DE102007026639A1

DE102007026639A1 - Industrielle Fertigung tierischer Lederhautsubstitute für die Lederproduktion aus etablierten Epithelzelllinien und/oder primären Epithelzellkulturen, wie vorzugsweise Fibroplasten, Melanozyten, Keratiozyten sowie deren Verfahren und Vorrichtungen

Info

Publication number: DE102007026639A1
Application number: DE200710026639
Authority: DE
Inventors: Stefan-Andreas Ulrich
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2007-06-06
Filing date: 2007-06-06
Publication date: 2008-12-11

Abstract

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung tierischer Lederhautsubstitute für die Lederproduktion aus etablierten tierischen Epithelzelllinien und/oder primären Epithelzellkulturen, die aus Schlachtabfällen gewonnen werden, eine dazugehörige Vorrichtung und das so hergestellte tierische Lederhautsubstitut.

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die industrielle Fertigung tierischer Lederhautsubstitute für die Lederproduktion aus etablierten tierischen Epithelzelllinien und/oder primären Epithelzellkulturen, wie vorzugsweise teilungsaktive Fibroblasten, Melanozyten und Keratinozyten, die aus Schlachtabfällen gewonnen werden sowie deren Verfahren und Vorrichtungen.
Hintergrund der Erfindung
Die Erfindung zur industrielle Herstellung von tierischen Lederhautsubstituten aus tierischen in-vitro-gezüchteten Epithelzellen, vorzugsweise Fibroblasten, Melanozyten und Keratinozyten als Grundstoff für die Lederproduktion sowie deren Verfahren und Vorrichtungen stützt sich auf folgende Erfahrungen und Erkenntnisse aus der Forschung. Die Verwendung von tierischen Häuten für die Lederproduktion ist eine der ältesten kulturellen Errungenschaften der Menschheit. Leder gehört zu einem der durch Menschen hergestellten ersten Materialien. Die dazu notwendigen Tierhäute wurden und werden als Nebenprodukt aus der Tierzucht von Nutztieren oder der Jagd von Wildtieren gewonnen. Tierhaut gehört zu den natürlich nachwachsenden Rohstoffen.
Angesichts des drohenden Klimawandels und der sich daraus ergebenen unabsehbaren Folgen für die Menschheit, erscheint eine weitere extensive Ausweitung der Tierproduktion zur Befriedigung der steigenden Nachfrage nach Tierhäuten fraglich. Bei der Aufzucht von Rindern, so weiß man heute, entstehen pro Rind zwanzig mal mehr Umwelt belastende Treibhausgase, wie CO₂ und Methan, als bei der gegenwärtigen Nutzung eines Kraftfahrzeuge. Wobei Methan achtmal schädlichre Wirkung auf das globl warming hat, als CO₂. Um die dennoch steigende Nachfrage nach Leder zu befriedigen, bedarf es neuer, umweltschonender, technologischer Bereitstellungsverfahren der tierischen Lederhaut als Rohstoff.
Das Lederhautsubstitut besteht ausschließlich aus der Lederhaut und spart während des Veredelungsprozesses zu Leder zwei aufwendige Arbeitsschritte. Dadurch kann Arbeit und Energie eingespart werden.
Mehr als 50 Jahre gibt es Methoden Zellen aus tierischen oder menschlichen Gewebe- und Organteilen zu isolieren und unter Kulturbedingungen am Leben zu erhalten. Meist werden die Zellen mit wachstums- oder serumhaltigen Medium in einer Kulturschale gefüttert, um eine möglichst schnelle Zellvermehrung zu erhalten. Auf diese Weise lassen sich Zellen in beliebiger Menge gewinnen. In der medizinischen Grundlagenforschung gehört die in-vitro-Züchtung von menschlichen Hautzellen- und Geweben unter Laborbedingungen zur täglichen Praxis. (Patent DE 00 0069 128 530 T2 , Eisenberg, M. Dower Height, Neusüdwales, AU) Sie werden gegenwärtig in verschiedener Form im medizinischen Bereich angewandt. Dabei handelt es sich um Reproduktionen oder Neuzüchtungen als Hautimplantate sowie Hautzellen zur Wundversorgung oder für die Pharma- und Kosmetikindustrie als Hautsubstitut für Experimente. Die Herstellung erfolgt im Labormaßstab.
Die Zellen von etablierten Epithelzelllinien und primären Epithelzellkulturen sind im allgemeinen anfangs undifferenziert. Erst später in den Kulturen erfolgt die spontane Differenzierung, nachdem sie zusammengewachsen sind.
Collagen wird bereits standardmäßig hergestellt (Patent DE 697 25 592 T2 2004.08.05 , US Patent 5.141.747 ) und kann bei verschiedenen Anbietern wie Sigma als hochgereinigtes Collagen Typ-1 oder Typ-3 bezogen werden.
Collagen-Zellkultursubstrate, die derzeit verfügbar sind, werden im allgemeinen unter nicht physiologischen Bedingungen hergestellt und bestehen entweder aus einer Schicht amorphem Collagen mit einer geringen organisierten Fibrillenstruktur, oder aus einer Membran, die aus chemisch vernetzten Collagenfasern bestehen. Amorphe Collagensubstrate werden durch Trocknen einer sauren Lösung eines löslichen Collagens auf einer Oberfläche hergestellt. Collagenfilme werden im allgemeinen hergestellt durch Behandlung eines löslichen Collagens mit Alkali (üblicherweise Amoniakdampf), um die Polymerisierung auf der gewünschten Oberfläche zu induzieren. Amorphe Collagenfilme haben besonders schlechte Diffusionseigenschaften auf Grund der mangelden Organisation der Fibrillen.
EP-A-0218065 beschreibt eine gelähnliche Zusammensetzung für eine Grundmembran, die Laminin, Kollagen, Heparinsulfat-Proteoglykan, Entactin und Nidogen enthält. Die Zusammensetzungen können zum Wachstum und zur Differenzierung verschiedener Zellen verwendet werden.
WO 92/15700 beschreibt Verfahren zur Kultivierung von Haut, bei der die Hautprobe auf eine extrazelluläre Unterstützungsmatrix aufgebracht werden, die ein collagenhaltiges Gel enthält.
Nährlösungen mit den unterschiedlichsten Wachstumsfaktoren oder -hämmern sind handelsüblich verfügbar.
Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung zum Lederhautsubstitut sowie den erfindungsgemäßen Verfahren und Vorrichtungen der industriellen in-vitro-Fertigung tierischer Lederhautsubstitute aus tierischen etablierten Epithelzelllinien und/oder primären Epithelzellkulturzüchtungen als Rohstoffersatz für die Lederproduktion stützt sich auf die vorhandenen Erfahrungen aus der biologischen und medizinischen Grundlagenforschung und führt isolierte Kenntnisse zu einer Prozesskette zusammen und wendet diese in einem neuen industriellen Prozess an.
Das Verfahren der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass in drei Schritten vorgegangen wird. Im ersten Schritt werden im industriellen Maßstab etablierte Epithelzelllinien und/oder primären Epithelzellkulturen, vorzugsweise teilungsaktive Fibroblasten, Melanozyten und Keratinozyten, die aus Schlachtabfällen gewonnen und unter optimalen Bedingungen kultiviert werden, in einer calziumarmen Nährlösung expotentiell vermehrt und zum weiternen Verfahren vorgehalten.
Im zweiten Schritt wird ein Trägermaterial mit den teilungsaktiven Zellen in einer Mindestdichte von 0,5 bis 1,0 × 10⁵/cm² laminiert. Die verbleibenden Zellen werden erneut bis auf das Zehnfache vermehrt. Die restlichen Zellen könnten auch gefriergetrocknet werden und bis zum Einsatz eingefroren vorgehalten werden. Aufgrund des erfahrungsgemäßen Verlustes von 40 bis 60% der Epithelzellen nach dem Auftauen, bevorzugt das erfindungsgemäße Verfahren die Vorhaltung und Vermehrung in Medien.
Sollten jedoch mehr Epithelzellen vermehrt worden sein als für den laufenden Produktionsprozess nötig, ist das Einfrieren eine optimale Möglichkeit, um Nährlösung zu sparen und den Innendruck in den Vorratstanks nicht exponentiell anwachsen zu lassen, da bei vermehrtem Wachstum immer ein Verhältnis von Nährlösung zu Zellen von 1 mio:3 ml eingehalten werden sollte, wobei der Druck nicht 8 Torr, wobei 1 torr = 101325 kg:760 ms², das entspricht ca. 133,322 Pa, nicht überschreiten sollte. Eine Überschreitung von einem systolischen Druck von 16 kPa und einem diastolischen von 10,6 kPa (oder 106 Millibar) sollte verhindert werden. Das kann nur erreicht werden, wenn genügend Speicher mit großen Oberflächen und wenig Tiefe vorhanden sind.
In weiteren Behältern werden die unterschiedlichen Nährmedien für die Zellenzucht und den Hautbildungsprozess bereitgestellt.
Im dritten Schritt erfolgt die Kultivierung der Lederhaut in einem gekapselten Inkubatorsystem mit einer vorzugsweisen aber nicht zwingenden 5% CO₂ Begasung. Während der Hautbildung durch Zusammenwachsen der Zellen, werden die Zellen durch permanenter Zugabe oder Entzug von Bestandteilen der Nährlösung in einem optimalen Klima bei 37°C Umgebungstemperatur, unter Simulation der natürlichen Umgebungsbedingungen, herangezüchtet.
Nach ca. 4 bis 6 Wochen kann das Lederhautsubstitut ausgereift dem gekapselten Verfahren entnommen werden. Es ist ein in allen Gebrauchseigenschften der natürlich gewachsenen Lederhaut identisch und weist, je nach Kundenwunsch und Züchtungsdauer, eine Dicke von 1 bis 4 mm auf. Die Abmaße der Hautsubstitute richteten sich nach der von den Kunden nachgefragten Größe. Sie können in jeder gewünschten Größe produziert werden. In der vorliegenden Erfindung wird eine Breite von 1.80 m im Endlosband oder als alternative Variante ein 2 × 2 m Form beschrieben.
Der erste Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass aus Schlachtabfällen die Epithelzellen, vorzugsweise Friboblasten, isoliert und gezüchtet werden, was einschließt, dass ein wachstumsförderndes Kulturmedium, wie das handelsübliche MCDB 153, 0,3 mM Calzium, mit erhöhten Mengen an ausgewählten Aminosäuren, 10 mg/ml epidermale Wachstumsfaktoren (EGF), 5 micog/ml Insulin, 0,5 μg/ml Hydrocortison, 0,1 mM Ethanolamin und 0,1 mM Phosphorethanolamin, 0,5% Rinderhypophyenextrakt (BPE) enthält und Transferrin und Progesteron nicht enthält, wie von Boysl und Hem, sowie Pilteekow beschrieben, in getrennten Behältern, in einem calziumarmen Medium im Verhältnis von 1 Mio. Zellen zu 1 ml bis 3 ml Nährlösung, bei 37°C vorgehalten und im 48 Stundenzyklus exponentiell in ihrer Anzahl bis zum zehnfachen vermehrt werden.
Das Verfahren ist im zweiten Schritt dadurch gekennzeichnet, dass ein Teil der gezüchteten und vorgehaltenen, teilungsaktiven Kulturepithelzellen, vorzugsweise Fibroblasten, über eine Perestaltikpumpe aus den Vorratsbehältern dem Laminatsverfahren zugeführt werden.
Das Laminationsverfahren der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass die Aufbringung der Zellen auf einen mit dem Nährmedium benetzten Matrix mittels sprühen erfolgt, nach dem die Träger gereinigt und sterilisiert wurden. Das Sprühen erfolgt entsprechend dem Verfahren, wie in „Advance in Plastic Surgery" Volume 58, Number 1, January 2007, Bernd Hartmann, MD, Aline Ekkernkamp, Christa Johnen, MD, Jörg C. Gerlach, MD, PhD, ..., beschrieben. Dabei wird ein Luftfluss von 3,7 L/min und ein Fluidfluss von 4,2 ml/min benötigt. Das entspricht einem Druck von 8.2 mmHg.
Die Dichte der Zellen kann vorzugsweise mit einem Lasersystem, mit einer 2 mykrometer Auflösung, überwacht und gesteuert werden.
Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass die Epithelzellkultur, vorzugsweise Fibroblasten, bei einschichtigem Laminat oder Fibroblasten und Melanozyten und/oder Keratinozyten als Kokulturen auf eine Träger in hinreichender Dichte, in einer Mindestdichte von 0,5 bis 1,0 × 10⁵/cm², aufgesprüht werden, bis sie eine zusammenfließende Epithelschicht bilden.
Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass der zu laminierende Träger entweder 4 m² groß ist und die Ausmaße 2 m × 2 m hat, oder ein 1.80 m breites Endlosband sein kann. Jedoch kann je nach Bedarf die Trägergröße und Form variieren. Die Matrix wird von dem Medium (Nährlösung) umspült auf der die Zellen sich vermehren und zusammenwachsen. Eine weitergehende Verbesserung der Zellzucht kann durch eine Beschichtung der Matrix mit Proteinen erreicht werden. Der Träger ist vorzugsweise eine Collagenmatrix, die jedoch auch aus Vliesen, Polimeren, Gummi, Silikon oder einer schwammartigen Unterlage sein kann, die beim Einsatz von Trägem in einem Rahmen eingespannt ist oder bei Anwendung des Fließbandverfahrens untere der aufgesprühte Zellschicht von Rollen angetrieben wird, läuft. Die Gewebeträger sind plan. Der Gewebeträger wird bei Rahmennutzung zwischen einem Halterahmen und einem Spannrahmen aus FVK Modulen eingespannt. Bei der Nutzung von Trägern werden die mit den Epithelzellen laminierten Träger in ein Perfusionpool eingesetzt, der permanent mit frischen Kulturmedium durchströhmt wird. In diesen Pool lässt sich gewebetypisches Umfeld simulieren. Äquivalent gilt es für das Fließbandprinzip, wo das Trägerband einen perfusionierenden Brutbereich durchläuft.
Das Verfahren ist gekennzeichnet, das die Zelltypkulturen im gekapselten lichtdurchlässigen Bioreaktorprozess nacheinander inkubiert werden. Nach dem Einbringen in den Perfusionpool oder -bereich wird das eingebrachte Epithelzellgewebe wie unter natürlichen Bedingungen gezüchtet. Von unten und oben werden die Zellen mit unterschiedlichen Medien mit einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/h versorgt damit sich keine stoffwechselschädlichen Metabolite, wie Radikale oder Protonen ansammeln können und so abgefangen werden. Zur Aufrechterhaltung der Säuregrades, kann eine 5%ige CO₂ Begasung erfolgen oder entsprechende Nährmedien zugeführt werden. Zeitweise wird das Zellgeflecht mechanisch belastet.
Der gekapselte Prozess ist gekennzeichnet durch sterile clean-nass-room-Bedingungen bei einer Tempratur von 37C°, die mittels Wärmepumpen konstant gehalten wird.
Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass nach der Vermehrung und dem Zusammenwachsen der Zellen die Träger in ein Kulturpool oder -bereich kommen, wo sie permanent mit frischem Medium durchströmt werden. Dadurch lassen sich beliebige organtypische Situationen während der Kultur simulieren, wie mechanische Beanspruchung, Lichteinfluss und Nährstoffzugabe oder Nährstoffverminderung bzw. -entzug. Eine 2 mykrometer auflösende Kamera überwacht und kontrolliert den Reifungsprozess. Je nach Ausreifungsgrad wird die Zugabe oder der Entzug von Nährmedien gesteuert.
Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass nur die Lederhaut gezüchtet wird.
Das wird durch die Steuerung der Differenzierung des kultivierten Gewebes mittels der Nährlösung erreicht.
Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass die Träger im Fließbandprozess von rotierenden Transportrollen bewegt wird und sich die Stufen der Lederhautausbildung weiter ausprägt, je weiter sich die besprühte Stelle des Matrixbandes von der Einbringungsstelle entfernt und die durchlaufende Züchtungszeitdauer zunimmt.
Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass die aufgesprühten Hauttypzellen bis zur vollständigen Ausreifung und Hautbildung der Lederhaut auf dem Träger oder dem Endlosband im gekapselten Prozess bleiben.
Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass während des Wachstumsprozesses das Endlosband oder der Träger mechanisch gestreckt und gestaucht wird wodurch die mechanische Beanspruchung des wachsenden, tierischen Hautsubstitutes mechanisch beansprucht und damit eine elastische und stabilere Ausprägung erhält, wodurch eine spätere Schrumpfung weniger als 30% erzielt wird.
Das Verfahren ist im dritten Schritt gekennzeichnet, dass im laufenden Prozess im Moment der Zellausreifung und vollendeter Hautbildung die Zuführung vom Nährstoff (Medium) eingestellt wird.
Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass das entnommene tierische Lederhautsubstitut, durch eine Waschanlage gezogen wird, um die restlichen Nährstoffreste zu entfernen.
Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass das ausgebildete tierische Lederhaut-substitut über eine Entnahmevorrichtung mittels Sauggreifer dem gekapselten Prozess entnommen wird.
Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass eine Stärke des Lederhautsubstitutes von 1 mm bis 4 mm und einer Breite nach Schrumpfung von > 1400 mm im Endlosband erzielt wird je nach Modifizierung und Züchtungsdauer.
Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass die von dem tierischen Lederhautsubstitut befreiten Träger gereinigt und desinfiziert werden und bis an die Startphase zurücklaufen und wieder in den Sprühprozess eintreten.

1: Medientank
2: Medienzufuhr
3: Zellzuchtcontainer
4: Leitung zur Zellzufuhr
5: gekapseltes Inkubationssystem
6: Einbringung
7: kultiviertes Lederhautsubstitut
8: mechanische Belastung
9: Wasch- und Reinigungsbereich des Ledersubstituts
10: Entnahme des Ledersubstituts
11: Abfalltank für verbrauchte Medien
12: Endlosträgerband
13: Transportrolle
14: Reiniungs- und Desinfektionsbereich für das Endlosträgerband
15: Perestaltikpumpe

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

- DE 000069128530 T2 [0005]
- DE 69725592 T2 [0007]
- DE 20040805 [0007]
- US 5141747 [0007]
- EP 0218065 A [0009]
- WO 92/15700 [0010]

Claims

Verfahren zur Herstellung eines tierischen Lederhautsubstituts, dadurch gekennzeichnet, dass a) tierische in-vitro-gezüchtete Epithelzellen aus etablierten tierischen Epithelzelllinien und/oder primären Epithelzellkulturen, die vorzugsweise aus Schlachtabfällen gewonnen werden in einem wachstumsfördernden Kulturmedium gezüchtet und danach in einer calciumarmen Nährlösung im Verhältnis von 1 Mio Zellen zu 1 ml bis 3 ml Nährlösung bei 37°C im 48 Stundenzyklus exponentiell in ihrer Anzahl bis zum 10-fachen vermehrt werden, welches in getrennten Behältern erfolgt, b) kultivierte teilungsaktive Zellen auf ein gereinigtes und sterilisiertes Trägermaterial in einer Mindestdichte von 0,5 bis 1,0 × 10⁵/cm² zur Bildung einer zusammenfließenden Epithelschicht laminiert werden, indem das Trägermaterial mit den Epithelzellen aus den Behältern unter Verwendung einer Perestaltikpumpe bei einem Luftfluss von 3,7 L/min und einem Fluidfluss von 4,2 ml/min besprüht wird, und verbleibende Zellen erneut bis auf das Zehnfache vermehrt werden, und anschließend c) die Zellen in einem gekapselten, lichtdurchlässigen Inkubatorsystem unter permanenter Zugabe oder Entzug von Bestandteilen der Nährlösung bei 37°C Umgebungstemperatur weitere 4 bis 6 Wochen auf eine Dicke von 1 bis 4 mm zur Hautbildung kultiviert werden, wobei die Fließgeschwindigkeit bei 1 ml/h liegt.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass wachstumsfördernde Kulturmedien eingesetzt werden wie das vorzugsweise MCDB 153.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass während der Zellzucht Proteine zugesetzt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass als Trägermaterial eine Collagenmatrix, Vliese, Polymere, Gummi, Silikon oder eine schwammartige Unterlage verwendet wird, vorzugsweise eine Collagenmatrix.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger eine Fläche von 4 m² besitzt oder ein Endlosband mit einer Breite von 1,80 m ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägermaterial in einen Rahmen eingespannt verwendet wird oder dass das Fließbandverfahren angewandt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger in einen Perfusionspool gesetzt wird oder das Trägerband einen perfusionierenden Brutbereich durchläuft.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger nach Beendigung der Kultivierung vom Lederhautsubstitut getrennt, gereinigt und einer Wiederverwendung zugeführt wird.
Tierisches Lederhautsubstitut hergestellt nach einem der Ansprüche 1 bis 8.
Vorrichtung zur Herstellung eines tierischen Lederhautsubstituts gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 gekennzeichnet durch 1, die damit Gegenstand des Anspruchs ist.
Vorrichtung nach Anspruch 10, gekennzeichnet durch – Medientanks (1) – Leitungen zur Medienzuführung (2) von den Medientanks (1) zu einem Trägerband (12) und zu Zellzuchtcontainern (3) – Zellzuchtcontainer (3) – Leitungen zur Zellzufuhr (4) vom Zellzuchtcontainer (3) zum Trägerband (12) – ein gekapseltes Inkubatorsystem (5) – Einbringung (6) – Perfusionspool (7) – Mechanische Belastung (8) – Wasch-Reinigungsbereich (9) – Hautentnahme (10) – Abfalltank (11) – Endlosträgerband (12) – Transportrolle (13) – Reinigungs- und Desinfektionsbereich (14) – Perestaltikpumpe (15).