DE102007020578A1

DE102007020578A1 - Wässrige Aerosolzubereitungen enthaltend therapeutisch wirksame Mikroorganismen oder Teile von Mikroorganismen und Verfahren zur Erzeugung entsprechender Aerosole

Info

Publication number: DE102007020578A1
Application number: DE102007020578A
Authority: DE
Inventors: Georg Boeck; Michael Spallek
Original assignee: Boehringer Ingelheim Pharma GmbH and Co KG; Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Boehringer Ingelheim Pharma GmbH and Co KG; Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2007-05-02
Filing date: 2007-05-02
Publication date: 2008-11-06
Also published as: EP2152235A2; US20100116268A1; WO2008135460A3; WO2008135460A2

Abstract

Die Erfindung betrifft wässrige Aerosolzubereitungen für die inhalative Applikation, enthaltend therapeutisch wirksame Mikroorganismen oder Teile von Mikroorganismen als Wirkstoff.

Description

Die Erfindung betrifft wässrige Aerosolzubereitungen für die inhalative Applikation enthaltend therapeutisch wirksame Mikroorganismen oder Teile von Mikroorganismen als Wirkstoff.
Die Anwendung von Arzneistoffen in Form inhalierfähiger Aerosole ist seit langem bekannt. Solche Aerosole dienen nicht nur zur Behandlung von Atemwegserkrankungen wie Asthma; sie werden auch verwendet, wenn die Lunge oder die Nasenschleimhäute als Resorptionsorgan dienen sollen. Häufig können so hohe Blutspiegel des Wirkstoffes erzeugt werden, um auch Krankheiten in anderen Körperregionen zu behandeln. Inhalierbare Aerosole können auch als Impfstoffe dienen.
Zur Herstellung von Aerosolen werden in der Praxis mehrere Verfahren angewendet. Entweder werden Suspensionen oder Lösungen von Wirkstoffen, u. a. mit Hilfe von Treibgasen, versprüht oder Wirkstoffe in Form mikronisierter Pulver in der Atemluft verwirbelt oder schließlich wässrige Lösungen mit Hilfe von Verneblern zerstäubt.
Bei komplizierter gebauten Molekülen, wie z. B. Interferonen, kann die Verneblung wässriger Lösungen leicht zu einer störenden Verminderung der Wirkstoffaktivität führen, vermutlich durch Scherkräfte und Erwärmung. Es wird vermutet, dass in diesem Prozess z. B. die Bildung minderaktiver Proteinaggregate eine Rolle spielt. A.Y. Ip und Kollegen haben in ihrem Artikel 'Stability of recombinant consensus interferon to air-jet and ultrasonic nebulisation', J. Pharm. Sci. 84: 1210–1214 [1995], Beispiele für die Entstehung von Interferonaggregaten nach Ultraschall oder Düsen-Verneblung mit damit einhergehendem Verlust der biologischen Aktivität des Interferons beschrieben. Auch wenn die Zerstörung des Biomoleküls nicht vollständig ist, ist die hier beschriebene Aktivitätsverminderung wichtig, weil sie einen größeren Verbrauch des möglicherweise teuren Biomoleküles verursacht und die Dosierung an aktivem Arzneimittel pro Hub ungenau werden lässt. Diese Abnahme der Aktivität von kompliziert gebauten Molekülen während der Aerosolerzeugung ist nicht nur auf Interferone begrenzt, sie kommt in kleinerem oder größerem Maß auch während der Aerosolisierung anderer Proteine (siehe z. B. Niven et al, Pharm Res. 12: 53–59 [1995]) und Biomoleküle, insbesondere von derartigen Makromolekülen, vor.
Es ist weiterhin bekannt, Mukoviszidose-Patienten mit Sulfid-Brücken spaltenden Enzymen zu behandeln, indem man diese Enzyme vernebelt.
In EP 1003478 sind wässrige Aerosolzubereitungen mit biologisch aktiven Makromolekülen für die treibgasfreie Erzeugung von inhalierbaren Aerosolen beschrieben.
Neben der technischen Herstellung des Biomolekül enthaltenden Aerosols ist ein zweiter Schritt notwendig, damit die Biomoleküle in der Lunge absorbiert werden. Die Lunge des erwachsenen Menschen bietet eine große Absorptionsfläche, aber sie weist auch mehrere Hindernisse für die pulmonäre Absorption von Biomolekülen auf. Nach Inspiration durch die Nase oder den Mund geht Luft (mit dem von ihn getragenen Aerosol) in die Trachea und dann über immer kleinere Bronchien und Bronchiolen in die Alveoli. Die Alveoli haben eine viel größere Fläche als Trachea, Bronchi und Bronchiolen zusammen. Sie sind die Hauptabsorptionszone, nicht nur für Sauerstoff, sondern auch für biologisch aktive Makromoleküle. Um aus der Luft in die Blutbahn zu gelangen, müssen Moleküle das alveoläre Epithel, das kapilläre Endothel und den lymphe-enthaltenden interstitiellen Raum zwischen diesen zwei Zell-Schichten durchqueren. Dies kann über aktive oder passive Transportprozesse stattfinden. Die Zellen in diesen zwei Zellschichten liegen dicht beieinander, so dass die meisten großen biologischen Makromoleküle (wie z. B. Proteine) diese Sperre viel langsamer durchqueren als kleinere Moleküle. Der Prozess der Durchquerung des alveolären Epithels und des kapillären Endothels läuft in Konkurrenz mit anderen biologischen Prozessen die zur Zerstörung des Biomoleküls führen. Die bronchoalveoläre Flüssigkeit enthält Exoproteasen [siehe z. B. Wall D.A. und Lanutti, A.T. 'High levels of exopeptidase activity are present in rat and canine bronchoalveolar lavage fluid'. Int. J. Pharm. 97: 171–181 (1993)]. Sie enthält auch Macrophagen, welche inhalierte Protein-Teilchen mittels Phagozytose eliminieren. Diese Macrophagen migrieren zur Basis des bronchialen Baumes, von wo aus sie mittels des mucoziliaren Clearance Mechanismus aus der Lunge geraten. Sie können dann in die Lymphbahn migrieren. Weiter können die Macrophagen vom aerosolisierten Protein in ihrer Physiologie beeinflusst werden, z. B. können Interferone alveolare Macrophagen aktivieren. Die Migration von aktivierten Macrophagen stellt einen weiteren Mechanismus für die Verbreitung der systemischen Wirkung eines inhalierten Proteins dar. Die Komplexität dieses Prozesses bedeutet, dass Ergebnisse von Aerosol-Versuchen mit einem Protein Typ auf einen anderen Protein Typ nur begrenzt übertragbar sind. Kleine Unterschiede zwischen Interferonen können zum Beispiel einen deutlichen Einfluss auf Ihre Susceptibilität gegenüber den Degradationsmechanismen in der Lunge haben [siehe Bocci et al 'Pulmonary catabolism of interferons: alveolar absorption of 125-I labelled human interferon alpha is accompanied by partial loss of biological activity' Antiviral Research 4: 211–220 (1984)].
Mikroorganismen, die eine Form von biologischen Makromolekülen darstellen, können zwar prinzipiell vernebelt werden, aber diese Verneblung findet in der Regel mit einem Aktivitätsverlust statt. Als Mikroorganismen werden in diesem Zusammenhang alle einzelligen Kleinstlebewesen mit einer Größe von ≤ 200 μm definiert. Zu den Mikroorganismen gehören insbesondere Bakterien und Pilze.
Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, wässrige Aerosolzubereitungen zur Verfügung zu stellen, welche therapeutisch wirksame Mikroorganismen oder Teile von Mikroorganismen, insbesondere Bakterien, Pilze oder Teile hiervon als Wirkstoff enthalten und zur Inhalation verwendet werden können.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass flüssige Zubereitungen von therapeutisch wirksamen Mikroorganismen oder Teilen von Mikroorganismen als Wirkstoff ohne nennenswerte Aktivitätsverluste vernebelt werden können.
Vorzugsweise handelt es sich hierbei um treibgasfreie Vernebler, die eine vorherbestimmte Menge einer Aerosolzubereitung unter hohem Druck zwischen 100 und 500 bar durch mindestens eine Düse mit einem hydraulischen Durchmesser von 1 bis 12 Mikrometer versprühen, so dass inhalierbare Tröpfchen mit einer mittleren Teilchengröße kleiner als 10 Mikrometer entstehen.
Außerdem können auch hochkonzentrierte Lösungen von therapeutisch wirksamen Mikroorganismen oder Teilen von Mikroorganismen vernebelt werden. Der Gebrauch hochkonzentrierter Lösungen ermöglicht die Verwendung eines Gerätes mit vielen Einzeldosen in einem kleinen Reservoir.
Gegenstand der Erfindung sind ferner Aerosolzubereitungen in Form von wässrigen Lösungen, die als Wirkstoff therapeutisch wirksame Mikroorganismen oder Teile von Mikroorganismen, insbesondere therapeutisch wirksame Bakterien, Pilze oder Teile von Bakterien oder Pilzen, in einer Menge zwischen 3 mg/ml und 100 mg/ml, enthalten. Besonders bevorzugt sind die Mikroorganismen der Gattung Bacillus, Staphylococcus, Pseudomonas, Escherichia, Salmonella, Candida oder Aspergillus bzw. eine Mischung dieser Gattungen. Ganz besonders bevorzugt werden Mikroorganismen der Spezies Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Salmonella abony, Candida albicans, Aspergillus niger, bzw. eine Mischung dieser Spezies.
Überraschenderweise hat sich gezeigt, dass auch höher viskose Lösungen von therapeutisch wirksamen Mikroorganismen oder Teile von Mikroorganismen zu inhalierbaren Tröpfchen geeigneter Tröpfchengröße versprüht werden können.
Dies ermöglicht die Applikation größerer Wirkstoffmengen pro Anwendung und erhöht damit die therapeutische Wirksamkeit von therapeutisch wirksamen Mikroorganismen oder Teile von Mikroorganismen bei der inhalativen Therapie.
Für das erfindungsgemäße Aerosol können therapeutisch wirksame Mikroorganismen oder Teile von Mikroorganismen enthaltende wässrige Aerosolzubereitungen bis zu einer Grenzviskosität von 1600 × 10^–6 Pascal eingesetzt werden.
Bevorzugt sind höhere viskose Lösungen von therapeutisch wirksamen Mikroorganismen oder Teile von Mikroorganismen, die eine Grenzviskosität bis zu 1100 × 10^–6 Pascal aufweisen. Die angegebenen Grenzviskositäten wurden mit einem Oswald Viskosimeter nach literaturbekannter Methode bestimmt. Zum Vergleich: Die Grenzviskosität von Wasser liegt bei 900 × 10^–6 Pascal.
Die wässrige Aerosolzubereitung kann außerdem einen oder mehrere Hilfsstoffe aus der Gruppe der oberflächenaktiven Stoffe, Emulgatoren, Stabilisatoren, Permeationsverbesserer und/oder Konservierungsstoffe sowie eine Aminosäure zur Verbesserung der Löslichkeit/Stabilität des Wirkstoffes, vorzugsweise Prolin, enthalten.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Verwendung der wässrigen Aerosolzubereitung zur Behandlung von Atemwegserkrankungen, insbesondere zur Behandlung der chronisch obstruktive Lungererkrankung (COPD) oder zur Immunbehandlung von Menschen und Tieren.
Als Vernebler können alle handelsüblichen Geräte mit oder ohne Treibgas verwendet werden.
Eine neue Generation von treibgasfreien Verneblern ist in dem US-Patent 5,497,944 und WO 97/12687 beschrieben, auf die hiermit inhaltlich Bezug genommen wird. Eine bevorzugte Düsenanordnung für die Verneblung der erfindungsgemäßen wässrigen Aerosolzubereitungen biologisch aktiver Makromoleküle ist in 8 der US-Patentschrift dargestellt. Der besondere Vorteil der dort beschriebenen Vernebler ist, dass auf die Verwendung von Treibgasen verzichtet wird.
Eine weiterentwickelte Ausführungsform der dort beschriebenen Vernebler ist in der PCT/EP96/04351 = WO 97/12687 offenbart. In Bezug auf die vorliegende Erfindung wird ausdrücklich auf die dort beschriebene 6 sowie auf die dazugehörigen Beschreibungsteile der Anmeldung verwiesen. Der dort beschriebene Vernebler kann vorteilhaft zur Erzeugung der beanspruchten inhalierbaren Aerosole biologisch aktiver Makromoleküle eingesetzt werden. Bei den dort beschriebenen Verneblern werden wirkstoffhaltige Lösungen definierter Volumina unter Anwendung hoher Drucke durch kleine Düsen versprüht, so dass inhalierbare Aerosole mit einer mittleren Teilchengröße zwischen 3 und 10 Mikrometer entstehen.
Von besonderer Bedeutung ist die Verwendung der in dem oben beschriebenen Patent bzw. der Patentanmeldung beschriebenen Vorrichtung zum treibgasfreien Zerstäuben der erfindungsgemäßen Aerosolzubereitung. Im Wesentlichen besteht der Zerstäuber (Vernebler) aus dem Gehäuseoberteil, einem Pumpengehäuse, einer Düse, einem Sperrspannwerk, einem Federgehäuse, einer Feder und einem Vorratsbehälter, gekennzeichnet durch

– ein Pumpengehäuse, das im Gehäuseoberteil befestigt ist, und das an seinem einen Ende einen Düsenkörper mit der Düse trägt,
– einen Hohlkolben mit Ventilkörper,
– einen Abtriebsflansch, in dem der Hohlkolben befestigt ist, und der sich im Gehäuseoberteil befindet,
– ein Sperrspannwerk, das sich im Gehäuseoberteil befindet,
– ein Federgehäuse mit der darin befindlichen Feder, das am Gehäuseoberteil mittels eines Drehlagers drehbar gelagert ist,
– ein Gehäuseunterteil, das auf das Federgehäuse in axialer Richtung aufgesteckt ist.

Der Hohlkolben mit Ventilkörper ( WO 97/12687 ) entspricht einer der oben genannten Vorrichtungen. Er ragt teilweise in den Zylinder des Pumpengehäuses hinein und ist im Zylinder axial verschiebbar angeordnet. Der Hohlkolben mit Ventilkörper übt auf seiner Hochruckseite zum Zeitpunkt des Auslösens der Feder einen Druck von 5 bis 60 MPa (etwa 50 bis 600 bar), bevorzugt 10 bis 60 MPa (etwa 100 bis 600 bar) auf das Fluid aus.
Die Düse im Düsenkörper ist bevorzugt mikrostrukturiert, d. h. durch Mikrotechnik hergestellt. Mikrostrukturierte Düsenkörper sind beispielsweise in WO-94/07607 offenbart; auf diese Schrift wird hiermit inhaltlich Bezug genommen.
Der Düsenkörper besteht z. B. aus zwei fest miteinander verbundenen Platten aus Glas und/oder Silizium, von denen wenigstens eine Platte einen oder mehrere mikrostrukturierte Kanäle aufweist, die die Düseneinlassseite mit der Düsenauslassseite verbinden. Auf der Düsenauslassseite ist mindestens eine runde oder nicht-runde Öffnung von kleiner oder gleich 10 μm angebracht.
Die Strahlrichtungen der Düsen im Düsenkörper können parallel zueinander verlaufen oder gegeneinander geneigt sein. Bei einem Düsenkörper mit mindestens zwei Düsenöffnungen auf der Auslassseite können die Strahlrichtungen um einen Winkel von 20 Grad bis 160 Grad gegeneinander geneigt sein, bevorzugt um einem Winkel von 60 bis 150 Grad. Die Strahlrichtungen treffen sich in der Umgebung der Düsenöffnungen.
Der Ventilkörper ist bevorzugt an dem Ende des Hohlkolbens angebracht, das dem Düsenkörper zugewandt ist.
Das Sperrspannwerk enthält eine Feder, bevorzugt eine zylindrische schraubenförmige Druckfeder als Speicher für die mechanische Energie. Die Feder wirkt auf den Abriebsflansch als Sprungstück, dessen Bewegung durch die Position eines Sperrglieds bestimmt wird. Der Weg des Abriebsflansches wird durch einen oberen und einen unteren Anschlag präzise begrenzt. Die Feder wird bevorzugt über ein kraftübersetzendes Getriebe, z. B. ein Schraubschubgetriebe, durch ein äußeres Drehmoment gespannt, das beim Drehen des Gehäuseoberteils gegen das Federgehäuse im Gehäuseunterteil erzeugt wird. In diesem Fall enthalten das Gehäuseoberteil und der Abtriebsflansch ein ein- oder mehrgängiges Keilgetriebe.
Das Sperrglied mit einrückenden Sperrflächen ist ringförmig um den Abtriebsflansch angeordnet. Es besteht z. B. aus einem in sich radial elastisch verformbaren Ring aus Kunststoff oder aus Metall. Der Ring ist in einer Ebene senkrecht zur Zerstäuberachse angeordnet. Nach dem Spannen der Feder schieben sich die Sperrflächen des Sperrgliedes in den Weg des Abtriebsflansches und verhindern das Entspannen der Feder. Das Sperrglied wird mittels einer Taste ausgelöst. Die Auslösetaste ist mit dem Sperrglied verbunden oder gekoppelt. Zum Auslösen des Sperrspannwerkes wird die Auslösetaste parallel zur Ringebene, und zwar bevorzugt in den Zerstäuber hinein, verschoben; dabei wird der verformbare Ring in der Ringebene verformt.
Das Gehäuseunterteil wird in axialer Richtung über das Federgehäuse geschoben und verdeckt die Lagerung, den Antrieb der Spindel und den Vorratsbehälter für das Fluid.
Beim Betätigen des Zerstäubers wird das Gehäuseoberteil gegen das Gehäuseunterteil gedreht, wobei das Gehäuseunterteil das Federgehäuse mitnimmt. Dabei wird die Feder über das Schraubschubgetriebe zusammengedrückt und gespannt, und das Sperrwerk rastet selbsttätig ein. Der Drehwinkel ist bevorzugt ein ganzzahliger Bruchteil von 360 Grad, z. B. 180 Grad. Gleichzeitig mit dem Spannen der Feder wird das Abtriebsteil im Gehäuseoberteil um einen vorgegebenen Weg verschoben, der Hohlkolben wird innerhalb des Zylinders im Pumpengehäuse zurückgezogen, wodurch eine Teilmenge des Fluids aus dem Vorratsbehälter in den Hochdruckraum vor der Düse eingesaugt wird.
In den Zerstäuber können gegebenenfalls nacheinander mehrere das zu zerstäubende Fluid enthaltende austauschbare Vorratsbehälter eingeschoben und benutzt werden. Der Vorratsbehälter enthält die erfindungsgemäß wässerige Aerosolzubereitung.
Die Effektivität eines Verneblungsgerätes kann in einem in vitro System getestet werden, wobei eine Proteinlösung vernebelt wird und das Aerosol aufgefangen und analysiert wird. Die Aktivität des Proteins in der Vernebelungslösung (a) wird mit der Aktivität im analysierten Aerosol (b) verglichen, z. B. mit Hilfe eines Immunoassays oder mit Hilfe eines Assays für die biologische Wirksamkeit des Proteins. Dieser Versuch erlaubt eine Beurteilung des Grades der Zerstörung des Proteins durch die Verneblung.
Ein zweiter Parameter zur Beurteilung der Aerosolqualität ist der so genannte inhalierbare Anteil, der hier als Anteil der Nebeltröpfchen mit einem Massen-medianen aerodynamischen Durchmesser (MMAD) von weniger als 5.8 μm definiert ist. Der MMAD kann z. B. mittels eines "Andersen Cascade Impactor" gemessen werden. Für eine effiziente Proteinabsorption ist es wichtig, nicht nur eine Verneblung ohne wesentlichen Aktivitätsverlust zu erreichen, sondern ein Aerosol mit einem guten (ca. 60%) inhalierbaren Anteil zu generieren. Aerosole mit einem MMAD von weniger als 5.8 μm sind deutlich besser geeignet die Alveoli zu erreichen, wo aufgrund der sehr großen Resorptionsoberfläche ihre Chancen absorbiert zu werden deutlich größer sind. Die Effektivität eines Verneblungsgerätes kann auch in einem in vivo System getestet werden, wobei in diesem Fall Faktoren wie Susceptibilität gegenüber Lungenproteasen im Spiel sind. Als Beispiel eines in vivo Testsystems kann einem Hund ein Protein-enthaltender Nebel über einen Trachealtubus verabreicht werden. Blutproben werden in passenden Zeitabständen genommen und danach wird der Proteinspiegel im Plasma mit immunologischen oder biologischen Methoden gemessen.
Um Vorteile des erfindungsgemäßen Aerosols zu illustrieren, werden die folgenden in vitro Versuche beschrieben.
In vitro Versuche mit dem Soft Inhaler Respimat^®
Das Reservoir eines Respimat Gerätes (a) wurde jeweils mit einer Suspension verschiedener Mikroorganismen in 50 mM Trinatriumcitrat, 150 mM NaCl, pH 5.5 befüllt. Folgende Mikroorganismen fanden Anwendung:

1.) Bacillus subtilis ATCC 6633
2.) Staphylococcus aureus ATCC 6538
3.) Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027
4.) Escherichia coli ATCC 8739
5.) Salmonella abony NCTC 6017
6.) Candida albicans ATCC 10231
7.) Aspergillus niger ATCC 16404

Diese Stämme sind bei der American Tissue Culture Collection hinterlegt.
Mehrere Hübe, die insgesamt einem Volumen von ca. 0,5 ml Lösung entsprachen, wurden am Respimat^® ausgelöst. Das entstehende Aerosol wurde in einen abgedichteten 1000 ml Schüttelkolben mit 100 ml einer physiologischen Pufferlösung und 0,1% Tween 80 aufgefangen. Danach wurde der Kolben an seiner Öffnung vollständig verschlossen und das Aerosol wird von der Pufferlösung im Kolben mit Hilfe von sanftem Schütteln aufgenommen.
Die abgegebene Aerosolmenge wurde durch Wiegen des Respimat^® Inhalators bestimmt. Die anschliessenden mikrobiologischen Untersuchungen wurden entsprechend den Vorgaben von Ph. Eur. 3, 2000 (2.6.12) und USP 24 durchgeführt:
20 ml der Pufferlösung aus dem Schüttelkolben sowie ein Aliquot von 0,1 ml der im Reservoir des Respimat^® Inhalers wurden getrennt voneinander durch Membranfilter gefiltert. Als Kontrollansatz werden 0,1 ml der entsprechenden Suspension der o. g. Mikroorganismen in 20 ml Pufferlösung gefiltert.
Die Membranfilter durch die die Suspensionen der Bakterien gefiltert wurden wurden im Anschluss an die Filtration auf Agarplatten aufgelegt und für 5 Tage bei 33°C inkubiert. Die Membranfilter durch die die Suspensionen der Hefen und Pilze gefiltert wurden wurden im Anschluss an die Filtration auf Agarplatten aufgelegt und für 5 Tage bei 25°C inkubiert. Insgesamt werden mit jedem Mikroorganismus drei Versuche durchgeführt.
Tab. 1, Tab. 3 und Tab. 5 zeigen die Ergebnisse der drei Versuche. Vergleichend sind die koloniebildenden Einheiten pro Milliliter (KBE/ml) aus dem Aerosol, dem Reservoir und der Kontrollgruppe dargestellt. Die Überlebensrate und die Abtötungsrate in Prozent wurden für das aufgefangene Aerosol im Bezug auf die Reservoirsuspension berechnet.

Tab. 2, Tab. 4 und Tab. 6 zeigen die Ergebnisse für die durch Wiegen bestimmte abgegebene Aerosolmenge. Tab. 1 Ergebnisse des ersten Versuchs.

	Aerosol	Reservoir	Kontrollgruppe	Überlebensrate	Abtötungsrate
	[KBE/ml]	[KBE/ml]	[KBE/ml]	[%]	[%]
Staphylococcus aureus	86	88	92	97.7	2.3
Bacillus subtilis	60	62	64	96.8	3.2
Pseudomonas aeruginosa	78	84	90	92.9	7.1
Escherichia coli	80	82	86	97.6	2.4
Salmonella abony	64	68	70	94.1	5.9
Candida albicans	6	70	74	8.6	91.4
Aspergillus niger	0	42	50	0.0	100.0

Tab. 2 Bestimmung der abgegebenen Aerosolmenge für den ersten Versuch

	Aerosolmenge [g]
Staphylococcus aureus	0.52
Bacillus subtilis	0.54
Pseudomonas aeruginosa	0.50
Escherichia coli	0.49
Salmonella abony	0.51
Candida albicans	0.50
Aspergillus niger	0.53

Tab. 3 Ergebnisse des zweiten Versuchs

	Aerosol	Reservoir	Kontrollgruppe	Überlebensrate	Abtötungsrate
	[KBE/ml]	[KBE/ml]	[KBE/ml]	[%]	[%]
Staphylococcus aureus	78	84	88	92.9	7.1
Bacillus subtilis	64	70	72	91.4	8.6
Pseudomonas aeruginosa	76	84	82	90.5	9.5
Escherichia coli	70	74	80	94.6	5.4
Salmonella abony	64	77	74	83.1	16.9
Candida albicans	0	62	68	0.0	100.0
Aspergillus niger	0	42	51	0.0	100.0

Tab. 4 Bestimmung der abgegebenen Aerosolmenge für den zweiten Versuch

	Aerosolmenge [g]
Staphylococcus aureus	0.55
Bacillus subtilis	0.50
Pseudomonas aeruginosa	0.46
Escherichia coli	0.52
Salmonella abony	0.50
Candida albicans	0.48
Aspergillus niger	0.55

Tab. 5 Ergebnisse des dritten Versuchs

	Aerosol	Reservoir	Kontrollgruppe	Überlebensrate	Abtötungsrate
	[KBE/ml]	[KBE/ml]	[KBE/ml]	[%]	[%]
Staphylococcus aureus	74	78	84	94.9	5.1
Bacillus subtilis	58	66	70	87.9	12.1
Pseudomonas aeruginosa	68	74	80	91.9	8.1
Escherichia coli	80	86	84	93.0	7.0
Salmonella abony	57	68	72	83.8	16.2
Candida albicans	0	64	71	0.0	100.0
Aspergillus niger	0	38	48	0.0	100.0

Tab. 6 Bestimmung der abgegebenen Aerosolmenge für den zweiten Versuch

	Aerosolmenge [g]
	[g]
Staphylococcus aureus	0.51
Bacillus subtilis	0.54
Pseudomonas aeruginosa	0.53
Escherichia coli	0.50
Salmonella abony	0.51
Candida albicans	0.53
Aspergillus niger	0.49

Tab. 7 Statistik der Überlebensrate über alle drei Versuche

	Mean	SD	Min.	Max.	N
	[%]	[%]	[%]	[%]
Staphylococcus aureus	95.2	2.4	92.9	97.7	3
Bacillus subtilis	92.0	4.5	87.9	96.8	3
Pseudomonas aeruginosa	91.7	1.2	90.5	92.9	3
Escherichia coli	95.1	2.3	93.0	97.6	3
Salmonella abony	87.0	6.2	83.1	94.1	3
Candida albicans	2.9	4.9	0.0	8.6	3
Aspergillus niger	0.0	0.0	0.0	0.0	3

Tab. 8 Statistik der Abtötungsrate über alle drei Versuche

	Mean	SD	Min.	Max.	N
	[%]	[%]	[%]	[%]
Staphylococcus aureus	4.8	2.4	2.3	7.1	3
Bacillus subtilis	8.0	4.5	3.2	12.1	3
Pseudomonas aeruginosa	8.3	1.2	7.1	9.5	3
Escherichia coli	4.9	2.3	2.4	7.0	3
Salmonella abony	13.0	6.2	5.9	16.9	3
Candida albicans	97.1	4.9	91.4	100.0	3
Aspergillus niger	100.0	0.0	100.0	100.0	3

Tab. 7 zeigt die statistischen Daten der Überlebensrate. Für Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli und Salmonella abony wurden mehr als 87% überlebende Mikroorganismen gefunden. Das bedeutet, dass zwischen 87 und 95 Prozent der Mikroorganismen, welche vernebelt wurden, nach der Vernebelung und der Aufarbeitung des Aerosols noch in der Lage waren sich zu teilen und zu wachsen. Dies ist ein Zeichen dafür, dass die Mikroorganismen die Vernebelung überlebt haben.
Die Raten von Candida albicans und Aspergillus niger sind unterhalb 3%. Tab. 8 zeigt die entsprechende Abtötungsrate. Das bedeutet, dass zwischen 97 und 100 Prozent dieser Mikroorganismen, welche vernebelt wurden, nach der Vernebelung und der Aufarbeitung des Aerosols nicht mehr in der Lage waren sich zu teilen und zu wachsen. Dies ist ein Zeichen dafür, dass die Mikroorganismen die Vernebelung entweder nicht überlebt haben oder aufgrund ihrer Größe durch die Filtermechanismen im Respimat^® Inhaler zurückgehalten wurden.
Die Ergebnisse der o. g. Versuche zeigen, dass Bakterien in aller Regel nach ihrer Verwendung und Vernebelung im Respimat^® Inhaler keinen Aktivitätsverlust zeigen.
Sehr große Mikroorganismen wie z. B. Hefen und Pilze (Candida albicans, Aspergillus niger) werden offensichtlich aufgrund ihrer Größe im Respimat zurückgehalten. Sie können die Filter des Respimat^® Inhalers nicht passieren.
Aufgrund der hohen Variabilität bei biologischen Untersuchungen kann davon ausgegangen werden, dass Bakterien bei ihrer Vernebelung im Respimat^® Inhaler praktisch nicht abgetötet oder durch Filtration zurückgehalten werden. Die Aerosolisierung von Bakteriensuspensionen im Respimat^® Inhaler hat keinen Effekt auf die Vitalität der Mikroorganismen. Somit können effizient Bakterien oder Bakterienbestandteile für kurative Zwecke in die menschliche Lunge transportiert werden.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

- EP 1003478 [0006]
- US 5497944 [0021]
- WO 97/12687 [0021, 0022, 0024]
- EP 96/04351 [0022]
- WO 94/07607 [0025]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

- 'Stability of recombinant consensus interferon to air-jet and ultrasonic nebulisation', J. Pharm. Sci. 84: 1210–1214 [1995] [0004]
- Niven et al, Pharm Res. 12: 53–59 [1995] [0004]
- Wall D.A. und Lanutti, A.T. 'High levels of exopeptidase activity are present in rat and canine bronchoalveolar lavage fluid'. Int. J. Pharm. 97: 171–181 (1993) [0007]
- Bocci et al 'Pulmonary catabolism of interferons: alveolar absorption of 125-I labelled human interferon alpha is accompanied by partial loss of biological activity' Antiviral Research 4: 211–220 (1984) [0007]

Claims

Wässrige Aerosolzubereitung für die inhalative Applikation von Mikroorganismen oder Teilen von Mikroorganismen als Wirkstoff, dadurch gekennzeichnet, dass die wässrige Aerosolzubereitung den Wirkstoff in einer therapeutisch wirksamen Form enthält.
Wässrige Aerosolzubereitung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die wässrige Aerosolzubereitung den Wirkstoff in einer Konzentration zwischen 3 mg/ml und 100 mg/ml enthält.
Wässrige Aerosolzubereitung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Wirkstoff Mikroorganismen der Gattung Bacillus, Staphylococcus, Pseudomonas, Escherichia, Salmonella, bzw. eine Mischung dieser Gattungen verwendet wird.
Wässrige Aerosolzubereitung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Wirkstoff Mikroorganismen der Spezies Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Salmonella abony bzw. eine Mischung dieser Spezies verwendet wird.
Wässrige Aerosolzubereitung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen oder mehrere Hilfsstoffe aus der Gruppe der oberflächenaktiven Stoffe, Emulgatoren, Stabilisatoren, Permeationsverbesserer und/oder Konservierungsstoffe enthält.
Wässrige Aerosolzubereitung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Aminosäure zur Verbesserung der Löslichkeit/Stabilität des Wirkstoffes enthält.
Wässrige Aerosolzubereitung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass sie in einem treibgasfreien Vernebler verwendet wird.
Wässrige Aerosolzubereitung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Aerosolzubereitung eine Grenzviskosität von bis zu 1600 × 10^–6 Pascal aufweist.
Verfahren zur Herstellung von Aerosolen für die inhalative Applikation von therapeutisch wirksamen Mikroorganismen oder Teile von Mikroorganismen, insbesondere von therapeutisch wirksamen Bakterien oder Teile von Bakterien, aus einer den Wirkstoff enthaltenen Aerosolzubereitung, dadurch gekennzeichnet, dass in einem treibgasfreien Vernebler eine therapeutisch wirksame Menge einer Einzeldosierung der Aerosolzubereitung in einer Messkammer abgemessen und unter hohem Druck zwischen 100 und 500 bar durch mindestens eine Düse mit einem hydraulischen Durchmesser von 1 bis 12 Mikrometer zu inhalierbaren Tröpfchen mit einer Teilchengröße kleiner als 10 Mikrometer innerhalb einer Zeit zwischen einer und zwei Sekunden versprüht wird.
Verfahren nach Anspruch 9, durch gekennzeichnet, dass die wirksame Menge der Einzeldosierung zwischen 10 und 20 Mikroliter beträgt.
Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Vernebler zwei Düsen aufweist, die so gerichtet sind, dass sich die beiden Strahlen so treffen, dass die Aerosolzubereitung vernebelt wird.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass eine wässerige Aerosolzubereitung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 eingesetzt wird.
Verwendung der wässrigen Aerosolzubereitung gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1–8 zur Behandlung von Erkrankungen der Atemwege.
Verwendung der wässrigen Aerosolzubereitung gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1–8 zur Behandlung von COPD.
Verwendung der wässrigen Aerosolzubereitung gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1–8 zur Immunbehandlung von Menschen oder Tieren.