DE102007029772B4

DE102007029772B4 - Verfahren und Schnelltest zum Nachweis spezifischer Nukleinsäuresequenzen

Info

Publication number: DE102007029772B4
Application number: DE102007029772A
Authority: DE
Inventors: Dr. Hillebrand Timo; Dr. Graser Elmara
Original assignee: AJ Innuscreen GmbH
Current assignee: AJ Innuscreen GmbH
Priority date: 2007-06-22
Filing date: 2007-06-22
Publication date: 2011-12-08
Anticipated expiration: 2027-06-23
Also published as: US10287636B2; WO2009000764A9; WO2009000764A2; EP2162553A2; US20150024386A1; WO2009000764A3; US20100221718A1; DE102007029772A1

Abstract

Verfahren zur Bestimmung mindestens einer spezifischen Nukleinsäuresequenz (Zielsequenz) mit den Schritten • Amplifikation der zur bestimmenden Nukleinsäuresequenz mit mindestens einem Primer und anschließender Strangtrennung und • Hybridisierung mit mindestens einer zu der Zielsequenz ganz oder partiell komplementären Sonde und • Nachweis der Hybridisierungsreaktion, dadurch gekennzeichnet, dass a) die Amplifikation, die Strangtrennung und die Hybridisierung in einem Reaktionsgefäß erfolgt und b) mindestens ein Primer mit einem Molekül markiert ist und c) die Hybridisierungssonde mit einer Markierung versehen ist und sich an den Strang der Zielsequenz hybridisiert, der den markierten Primer enthält und d) der Nachweis der Hybridisierungsreaktion außerhalb des unter a) genannten Reaktionsgefäßes an einer festen Phase erfolgt und e) die feste Phase eine Bindungsstelle für die Markierung entweder der Primer oder der Sonde enthält und dadurch das Hybridisierungprodukt dadurch an die feste Phase gebunden wird und f) der Nachweis der...

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und ein Testkit zum Nachweis spezifischer Nukleinsäuresequenzen mit den Schritten Amplifikation, Hybridisierung mittels Sonden und dem Nachweis des Hybridisierungsereignisses, wobei der Nachweis der Hybridisierungsreaktion außerhalb des Reaktionsgefäßes der Amplifikation/Hybridisierung an einer festen Phase stattfindet.
Stand der Forschung
Die Gendiagnostik ist zu einem unverzichtbaren Bestandteil der modernen medizinischen Labordiagnostik, der forensischen Diagnostik, der veterinärmedizinischen Labordiagnostik oder der Lebensmittel- und Umweltdiagnostik geworden.
Revolutioniert wurde die genetische Diagnostik mit der Erfindung der PCR-Technologie, die es gestattet, jede beliebige Nukleinsäuresequenz spezifisch zu vervielfachen.
Unter Verwendung der PCR existieren eine Vielzahl von Methoden, die in Kombination mit der PCR-Technologie darüber hinaus den spezifischen Nachweis einer erfolgten Amplifikation ermöglichen. Insbesondere die Vorgaben einer exakten genetischen Diagnostik müssen sich Verfahren bedienen, die sicherstellen, dass ein erzeugtes Amplifikationsprodukt auch der spezifisch nachzuweisenden Zielsequenz entspricht. Die weit verbreitete Nutzung der Visualisierung eines PCR-Produktes mittels Gelelektrophorese ist dazu nicht ausreichend.
Eine prinzipiell sehr schnelle und ohne großen experimentellen Aufwand realisierbare Möglichkeit zum Nachweis spezifischer Nukleinsäuren kann durch die sog. Real Time PCR-Methoden erreicht werden. Hierbei ist die Amplifikationsreaktion mit der eigentlichen Nachweisreaktion direkt gekoppelt.
Eine weit verbreitete Methode zum Nachweis spezifischer Nukleinsäuren ist die Light Cycler Technologie (Fa. Roche). Die Firma Roche entwickelte dazu spezielle Hybridisierungssonden bestehend aus zwei verschiedenen Oligonukleotiden, die jeweils mit nur einem Fluorochrom markiert sind. Am 3'-Ende der einen Sonde befindet sich der Akzeptor, das andere Oligonukleotid ist am 5'-Ende mit einem Donor versehen. Die Sonden werden so gewählt, dass sie beide an den gleichen DNA Strang binden, wobei der Abstand zwischen Akzeptor und Donor nur maximal 1 bis 5 Nukleotide betragen darf, damit es zum sog. FRET-Effekt kommen kann. Die Messung der Fluoreszenz erfolgt während des Annealingschrittes, wobei nur Licht dieser Wellenlänge nachweisbar ist, solange beide Sonden an die DNA gebunden sind. Der Schmelzpunkt beider Sonden sollte bei diesem System identisch sein. Durch die Verwendung zweier hybridisierender Sonden zusätzlich zu den verwendeten Primern ist die Spezifität dieses Detektionsystems äußerst hoch.
Eine weitere Real Time PCR Anwendung zum Nachweis spezifischer Nukliensäure-Targets kann mit sog. Double Dye Sonden, welche in der Patentschrift US 5210015 und US 5487972 offenbart sind (TaqMan-Sonden), durchgeführt werden. Double Dye Sonden tragen zwei Fluorochrome auf einer Sonde. Der Reporterfarbstoff befindet sich hier am 5'-Ende, der Quencherfarbstoff am 3'-Ende. Zusätzlich befindet sich am 3'-Ende der Sonde eventuell noch eine Phosphatgruppe, damit die Sonde bei der Elongation nicht als Primer fungieren kann. Solange die Sonde intakt ist, ist die freigesetzte Lichtstärke gering, da fast die gesamte Lichtenergie, die nach der Anregung des Reporters entsteht, aufgrund der räumlichen Nähe vom Quencher aufgenommen und umgeformt wird. Das emittierte Licht des Reporterfarbstoffes wird „gequenched”, d. h. gelöscht. Dieser FRET-Effekt bleibt auch erhalten, nachdem die Sonde an den komplementären DNA-Strang gebunden hat. Während der Elongationsphase trifft die Polymerase auf die Sonde und hydrolysiert sie. Man bezeichnet die Fähigkeit der Polymerase, ein Oligonukleotid (bzw. eine Sonde) während der Strangsynthese zu hydrolysieren, als 5'-3' Exonukleaseaktivität. Nicht alle Polymerasen haben eine 5'-3' Exonukleaseaktivität (Taq- und Tth-Polymerase). Als erstes wurde dieses Prinzip für die Taq-Polymerase beschrieben. Das Prinzip wird als TaqMan-Prinzip bezeichnet. Nach Sondenhydrolyse befindet sich der Reporterfarbstoff nicht mehr in räumlicher Nähe zum Quencher. Die emittierte Fluoreszenz wird jetzt nicht mehr umgeformt, dieser Fluoreszenzanstieg wird gemessen.
Eine weitere Möglichkeit zum spezifischen Nachweis von Amplifikationsprodukten mittels Real Time PCR Technologie besteht in der Nutzung von interkalierenden Farbstoffen (Ethidiumbromid, Hoechst 33258, Yo-Pro-1 oder SYBR Green^TM u. ä.). Diese Farbstoffe emittieren, nach Anregung durch energiereiches UV-Licht, Licht im sichtbaren energieärmeren Wellenlängenbereich (Fluoreszenz). Liegt der Farbstoff als freier Farbstoff im Reaktionsgemisch vor, ist die Emission sehr gering. Erst durch die Interkalierung des Farbstoffs, d. h. durch die Einlagerung in die kleine Furche doppelsträngiger DNA-Moleküle wird die Lichtemission stark verstärkt. Die Farbstoffe sind preiswert und universell verwendbar, da mit ihnen prinzipiell jede PCR-Reaktion in Echtzeit verfolgt werden kann. Außerdem haben sie eine hohe Signalstärke, da jedes DNA-Molekül mehrere Farbstoffmoleküle bindet. Aus den Vorteilen resultiert aber auch ein extremer applikativer Nachteil: Durch interkalierende Farbstoffe kann man prinzipiell nicht zwischen korrektem Produkt und Amplifikations-Artefakten (wie z. B. Primer Dimeren oder Fehlprodukten) unterscheiden. Entstehende Primer Dimere und andere Artefakte binden naturgemäß ebenfalls interkalierende Farbstoffe und führen somit zu einem unspezifischen Anstieg der Fluoreszenz auch in negativen Proben. Eine klare Differenzierung zwischen spezifischem Amplifikationsereignis bzw. Artefakt ist aber zwingend notwendig. Um dies dennoch zu erreichen, nutzt man eine sog. Schmelzpunktanalyse am Ende der eigentlichen PCR-Reaktion. Das Reaktionsgemisch wird dabei in 1 Grad-Schritten von 50°C auf 95°C erhitzt. Bei diesem Prozess wird kontinuierlich die Fluoreszenz gemessen. Der Punkt, an dem doppelsträngige DNA schmilzt, ist durch einen Abfall (Peak) der Fluoreszenz des interkalierenden Farbstoffes gekennzeichnet, da der interkalierende Farbstoff von der einzelsträngigen DNA dissoziiert. Wenn die PCR optimal eingestellt ist, sollte ein Schmelzpunktpeak zu erwarten sein, der spitz zuläuft. Dieser Schmelzpunkt stellt das spezifische, zu erwartende Produkt dar. Unterschiedlich große Produkte und Produkte anderer Sequenz haben unterschiedliche Schmelzpunkte.
Trägt man die Fluoreszenz gegen die Temperatur graphisch auf, so kann man den Fluoreszenzabfall beider Produkte als zwei getrennte Schmelzpunkte wahrnehmen. Damit gewinnt dieses System an Spezifität und erlaubt es, ein spezifisches Amplifikations-Produkt von Artefakten zu unterscheiden. Auf diese Weise ist es möglich, auch zwischen homozygot (ein Peak) und heterozygot (zwei Peaks) zu unterscheiden.
Mittels REAL-Time PCR Anwendungen ist es darüber hinaus auch möglich, eine Quantifizierung der nachzuweisenden Targets durchzuführen.
Wie schon aufgeführt, erfüllen die beschriebenen Verfahren die Notwendigkeit des spezifischen Nachweises eines Amplifikationsproduktes.
Ein großer Nachteil besteht allerdings darin, dass sie auf sehr teuren Geräteplattformen implementiert sind, welche den Prozess sowohl der Amplifikation als auch nachfolgenden, der Fragestellung entsprechenden optischen Detektion in einer Hardware-Lösung vereinen müssen. Weiterhin basieren viele dieser beschriebenen Nachweisverfahren immer auf der Echtzeitverfolgung des Amplifikationsprozesses. Auf dieser Strategie basierend erfolgt auch die Aufarbeitung der gemessenen Fluoreszenzwerte im Verlauf der Amplifikationsreaktion. Dem Fachmann ist klar, dass damit verbunden auch ein enorm hoher Grad an Analysealgorithmen in Real Time Systeme integriert sein muss. Dies erklärt letztlich den hohen finanziellen Aufwand, der für die Nutzung von Real Time PCR Systemen investiert werden muss. Letztlich ist auch die Bedienung solcher Gerätesysteme an ein hohes Maß an Expertise gebunden.
Neben den dargestellten REAL-Time PCR basierten diagnostischen Nachweisen existieren aber auch alternative Varianten zum spezifischen Nachweis von Nukleinsäuren.
Preiswertere Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren sind in diesem Zusammenhang z. B. PCR-ELISA. Bei dieser Methode wird die zu untersuchende DNA-Sequenz amplifiziert und das erzeugte DNA-Fragment nachfolgend an einer festen Phase (z. B. Mikrotiterplatte oder Streifen) kovalent immobilisiert, nachfolgend zu einem Einzelstrang denaturiert und mit einer sequenzspezifischen Sonde hybridisiert. Die erfolgreiche Anbindung der Sonde kann durch eine antikörpervermittelte Farbreaktion sichtbar gemacht werden. Eine andere Variante basiert darauf, dass man die Sonden an eine feste Phase immobilisiert und nach erfolgter Denaturierung des PCR-Produktes dieses in Kontakt mit der immobilisierten Sonde bringt. Der Nachweis eines erfolgten Hybridisierungsereignisses erfolgt in Analogie zur ersten Verfahrensvariante.
PCR-ELISA sind prinzipiell einfach in der Durchführung, umfassen allerdings multiple Verfahrensschritte, so dass neben der benötigten Zeit zur Durchführung der PCR auch mehrere Stunden Arbeitszeit für die Durchführung des nachfolgenden Detektionsverfahrens benötigt werden. Ein solches Verfahren benötigt in der Regel 8 h und ist damit auch als Schnelltest nicht geeignet.
Darüber hinaus werden auch einige Geräte wie eine Temperierstation, ein sog. Washer oder auch ein Messgerät zum Nachweis des Hybridisierungssignals benötigt. Darüber hinaus sind ggf. weitere Spezialgräte oder Spezialverbrauchsmaterialien notwendig.
Weitere einfache Verfahren zum Nachweis von Amplifikationsprodukten basieren auf der Amplifikation der Zielsequenzen und der nachfolgenden Hybridisierung von Amplifikationsprodukten an einer Membran. Auch bei diesem Verfahren gibt es dem Fachmann bekannte verschiedene Varianten. Diese Verfahren sind aber auch wieder aufwendig in der Durchführung und benötigen eine Vielzahl an abzuarbeitenden Verfahrensschritten und sind damit als Schnelltests nicht geeignet. Dies betrifft dann auch die Nutzung von Biochip-Strategien, welche die Hybridisierung von PCR-Produkten mit Hybridisierungssonden zum Nachweis der Spezifität nutzen. Auch diese Verfahren sind aufwendig und an sehr teure Geräteplattformen gebunden.
Eine deutliche Reduktion von Arbeitsschritten wird in der Patentschrift KR 1020060099022 A (Method and kit for rapid and Accurate detection and analysis of nucleotide sequence with naked eye by using membrane lateral flow analysis) offenbart.
Hierbei wird ein sog. Lateral Flow Verfahren genutzt, um Nukleinsäuren zu detektieren. Auch dieses Verfahren bedient sich der Technologie der Hybridisierung von Nukleinsäuren an einer festen Phase. Vorteilhaft ist, dass es sich bei einem Lateral Flow Verfahren um eine kleines handliches Testformat handelt (Streifentest).
Eine sehr schnelle Nachweismethodik, welche sich auch dem Nachweis von Amplifikationsprodukten mittels eines Teststreifens bedient und kommerziell angeboten wird, basiert im Gegensatz zur obigen Patentschrift wiederum auf einem völlig anderen Prinzip. Hierbei erfolgt die Durchführung der PCR-Reaktion mit einem biotinylierten Primer und einem nicht-biotinylierten Primer. Nach Durchführung der PCR liegt ein PCR-Produkt vor, welches an einem Ende damit Biotin-markiert ist. Der Nachweis nutzt einen Teststreifen (z. B. Fa. Millenia), welcher zwei getrennte Bindungsstellen enthält. Eine Streptavidin-Stelle zur Kopplung des Biotin-markierten DNA Stranges und eine FITC-Bindungstelle zur Funktionskontrolle des Teststreifens.
Der Nachweis des PCR-Produktes realisiert sich dadurch, dass man nach durchgeführter PCR den PCR-Ansatz denaturiert und mit einer zum Biotin-markierten DNA-Strang komplementären Sonde hybridisiert. Die Sonde ist FITC markiert.
Zum Nachweis wird der PCR-Ansatz mit einem Laufpuffer gemischt und auf den Teststreifen aufgetragen. Nach der Testbeschreibung bindet sich der biotinylierte DNA-Strang an die Streptavidin-Bindungstelle des Streifens. Der Nachweis erfolgt über die FITC-Markierung der mit dem DNA-Strang hybridisierten Sonde. Es bildet sich ein typisches Signal in Form eines Streifens aus. Dieses Signal soll der spezifische Nachweis des Amplifikationsproduktes sein. Das Verfahren kombiniert aber nicht die Hybridisierung der Sonde mit dem Prozess der PCR, sondern führt dies als separaten Verfahrensschritt durch. Das Verfahren hat aber eine grundsätzliche und dramatische Fehlerquelle.
Die Detektion der nachzuweisenden Zielnukleinsäure ist nicht spezifisch. Die Ursache liegt darin, dass während der PCR entstandene Artefakte, z. B. Primer-Dimere, natürlich auch spezifisch an die Streptavidin-Bindungsstelle des Teststreifens binden und damit auch wie ein spezifisches PCR-Produkt eine positive Reaktion hervorrufen können.
All die beschriebenen alternativen Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuresequenzen ohne REAL-Time PCR-Technologien haben also unabhängig von dem doch notwendigen hohen manuellen Arbeitsaufwand auch eine wesentliche Gemeinsamkeit. Die notwendige Hybridisierungsreakion zwischen PCR-Produkt und spezifischer Sonde findet immer außerhalb des Prozesses der PCR statt. Dieses Merkmal liegt all diesen Verfahren zu Grunde. Ein großer Vorteil von REAL-Time PCR-Technologien besteht aber grade darin, dass der Prozess von Amplifikation und spezifischer Hybridisierung in einem Reaktionsgefäß abläuft und damit der Prozess von Amplifikation und Hybridisierung nicht entkoppelt wird. Darüber hinaus führen in diesen Fällen Amplifikationsartefakte häufig zu einem falsch positiven Signal.
Ziel der vorliegenden Erfindung lag darin, ein universell nutzbares Verfahren zum spezifischen Nachweis von Targetnukleinsäuren bereitzustellen, welches sehr schnell durchführbar sowie einfach ist und darüber hinaus keine teuren Gerätesysteme benötigt. Das Verfahren soll sich als molekulargenetischer Schelltest eigenen und den Vorgaben der diagnostischen Spezifitätssicherung Rechnung tragen. Wesentlich ist dabei, dass nur ein spezifisches Amplifikationsprodukt detektiert wird und Amplifikations-Artefakte eindeutig diskriminiert werden können.
Die Aufgabe wurde gemäß den Merkmalen der Patentansprüche gelöst.
Die vorliegende Erfindung löst die bestehende Aufgabenstellung dabei in idealster Weise. Das erfindungsgemäße Verfahren kombiniert darüber hinaus zum ersten Mal die Amplifikationsreaktion und spezifische Sondenhybridisierung in ein und demselben Reaktionsgefäß und kann trotzdem auf die extrem teuren gerätetechnischen Systeme der REAL Time PCR gänzlich verzichten.
Das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis spezifischer Nukleinsäuresequenzen basiert auf einer in die PCR integrierte Sondenhybridisierung und einem nachfolgenden einfachen Nachweis des spezifischen Hybridisierungsereignisses. Dieser Nachweis erfolgt außerhalb des PCR-Reaktionsgefäßes. Vorzugsweise nutzt man z. B. eine Lateral Flow Technologie (Nachweis-Streifen). Damit benötigt die Testdurchführung nur noch ein PCR-Gerät und einen Teststreifen und ist in der Durchführung einfach, extrem schnell und auch für ungeübtes Personal problemlos durchführbar. In einer bevorzugten Ausführungsvariante wird die Rapid-Cycler Technologie (Patent) genutzt. Die Kombination von Rapid-PCR und Nachweisstreifen erlaubt die Testdurchführung zum Nachweis einer spezifischen Nukleinsäure in nicht einmal einer Stunde und dies bei extrem niedrigen Testkosten.
Das erfindungsgemäße Verfahren basiert dabei auf folgenden Schritten:
A. Bereitstellung eines PCR-Reaktionsansatzes bestehend aus:

1. zwei PCR Primer, dabei ist einer der Primer am 5'-Ende mit einem Markierungs-Molekül (z. B. Biotin markiert)
2. einer spezifischen Hybridisierungssonde (ebenfalls mit einer Markierung versehen; z. B. FITC), die sich an den Strang der Zielsequenz hybridisieren kann, der den markierten Primer enthält.
3. an sich bekannte PCR Reagenzien: PCR-Puffer, Polymerasen, dNTPs und ggf. weitere Zusätze

B. Durchführung des Amplifikationsprozesses mit integrierter Sondenhybridisierung
Die Amplifikationsreaktion erfolgt unter Standardbedingungen. Dabei folgt der eigentlichen Amplifikationsreaktion ein Denaturierungsschritt bei einer Temperatur > 90°C zur thermischen Strangtrennung des während der PCR generierten Amplifikationsproduktes. Nach Denaturierung wird der PCR-Reaktionsansatz auf die Hybridisierungstemperatur der Sonde abgekühlt. Während dieses Schrittes bindet die Hybridisierungssonde spezifisch an den komplementären DNA-Strang des Amplifikationsproduktes. Dieser Strang trägt dabei die Botin-Markierung, welche durch den Biotin-markierten Primer in das PCR-Produkt eingebaut wurde.
C. Nachweis des Hybridisierungsereignisses
Der Nachweis des spezifischen Hybridisierungsereignisses erfolgt über die spezifische Ankopplung des biotinylierten DNA-Stranges an eine feste Phase und der spezifischen Detektion der Markierung der Hybridisierungssonde, welche an der zur Sonde komplementären Sequenz des biotinylierten DNA-Stranges hybridisiert ist. In einer bevorzugten Variante nutzt man für den Nachweis kommerziell verfügbare Lateral Flow Teststreifen (z. B. Fa. Millenia). Der Teststreifen enthält, wie schon aufgeführt, zwei getrennte Bindungsstellen. Eine Streptavidin-Stelle zur Kopplung der Botin-markierten Markierung und eine FITC-Bindungstelle zur Funktionskontrolle des Teststreifens. Zum Nachweis wird der PCR-Ansatz mit einem Laufpuffer gemischt und auf den Teststreifen aufgetragen. Folgende Bindungsereignisse können auftreten.

1. alle FITC-markierten Nukleinsäuren (nicht hybridisierte FITC-markierte Hybridisierungssonde bzw. Hybridisierungsprodukt zwischen Biotin-markiertem DNA Strang und FITC-markierter Hybridisierungssonde) binden im unteren Probenauftragsbereich des Teststreifens an Goldpartikel, die mit anti-FITC-Antikörpern beschichtet sind.
2. im weiteren Verlauf des Teststreifens befindet sich die Streptavidin-Bindungstelle. An diese Bindungsstelle können sich folgende Nukleinsäuren binden: 1. die Biotin-markierten Primer, 2. die Biotin-markierten DNA-Stränge und 3. die Hybridisierungsprodukte zwischen Biotin-markiertem DNA Strang und FITC-markierter Hybridisierungssonde. Ein Nachweissignal kann aber nur dann sichtbar werden, wenn das spezifische Hybridisierungsprodukt zwischen Biotin-markiertem DNA Strang und FITC-markierter Hybridiserungssonde vorliegt, da nur dieses Produkt auch mit dem Nachweissystem (FITC-anti FITC-Goldpartikel) gekoppelt ist.
3. Im weiteren Verlauf des Teststreifens binden dann noch überschüssige mit anti-FITC-Antikörpern beschichte Goldpartikel, welche als Kontrolle zur Funktionsfähigkeit des Teststreifens dienen.

Nach der Durchführung des beschriebenen Verfahrens (Ausführungsbeispiel I) konnte problemlos der Nachweis eines Amplifikationsproduktes erbracht werden. Allerdings zeigte sich, dass auch die mitgeführte Negativkontrolle ebenfalls ein stark positives Testsignal auf dem Testreifen erbringen kann. Als Ursache für das falsch-positive Ergebnis wurde folgender Tatbestand herausgefunden. Während der PCR kann auch die FITC-markierte Hybridisierungssonde als Primer fungieren. Dadurch kommt es zu einem verkürzten Amplifikationsprodukt, welches damit genauso detektiert werden würde wie das spezifische Amplifikationsprodukt. Dieses Ergebnis ist dabei prinzipiell nicht problematisch, da es natürlich auch spezifisch wäre. Das Problem besteht aber darin, das Amplifikations-Artefakte natürlich auch entstehen, wenn die Hybridisierungssonde als Primer arbeitet. Diese so oftmals entstehenden Primer-Dimere führen dann auf dem Teststreifen zu einem falsch-positiven Signal, da sie spezifisch an die Streptavidinstelle binden und über die eingebaute FITC-Markierung nachgewiesen werden. Dieses experimentelle Ergebnis zeigt damit, dass in der dargestellten Form die Integration der Nachweissonde im PCR-Ansatz und damit die Kopplung von Amplifikation und spezifischer Hybridisierung in einem Reaktionsgefäß nicht funktionieren kann.
Das erklärt möglicherweise, dass es bisher ein diesbezügliches Nachweissystem nicht gibt.
Das erfindungsgemäßen Verfahren löst das Problem überraschenderweise dadurch, dass man die Hybridisierungssonde chemisch so modifiziert, dass sie im Prozess der Amplifikation nicht mehr als Primer fungieren kann, d. h. dass eine Verlängerung durch die Polymerase nicht mehr möglich ist. Dies erreicht man durch eine Blockierung der Sonde gegen die 5'→3'-Polymeraseaktivität, vorzugsweise durch eine Phosphorylierung des letzten Nukleotides der Sonde. Der Prozess wird noch dadurch verstärkt, dass die Schmelztemperatur der Sonde weit unter den Temperaturen liegt, bei denen die PCR abläuft. Durch die Verwendung einer modifizierten Sonde konnte das geschilderte Problem vollständig beseitigt werden (siehe Ausführungsbeispiel 1).
Eine weitere Effizienzsteigerung des Testverfahrens kann dadurch erreicht werden, dass man neben dem beschriebenen Denaturierungsschritt nach abgeschlossener Vervielfältigungsreaktion das PCR-Protokoll modifiziert. So bewirkt die Durchführung einer asymmetrischen PCR (anstelle der Standard PCR-Reaktion) eine Erhöhung der Detektionseffizienz (höhere Signalstärke auf dem Teststreifen).
Zusammenfassend steht mit dem erfindungsgemäßen Verfahren nun ein extrem einfaches Nachweisverfahren zur Verfügung. Die erfindungsgemäße Integration einer Hybridisierungssonde in die PCR gibt die Sicherheit, dass das amplifizierte Fragment wirklich die Zielsequenz beinhaltet. Dadurch werden die durch Mispriming entstehenden falschpositiven Resultate ausgeschlossen. Die Verwendung der chemisch modifizierten Sonde (vorzugsweise Phosphorylierung des letzten Nukleotides der Sonde) verhindert die Verlängerung der Sonde durch 5'→3'-Polymeraseaktivität und verhindert damit, dass die Sonde als Primer fungiert und unspezifische PCR-Artefakte (Primer-Dimere) erzeugt, die als falsch positive Signale detektiert werden würden.
Im Unterschied zu REAL-Time PCR Verfahren erfolgt die Detektion des spezifischen Nachweissignals nicht mittels Fluoreszenz, welche durch die von der Taq-Polymerase durchgeführte Sondenhydrolyse freigesetzt wird ( EP 0972 848 A2 ). Es wird aber trotzdem der Vorteil von Real-Time Technologien genutzt, das PCR und die Hybridisierung in einem Reaktionsgefäß erfolgen, nicht aber durch Quenching und Exonukleaseaktivität. Das erfindungsgemäße Verfahren unterscheidet sich auch von der Patentschrift ( EP 0 826 066 B1 ), welche ebenfalls eine Kombination von PCR und Hybridisierung darstellt. Auch bei diesem Verfahren wird wiederum ein durch FRET-Effekt vermitteltes Fluoreszenzsignal detektiert. Dieses entsteht während des Amplifikationsvorganges durch die Hybridisierung einer Sonde, die eine niedrigere Annealingtemperatur hat, als die Primer. Die Freisetzung der Fluoreszenz erfolgt dabei nicht durch Hydrolyse der Sonde in Folge der Exonukleaseaktivität der Polymerase, sondern dadurch, dass bei der Hybridisierung die sekundäre Struktur der Sonde aufgelöst wird und die Fluoreszenz weniger gequencht wird. Hierbei können nur Enzyme für die Amplifikation eingesetzt werden, die keine Exonukleaseaktivität besitzen (z. B. Klenow Fragment oder T4 oder T7 Polymerasen).
Die Messung der Fluoreszenz wird immer bei der Sonden-Hybridisierungstemperatur gemessen. Damit benötigt auch dieses Verfahren immer extrem teure Real-Time PCR Geräte. Das erfindungsgemäße Verfahren nutzt als finale Detektion z. B. einfach zu handhabende Streifen (Latral Flow Formate) oder andere feste Phasen, welche in der Lage sind, den nachzuweisenden DNA-Strang des PCR-Produktes zu binden. Nachfolgend erfolgt dann mittels dem Fachmann bekannter Technologien der Nachweis der Markierung der Sonde.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist erstmals ein extrem einfaches, schnelles und universelles Verfahren zum spezifischen Nachweis eines Amplifikationsereignisses verfügbar, welches gerätetechnisch lediglich ein PCR-Gerät benötigt. Die Kombination von PCR-Reaktion und Sondenhybridisierung in einem Reaktionsgefäß bedeutet, dass die Detektion nur noch durch das In-Kontakt-bringen des PCR-Reaktionsansatzes mit dem Teststreifen erfolgt. Damit stellt das erfindungsgemäße Verfahren ein Testformat dar, welches prinzipiell auch unter Feldbedingungen realisiert werden kann.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen erläutert, wobei die Ausführungsbeispiele keine Einschränkung des Verfahren darstellen sollen.
Ausführungsbeispiele
Beispiel 1:
Nachweis der Listeria monocytogenes DNA mittels in die PCR integriertem Hybridisierungsverfahren und Lateral Flow Detektion. Vergleich einer unphosphorylierten und einer phosphorylierten Hybridisierungssonde
Im Ansatz werden zwei Typen von markierten Sonden gegeneinander getestet. Die erste Sonde ist am 5'-Ende FITC-markiert, die zweite Sonde ist darüber hinaus an ihrem 3'-Ende eine phosphoryliert. Die 3'-Phosphorylierung der Sonde verhindert ihre Verlängerung durch die Taq-Polymerase.
Ansatz 1 (unphosphorylierte Hybridisierungssonde)

PCR-Primer/Sonde
L.monozytogenes sense Primer (5'-CGC AAC AAA CTG AAG CAA AGG-3')
L.monozytogenes antisense Primer (5'-BIOTIN-TCC GCG TGT TTC TTT TCG AT-3')
L.monozytogenes Sonde (5'-FITC-CCA TGG CAC CAC CAG CAT CT-3')

Reaktionsansatz (Amplifikation/Hybridisierung)

Pro Probe:
sense Primer (50 pmol/μl)	0,1 μl
antisense Primer (50 pmol/μl)	0,1 μl
Sonde (25 pmol/μl)	0,1 μl
dNTP-Mix (12,5 mM)	0,3 μl
10X PCR-Buffer (MgCl₂ included)	1,5 μl
Taq-DNA-Polymerase	0,75 U
PCR-Grade H₂O	add 15 μl

Ansatz 2 (phosphorylierte Hybridisierungssonde)

PCR-Primer/Sonde
L.monozytogenes sense Primer (5'-CGC AAC AAA CTG AAG CAA AGG-3')
L.monozytogenes antisense Primer (5'-BIOTIN-TCC GCG TGT TTC TTT TCG AT-3')
L.monozytogenes Sonde (5'-FITC-ATG CAT CTG CAT TCA ATA-Pho-3')

Reaktionsansatz (Amplifikation/Hybridisierung)

Pro Ansatz:
sense Primer (50 pmol/μl)	0,1 μl
antisense Primer (50 pmol/μl)	0,1 μl
Sonde (25 pmol/μl)	0,1 μl
dNTP-Mix (12,5 mM)	0,3 μl
10X PCR-Buffer (MgCl₂ included)	1,5 μl
Taq-DNA-Polymerase	0,75 U
PCR-Grade H₂O	add 15 μl

Zur Testung wird von jedem Ansatz jeweils eine negative Probe (beinhaltend nur PCR-Chemikalien und H₂O) und eine positive Probe (beinhaltend zusätzlich L. monocytogenes DNA (1,5 μl, Gesamt DNA-Konzentration ca. 50 ng/μl)) eingesetzt.

Die PCR wird im SpeedCycler (Analytik Jena) unter der Nutzung der Rapid-Cycler-Technologie durchgeführt: Amplifikations/Hybridisierungskonditionen

Schritt 1:
	Denaturierung	95°C	120''
Schritt 2
	Amplifizierung	37 Zyklen
		95°C	4''
		55°C	4''
		72°C	20''
Schritt 3
	Denaturierung	95°C	300''
Schritt 4
	Hybridisierung	15°C	600''

Der Nachweis des Amplifikationsereignisses/der Hybridisierungsreaktion erfolgt mittels gelelektrophoretischer Auftrennung des Amplifikations/Hybridisierungsansatzes (1) sowie mittels Lateral Flow Teststreifen (GeneLine HybriDetect; Millenia Biotec GmbH; 2).
Der Vergleich beider Abbildungen demonstriert die Nachteile der nicht von der Polymeraseaktivität geschützten Sonde (Ansatz 1) und damit die Untauglichkeit des Lateral Flow-Verfahrens bei Sonden ohne einer Polymerisationblockierung. Auf dem Gelbild beinhaltet die Negativkontrolle keine spezifische DNA-Bande, auf dem Teststreifen zeigt sich dagegen ein starkes positives Signal, das von doppelt markierten Primer-Dimeren verursacht wird.
Dagegen zeigt der Amplifikationsansatz/Hybridisierungsansatz mit der am 3'-Ende phosphorylierten Hybridisierungssonde auf dem Teststreifen nur ein positives Signal, bei der Positivkontrolle. Damit korreliert das Ergebnis auf dem Teststreifen eindeutig mit dem Gelbild.
Erklärung zu Fig. 1:

Spur 1: DNA Leiter; Spur 2: Positivkontrolle aus Ansatz 1; Spur 3: Negativkontrolle aus Ansatz 1; Spur 4: Positivkontrolle aus Ansatz 2; Spur 5: Negativkontrolle aus Ansatz 2

2 zeigt den Nachweis des spezifischen Hybridisierungsereignisses auf einem Lateral Flow Teststreifen.
Erklärung zu Fig. 2:

Streifen 1: Positivkontrolle aus Ansatz 1; Streifen 2: Negativkontrolle aus Ansatz 1; Streifen 3: Positivkontrolle aus Ansatz 2; Streifen 4: Negativkontrolle aus Ansatz 2

Beispiel 2:
Durchführung des Verfahrens mittels asymmetrischer PCR und Überprüfung der Spezifität des Tests anhand der Testung positiver und negativer Ausgangsproben
Das erfindungsgemäße Verfahren wurde exemplarisch für den Nachweis von aus dem Zeckengewebe isolierter Rickettsien DNA eingesetzt. Die Spezifität des Verfahrens wurde anhand der Mitführung von Rickettsien- negativen, gleichfalls aus dem Zeckengewebe isolierten DNA Proben, durchgeführt.
PCR-Primer/Sonde:

Rickettsien sense Primer: 5'-GGG ACC TGC TCA CGG CGG-3'
Rickettsien antisense Primer: 5'-Biotin-TCT ATT GCT ATT TGT AAG AGC GGA TTG-3'
Rickettsien Sonde: 5'-FITC- CAA AGA AGT ATT AAA GGA ACT C-Pho-3'

Reaktionsansatz (Amplifikation/Hybridisierung)

Pro Ansatz:
sense Primer (50 pmol/μl)	0,05 μl
antisense Primer (50 pmol/μl)	0,1 μl
Sonde (25 pmol/μl)	0,1 μl
dNTP-Mix (12,5 mM)	0,3 μl
10X PCR-Buffer (MgCl₂ included)	1,5 μl
Taq-DNA-Polymerase	0,75 U
DNA (positiv oder negativ)	1,5 μl (ca. 50 ng)
PCR-Grade H₂O	add 15 μl

Schritt 1:
	Denaturierung	95°C	120''
Schritt 2
	Amplifizierung	37 Zyklen
		95°C	4''
		55°C	4''
		72°C	20''
Schritt 3
	Denaturierung	95°C	300''
Schritt 4
	Hybridisierung	45°C	600''

Nach der Durchführung des gekoppelten Amplifikations/Hybridisierungsverfahrens erfolgte die Visualisierung des spezifischen Nachweises der Erreger-Nukleinsäure wiederum mittels eines Lateral Flow Teststreifens (4) als auch mittels Gelelektrophorese (3). Die Ergebnisse zeigen eindrucksvoll die spezifische Detektion der nachzuweisenden Zielnukleinsäure. Das gesamte Verfahren benötigt ca. 50 min.
Erklärung zu Fig. 3:

Spur 1: DNA Leiter; Spur 2: negative Probe; Spur 3: positive Probe; Spur 4: negative Probe; Spur 5: positive Probe; Spur 6: negative Probe; Spur 7: positive Probe; Spur 8: PCR-Leerkontrolle

4 zeigt den Nachweis der spezifischen Hybridisierungsereignisse auf einem Lateral Flow Teststreifen.
Erklärung zu Fig. 4:

Streifen 1: negative Probe; Streifen 2: positive Probe; Streifen 3: negative Probe; Streifen 4: positive Probe; Streifen 5: negative Probe; Streifen 6: positive Probe; Streifen 7: PCR-Leerkontrolle

Claims

Verfahren zur Bestimmung mindestens einer spezifischen Nukleinsäuresequenz (Zielsequenz) mit den Schritten • Amplifikation der zur bestimmenden Nukleinsäuresequenz mit mindestens einem Primer und anschließender Strangtrennung und • Hybridisierung mit mindestens einer zu der Zielsequenz ganz oder partiell komplementären Sonde und • Nachweis der Hybridisierungsreaktion, dadurch gekennzeichnet, dass a) die Amplifikation, die Strangtrennung und die Hybridisierung in einem Reaktionsgefäß erfolgt und b) mindestens ein Primer mit einem Molekül markiert ist und c) die Hybridisierungssonde mit einer Markierung versehen ist und sich an den Strang der Zielsequenz hybridisiert, der den markierten Primer enthält und d) der Nachweis der Hybridisierungsreaktion außerhalb des unter a) genannten Reaktionsgefäßes an einer festen Phase erfolgt und e) die feste Phase eine Bindungsstelle für die Markierung entweder der Primer oder der Sonde enthält und dadurch das Hybridisierungprodukt dadurch an die feste Phase gebunden wird und f) der Nachweis der Hybridisierungsreaktion außerhalb des unter a) genannten Reaktionsgefäßes an einer festen Phase dadurch erfolgt, dass • die feste Phase eine Bindungsstelle aufweist, die eine Bindung mit der Markierung des Primers oder mit der Markierung der Hybridisierungssonde ermöglicht, wodurch das Hybridisierungsprodukt an die feste Phase gebunden wird und der Nachweis des gebunden Hybridisierungsproduktes durch den direkten oder indirekten Nachweis der noch freien Markierung erfolgt oder • das die Markierung des Primers oder die Markierung der Hybridisierungssonde eine Bindung mit einem Nachweismolekül eingeht und nachfolgend die freie Markierung eine Bindung mit einer Bindungsstelle der festen Phase eingeht, wodurch das Hybridisierungsprodukt an die festen Phase gebunden wird und der Nachweis des an der festen Phase gebundenen Hybridisierungsproduktes über das Nachweismolekül erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Visualisierung der bzw. Messung des PCR-Hybridisierungsereignisses mit Hilfe einer optischen Einrichtung erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Hybridisierungssonde gegen die 5'→3'-Polymeraseaktivität geschützt ist.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Hybridisierungssonde gegen die 5'→3'-Polymeraseaktivität durch eine Markierung oder durch eine Phosphorylierung geschützt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Primer mit Biotin markiert ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Hybridisierungssonde mit FITC (Fluoreszeinisothiocyanat) markiert ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass als feste Phase ein Teststreifen verwendet wird, der eine Streptavidin-Stelle zur Kopplung der Botin-markierten Markierung und eine FITC-Bindungstelle zur Funktionskontrolle des Teststreifens enthält.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der PCR-Ansatz (Amplifikationsansatz) mit einem Laufpuffer gemischt und auf den Teststreifen aufgetragen wird.
Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass im unteren Probenauftragsbereich des Teststreifens sich Goldpartikel befinden, die mit anti-FITC-Antikörpern beschichtet sind und dass sich im weiteren Verlauf des Teststreifens die Streptavidin-Bindungstelle befindet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass anstelle der Standard PCR-Reaktion eine asymmetrischen PCR durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass im Fall der Bestimmung von RNA vor der Amplifikation eine reverse Transkription erfolgt.
Testkit zur Durchführung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, umfassend: • ein Reaktionsgefäß zur Durchführung der Amplifikation, der Strangtrennung und der Hybridisierung mit der Sonde und • mindestens 1 Primer, der mit einem Molekül markiert ist und • mindestens einer zu der Zielsequenz ganz oder partiell komplementären Sonde, die gegen die 5'→3'-Polymeraseaktivität geschützt ist und/oder mit einer Markierung versehen ist und sich an den Strang der Zielsequenz hybridisiert, der den markierten Primer enthält und • mindestens eine feste Phase, die eine Bindungsstelle für die Markierung entweder der Primer oder der Sonde enthält und • an sich bekannte PCR Reagenzien sowie mindestens ein Laufmittel für den Nachweis der Hybridisierung.
Testkit nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den bekannten PCR Reagenzien um PCR-Puffer, Polymerasen oder dNTPs handelt.
Testkit nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Reaktionsgefäß die Primer, die Sonde und die an sich bekannte PCR Reagenzien in fester Form enthält.
Verwendung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 oder des Testkits gemäß Anspruch 12 zum qualitativen Nachweis von Zielnukleinsäuren.
Verwendung nach Anspruch 15 als Schnelltest, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis weniger als eine Stunde dauert.
Verwendung nach Anspruch 15 oder 16, wobei die Methodik einer Multiplexdetektion, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Primer und Sonden, die entweder durch gleich oder durch unterschiedliche Moleküle markiert sind, Anwendung findet.
Verwendung nach einem der Ansprüche 15 bis 17 zum Nachweis einer Infektion mit Viren oder Bakterien.
Verwendung nach Anspruch 15 oder 16 zum Nachweis für Bakterien, insbesondere für die Lebensmitteldiagnostik, Umweltanalytik und Krankenhaushygiene,
Verwendung nach Anspruch 15 zum Nachweis von Salmonella, Listeria, E. coli, Campylobacter, Shigella, Enterobacter; MRSA-Keime oder Legionellen.
Verwendung nach Anspruch 16 zum Nachweis von durch Zecken übertragbare Erreger wie Borrelien, Rickettsien, Erlichien oder Babesien.
Verwendung nach Anspruch 15 zum Nachweis von SNP's, Mutationen oder von methylierten Sequenzmotiven.