), Dipeptidylpeptidase II (DP II), Attractin (Mahogany Protein), Dipeptidylpeptidase 8 (DP 8) und Dipeptidylpeptidase 9 (DP 9).
  • In den Verbindungen der obigen allgemeinen Formeln (1) und (2), die duale Inhibitoren im Sinne der obigen Definition sind, stehen A und A', die gleich oder verschieden sein können, für einen Rest
    Figure 00330001
    worin X für S, O, CH2, CH2CH2, CH2O oder CH2NH steht und Y für H oder CN steht und * für ein chirales Kohlenstoff-Atom steht. Besonders bevorzugt sind erfindungsgemäß Verbindungen der allgemeinen Formeln (1), in denen A und A' gleich sind, sowie Verbindungen der allgemeinen Formeln (1) und (2), in denen in dem obigen für A stehenden Rest X für S, CH2 oder CH2CH2 und/oder Y für H oder CN steht.
  • In weiter bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung stellen solche Verbindungen der allgemeinen Formeln (1) und (2) Prodrugs zu besonders bei der Aktivierung von Treg-Zellen wirksamen Inhibitoren dar, in denen das mit * bezeichnete chirale Kohlenstoff-Atom eine S- bzw. L-Konfiguration aufweist.
  • Unter dem Begriff „Prodrug" werden in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen natürlich vorkommende oder synthetische oder natürlich vorkommende, jedoch synthetisch modifizierte Verbindungen verstanden, aus denen sich andere Verbindungen unter bestimmten Bedingungen, vorzugsweise unter physiologischen oder pathologischen Bedingungen oder unter Bedingungen einer gewünschten chemischen Reaktion (wie z. B. der Aktivierung von Treg-Zellen), chemisch ableiten bzw. derivatisieren lassen, wobei diese ande ren Verbindungen eine chemische oder pharmakologische Wirksamkeit entfalten, die sich qualitativ und/oder quantitativ von der der Ausgangssubstanz (des „Prodrugs") unterscheidet. So werden unter Inhibitor-Prodrugs Verbindungen natürlicher oder synthetischer Herkunft oder natürliche, jedoch synthetisch modifizierte Verbindungen verstanden, die vorzugsweise unter physiologischen oder pathologischen Bedingungen oder Bedingungen einer gewünschten chemischen Reaktion, gezielt zu neuen Substanzen mit inhibitorischer Wirksamkeit reagieren können. Dies schließt nicht aus, dass diese Prodrugs als solche auch schon vor der Umwandlung in Drugs mit bestimmter pharmakologischer (beispielsweise inhibitorischer) Wirksamkeit in der Lage sind, pharmakologische Wirksamkeit zu entfalten (beispielsweise eines der beiden oben genannten Enzyme zu hemmen). Bedingungen zur Umwandlung von Prodrugs in Drugs im Säuger bzw. Menschen können solche sein, wie sie regelmäßig in der physiologischen Umgebung eines Säugers, beispielsweise eines Menschen, oder im Körper eines Säugers, beispielsweise eines Menschen, vorliegen. Alternativ können solche physiologischen Bedingungen nur unter bestimmten, beispielsweise einen bestimmten physiologischen Zustand wie beispielsweise ein Krankheitsbild bestimmenden, Bedingungen in einem Säuger wie beispielsweise in einem Menschen vorliegen, oder sie können durch äußere Einwirkung, beispielsweise (ohne Beschränkung) durch medikamentöse Einwirkung, auf den Organismus eines Säugers wie beispielsweise den Organismus eines Menschen, oder durch Schaffung bestimmter chemischer Reaktionsbedingungen induziert oder eingestellt werden.
  • In den Verbindungen der obigen allgemeinen Formeln (1) und (2) können B und B' gleich oder verschieden sein und stehen für einen O, N oder S enthaltenden oder nicht enthaltenden, unsubstituierten oder substituierten, unverzweigten oder verzweigten Alkylen-Rest, Cycloalkylen-Rest, Aralkylen-Rest, Heterocycloalkylen-Rest, Heteroarylalkylen-Rest, Arylamidoalkylen-Rest, Heteroarylamidoalkylen-Rest, unsubstituierten oder einfach oder mehrfach substituierten Arylen- Rest oder Heteroarylen-Rest mit einem oder mehreren fünf-, sechs- oder siebengliedrigen Ringen.
  • In der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen wird unter dem Begriff „Alkyl-Rest" verstanden ein einwertiger geradkettiger („unverzweigter") oder verzweigter Rest aus aneinander über Einfachbindungen gebundenen Kohlenstoffatomen mit an die Kohlenstoff-Atome gebundenen Wasserstoff-Atomen. Alkyl-Reste im Sinne der vorliegenden Erfindung sind also gesättigte einwertige Kohlenwassertoff-Reste. Bevorzugterweise umfassen die Alkyl-Reste in den Verbindungen der allgemeinen Formeln (1) und (2) 1 bis 18 Kohlenstoff-Atome und sind damit gewählt aus den Resten Methyl, Ethyl, n-Propyl, i-Propyl und den zahlreichen verschiedenen geradkettigen und verzweigten Isomeren der Reste Butyl, Pentyl, Hexyl, Heptyl, Octyl, Nonyl, Decyl, Undecyl, Dodecyl, Tridecyl, Tetradecyl, Pentadecyl, Hexadecyl, Heptadecyl und Octadecyl. Besonders bevorzugt sind geradkettige und verzweigte Alkyl-Reste mit 1 bis 12 Kohlenstoff-Atomen, und geradkettige und verzweigte Alkyl-Reste mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen sind noch mehr bevorzugt. Am meisten bevorzugt sind die Reste Methyl, Ethyl, n-Propyl, i-Propyl, n-Butyl, i-Butyl, sec-Butyl und tert-Butyl.
  • Entsprechend werden in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen unter den Begriffen „Alkenyl-Rest" und „Alkinyl-Rest” einwertige geradkettige („unverzweigte") oder verzweigte Reste aus aneinander über Einfachbindungen und mindestens eine Doppelbindung bzw. Dreifachbindung an beliebiger, aber definierter Stelle im Molekül gebundenen Kohlenstoff-Atomen mit an die restlichen Bindungen der Kohlenstoff-Atome gebundenen Wasserstoff-Atomen verstanden, die mindestens 2 Kohlenstoff-Atome und bis zu 18 Kohlenstoff-Atome aufweisen. Als solche Reste kommen beispielsweise bevorzugt Vinyl-Reste oder Allyl-Reste infrage; Kohlenstoff-Kohlenstoff-Mehrfachbindungen aufweisende Reste sind jedoch nicht auf die beiden vorgenannten Reste beschränkt.
  • In der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen wird unter dem Begriff „Alkylen-Rest" verstanden ein zweiwertiger geradkettiger („unverzweigter”) oder verzweigter Rest aus aneinander über Einfachbindungen gebundenen Kohlenstoffatomen mit an die Kohlenstoff-Atome gebundenen Wasserstoff-Atomen. Alkylen-Reste im Sinne der vorliegenden Erfindung sind also gesättigte zweiwertige Kohlenwassertoff-Reste. Bevorzugterweise umfassen die Alkylen-Reste in den Verbindungen der allgemeinen Formeln (1) und (2) 1 bis 18 Kohlenstoff-Atome und sind damit gewählt aus den Resten Methylen, Ethylen, n-Propylen, 2,2-Propylen, 1,2-Propylen und den zahlreichen verschiedenen geradkettigen und verzweigten Isomeren der Reste Butylen, Pentylen, Hexylen, Heptylen, Octylen, Nonylen, Decylen, Undecylen, Dodecylen, Tridecylen, Tetradecylen, Pentadecylen, Hexadecylen, Heptadecylen und Octadecylen. Besonders bevorzugt sind geradkettige und verzweigte Alkylen-Reste mit 1 bis 12 Kohlenstoff-Atomen, und geradkettige und verzweigte Alkylen-Reste mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen sind noch mehr bevorzugt. Am meisten bevorzugt sind die Reste Methylen, Ethylen, n-Propylen, 2,2-Propylen, 1,2-Propylen und die zahlreichen verschiedenen Butylen-Stellungsisomere.
  • In den Alkyl-Resten und/oder den Alkylen-Resten, die erfindungsgemäß Teil der Verbindungen der allgemeinen Formeln (1) und (2) sein können, können die Ketten aus Kohlenstoff-Atomen durch -O-Atome, -N-Atome oder -S-Atome unterbrochen sein; es können sich also im Verlauf der Kette statt einer oder mehrerer -CH2-Gruppe(n) eine oder mehrere Gruppe(n) aus der Gruppe -O-, -NHund -S- befinden, wobei üblicherweise nicht zwei der Gruppen -O-, -NHund/oder -S- in der Kette aufeinander folgen. Die eine oder mehreren Gruppe(n) -O-, -NH- oder -S- können dabei an beliebigen Stellen im Molekül eingeführt sein. Vorzugsweise ist dann, wenn eine derartige Hetero-Gruppe vorhanden ist, eine derartige Gruppe im Molekül enthalten.
  • Sowohl geradkettige als auch verzweigte Alkyl- oder Alkylen-Reste in den Verbindungen der allgemeinen Formeln (1) und (2) können erfindungsgemäß in einer weiteren Ausführungsform mit einem oder mehreren Substituenten, vorzugsweise mit einem Substituenten, substituiert sein. Der/die Substituent(en) kann/können an beliebigen Positionen des aus Kohlenstoffatomen gebildeten Grundgerüsts stehen und kann/können vorzugsweise, ohne die Erfindung hierauf zu beschränken, gewählt sein aus der Gruppe, die besteht aus Halogenatomen wie Fluor, Chlor, Brom und Iod, besonders bevorzugt Chlor und Brom, Alkyl-Gruppen mit 1 bis 6 C-Atomen, besonders bevorzugt Alkyl-Gruppen mit 1 bis 4 C-Atomen, Alkoxy-Gruppen mit 1 bis 6 C-Atomen im Alkyl-Rest, vorzugsweise mit 1 bis 3 C-Atomen im Alkyl-Rest, unsubstituierten oder mit einem oder zwei Alkylresten mit jeweils unabhängig voneinander 1 bis 6 C-Atomen, vorzugsweise 1 bis 3 C-Atomen, substituierten Amino-Gruppen, Carbonyl-Gruppen und Carboxyl-Gruppen. Letztere können auch in Form von Salzen oder Estern mit Alkoholen mit 1 bis 6 Kohlenstoff-Atomen im Alkyl-Rest vorliegen; der Begriff „Carboxyl-Gruppen" schließt also Gruppen der Grundstruktur -COO– M+ (mit M = einwertiges Metallatom wie z. B. Alkalimetall-Atom oder entsprechendes Äquivalent eines mehrwertigen Metallatoms wie z. B. halbes Äquivalent eines zweiwertigen Metallatoms wie beispielsweise eines Erdalkalimetall-Atoms) oder der Grundstruktur -COORx (mit Rx = Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoff-Atomen) ein. Die substituierenden Alkyl-Gruppen sind gewählt aus den oben im einzelnen definierten Alkyl-Gruppen und sind ganz besonders bevorzugt Methyl-Gruppen, Ethyl-Gruppen, n-Propyl-Gruppen, i-Propyl-Gruppen, n-Butyl-Gruppen, i-Butyl-Gruppen, sec-Butyl-Gruppen oder tert-Butyl-Gruppen. Alkoxy-Gruppen sind Alkyl-Gruppen im oben definierten Sinn, die über ein Brücken-O-Atom an das aus Kohlenstoff-Atomen gebildete Grundgerüst gebunden sind. Sie sind bevorzugt gewählt aus der Gruppe, die besteht aus den Resten Methoxy, Ethoxy, n-Propoxy, i-Propoxy; n-Butoxy, i-Butoxy, sec-Butoxy und tert-Butoxy. Aminogruppen sind Gruppen der Grundstruktur -NRxRy, worin die Reste Rx und Ry unabhängig voneinander stehen können für Wasserstoff oder Alkyl-Gruppen (entsprechend der obigen Definition) mit 1 bis 6 Kohlen stoff-Atomen, besonders bevorzugt mit 1 bis 3 C-Atomen, wobei die Reste Rx und Ry gleich oder voneinander verschieden sein können. Besonders bevorzugte Amino-Gruppen als Substituenten sind die Gruppen -NH2, -NH(CH3), -N(CH3)2, -NH(C2H5) und -N(C2H5)2. Unter den Begriff „Amino-Gruppen" fallen auch Gruppen der vorstehend definierten Struktur, die als quaternierte Ammonium-Ionen vorliegen, entweder durch Salzbildung mit organischen Säuren oder anorganischen Säuren (d. h. Reste der Struktur RxRyR,N+Q– worin Rx, Ry und Rz gleich oder verschieden sein können, vorzugsweise gleich sind, und die oben für Rx und Ry definierten Bedeutungen haben können und mindestens einer der Reste Wasserstoff aus der Quaternierung mit der organischen oder anorganischen Säure ist und Q für einen Säurerest der organischen oder anorganischen Säure steht) oder durch Salzbildung mit geeigneten Quaternierungsreagentien, die dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind, wie beispielsweise (ohne Beschränkung hierauf) mit Alkylhalogeniden.
  • In der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen steht der Begriff „Cycloalkyl" für unsubstituierte oder substituierte einwertige Reste aus zu geschlossenen Ringen verbundenen -CH2-Gruppen. Diese können erfindungsgemäß bevorzugt drei bis acht Atome im Ring enthalten und können entweder ausschließlich aus Kohlenstoff-Atomen bestehen oder ein oder mehrere Heteroatom(e) enthalten, das/die gewählt ist/sind aus -O-, -S- und -NRx-, worin Rx für Wasserstoff oder einen (wie oben definierten) Alkyl-Rest mit 1 bis 6 Kohlenstoff-Atomen steht. In den Fällen, in denen Heteroatome in die Ringe eingebunden sind, können diese – bei mehreren Heteroatomen – gleich oder verschieden sein. Vorzugsweise ist im Fall der Präsenz von Heteroatomen ein Heteroatom in den Ring eingebunden. Besonders bevorzugt unter den rein carbocyclischen Ringen sind die Reste Cyclopentyl, Cyclopentenyl, Cyclopentadienyl, Cyclohexyl, Cyclohexenyl, Cyclohexadienyl, Cycloheptyl, Cycloheptenyl, Cycloheptadienyl und Cycloheptatrienyl. Beispiele für Heteroatome enthaltende Cycloalkyl-Reste, die auch als Heterocycloalkyl-Reste bezeichnet werden, sind in weiteren Ausführungsformen der Erfindung die Reste Tetrahydrofuranyl, Pyrrolidinyl, Pyrazolidinyl, Imidazolidinyl, Piperidinyl, Piperazinyl und Morpholinyl.
  • Mögliche Substituenten an diesen carbocyclischen oder heterocyclischen Cycloalkylresten können vorzugsweise, ohne die Erfindung hierauf zu beschränken, gewählt sein aus der obigen Gruppe von Substituenten für lineare Alkyl-Gruppen. Besonders bevorzugte Substituenten für Cycloalkyl-Gruppen sind die Substituenten -Cl, -Br, Methyl, Ethyl, n-Propyl, i-Propyl, n-Butyl, i-Butyl, sec-Butyl oder tert-Butyl, Methoxy, Ethoxy, n-Propoxy, i-Propoxy; n-Butoxy, Butoxy, sec-Butoxy und tert-Butoxy, -NH2, -NH(CH3), -N(CH3)2, -NH(C2H5) und -N(C2H5)2, Carbonyl und Carboxyl.
  • In der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen steht der Begriff „Cycloalkylen" für unsubstituierte oder substituierte zweiwertige Reste aus zu geschlossenen Ringen verbundenen -CH2-Gruppen. Diese können erfindungsgemäß bevorzugt drei bis acht Atome im Ring enthalten und können entweder ausschließlich aus Kohlenstoff-Atomen bestehen oder ein oder mehrere Heteroatom(e) enthalten, das/die gewählt ist/sind aus -O-, -S- und -NRx-, worin Rx für Wasserstoff oder einen (wie oben definierten) Alkyl-Rest mit 1 bis 6 Kohlenstoff-Atomen steht. Besonders bevorzugt unter den rein carbocyclischen Ringen sind die Reste Cyclopentylen, Cyclopentenylen, Cyclopentadienylen, Cyclohexylen, Cyclohexenylen, Cyclohexadienylen, Cycloheptylen, Cycloheptenylen, Cycloheptadienylen und Cycloheptatrienylen. Auch die oben bei den Cycloalkyl-Resten definierten heterocyclischen Gruppen können in den Verbindungen der allgemeinen Formeln (1) und (2) als Gruppen „B" als zweiwertige Reste auftreten, und besonders bevorzugt sind solche cyclischen zweiwertigen Reste, in denen eine Gruppe -O- oder -NRx- in den Ring eingebunden ist. In diesen Fällen sind beide Valenzen an beliebigen C-Atomen im Ring lokalisiert. Bevorzugterweise ist ein Heteroatom oder sind zwei Heteroatome in den Ring eingebunden, und in besonders bevorzugten Ausführungsformen solcher Grup pen sind die zweiwertigen Reste abgeleitet von Tetrahydrofuran, Pyrrolidin, Pyrazolidin, Imidazolidin, Piperidin, Piperazin und Morpholin.
  • Mögliche Substituenten an diesen carbocyclischen oder heterocyclischen Cycloalkylen-Resten können vorzugsweise, ohne die Erfindung hierauf zu beschränken, gewählt sein aus der obigen Gruppe von Substituenten für lineare Alkyl-Gruppen. Besonders bevorzugte Substituenten für Cycloalkylen-Gruppen sind die Substituenten -Cl, -Br, Methyl, Ethyl, n-Propyl, i-Propyl, n-Butyl, i-Butyl, sec-Butyl oder tert-Butyl, Methoxy, Ethoxy, n-Propoxy, i-Propoxy; n-Butoxy, i-Butoxy, sec-Butoxy und tert-Butoxy, -NH2, -NH(CH3), -N(CH3)2, -NH(C2H5) und -N(C2H5)2, Carbonyl und Carboxyl.
  • Im Rahmen der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen wird unter „Aryl-Rest" ein von einem cyclischen Molekül mit aromatischen Charakter (4n + 2 in Ringorbitalen delokalisierte π-Elektronen) abgeleiteter einwertiger Kohlenwasserstoff-Rest verstanden, der unsubstituiert oder substituiert sein kann. Die Ringstruktur eines solchen Aryl-Restes kann eine fünfgliedrige, sechsgliedrige oder siebengliedrige Ringstruktur mit einem Ring oder eine aus zwei oder mehreren aneinander gebundenen („annellierten") Ringen gebildete Struktur sein, wobei die annellierten Ringe die gleiche oder eine unterschiedliche Zahl von Ringgliedern, insbesondere von C-Atomen, haben können. Bei aus mehreren aneinander kondensierten Ringen bestehenden Systemen sind benzokondensierte Ringe besonders bevorzugt, d. h. Ringsysteme, in denen zumindest einer der Ringe ein aromatischer, nur aus C-Atomen bestehender Sechsring (Phenylring) ist. Typische, nicht jedoch beschränkende Beispiele von Aryl-Resten stellen Cyclopentadienyl-Reste (C5H5 –) (als fünfgliedriger Ring), Phenyl-Reste (als sechsgliedriger Ring), Cycloheptatrienyl-Reste (C7H7 +) (als siebengliedriger Ring), Naphthyl-Reste (als zwei annellierte sechsgliedrige Ringe umfassendes Ringsystem) sowie von Anthracen und Phenanthren abgeleitete einwertige Reste (drei annellierte sechsgliedrige Ringe) dar. Die erfindungsgemäß am meisten bevorzugten Aryl-Reste sind Phenyl- und Naphthyl-Reste.
  • Mögliche Substituenten an diesen carbocyclischen Aryl-Resten können vorzugsweise gewählt sein aus der obigen Gruppe von Substituenten für lineare Alkyl-Gruppen, ohne die Erfindung auf diese Substituenten zu beschränken. Besonders bevorzugte Substituenten für Aryl-Gruppen sind die Substituenten -Cl, -Br, Methyl, Ethyl, n-Propyl, i-Propyl, n-Butyl, i-Butyl, sec-Butyl oder tert-Butyl, Methoxy, Ethoxy, n-Propoxy, i-Propoxy; n-Butoxy, i-Butoxy, sec-Butoxy, tert-Butoxy, -NH2, -NH(CH3), -N(CH3)2, -NH(C2H5) und -N(C2H5)2, Carbonyl und Carboxyl. Es kann ein oder es können mehrere derartige Substituent(en), die gleich oder verschieden voneinander sein können, an einen Aryl-Rest gemäß der vorliegenden Erfindung gebunden sein. Die substituierte(n) Position(en) am Aryl-Ring(-System) kann/können beliebig gewählt sein.
  • Eine vergleichbare Definition wie bei den Aryl-Resten gilt im Rahmen der vorliegenden Beschreibung und der Patentansprüche bezüglich der Definition des Begriffs „Arylen-Rest": Hierunter wird ein zweiwertiger Rest verstanden, dessen grundsätzlicher Aufbau und dessen Auswahl und dessen Substituent(en) mit den vorstehenden Angaben zur Definition der „Aryl-Reste" vergleichbar sind, nur dass es sich um einen zweiwertigen Rest handelt, dessen Einbindung an beliebigen zwei Kohlenstoff-Atomen des Ringes erfolgen kann.
  • Im Rahmen der vorliegenden Beschreibung und der Patentansprüche wird unter „Heteroaryl-Rest" ein Arylrest (im Sinne der obigen Definition) verstanden, in dessen Ringstruktur ein Heteroatom oder mehrere Heteroatome, vorzugsweise aus der Gruppe O, N oder S, enthalten sind, ohne dass der aromatische Charakter des Moleküls dabei verloren geht. Heteroaryl-Reste gemäß der Erfindung können unsubstituiert oder substituiert sein. Die Ringstruktur eines solchen Heteroaryl-Restes kann eine fünfgliedrige, sechsgliedrige oder siebengliedrige Ringstruktur mit einem Ring oder eine aus zwei oder mehreren aneinander gebundenen („annellierten") Ringen gebildete Struktur sein, wobei die annellierten Ringe die gleiche oder eine unterschiedliche Zahl von Ringgliedern haben kön nen. Das/die Heteroatom(e) kann/können allein in einem oder auch in mehreren der Ringe des Ringsystems vorkommen. Die Heteroaryl-Reste bestehen vorzugsweise aus einem oder zwei Ringen. Bei aus mehreren aneinander kondensierten Ringen bestehenden Systemen sind benzokondensierte Ringe besonders bevorzugt, d. h. Ringsysteme, in denen zumindest einer der Ringe ein aromatischer carbocyclischer (d. h. nur aus C-Atomen bestehender) Sechsring ist. Besonders bevorzugte Heteroaryl-Reste sind gewählt aus Furanyl, Thiophenyl, Pyridyl, Indolyl, Cumaronyl, Thionaphthenyl, Chinolinyl (Benzopyridyl), Chinazolinyl (Benzopyrimidinyl) und Chinoxylinyl (Benzopyrazinyl).
  • Mögliche Substituenten an diesen Heteroaryl-Resten können vorzugsweise gewählt sein aus der obigen Gruppe von Substituenten für lineare Alkyl-Gruppen, ohne die Erfindung auf diese Substituenten zu beschränken. Besonders bevorzugte Substituenten für Heteroaryl-Gruppen sind die Substituenten -Cl, -Br, Methyl, Ethyl, n-Propyl, i-Propyl, n-Butyl, i-Butyl, sec-Butyl oder tert-Butyl, Methoxy, Ethoxy, n-Propoxy, i-Propoxy; n-Butoxy, i-Butoxy, sec-Butoxy, tert-Butoxy, -NH2, -NH(CH3), -N(CH3)2, -NH(C2H5) und -N(C2H5)2, Carbonyl und Carboxyl. Es kann ein oder es können mehrere derartige Substituent(en), die gleich oder verschieden voneinander sein können, an einen Heteroaryl-Rest gemäß der vorliegenden Erfindung gebunden sein. Die substituierte(n) Position(en) am Heteroaryl-Ring(-System) kann/können beliebig gewählt sein.
  • Eine vergleichbare Definition wie bei den Heteroaryl-Resten gilt im Rahmen der vorliegenden Beschreibung und der Patentansprüche bezüglich der Definition des Begriffs „Heteroarylen-Rest": Hierunter wird ein zweiwertiger Rest verstanden, dessen grundsätzlicher Aufbau und dessen Auswahl und dessen Substituent(en) mit den vorstehenden Angaben zur Definition der „Heteroaryl-Reste" vergleichbar sind, nur dass es sich um einen zweiwertigen Rest handelt, dessen Einbindung an beliebigen zwei Kohlenstoff-Atomen des Ringes bzw. Ringsystems oder auch an einem Stickstoff-Atom erfolgen kann.
  • Im Rahmen der vorliegenden Beschreibung und der Patentansprüche bedeuten die nachfolgend verwendeten Begriffe „Aralkyl-Rest", „Heteroarylalkyl-Rest", „Heterocycloalkyl-Rest", „Arylamidoalkyl-Rest" und „Heteroarylamidoalkyl-Rest" Alkyl-Reste (bzw. – genauer gesagt – Alkylen-Reste) im Sinne der obigen allgemeinen und spezifischen Definition, die an einer ihrer Bindungen mit einem Aryl-Rest (gemäß der obigen allgemeinen und spezifischen Definition), Heteroaryl-Rest (gemäß der obigen allgemeinen und spezifischen Definition), Heterocyclyl-Rest (gemäß der obigen allgemeinen und spezifischen Definition der mit Heteroatomen substituierten Cycloalkyl-Reste), Arylamido-Rest (gemäß der nachfolgenden allgemeinen und spezifischen Definition) oder Heteroarylamido-Rest (gemäß der nachfolgenden allgemeinen und spezifischen Definition) substituiert sind. Diese Reste können unsubstituiert oder substituiert sein.
  • In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung sind Aralkyl-Reste solche Reste, in denen der Aryl-Rest ein Phenyl-Rest, substituierter Phenyl-Rest, Naphthyl-Rest oder substituierter Naphthyl-Rest ist und die Alkyl(en)-Gruppe geradkettig oder verzweigt ist und 1 bis 6 Kohlenstoff-Atome aufweist. Mit ganz besonderem Vorteil lassen sich als Aralkyl-Reste die Reste Benzyl, Phenethyl, Naphthylmethyl und Naphthylethyl verwenden, von denen Benzyl-Reste ganz besonders bevorzugt sind.
  • Mögliche Substituenten an den Aryl-Gruppen der Aralkyl-Reste können vorzugsweise gewählt sein aus der obigen Gruppe von Substituenten für lineare Alkyl-Gruppen, ohne die Erfindung auf diese Substituenten zu beschränken. Besonders bevorzugte Substituenten für Aryl-Gruppen der Aralkyl-Reste sind die Substituenten -Cl, -Br, Methyl, Ethyl, n-Propyl, i-Propyl, n-Butyl, i-Butyl, sec-Butyl oder tert-Butyl, Methoxy, Ethoxy, n-Propoxy, i-Propoxy; n-Butoxy, i-Butoxy, sec-Butoxy, tert-Butoxy, -NH2, -NH(CH3), -N(CH3)2, -NH(C2H5) und -N(C2H5)2, Carbonyl und Carboxyl. Es kann ein oder es können mehrere derartige Substituent(en), die gleich oder verschieden voneinander sein können, an eine Aryl-Gruppe eines Aralkyl-Rest gemäß der vorliegenden Erfindung gebun den sein. Die substituierte(n) Position(en) am Aryl-Ring(-System) kann/können beliebig gewählt sein.
  • In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung sind Heteroarylalkyl-Reste solche Reste, in denen der Heteroaryl-Rest der Heteroarylalkyl-Reste gemäß der Erfindung substituiert ist und die Alkylen-Gruppe geradkettig oder verzweigt ist und 1 bis 6 Kohlenstoff-Atome aufweist. Die Ringstruktur eines solchen Heteroaryl-Restes kann eine fünfgliedrige, sechsgliedrige oder siebengliedrige Ringstruktur mit einem Ring oder eine aus zwei oder mehreren aneinander gebundenen („annellierten") Ringen gebildete Struktur sein, wobei die annellierten Ringe die gleiche oder eine unterschiedliche Zahl von Ringgliedern haben können. Das/die Heteroatom(e) kann/können allein in einem oder auch in mehreren der Ringe des Ringsystems vorkommen. Die Heteroaryl-Reste der Heteroarylalkyl-Reste bestehen vorzugsweise aus einem oder zwei Ringen. Bei aus mehreren aneinander kondensierten Ringen bestehenden Heteroarylalkyl-Systemen sind benzokondensierte Ringe besonders bevorzugt, d. h. Ringsysteme, in denen zumindest einer der Ringe ein aromatischer carbocyclischer Sechsring ist. Besonders bevorzugte Heteroarylalkyl-Reste sind gewählt aus Furanylmethyl und -ethyl, Thiophenylmethyl und -ethyl, Pyridylmethyl und -ethyl, Indolylmethyl und -ethyl, Cumaronylmethyl und -ethyl, Thionaphthenylmethyl und -ethyl, Chinolinyl-(Benzopyridyl-)methyl und -ethyl, Chinazolinyl-(Benzopyrimidinyl-) und Chinoxylinyl-(Benzopyrazinyl)-methyl und -ethyl.
  • Mögliche Substituenten an diesen Heteroaryl-Gruppen der Heteroarylalkyl-Reste können vorzugsweise gewählt sein aus der obigen Gruppe von Substituenten für lineare Alkyl-Gruppen, ohne die Erfindung auf diese Substituenten zu beschränken. Besonders bevorzugte Substituenten für Heteroaryl-Gruppen sind die Substituenten -Cl, -Br, Methyl, Ethyl, n-Propyl, i-Propyl, n-Butyl, i-Butyl, sec-Butyl oder tert-Butyl, Methoxy, Ethoxy, n-Propoxy, i-Propoxy; n-Butoxy, i-Butoxy, sec.Butoxy, tert-Butoxy, -NH2, -NH(CH3), -N(CH3)2, -NH(C2H5) und -N(C2H5)2, Carbonyl und Carboxyl. Es kann ein oder es können mehrere derar tige Substituent(en), die gleich oder verschieden voneinander sein können, an einen Heteroarylalkyl-Rest gemäß der vorliegenden Erfindung gebunden sein. Die substituierte(n) Position(en) am Heteroaryl-Ring(-System) kann/können beliebig gewählt sein.
  • In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung sind Heterocycloalkyl-Reste Cycloalkyl-Reste gemäß der obigen allgemeinen oder speziellen Definition, die ein oder mehrere Heteroatom(e) enthalten, das/die gewählt ist/sind aus -O-, -Sund -NRx, worin Rx für Wasserstoff oder einen (wie oben definierten) Alkyl-Rest mit 1 bis 6 Kohlenstoff-Atomen steht, und die Alkyl(en)-Gruppen der Heterocycloalkyl-Reste sind geradkettig oder verzweigt und weisen 1 bis 6 Kohlenstoff-Atome auf. Bei mehreren in den/die Ring(e) eingebundenen Hetero-Atomen können diese gleich oder verschieden sein. Vorzugsweise ist ein Heteroatom in den Ring eingebunden. Bevorzugte Beispiele für Heteroatome enthaltende Cycloalkyl-Reste, die auch als Heterocycloalkyl-Reste bezeichnet werden, sind in weiteren Ausführungsformen der Erfindung die Reste Tetrahydrofuranyl, Pyrrolidinyl, Pyrazolidinyl, Imidazolidinyl, Piperidinyl, Piperazinyl und Morpholinyl.
  • Mögliche Substituenten an diesen Heterocycloalkyl-Resten können vorzugsweise gewählt sein aus der obigen Gruppe von Substituenten für lineare Alkyl-Gruppen, ohne die Erfindung auf diese Substituenten zu beschränken. Besonders bevorzugte Substituenten für Heteroaryl-Gruppen sind die Substituenten -Cl, -Br, Methyl, Ethyl, n-Propyl, i-Propyl, n-Butyl, i-Butyl, sec-Butyl oder tert-Butyl, Methoxy, Ethoxy, n-Propoxy, i-Propoxy; n-Butoxy, i-Butoxy, sec-Butoxy, tert-Butoxy, -NH2, -NH(CH3), -N(CH3)2, -NH(C2H5) und -N(C2H5)2, Carbonyl und Carboxyl. Es kann ein oder es können mehrere derartige Substituent(en), die gleich oder verschieden voneinander sein können, an einen Heterocycloalkyl-Rest gemäß der vorliegenden Erfindung gebunden sein. Die substituierte(n) Position(en) am Heterocycloalkyl-Ring(-System) kann/können beliebig gewählt sein.
  • In der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen werden unter dem Begriff „Arylamidoalkyl-Rest" und „Heteroarylamidoalkyl-Rest" Alkyl-Reste (bzw. – genauer gesagt – Alkylen-Reste) im Sinne der obigen allgemeinen und spezifischen Definition verstanden, die an einer ihrer Bindungen mit einem Arylamido-Rest oder Heteroarylamido-Rest der allgemeinen Formel Ar-NRx-C(=O)- oder der allgemeinen Formel Ar-C(=O)-NRx- substituiert sind, worin Rx für Wasserstoff oder einen Alkyl-Rest mit 1 bis 6 Kohlenstoff-Atomen steht und Ar für einen beliebigen Aryl-Rest oder Heteroaryl-Rest gemäß der obigen allgemeinen oder speziellen Definition steht. Diese Aryl- oder Heteroaryl-Reste können unsubstituiert oder substituiert sein. Bevorzugte Beispiele für einen Arylamidoalkyl-Rest – ohne die Erfindung insoweit zu beschränken – sind 2-, 3- oder 4-Benzoesäure-amido-n-butyl-Reste oder 2-Nitro-3-, -4-, -5- oder -6-Benzoesäure-amido-n-butyl-Reste; bevorzugte, jedoch nicht beschränkende Beispiele für Heteroarylamidoalkyl-Reste sind 2-, 4-, 5- oder 6-Pyridin-3-carbonsäureamido-n-butyl-Reste.
  • Mögliche Substituenten an diesen Arylamidoalkyl-Resten und Heteroarylamidoalkyl-Resten können vorzugsweise gewählt sein aus der obigen Gruppe von Substituenten für lineare Alkyl-Gruppen, ohne die Erfindung auf diese Substituenten zu beschränken. Besonders bevorzugte Substituenten für Aryl-Gruppen bzw. Heteroaryl-Gruppen der Arylamidoalkyl-Reste und Heteroarylamidoalkyl-Reste sind die Substituenten -Cl, -Br, Methyl, Ethyl, n-Propyl, i-Propyl, n-Butyl, i-Butyl, sec-Butyl oder tert-Butyl, Methoxy, Ethoxy, n-Propoxy, i-Propoxy; n-Butoxy, i-Butoxy, sec.Butoxy, tert-Butoxy, -NH2, -NH(CH3), -N(CH3)2, -NH(C2H5) und -N(C2H5)2, Carbonyl und Carboxyl. Es kann ein oder es können mehrere derartige Substituent(en), die gleich oder verschieden voneinander sein können, an eine Aryl- oder Heteroaryl-Gruppe der Arylamidoalkyl-Reste oder Heteroarylamidoalkyl-Reste gemäß der vorliegenden Erfindung gebunden sein. Die substituierte(n) Position(en) am aromatischen Ring(-System) kann/können beliebig gewählt sein.
  • Eine vergleichbare Definition wie bei den Aralkyl-Resten, Heteroarylalkyl-Resten, Heterocycloalkyl-Resten, Arylamidoalkyl-Resten und Heteroarylamidoalkyl-Resten gilt im Rahmen der vorliegenden Beschreibung und der Patentansprüche bezüglich der Definition der Begriffe „Aralkylen-Rest", „Heteroarylalkylen-Rest", „Heterocycloalkylen-Rest", „Arylamidoalkylen-Rest" und „Heteroarylamidoalkylen-Rest": Hierunter werden jeweils zweiwertige Reste verstanden, deren grundsätzlicher Aufbau und deren Auswahl und deren Substituent(en) mit den vorstehenden Angaben zur Definition der „Aralkyl-Rest", „Heteroarylalkyl-Rest", „Heterocycloalkyl-Rest", „Arylamidoalkyl-Rest" und „Heteroarylamidoalkyl-Rest" vergleichbar sind, nur dass es sich jeweils um einen zweiwertigen Rest handelt, dessen Einbindung an beliebigen zwei Kohlenstoff-Atomen des Ringes bzw. Ringsystems oder der Alkylen-Gruppe oder auch an einem Stickstoff-Atom des Heteroaryl- oder Heterocyclyl-Ring-Systems erfolgen kann.
  • In den allgemeinen Formeln (1) und (2) steht der Rest D für -S-S- oder -Se-Se-. Diese beiden S- bzw. Se-Atome bilden eine Brücke zwischen zwei Teilen der Moleküle der Verbindungen der allgemeinen Formeln (1) und (2) bildet, die unter natürlichen, insbesondere unter reduzierenden Bedingungen gespalten werden kann. Dabei werden zwei Molekül-Teile freigesetzt, die eine inhibierende Wirkung für die Dipeptidylpeptidase IV (DP IV) und für Peptidasen mit analoger enzymatischer Wirkung sowie für die Alanyl-Aminopeptidase N (APN) und für Peptidasen mit analoger enzymatischer Wirkung entfalten.
  • In der obigen allgemeinen Formel (2) steht E für die Gruppe -CH2-C*H(NH2)-R9, worin R9 für einen O, N oder S enthaltenden oder nicht enthaltenden unsubstituierten oder substituierten unverzweigten oder verzweigten Alkyl-Rest, Cycloalkyl-Rest, Aralkyl-Rest, Heterocycloalkyl-Rest, Heteroarylalkyl-Rest, Arylamidoalkyl-Rest, Heteroarylamidoalkyl-Rest, unsubstituierten oder einfach oder mehrfach substituierten Aryl-Rest oder Heteroaryl-Rest mit einem oder mehreren fünf-, sechs- oder siebengliedrigen Ringen steht. Bezüglich der erfindungs gemäß verwendbaren bzw. bevorzugten Beispiele der Alkyl-Reste, Cycloalkyl-Reste, Aralkyl-Reste, Heterocycloalkyl-Reste, Heteroarylalkyl-Reste, Arylamidoalkyl-Reste, Heteroarylamidoalkyl-Reste, unsubstituierten oder einfach oder mehrfach substituierten Aryl-Reste oder Heteroaryl-Reste mit einem oder mehreren fünf-, sechs- oder siebengliedrigen Ringen sowie der für diese Reste denkbaren und bevorzugten Substituenten kann auf die obigen Definitionen der entsprechenden Reste und ihrer bevorzugten Ausführungsformen Bezug genommen werden; diese Definitionen sind in gleicher Weise auch für die Reste in der allgemeinen Formel (2) anwendbar, für die E steht.
  • In der obigen Formel für E bedeutet * am mit der Amino-Gruppe substituierten Kohlenstoff-Atom ein chirales Kohlenstoff-Atom. In weiter bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung stellen solche Verbindungen der allgemeinen Formel (2) Prodrugs zu besonders wirksamen Inhibitoren dar, in denen das mit * bezeichnete chirale Kohlenstoff-Atom eine S- bzw. L-Konfiguration aufweist.
  • Erfindungsgemäß besonders bevorzugt steht E für substituierte 2-Aminoalkylen-Reste, beispielsweise einen 2-Amino-3-phenylpropyl-Rest, oder für unsubstituierte oder durch Heteroatome wie -S-, -S(=O)-, -N- oder -O- substituierte 2-Aminoalkylen-Reste, beispielsweise einen 2-Amino-4-methylpentyl-Rest, einen 2-Amino-4-methylthiobutyl-Rest oder einen 2-Amino-4-methylsulfoxybutyl-Rest.
  • In weiter bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung stehen in den allgemeinen Formeln (1) und (2) die Reste B und/oder B' für einen Rest R1, welcher steht für einen geradkettigen oder verzweigten Alkylen-Rest mit 1 bis 6 Kohlenstoff-Atomen. Besonders bevorzugte Verbindungen der allgemeinen Formeln (1) und (2) umfassen Reste B und/oder B' in Form einer oder mehrerer der Gruppen gewählt aus -CH2-(Methylen), -CH2-CH2-(Ethylen) oder (H3C)2-C < (2,2-Propylen).
  • In alternativen, ebenfalls weiter bevorzugten Ausführungsformen stehen B und/oder B' für einen Rest -(CH2)n-R2-R3-R4-, worin n für eine ganze Zahl von 1 bis 5 steht; R2 für -NH- oder -NH-C(=NH)-NH- steht, wenn R3 für O = C < oder -SO2- steht, oder worin R2 für O = C < steht, wenn R3 für -NH- steht; R4 für einen O, N oder S enthaltenden oder nicht enthaltenden unsubstituierten oder substituierten unverzweigten oder verzweigten Alkylen-Rest, Cycloalkylen-Rest, Aralkylen-Rest, Heterocycloalkylen-Rest, Heteroarylalkylen-Rest, unsubstituierten oder einfach oder mehrfach substituierten Arylen-Rest oder Heteroarylen-Rest mit einem oder mehreren fünf-, sechs- oder siebengliedrigen Ringen steht. Weiter bevorzugt steht n für 1 bis 5, so dass bevorzugte Beispiele des oben genannten Restes eine Methylen-Gruppe, Ethylen-Gruppe, Propylen-Gruppe, Butylen-Gruppe und Pentylen-Gruppe umfassen; R2 und R3 bilden vorzugsweise zusammen eine Amido-Gruppe -C(=O)-NH- oder -NH-C(=O)-. Weiter bevorzugt sind solche Verbindungen der allgemeinen Formeln (1) und (2) mit Resten B und/oder B', worin B für die vorgenannte Formel steht und R4 einen Amino-substituierten Alkylen-Rest, beispielsweise einen Aminoethylen-Rest, oder einen unsubstituierten oder (beispielsweise mit einer Nitro-Gruppe) substituierten Phenylen-Rest oder einen unsubstituierten oder substituierten Pyridyl-2,5-en-Rest bedeutet.
  • In alternativen, ebenfalls weiter bevorzugten Ausführungsformen stehen B und/oder B' für einen Rest der Formel -R7-R8-, worin R7 für einen einfach oder mehrfach substituierten Benzylenrest steht und R8 für eine Einfachbindung oder für einen O, N oder S enthaltenden oder nicht enthaltenden unsubstituierten oder substituierten unverzweigten oder verzweigten Alkylen-Rest, Cycloalkylen-Rest, Aralkylen-Rest, Heterocycloalkylen-Rest oder Heteroarylalkylen-Rest steht, der vorzugsweise eine oder mehrere Amino-Gruppen, Carbonyl-Gruppen oder Carboxyl-Gruppen als funktionelle Gruppen aufweisen kann, oder einen unsubstituierten oder einfach oder mehrfach substituierten Arylen-Rest oder Heteroarylen-Rest mit einem oder mehreren fünf-, sechs- oder siebengliedrigen Ringen steht. Hinsichtlich der Definition der vorgenannten Reste und ihrer denkbaren erfindungsgemäßen Substituenten kann auf die vorangehenden allgemeinen oder speziellen Definitionen der jeweiligen Reste und Substituenten zurückgegriffen werden.
  • Weiter bevorzugt sind erfindungsgemäß Verbindungen der allgemeinen Formeln (1) oder (2), in denen B und B' gleich oder verschieden sein können und für einen Rest -(CH2)n-R2-R3-R4 stehen, worin R2 für -NH- oder -NH-C(=NH)-NH- steht, wenn R3 für O = C < oder -SO2- steht, oder worin R2 für O = C < steht, wenn R3 für -NH- steht, und worin R4 steht für
    • – -CH(COOH)-R1-, worin R1 die oben angegebene Bedeutung hat, wenn R2 für O = C < steht und R3 für -NH- steht; oder
      Figure 00500001
      (Substitution in Position 2, 3 oder 4), worin R1 die oben angegebene Bedeutung hat, wenn R2 für O = C < steht und R3 für -NH- steht; oder
    • – -CH(NHR5)-R1-, wenn R2 für -NH- oder -NH-C(=NH)-NH- steht und R3 für O = C < steht, worin R5 für H oder einen Acyl-Rest steht, vorzugsweise für einen Benzyloxycarbonyl-Rest, einen Fluoren-9-ylmethoxycarbonyl-Rest, einen tert-Butyloxycarbonyl-Rest oder einen Benzoyl-Rest steht; oder
      Figure 00500002
      – (Substitution in Position 2, 3 oder 4), worin R4 für Phenylen steht und R2 für -NH- oder -NH-C(=NH)-NH- steht, wenn R3 für O = C < oder -SO2- steht, oder worin R2 für O = C < steht, wenn R3 für -NH- steht; oder
      Figure 00500003
      (Substitution in Position 2, 3, oder 4), worin R5 für H oder einen Acyl-Rest steht, vorzugsweise für einen Benzyloxycarbonyl-Rest, einen Fluoren-9-ylmethoxycarbonyl-Rest oder einen Benzoyl-Rest steht und R2 für -NH- oder -NH-C(=NH)-NHsteht, wenn R3 für O = C < oder -SO2- steht, oder worin R2 für O = C < steht, wenn R3 für -NH- steht; oder
      Figure 00510001
      (Substitution in Position 2, 3 oder 4), worin Alkylen für einen unverzweigten oder verzweigten Alkylen-Rest mit 1 bis 6 Kohlenstoff-Atomen steht und R2 für -NH- oder -NH-C(=NH)-NHsteht, wenn R3 für O = C < oder -SO2- steht, oder worin R2 für O = C < steht, wenn R3 für -NH- steht; oder
      Figure 00510002
      (Substitution in Position 2, 3 oder 4), worin Alkylen für einen unverzweigten oder verzweigten Alkylen-Rest mit 1 bis 6 Kohlenstoff-Atomen steht und R2 für -NH- oder -NH-C(=NH)-NHsteht, wenn R3 für O = C < oder -SO2- steht, oder worin R2 für O = C < steht, wenn R3 für -NH- steht; oder
      Figure 00510003
      worin und R2 für -NH- oder -NH-C(=NH)-NH- steht, wenn R3 für O = C < oder -SO2- steht, oder worin R2 für O = C < steht, wenn R3 für -NHsteht; oder
      Figure 00520001
      Substitution in Position 2, 3 oder 4)(Substitution am Ring in Abhängigkeit von der Position von R6), worin R6 für H, NO2, CN, Halogen oder einen Acyl-Rest steht und R2 für -NH- oder -NH-C(=NH)-NH- steht, wenn R3 für O = C < oder -SO2- steht, oder worin R2 für O = C < steht, wenn R3 für -NH- steht; oder
      Figure 00520002
      (Substitution in Position 3, 4 oder 6), worin R6 für H, NO2, CN, Halogen oder einen Acyl-Rest steht und R2 für -NH- oder -NH-C(=NH)-NH- steht, wenn R3 für O = C < oder -SO2- steht, oder worin R2 für O = C < steht, wenn R3 für -NH- steht; oder
      Figure 00520003
      (Substitution in Position 4, 5 oder 6), worin R6 für H, NO2, CN, Halogen oder einen Acyl-Rest steht und R2 für -NH- oder -NH-C(=NH)-NH- steht, wenn R3 für O = C < oder -SO2- steht, oder worin R2 für O = C < steht, wenn R3 für -NH- steht; oder
      Figure 00520004
      worin und R2 für -NH- oder -NH-C(=NH)-NH- steht, wenn R3 für O = C < oder -SO2- steht, oder worin R2 für O = C < steht, wenn R3 für -NHsteht.
  • Alternativ dazu sind erfindungsgemäß Verbindungen der allgemeinen Formeln (1) und (2) weiter bevorzugt, in denen B und B' gleich oder verschieden sein können und für einen Rest -R7-R8- stehen, worin R7 und R8 in Kombination stehen für einen Rest
    Figure 00530001
    (in dem R7 für den obigen Rest ohne R8 steht und die Stellung von R6 in Abhängigkeit von der Position von R8 ist), worin R8 und R6 die oben angegebenen Bedeutungen haben, d. h. worin R6 für H, NO2, CN, Halogen oder einen Acyl-Rest steht und worin R8 für eine Einfachbindung oder für einen O, N oder S enthaltenden oder nicht enthaltenden unsubstituierten oder substituierten unverzweigten oder verzweigten Alkylen-Rest, Cycloalkylen-Rest, Aralkylen-Rest, Heterocycloalkylen-Rest oder Heteroarylalkylen-Rest steht, der vorzugsweise eine oder mehrere Amino-Gruppen, Carbonyl-Gruppen oder Carboxyl-Gruppen als funktionelle Gruppen aufweisen kann, oder für einen unsubstituierten oder einfach oder mehrfach substituierten Arylen-Rest oder Heteroarylen-Rest mit einem oder mehreren fünf-, sechs- oder siebengliedrigen Ring(en) steht.
  • Noch weiter bevorzugte Verbindungen der allgemeinen Formeln (1) und (2) sind solche, in denen B und B' gleich oder verschieden sind und unabhängig voneinander für einen Rest R7-R8- stehen, worin R7 für einen einfach oder mehrfach substituierten Benzylen-Rest der vorstehenden Formel (ohne R8) steht und R8 steht für
    • – NH- oder -C1- bis C6-Alkylen-NH- in Kombination mit
    • – -C(=O)-C1- bis C6-Alkylen- oder
    • – -C(=O)-Arylen- oder
    • – -SO2-C1- bis C6-Alkylen- oder
    • – -SO2-Arylen- oder
      Figure 00540001
      (Substitution in der Position 2, 3 oder 4) oder
    • – -C(=O)-CH(NHR5)-R1, worin R1 und R5 die oben angegebenen Bedeutungen haben; oder
    • – O = C < in Kombination mit
    • – -H-C1- bis C6-Alkylen- oder
    • – -NH-Arylen- oder
    • – -NH-CH(COOH)-R1-, worin R1 die oben genannten Bedeutungen aufweist; oder
    • – -O-C1- bis C6-Alkylen- oder
    • – -O-Arylen- oder
    • – -O-C1- bis C6-Alkylen-NH-C(=O)-CH(NH2)-R1-, worin R1 die oben genannten Bedeutungen aufweist, oder
    • – -O-C1- bis C6-Alkylen -C(=O)-NH-CH(COOH)-R1-, worin R1 die oben genannten Bedeutungen aufweist.
  • Erfindungsgemäß liegen die Verbindungen der allgemeinen Formeln (1) und/oder (2) in Form neutraler Moleküle vor und finden als solche erfindungsgemäße Verwendung bei der Aktivierung von Treg-Zellen. Alternativ dazu können die Verbindungen der allgemeinen Formeln (1) und/oder (2) auch in Form ihrer Säureadditionssalze mit anorganischen und/oder organischen Säuren vor liegen. Derartige Säureadditionssalze werden aufgrund der Präsenz basischer Zentren (meist von basischen Stickstoff-Atomen) im Molekül durch Anlagerung eines oder mehrerer Moleküle von H-aciden Verbindungen (Brönstedt-Säuren), bevorzugt eines Moleküls einer H-aciden Verbindung, gebildet und sorgen für eine verbesserte Löslichkeit der Moleküle in polaren Medien, wie beispielsweise in Wasser. Die letztgenannte Eigenschaft ist von besonderer Bedeutung für solche Verbindungen, die pharmakologische Wirkungen entfalten.
  • In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung sind die Säureadditionssalze Salze pharmazeutisch annehmbarer Säuren und sind mit Vorteil (jedoch ohne Beschränkung für die vorliegende Erfindung) gewählt aus der Gruppe, die besteht aus Hydrochloriden, Trifluoracetaten, Tartraten, Succinaten, Formiaten und/oder Citraten der Verbindungen der allgemeinen Formeln (1) oder (2).
  • Besonders bevorzugte und mit Vorteil verwendbare Verbindungen der allgemeinen Formel (1) sind gekennzeichnet durch die allgemeine Formel (1a)
    Figure 00550001
    worin X, Y und B die oben angegebenen Bedeutungen haben. Mit besonderem Vorteil verwendbar sind in dem erfindungsgemäßen Verfahren Säureadditionssalze der Verbindung der allgemeinen Formel (1a), bevorzugt ihre Säureadditionssalze mit pharmazeutisch annehmbaren anorganischen und/oder organischen Säuren, insbesondere mit Säuren aus der vorstehend genannten Gruppe, ganz besonders bevorzugt die Hydrochloride, Trifluoracetate, Tartrate, Succinate, Formiate und/oder Citrate der Verbindungen der allgemeinen Formel (1a).
  • Ganz besonders bevorzugte Verbindungen der allgemeinen Formel (1a) ergeben sich aus der nachfolgenden Tabelle 1, ohne dass die Erfindung auf diese Verbindungen beschränkt ist: Tabelle 1 Beispiele Verbindungen der allgemeinen Formel A-B-D-B'-A' (1)
    Figure 00560001
    und ihre Säureadditionssalze, bevorzugt ihre Säureadditionssalze mit pharmazeutisch annehmbaren anorganischen und/oder organischen Säuren, vorzugsweise aus der o. g. Gruppe pharmazeutisch annehmbarer Säuren, ganz besonders bevorzugt die Hydrochloride, Trifluoracetate, Tartrate, Succinate, Formiate und/oder Citrate der Verbindungen der allgemeinen Formel (1a).
  • Besonders bevorzugte und mit Vorteil verwendbare Verbindungen der allgemeinen Formel (2) sind gekennzeichnet durch die allgemeine Formel (2a)
    Figure 00570001
    worin X, Y, R9 und B die oben angegebenen Bedeutungen haben, und ihre Säureadditionssalze, bevorzugt ihre Säureadditionssalze mit pharmazeutisch annehmbaren anorganischen und/oder organischen Säuren, vorzugsweise aus der o. g. Gruppe pharmazeutisch annehmbarer Säuren, besonders bevorzugt die Hydrochloride, Trifluoracetate, Tartrate, Succinate, Formiate und/oder Citrate der Verbindungen der allgemeinen Formel (2a).
  • Ganz besonders bevorzugte Verbindungen der allgemeinen Formel (2a) ergeben sich aus der nachfolgenden Tabelle 2, ohne dass die Erfindung auf diese Verbindungen beschränkt ist: Tabelle 2 Beispiele Verbindungen der allgemeinen Formel A-B-D-E (2)
    Figure 00580001
    und ihre Säureadditionssalze, bevorzugt ihre Säureadditionssalze mit pharmazeutisch annehmbaren anorganischen und/oder organischen Säuren, ganz besonders bevorzugt die Hydrochloride, Trifluoracetate, Tartrate, Succinate, Formiate und/oder Citrate der Verbindungen der allgemeinen Formel (2a).
  • Die Inhibitoren werden in einer Konzentration eingesetzt, die dem IC50-Hemmwert entspricht oder über diesem liegt. Die Inhibitor-Konzentration liegt im nanomolekularen bis mikromolaren Bereich und kann vom Fachmann in wenigen leicht durchzuführenden Standard-Experimenten ohne Schwierigkeiten ermittelt werden. Die Kultivierung der Treg-Zellen mit dem einen oder den mehreren Inhibitoren gemäß der obigen ausführlichen Beschreibung erfolgt vorzugsweise bei 37°C, weiter bevorzugt in einer Atmosphäre von Wasserdampfgesättigter Luft mit einem Gehalt an CO2 von beispielsweise 5%. Die Konzentration der Treg-Zellen wird dem Gesamt-Volumen angepasst und liegt besonders bevorzugt bei 1 bis 5 Millionen Zellen pro ml.
  • In einer weiteren, ebenfalls bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden zusätzlich zu dem einen oder den mehreren Inhibitor(en) von Alanyl-Aminopeptidase (Aminopeptidase N; APN) und/oder zusätzlich zu dem einen oder den mehreren Inhibitor(en) von Peptidasen gleicher Substratspezifität Peptidfragmente von pathogenen Autoantigenen oder synthetische Analoga und/oder spezifische antigene Komponenten pathogener Mikroorganismen einsetzt. Es kann ein Typ Peptidfragmente eingesetzt werden, oder es können mehrere Arten von Peptidfragmenten eingesetzt werden. Weiter ist es möglich, dass ein Typ spezifischer antigener Komponenten pathogener Mikroorganismen eingesetzt wird oder dass mehrere Typen spezifischer antigener Komponenten pathogener Mikroorganismen eingesetzt werden. Erfindungsgemäß sind auch Kombinationen von einer oder mehreren der genannten Komponenten einsetzbar. Mit dieser Kombination aus Inhibitor(en) und weiteren/weiteren Komponente(n) lässt sich überraschenderweise eine besonders gute Aktivierung von regulatorischen T-Zellen (Treg-Zellen) erreichen.
  • In weiter bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens setzt man als Peptidfragmente von pathogenen Autoantigenen MBP (Myelin-Basisches-Protein), MOG (Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein), MAG (Myelin-Assoziiertes-Glykoprotein) und/oder PLP (Proteolipid-Protein) ein. Einer an deren, ebenfalls weiter bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens entspricht es, wenn man als spezifische antigene Komponenten pathogener Mikroorganismen Hüllproteine oder Membranglycolipid-Komplexe einsetzt. Kombinationen der speziellen Komponenten sind ebenfalls einsetzbar.
  • Erfindungsgemäß erfolgt das In-Kontakt-Bringen von regulatorischen T-Zellen (Treg-Zellen) in dem/den oben im Detail beschriebenen Medium/Medien in dem Fachmann auf diesem technischen Gebiet bekannter Weise. Rein beispielhaft (und ohne Beschränkung für die vorliegende Erfindung) wird angegeben, dass man den Schritt des In-Kontakt-Bringens bzw. der Inkubation von regulatorischen T–Zellen (Treg-Zellen) mit einem oder mehreren Inhibitoren von Alanyl-Aminopeptidase (Aminopeptidase N; APN) und/oder mit einem oder mehreren Inhibitoren von Peptidasen gleicher Substratspezifität durchführt in üblichen, vorzugsweise in statischen oder horizontal bewegten oder vertikal bewegten oder kreisend bewegten, Zellkultur-Gefäßen. Dies können weiter bevorzugt Kulturschalen, Kulturplatten, Zellkultur-Reaktoren, Zellkultur-Flaschen, Zellkultur-Beutel, für Zellkulturen geeigneten Zwei- oder Mehrkammer-Systeme oder Hohlfaser-Reaktoren oder beliebige andere, dam Fachmann bekannte Gefäße sein, wie sie für das Kultivieren von Zellen allgemein verwendet werden. Besonders bevorzugt wird das Kultivieren durchgeführt in Zellkultur-Gefäßen, die auf einem Teil oder auf der Gänze ihrer der Kultur zugewandten Oberfläche eine gegebenenfalls reaktionsfördernde Oberflächenbeschichtung und/oder Matrix-Ersatzstoffe aufweisen. Die Zellkultur erfolgt vorzugsweise in Gegenwart von 5% CO2 in Wasserdampf-gesättigter Luft bei 37°C.
  • Im letzten Schritt des Verfahrens gemäß der Erfindung werden die auf dem vorgenannten Weg aktivierten regulatorischen T-Zellen (Treg-Zellen) in einem geeigneten Medium in mindestens einen menschlichen oder tierischen Körper zurückgeführt. Regelmäßig werden die Treg-Zellen einem menschlichen oder tierischen Körper zugeführt, der dieser aktivierten Treg-Zellen zur Regulation eines Immun-Problems bedarf. Das Medium ist jedenfalls ein Medium, das pharmazeutisch für den Empfänger akzeptabel ist und kann in weiter bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung gewählt sein aus bevorzugt fluiden, weiter bevorzugt flüssigen Medien aus der Gruppe physiologisch annehmbarer Lösungen, besonders bevorzugt wässriger Lösungen, die gegebenenfalls weitere für den geplanten Verwendungszweck nützliche oder gar förderliche Komponenten enthalten können.
  • Besonders bevorzugt werden die aktivierten Treg-Zellen dem Organismus des (menschlichen oder tierischen) Spenders der Körperflüssigkeit zugeführt, aus der die Treg-Zellen isoliert wurden. Die Rückführung kann auf jede dem Fachmann denkbare Art geschehen, die den gewünschten Zweck erfüllt, d. h. dem Empfänger-Organismus (gleich ob Mensch oder Tier) die aktivierten Treg-Zellen wieder zuführt. Besonders bevorzugte Wege der Wiederzuführung sind Applikationsformen, die gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus intravenöser Applikation, intraarterieller Applikation, intrakavitärer Applikation, intrathekaler Applikation und intradermaler Applikation. Mit besonderem Vorteil wird vorzugsweise auf eine intravenöse Applikation zurückgegriffen, wenn man dem Empfänger die aktivierten Treg-Zellen wieder infundieren will, da auf diesem Wege eine direkte Einführung der regulatorischen T-Zellen in das periphere System und damit in den Blutkreislauf erreicht wird, wo die Treg-Zellen auch natürlicherweise wirken.
  • Die infundierte Menge an regulatorischen T-Zellen (Treg-Zellen) hängt stark von deren Konzentration in dem für die Rückinfusion verwendeten Medium, der Konstitution des Empfängers (Mensch oder Tier), dem Krankheitsbild bzw. dem Immunstatus und von anderen, dem Fachmann bekannten oder von diesem leicht ermittelbaren Faktoren ab.
  • Die Erfindung betrifft auch aktivierte regulatorische T-Zellen (Treg-Zellen), wie sie nach dem oben im Einzelnen beschriebenen Verfahren mit einem oder mehreren Inhibitor(en) der Alanyl-Aminopeptidase und/oder mit einem oder mehre ren Inhibitor(en) von Peptidasen mit gleicher Substratspezifität erhältlich sind. Solche aktivierten Treg-Zellen sind bis heute unbekannt und verfügen über eine überraschend hohe suppressive Wirkung, verglichen mit Treg-Zellen, deren Aktivierung auf herkömmlichem Weg erfolgte. Insbesondere können die auf dem Weg des erfindungsgemäßen Verfahrens aktivierten regulatorischen T-Zellen (Treg-Zellen) zur Erzeugung von Toleranz gegen Autoantigene (im eigenen Organismus erzeugte Antigene) und Alloantigene (durch äußere Faktoren eingebrachte Antigene) im menschlichen und tierischen Körper und zur Überwindung einer überschießenden Immunantwort im menschlichen und tierischen Körper herangezogen werden, da sie überraschend stark die Immunantwort des Körpers unterdrücken.
  • Die Erfindung betrifft auch Zubereitungen jeder Art, die aktivierte regulatorische T-Zellen (Treg-Zellen) umfassen oder beinhalten, die nach dem oben im Detail beschriebenen Verfahren mit einem oder mehreren Inhibitor(en) der Alanyl-Aminopeptidase und/oder mit einem oder mehreren Inhibitor(en) von Peptidasen mit gleicher Substratspezifität aktivierbar sind. Derartige Zubereitungen umfassen neben den aktivierten regulatorischen T-Zellen und dem für eine Verabreichung geeigneten Träger oder Lösungsmittel gegebenenfalls zusätzlich noch einen oder mehrere, dem Fachmann bekannte(n) Träger, Hilfsstoff(e) und/oder Adjuvantien. Darunter können – wie dem Fachmann bekannt ist – eine oder mehrere der dem Fachmann als Lösungsmittel, Träger, Hilfsstoff und/oder Adjuvans bekannte Komponenten einzeln oder in Kombination fallen.
  • Die Erfindung betrifft weiter die Verwendung aktivierter regulatorischer T-Zellen (Treg-Zellen) oder auch die Verwendung von aktivierte regulatorische T-Zellen (Treg-Zellen) umfassenden Zubereitungen zur Prävention, Milderung oder Therapie zahlreicher Erkrankungen und Zustände, die mit einer nicht ausbalancierten Immunreaktion des menschlichen oder tierischen Körpers zu tun haben bzw. in Verbindung stehen. Mit welchem Inhibitor oder welchen Inhibitoren die Treg-Zellen aktiviert wurden, spielt bei der erfindungsgemäßen Verwendung keine Rolle.
  • Besonders gut bewährt haben sich die aktivierten regulatorischen T-Zellen (Treg-Zellen) sowie diese enthaltende Zubereitungen bei der Prävention, Milderung oder Therapie von Transplantat-Abstoßungen,
  • Die Erfindung betrifft auch die Verwendung aktivierter regulatorischer T-Zellen (Treg-Zellen) oder auch die Verwendung von aktivierte regulatorische T-Zellen (Treg-Zellen) umfassenden Zubereitungen zur Prävention, Milderung oder Therapie von Erkrankungen mit überschießender Immunantwort und entzündlicher Genese, einschließlich Arteriosklerose, von neuronalen Erkrankungen, von cerebralen Schädigungen, Hauterkrankungen wie beispielsweise Psoriasis, Akne, Kelloiden und anderen hyperproliferativen Zuständen, von Fibrosen, von Tumorerkrankungen und Virus-bedingten Erkrankungen sowie Sepsis und Diabetes Typ II.
  • Die Erfindung betrifft auch die Verwendung aktivierter regulatorischer T-Zellen (Treg-Zellen) oder auch die Verwendung von aktivierte regulatorische T-Zellen (Treg-Zellen) umfassenden Zubereitungen zur Herstellung eines Medikaments oder einer kosmetischen Zubereitung zur Prävention, Milderung oder Therapie von Erkrankungen mit überschießender Immunantwort und entzündlicher Genese, einschließlich Arteriosklerose, von neuronalen Erkrankungen, von cerebralen Schädigungen, Hauterkrankungen wie beispielsweise Psoriasis, Akne, Kelloiden und anderen hyperproliferativen Zuständen, von Fibrosen, von Tumorerkrankungen und Virus-bedingten Erkrankungen sowie Sepsis und Diabetes Typ II.
  • In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung erfolgt eine Verwendung der aktivierten regulatorischen T-Zellen (Treg-Zellen) oder der diese enthaltenden Zubereitungen zur Prophylaxe und Therapie von Erkrankungen wie beispiels weise Multiple Sklerose, Morbus Crohn, Colitis ulcerosa, und anderen Autoimmunerkrankungen sowie entzündlichen Erkrankungen, Asthma bronchiale und anderen allergischen Erkrankungen, Haut- und Schleimhauterkrankungen, beispielsweise Psoriasis, Akne sowie dermatologischen Erkrankungen mit Hyperproliferation und veränderten Differenzierungszuständen von Fibroblasten, benigner fibrosierender und sklerosierender Hauterkrankungen und maligner fibroblastärer Hyperproliferationszustände, akuten neuronalen Erkrankungen, wie beispielsweise Ischämie-bedingter cerebraler Schädigungen nach einem ischämischen oder hämorrhagischen Schlaganfall, Schädel/Hirn-Trauma, Herzstillstand, Herzinfarkt oder als Folge von herzchirurgischen Eingriffen, von chronischen neuronalen Erkrankungen, beispielsweise von Morbus Alzheimer, der Pick'schen Erkrankung, der Progressiven Supranukleären Palsy, der kortikobasalen Degeneration, der frontotemporalen Demenz, von Morbus Parkinson, insbesondere Parkinsonismus gekoppelt an Chromosom 17, von Morbus Huntington, von durch Prionen bedingten Krankheitszuständen und von Amyotropher Lateralsklerose, von Artherosklerose, arterieller Entzündung, Stent-Restenose, von Chronisch Obstruktiven Lungenerkrankungen (COPD), von Tumoren, Metastasierungen, von Prostatakarzinom, von Schwerem Akutem Respiratorischen Syndrom (SARS) und von Sepsis und Sepsis-ähnlichen Zuständen sowie Diabetes Typ II.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt eine Verwendung der aktivierten regulatorischen T-Zellen (Treg-Zellen) oder der diese enthaltenden Zubereitungen zur Prophylaxe und Therapie der Abstoßung von transplantierten Geweben und Zellen. Als ein Beispiel einer solchen Anwendung kann die Verwendung regulatorischer T-Zellen (Treg-Zellen) oder die Verwendung einer Zubereitung, die Treg-Zellen umfasst, bei allogenen oder xenogenen transplantierten Organen, Geweben und Zellen, wie Nieren-, Herz-, Leber-, Pankreas-, Haut- oder Stammzelltransplantation sowie Graft versus Host-Erkrankungen genannt werden.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt eine Verwendung der aktivierten regulatorischen T-Zellen (Treg-Zellen) oder der diese enthaltenden Zubereitungen zur Prophylaxe und Therapie der Abstoßungs- oder Entzündungsreaktionen an oder durch in einen Organismus implantierte medizinische Gegenstände („medical devices"). Dies können beispielsweise Stents, Gelenkimplantate (Kniegelenk-Implantate, Hüftgelenk-Implantate), Knochen-Implantate, Herz-Schrittmacher oder andere Implantate sein.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt eine Verwendung der aktivierten regulatorischen T-Zellen (Treg-Zellen) oder der diese enthaltenden Zubereitungen in der Weise, daß die Treg-Zellen oder diese enthaltende Zusammensetzung(en) in Form einer Beschichtung oder Benetzung auf den Gegenstand bzw. die Gegenstände aufgebracht werden oder mindestens die regulatorischen T-Zellen (Treg-Zellen) oder die diese enthaltenden Zusammensetzungen stofflich dem Material des Gegenstandes/der Gegenstände beigemischt wird. Auch in diesem Fall ist natürlich möglich, aktivierte Treg-Zellen, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurden, oder diese umfassende Zusammensetzungen – gegebenenfalls zeitlich abgestuft oder parallel – lokal oder systemisch zu verabreichen.
  • In gleicher Weise wie vorstehend beschrieben – und für die vergleichbaren Zwecke bzw. zur Prophylaxe und Therapie der vorstehend beispielhaft, jedoch nicht abschließend genannten Erkrankungen und Zustände – können die regulatorischen T-Zellen (Treg-Zellen) im allgemeinen und die diese enthaltenden pharmazeutischen und kosmetischen Zusammensetzungen allein oder in Kombination mehrerer von ihnen zur Herstellung von Medikamenten zur Behandlung der o. g. Krankheiten oder Zustände verwendet werden. Diese können die aktivierten regulatorischen T-Zellen (Treg-Zellen) in den nachstehend beispielhaft genannten Mengen umfassen, gegebenenfalls zusammen mit an sich bekannten Träger-, Hilfs- und/oder Zusatzstoffen.
  • Die Erfindung wird nachfolgend durch Anwendungs-Beispiele näher erläutert. Es versteht sich jedoch im Hinblick auf die obige detaillierte Offenbarung, dass die Erfindung nicht auf die nachfolgenden Beispiele beschränkt ist. Die folgenden Beispiele stellen die derzeit bevorzugten, besten Ausführungsformen dar.
  • Beispiele
  • Beispiel 1
  • Aktivierung humaner regulatorischer T-Zellen in Gegenwart von Actinonin als Inhibitor der Aminopeptidase N
  • Mononukleare Zellen wurden mittels Dichtegradienten-Zentrifugation aus dem peripheren Blut gesunder Spender gewonnen. Die Isolierung regulatorischer T-Zellen erfolgte durch eine zweistufige Magnetseparation:
    In einem ersten Schritt wurden CD4+ T-Zellen durch Depletion aller CD4-negativen Zellen gewonnen [CD4-Separation Kit, Miltenyi Biotech, Bergisch-Gladbach, Deutschland]. Die erzielte Reinheit betrug regelmäßig > 95% CD4+ T-Zellen.
  • In einem zweiten Schritt wurden aus dieser Population mittels CD25-Markierung [anti-CD25 MicroBeads, Miltenyi Biotech] CD4+CD25+ regulatorische T-Zellen wiederum durch Magnetsäulenseparation isoliert.
  • Die CD4+CD25– Fraktion diente als Effektorzell-Kontrolle.
  • Die funktionelle Kapazität der regulatorischen T-Zellen wurde in einer speziellen Kokultur getestet. Hierzu wurden jeweils insgesamt 20.000 Effektorzellen (CD4+CD25–) und regulatorische T-Zellen (CD4+CD25+) in unterschiedlichen quantitativen Verhältnissen zueinander über einen Zeitraum von 120 Stunden in Mikrotestplatten kultiviert. Als Aktivator der T-Zellstimulation wurde ein Festphasen-gebundener anti-CD3-Antikörper [UCHT1, 0,25 μg/well] genutzt.
  • Der Proliferationsgrad der kultivierten Zellen wurde anhand der DNS-Syntheserate mittels Tritium-Thymidineinbau über 24 Stunden analysiert [n = 5].
  • Die Abbildung (1) zeigt die Induktion des suppressiven Phenotyps regulatorischer T-Zellen (Treg-Zellen)) in den quantitativen Relationen von 50% (experimentell relevanten), 20% (experimentell relevanten) und 10% (physiologisch relevanten) Treg-Anteilen in Gegenwart und Abwesenheit des APN-Inhibitors Actinonin.
  • Während bei einem Verhältnis von 1:1 Effektorzellen zu Treg-Zellen auf Grund der starken suppressiven Kapazität der Treg-Zellen kein sicherer Effekt des Inhibitors zu erkennen ist, wird insbesondere in dem physiologisch relevanten quantitativen Bereich von 10:1 eine signifikante Verstärkung der suppressiven Kapazität der Treg-Zellen deutlich (p < 0,05).
  • Beispiel 2
  • Aktivierung humaner regulatorischer T-Zellen in Gegenwart von PAQ22 als Inhibitor der cytosolischen Aminopeptidase (cAAP)
  • Mononukleäre Zellen wurden mittels Dichtegradienten-Zentrifugation aus dem peripheren Blut gesunder Spender gewonnen. Die Isolierung regulatorischer T-Zellen erfolgte durch eine zweistufige Magnetseparation:
    In einem ersten Schritt wurden CD4+ T-Zellen durch Depletion aller CD4-negativen Zellen gewonnen [CD4-Separation Kit, Miltenyi Biotech, Bergisch- Gladbach, Deutschland]. Die erzielte Reinheit betrug regelmäßig > 95% CD4+ T-Zellen.
  • In einem zweiten Schritt wurden aus dieser Population mittels CD25-Markierung [anti-CD25 MicroBeads, Miltenyi Biotech] CD4+CD25+ regulatorische T-Zellen wiederum durch Magnetsäulenseparation isoliert.
  • Die CD4+CD25– Fraktion diente als Effektorzell-Kontrolle.
  • Die funktionelle Kapazität der regulatorischen T-Zellen wurde in einer speziellen Kokultur getestet. Hierzu wurden jeweils insgesamt 20.000 Effektorzellen (CD4+CD25–) und regulatorische T-Zellen (CD4+CD25+) in unterschiedlichen quantitativen Verhältnissen zueinander über einen Zeitraum von 120 Stunden in Mikrotestplatten kultiviert. Als Aktivator der T-Zeltstimulation wurde ein Festphasen-gebundener anti-CD3-Antikörper [UCHT1, 0,25 μg/well] genutzt.
  • Der Proliferationsgrad der kultivierten Zellen wurde anhand der DNS-Syntheserate mittels Tritium-Thymidineinbau über 24 Stunden analysiert [n = 3].
  • Die Abbildung (2) zeigt die Induktion des suppressiven Phenotyps regulatorischer T-Zellen (Treg-Zellen) in den physiologisch relevanten quantitativen Relationen von 10% und 5% Treg-Zellen-Anteilen in Gegenwart und Abwesenheit des selektiven Inhibitors der zytosolischen Aminopeptidase (cAAP) PAQ22. PAQ22 induziert nach 5 Tagen Kokultur konzentrationsabhängig die suppressive Kapazität der regulatorischen T-Zellen.
  • Beispiel 3
  • Aktivierung humaner regulatorischer T-Zellen in Gegenwart von IP10.C8 als dualem Inhibitor der Alanyl-Aminopeptidase (APN) und Dipeptidylpeptidase IV (DPIV)
  • Mononukleäre Zellen wurden mittels Dichtegradienten-Zentrifugation aus dem peripheren Blut gesunder Spender gewonnen. Es schloß sich eine T-Zellseparation unter Verwendung von Nylonwatte-Adhärenz an.
  • Die Isolierung regulatorischer T-Zellen erfolgte durch eine zweistufige Magnetseparation:
    In einem ersten Schritt wurden CD4+ T-Zellen durch Depletion aller CD4-negativen Zellen gewonnen [CD4-Separation Kit, Miltenyi Biotech, Bergisch-Gladbach, Deutschland]. Die erzielte Reinheit betrug regelmäßig > 95% CD4+ T-Zellen.
  • In einem zweiten Schritt wurden aus dieser Population mittels CD25-Markierung [anti-CD25 MicroBeads, Miltenyi Biotech] CD4+CD25+ regulatorische T-Zellen wiederum durch Magnetsäulenseparation isoliert.
  • Die CD4+CD25– Fraktion diente als Effektorzell-Kontrolle.
  • Die funktionelle Kapazität der regulatorischen T-Zellen wurde in einer speziellen Kokultur getestet. Hierzu wurden jeweils insgesamt 20.000 Effektorzellen (CD4+CD25–) und regulatorische T-Zellen (CD4+CD25+) in unterschiedlichen quantitativen Verhältnissen zueinander über einen Zeitraum von 120 Stunden in Mikrotestplatten kultiviert. Als Aktivator der T-Zellstimulation wurde ein Festphasen-gebundener anti-CD3-Antikörper [UCHT1, 0,25 μg/well] genutzt.
  • Der Proliferationsgrad der kultivierten Zellen wurde anhand der DNS-Syntheserate mittels Tritium-Thymidineinbau über 24 Stunden analysiert [n = 10].
  • Die Abbildung (3) zeigt die Induktion des suppressiven Phenotyps regulatorischer T-Zellen (Treg-Zellen) in den quantitativen Relationen von 50% (experimentell relevanten), 20% (experimentell relevanten) und 10% (physiologisch relevanten) Treg-Zellen-Anteilen in Gegenwart und Abwesenheit des dualen Inhibitors der Aminopeptidase N und der Dipeptidylpeptidase IV IP10.C8.
  • Während bei einem Verhältnis von 1:1 Effektorzellen zu Treg-Zellen auf Grund der starken suppressiven Kapazität der Treg-Zellen kein sicherer Effekt des Inhibitors zu erkennen ist, wird insbesondere in dem physiologisch relevanten quantitativen Bereich von 10:1 eine signifikante Verstärkung der suppressiven Kapazität der Treg-Zellen deutlich (p < 0,01).
  • Beispiel 4
  • Aktivierung muriner regulatorischer T-Zellen in Gegenwart von Phebestin als Inhibitor der Alanyl-Aminopeptidase (APN)
  • Mononukleare Zellen (MNC) wurden mittels Dichtegradienten-Zentrifugation aus dem peripheren Blut gesunder Mäuse gewonnen. Die Isolierung regulatorischer T-Zellen erfolgte durch CD25-Markierung [anti-CD25 MicroBeads, Miltenyi Biotech]. Die CD25– MNC-Fraktion diente als Effektorzell-Kontrolle.
  • Die funktionelle Kapazität der regulatorischen T-Zellen wurde in einer speziellen Kokultur getestet. Hierzu wurden jeweils insgesamt 20.000 Effektorzellen (MNC-CD25–) und regulatorische T-Zellen (CD4+CD25+) in unterschiedlichen quantitativen Verhältnissen zueinander über einen Zeitraum von 120 Stunden in Mikrotestplatten kultiviert. Die T-Zellstimulation erfolgte durch Zugabe von anti-CD3/anti-CD28 [1 μg/ml].
  • Der Proliferationsgrad der kultivierten Zellen wurde anhand der DNS-Syntheserate mittels Tritium-Thymidineinbau über 24 Stunden analysiert [n = 4].
  • Die Abbildung (4) zeigt die Induktion des suppressiven Phenotyps regulatorischer T-Zellen (Treg-Zellen) in Gegenwart und Abwesenheit des APN-Inhibitors Phebestin.
  • Phebestin [1,0 μM] induzierte nach 5 Tagen Kokultur die suppressive Kapazität der regulatorischen T-Zellen signifikant (*p < 0,01; #p < 0,05).
  • Beispiel 5
  • Effekt von ex-situ mit einem Inhibitor der APN (Phebestin) aktivierten regulatorischen T-Zellen (Treg-Zellen) im Colitis-Modell an der Maus
  • In Balb-c Mäusen wurde durch orale Applikation von 3% Dextran-Natriumsulfat-Lösung (DSS) eine Colitis ausgelöst. Der Schweregrad der Erkrankung wurde anhand eines Krankheits-Aktivitäts-Index (DAI) festgestellt. Dieser setzte sich aus der täglichen Dokumentation von Körpergewichtsverlust, Stuhlkonsistenz, rektale Blutungen, Nahrungs- und Wasseraufnahme zusammen und ist definiert in der Druckschrift "Bank, U., Heimburg, A., Helmuth, M., Stefin, S., Lendeckel, U., Reinhold, D., Faust, J., Fuchs, P., Sens, B., Neubert, K., Täger, M., Ansorge, S.; Triggering endogenous immunosuppressive mechanisms by combined targeting of Dipeptidyl peptidase IV (DPIV/CD26) and Aminopeptidase N (APN/CD13) – A novel approach for the treatment of inflammatory bowel disease; International Immunopharmacology 6: 1925–1934 (2006)".
  • Parallel wurden regulatorische T-Zellen aus peripherem venösen Blut mittels Dichtegradienten-Zentrifugation und CD25-Microbeads-Magnetseparation gewonnen.
  • An Tag 3 wurden einmalig entweder der Aminopeptidase N-Inhibitor Phebestin (0,5 mg/kgKG), unbehandelte CD4+CD25+ Treg-Zellen (1 Million Zellen / Tier) oder aktivierte CD4+CD25+Treg-Zellen (1 Million Zellen/Tier) intravenös appliziert.
  • Die Aktivierung der Treg-Zellen erfolgte nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ex situ durch 45-minütige Inkubation der Treg-Zellen in Gegenwart von Phebestin [500 μg/ml].
  • Während die einmalige Applikation unbehandelter regulatorischer T-Zellen oder Phebestin intravenös keinen Effekt auf die Krankheitsaktivität (gemessen mit dem Krankheits-Aktivitäts-Index) hatten, resultierte aus der einmaligen Gabe der durch Aktivierung mit einem Alanyl-Aminopeptidase-Inhibitor aktivierten Treg-Zellen eine signifikante Verringerung der klinischen Krankheitssymptome bis zu 48 Stunden nach der Applikation (p < 0,05).
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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  • Zitierte Patentliteratur
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Claims (38)

  1. Verfahren zur Aktivierung regulatorischer T-Zellen (Treg-Zellen) des menschlichen oder tierischen Körpers, umfassend einen Schritt des In-Kontakt-Bringens der regulatorischen T-Zellen (Treg-Zellen) in einem geeigneten flüssigen Medium mit einem oder mehreren Inhibitoren von Alanyl-Aminopeptidase (Aminopeptidase N; APN) und/oder mit einem oder mehreren Inhibitoren von Peptidasen gleicher Substratspezifität unter Induktion einer suppressiven Wirkung der regulatorischen T-Zellen (Treg-Zellen).
  2. Verfahren zur Ex-vivo-Aktivierung regulatorischer T-Zellen (Treg-Zellen) des menschlichen oder tierischen Körpers, umfassend die Schritte: (a) Gewinnen mindestens einer Treg-Zellen umfassenden Körperflüssigkeit aus mindestens einem menschlichen oder tierischen Körper; (b) Isolieren der regulatorischen T-Zellen (Treg-Zellen) aus der/den so gewonnenen menschlichen oder tierischen Körperflüssigkeit(en); (c) In-Kontakt-Bringen der so isolierten und gereinigten regulatorischen T-Zellen in einem geeigneten fluiden Medium mit einem oder mehreren Inhibitoren von Alanyl-Aminopeptidase (Aminopeptidase N; APN) und/oder mit einem oder mehreren Inhibitoren von Peptidasen gleicher Substratspezifität für eine für eine Aktivierung ausreichende Zeit; und (d) Rückführen der so behandelten regulatorischen T-Zellen (Treg-Zellen) in einem geeigneten Medium in mindestens einen menschlichen oder tierischen Körper.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin man als den mindestens einen Inhibitor der Alanyl-Aminopeptidase und/oder als den mindestens einen Inhibitor von Peptidasen mit gleicher Substratspezifität einen oder mehrere bekannte Inhibitoren aus der Gruppe Actinonin, Leuhistin, Phebestin, Amastatin, Bestatin, Probestin, Arphamenin A, Arphamenin B, MR 387 A, MR 387 B, β-Aminothiole, α-Aminophosphinsäuren und deren Ester und Salze, α-Aminophosphonate, α-Aminoboronsäuren, α-Aminoaldehyde, Hydroxamate von α-Aminosäuren, N-Phenylphthalimide, N-Phenylhomophthalimide, α-Ketoamide, Thalidomid und dessen Derivate verwendet.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, worin man als den mindestens einen Inhibitor der Alanyl-Aminopeptidase und/oder als den mindestens einen Inhibitor von Peptidasen mit gleicher Substratspezifität einen oder mehrere bekannte Inhibitoren aus der Gruppe α-Ketoamide, bevorzugt 3-Amino-2-oxo-4-phenylbutansäureamide, α-Aminophosphinsäuren, bevorzugt D-Phe-γ[PO(OH)-CH2]-Phe-Phe, N-Phenylhomophthalimide, bevorzugt PAQ-22, α-Aminophosphonate, bevorzugt RB3014 und/oder Phebestin, besonders bevorzugt PAQ-22, RB3014 und/oder Phebestin, verwendet, ganz besonders bevorzugt worin man als den mindestens einen Inhibitor der Alanyl-Aminopeptidase und/oder als den mindestens einen Inhibitor von Peptidasen mit gleicher Substratspezifität PAQ-22 verwendet oder mehrere bekannte Inhibitoren verwendet, die PAQ-22 umfassen.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin man als den mindestens einen Inhibitor der Alanyl-Aminopeptidase und/oder als den mindestens einen Inhibitor von Peptidasen mit gleicher Substratspezifität einen oder mehrere bekannte Inhibitoren aus der Gruppe dualer Inhibitoren der Alanyl-Aminopeptidase oder von Peptidasen mit gleicher Substratspezifität und der Dipeptidylpeptidase (IV) oder von Peptidasen mit gleicher Substratspezifität aus der Gruppe der Verbindungen der allgemeinen Formeln (1) und (2) A-B-D-B'-A' (1) und A-B-D-E (2) verwendet, worin – A und A' gleich oder verschieden sein können und für den Rest
    Figure 00750001
    stehen, worin X für S, O, CH2, CH2CH2, CH2O oder CH2NH steht und Y für H oder CN steht und * ein chirales Kohlenstoff-Atom vorzugsweise in der S- bzw. L-Konfiguration bezeichnet; – B und B' gleich oder verschieden sein können und für einen O, N oder S enthaltenden oder nicht enthaltenden, unsubstituierten oder substituierten, unverzweigten oder verzweigten Alkylen-Rest, Cycloalkylen-Rest, Aralkylen-Rest, Heterocycloalkylen-Rest, Heteroarylalkylen-Rest, Arylamidoalkylen-Rest, Heretoarylamidoalkylen-Rest, unsubstituierten oder einfach oder mehrfach substituierten Arylen-Rest oder Heteroarylen-Rest mit einem oder mehreren fünf-, sechs- oder siebengliedrigen Ring(en) stehen; – D für -S-S- oder -Se-Se- steht; und – E für die Gruppe- -CH2-CH(NH2)-R9 bzw. -H2-*CH(NH2)-R9 steht, worin R9 für einen O, N oder S enthaltenden oder nicht enthaltenden unsubstituierten oder substituierten unverzweigten oder verzweigten Alkyl-Rest, Cycloalkyl-Rest, Aralkyl-Rest, Heterocycloalkyl-Rest, Heteroarylalkyl-Rest, Arylamidoalkyl-Rest, Heteroarylamidoalkyl-Rest, unsubstituierten oder einfach oder mehrfach substituierten Aryl-Rest oder Heteroaryl-Rest mit einem oder mehreren fünf-, sechs- oder siebengliedrigen Ringen steht und * ein chirales Kohlenstoff-Atom vorzugsweise in der 5- bzw. L-Konfiguration bezeichnet; – oder deren Säureadditionssalze mit organischen und/oder anorganischen Säuren.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, worin man als den mindestens einen Inhibitor der Alanyl-Aminopeptidase und/oder als den mindestens einen Inhibitor von Peptidasen mit gleicher Substratspezifität ein oder mehrere Säureadditionssalz(e) der Verbindungen der allgemeinen Formeln (1) oder (2) aus der Gruppe der Säureadditionssalze pharmazeutisch annehmbarer Säuren verwendet, bevorzugt worin man als die Säureadditionssalze Hydrochloride, Trifluoracetate, Tartrate, Succinate, Formiate und/oder Citrate verwendet.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 oder 6, worin man als den mindestens einen Inhibitor der Alanyl-Aminopeptidase und/oder als den mindestens einen Inhibitor von Peptidasen mit gleicher Substratspezifität eine oder mehrere Verbindungen der allgemeinen Formel (1a)
    Figure 00770001
    verwendet, worin X, Y und B die oben angegebenen Bedeutungen haben, und/oder ihre Säureadditionssalze, bevorzugt ihre Säureadditionssalze mit pharmazeutisch annehmbaren anorganischen und/oder organischen Säuren, weiter bevorzugt ihre Hydrochloride, Trifluoracetate, Tartrate, Succinate, Formiate und/oder Citrate.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, worin man als den mindestens einen Inhibitor der Alanyl-Aminopeptidase und/oder als den mindestens einen Inhibitor von Peptidasen mit gleicher Substratspezifität eine oder mehrere Verbindungen der allgemeinen Formel (1a) verwendet, worin X, Y und B die nachfolgend angegebenen Bedeutungen haben:
    Figure 00780001
    und/oder ihre Säureadditionssalze, bevorzugt ihre Säureadditionssalze mit pharmazeutisch annehmbaren anorganischen und/oder organischen Säuren, weiter bevorzugt ihre Hydrochloride, Trifluoracetate, Tartrate, Succinate, Formiate und/oder Citrate.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 oder 6, worin man als den mindestens einen Inhibitor der Alanyl-Aminopeptidase und/oder als den mindestens einen Inhibitor von Peptidasen mit gleicher Substratspezifität eine oder mehrere Verbindungen der allgemeinen Formel (2a)
    Figure 00780002
    verwendet, worin X, Y, R9 und B die oben angegebenen Bedeutungen haben, und/oder ihre Säureadditionssalze, bevorzugt ihre Säureadditionssalze mit pharmazeutisch annehmbaren anorganischen und/oder organischen Säuren, weiter bevorzugt ihre Hydrochloride, Trifluoracetate, Tartrate, Succinate, Formiate und/oder Citrate.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, worin man als den mindestens einen Inhibitor der Alanyl-Aminopeptidase und/oder als den mindestens einen Inhibitor von Peptidasen mit gleicher Substratspezifität eine oder mehrere Verbindungen der allgemeinen Formel (1a) verwendet, worin X, Y, R9 und B die nachfolgend angegebenen Bedeutungen haben:
    Figure 00800001
    und/oder ihre Säureadditionssalze, bevorzugt ihre Säureadditionssalze mit pharmazeutisch annehmbaren anorganischen und/oder organischen Säuren, weiter bevorzugt ihre Hydrochloride, Trifluoracetate, Tartrate, Succinate, Formiate und/oder Citrate.
  11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, worin man zusätzlich Peptidfragmente von pathogenen Autoantigenen oder synthetische Analoga und/oder spezifische antigene Komponenten pathogener Mikroorganismen einsetzt.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, worin man als Peptidfragmente von pathogenen Autoantigenen MBP (Myelin-Basisches-Protein), MOG (Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein), MAG (Myelin-Assoziiertes-Glykoprotein) und/oder PLP (Proteolipid-Protein) einsetzt und/oder worin man als spezifische antigene Komponenten pathogener Mikroorganismen Hüllproteine oder Membranglycolipid-Komplexe einsetzt.
  13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, worin man die regulatorischen T-Zellen (Treg-Zellen) aus einer oder mehreren der Körperflüssigkeiten isoliert, die gewählt sind aus Blut, vorzugsweise peripherem Blut, noch weiter bevorzugt intravenösem Blut, Fraktionen davon, Lymphe, Exsudaten, oder lokalen Kompartimenten, vorzugsweise Pleura oder Peritoneum.
  14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, worin man die isolierten regulatorischen T-Zellen mit dem mindestens einen Inhibitor der Alanyl-Aminopeptidase und/oder mit dem mindestens einen Inhibitor von Peptidasen mit gleicher Substratspezifität in Kontakt bringt in einer Flüssigkeit aus der Gruppe physiologisch annehmbare Lösungen, Zellkulturmedien und Nährmedien, vorzugsweise aus der Gruppe physiologisch annehmbare wässrige Lösungen, wässrige Zellkulturmedien und wässrige Nährmedien, weiter bevorzugt auch in Gegenwart von in der Zellkultur und Zelltherapie üblichen Antibiotika, Aminosäure-Supplementen, Vitamin-Supplementen, Spurenelement-Supplementen.
  15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, worin man die regulatorischen T-Zellen (Treg-Zellen) in mindestens einen menschlichen oder tierischen Körper, vorzugsweise in den Körper des Spenders der Körperflüssigkeit(en), aus der/denen man die regulatorischen T-Zellen (Treg-Zellen) zuvor isoliert hat, durch eine Applikationsform zurückführt, die gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus intravenöser Applikation, intraarterieller Applikation, intrakavitärer Applikation, intrathekaler Applikation und intradermaler Applikation, vorzugsweise durch intravenöse Applikation.
  16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, worin man den Schritt der Inkubation von regulatorischen T–Zellen (Treg-Zellen) mit einem oder mehreren inhibitoren von Alanyl-Aminopeptidase (Aminopeptidase N; APN) und/oder mit einem oder mehreren Inhibitoren von Peptidasen gleicher Substratspezifität durchführt in üblichen, vorzugsweise statischen oder horizontal bewegten oder vertikal bewegten oder kreisend bewegten, Zellkultur-Gefäßen, bevorzugt in Kulturschalen, auf Kulturplatten, in Zellkultur-Reaktoren, in Zellkultur-Flaschen, in Zellkultur-Beuteln, in für Zellkulturen geeigneten Zwei- oder Mehrkammer-Systemen, in Hohlfaser-Reaktoren, besonders bevorzugt in Zellkultur-Gefäßen, die auf einem Teil oder auf der Gänze ihrer der Kultur zugewandten Oberfläche eine gegebenenfalls reaktionsfördernde Oberflächenbeschichtung und/oder Matrix-Ersatzstoffe aufweisen.
  17. Aktivierte regulatorische T-Zellen (Treg-Zellen), erhältlich nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16.
  18. Zubereitung, umfassend aktivierte regulatorische T-Zellen (Treg-Zellen) nach Anspruch 17, gegebenenfalls zusammen mit üblichen Lösungsmitteln, Trägern, Hilfsstoffen und/oder Adjuvantien.
  19. Verwendung aktivierter regulatorischer T-Zellen (Treg-Zellen) nach Anspruch 17 und/oder Verwendung von Zubereitungen nach Anspruch 18 zur Prävention, Milderung oder Therapie von Transplantat-Abstoßungsreaktionen.
  20. Verwendung aktivierter regulatorischer T-Zellen (Treg-Zellen) nach Anspruch 17 und/oder Verwendung von Zubereitungen nach Anspruch 18 zur Prävention, Milderung oder Therapie von Autoimmunerkrankungen.
  21. Verwendung aktivierter regulatorischer T-Zellen (Treg-Zellen) nach Anspruch 17 und/oder Verwendung von Zubereitungen nach Anspruch 18 zur Prävention, Milderung oder Therapie von Allergien, Asthma bronchiale und Chronisch Obstruktiven Lungen-Erkrankungen (COPD).
  22. Verwendung aktivierter regulatorischer T-Zellen (Treg-Zellen) nach Anspruch 17 und/oder Verwendung von Zubereitungen nach Anspruch 18 zur Prävention, Milderung oder Therapie von Erkrankungen chronisch-entzündlicher Genese, vorzugsweise zur Prävention, Milderung oder Therapie von Arteriosklerose.
  23. Verwendung aktivierter regulatorischer T-Zellen (Treg-Zellen) nach Anspruch 17 und/oder Verwendung von Zubereitungen nach Anspruch 18 zur Prävention, Milderung oder Therapie von neuronalen Erkrankungen und cerebraler Schädigung.
  24. Verwendung aktivierter regulatorischer T-Zellen (Treg-Zellen) nach Anspruch 17 und/oder Verwendung von Zubereitungen nach Anspruch 18 zur Prävention, Milderung oder Therapie von Hauterkrankungen, vorzugsweise Psoriasis, Akne oder Kelloiden, und anderen hyperproliferativen Zuständen.
  25. Verwendung aktivierter regulatorischer T-Zellen (Treg-Zellen) nach Anspruch 17 und/oder Verwendung von Zubereitungen nach Anspruch 18 zur Prävention, Milderung oder Therapie von Fibrosen.
  26. Verwendung aktivierter regulatorischer T-Zellen (Treg-Zellen) nach Anspruch 17 und/oder Verwendung von Zubereitungen nach Anspruch 18 zur Prävention, Milderung oder Therapie von Tumorerkrankungen und Sepsis.
  27. Verwendung aktivierter regulatorischer T-Zellen (Treg-Zellen) nach Anspruch 17 und/oder Verwendung von Zubereitungen nach Anspruch 18 zur Prävention, Milderung oder Therapie von Multipler Sklerose, Morbus Crohn, Colitis ulcerosa, und anderen Autoimmunerkrankungen.
  28. Verwendung aktivierter regulatorischer T-Zellen (Treg-Zellen) nach Anspruch 17 und/oder Verwendung von Zubereitungen nach Anspruch 18 zur Prävention, Milderung oder Therapie von entzündlichen Erkrankungen.
  29. Verwendung aktivierter regulatorischer T-Zellen (Treg-Zellen) nach Anspruch 17 und/oder Verwendung von Zubereitungen nach Anspruch 18 zur Prävention, Milderung oder Therapie von Asthma bronchiale und anderen allergischen Erkrankungen.
  30. Verwendung aktivierter regulatorischer T-Zellen (Treg-Zellen) nach Anspruch 17 und/oder Verwendung von Zubereitungen nach Anspruch 18 zur Prävention, Milderung oder Therapie von Haut- und Schleimhauterkrankungen, vorzugsweise Psoriasis, Akne sowie dermatologischen Erkrankungen mit Hyperproliferation und veränderten Differenzierungszuständen von Fibroblasten, benigner fibrosierender und sklerosierender Hauterkrankungen und maligner fibroblastärer Hyperproliferationszustände.
  31. Verwendung aktivierter regulatorischer T-Zellen (Treg-Zellen) nach Anspruch 17 und/oder Verwendung von Zubereitungen nach Anspruch 18 zur Prävention, Milderung oder Therapie von akuten neuronalen Erkrankungen, wie beispielsweise Ischämie-bedingter cerebraler Schädigungen nach einem ischämischen oder hämorrhagischen Schlaganfall, Schädel/Hirn-Trauma, Herzstillstand, Herzinfarkt oder als Folge von herzchirurgischen Eingriffen.
  32. Verwendung aktivierter regulatorischer T-Zellen (Treg-Zellen) nach Anspruch 17 und/oder Verwendung von Zubereitungen nach Anspruch 18 zur Prävention, Milderung oder Therapie von chronischen neuronalen Erkrankungen, vorzugsweise von Morbus Alzheimer, der Pick'schen Erkrankung, der Progressiven Supranukleären Palsy, der kortikobasalen Degeneration, der frontotemporalen Demenz, von Morbus Parkinson, weiter bevorzugt von Parkinsonismus gekoppelt an Chromosom 17, von Morbus Huntington.
  33. Verwendung aktivierter regulatorischer T-Zellen (Treg-Zellen) nach Anspruch 17 und/oder Verwendung von Zubereitungen nach Anspruch 18 zur Prävention, Milderung oder Therapie von durch Prionen bedingten Krankheitszuständen und von Amyotropher Lateralsklerose.
  34. Verwendung aktivierter regulatorischer T-Zellen (Treg-Zellen) nach Anspruch 17 und/oder Verwendung von Zubereitungen nach Anspruch 18 zur Prävention, Milderung oder Therapie von Artherosklerose, arterieller Entzündung, Stent-Restenose.
  35. Verwendung aktivierter regulatorischer T-Zellen (Treg-Zellen) nach Anspruch 17 und/oder Verwendung von Zubereitungen nach Anspruch 18 zur Prävention, Milderung oder Therapie von Tumoren, Metastasierungen, von Prostatakarzinom.
  36. Verwendung aktivierter regulatorischer T-Zellen (Treg-Zellen) nach Anspruch 17 und/oder Verwendung von Zubereitungen nach Anspruch 18 zur Prävention, Milderung oder Therapie von von Schwerem Akutem Respiratorischen Syndrom (SARS).
  37. Verwendung aktivierter regulatorischer T-Zellen (Treg-Zellen) nach Anspruch 17 und/oder Verwendung von Zubereitungen nach Anspruch 18 zur Prävention, Milderung oder Therapie von Sepsis und Sepsisähnlichen Zuständen.
  38. Verwendung aktivierter regulatorischer T-Zellen (Treg-Zellen) nach Anspruch 17 und/oder Verwendung von Zubereitungen nach Anspruch 18 zur Prävention, Milderung oder Therapie von Diabetes Typ II.
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