DE102007013047A1

DE102007013047A1 - Herstellung chemischer Bausteine aus pflanzlicher Biomasse durch selektive Depolymerisierung

Info

Publication number: DE102007013047A1
Application number: DE200710013047
Authority: DE
Inventors: Andre Dr. Koltermann; Ulrich Dr. Kettling; Thomas Dr. Brück; Markus Dr. Rarbach
Original assignee: Sued Chemie AG
Current assignee: Sued Chemie IP GmbH and Co KG
Priority date: 2007-03-19
Filing date: 2007-03-19
Publication date: 2008-09-25

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymatischen Behandlung eines polymeren Rohsubstrats, umfassend die folgenden Schritte: (a) Behandlung des polymeren Rohsubstrats mit einem Enzymsystem, um definierte monomere oder oligomere Bausteine aus dem polymeren Rohsubstrat freizusetzen; und (b) Abtrennung der in Schritt (a) definierten monomeren oder oligomeren Bausteine von dem Rest des polymeren Rohsubstrats. Vorzugsweise umfasst das in Schritt (a) verwendete Enzymsystem nicht mehr als 50%, vorzugsweise nicht mehr als 20%, besonders bevorzugt nicht mehr als 10%, besonders bevorzugt nicht mehr als 5%, besonders bevorzugt nicht mehr als 2%, besonders bevorzugt nicht mehr als 1%, anderer enzymatischer Aktivitäten außer der enzymatischen Aktivität, welche zur Freisetzung der definierten monomeren oder oligomeren Bausteine aus dem polymeren Rohsubstrat gemäß Schritt (a) führt. Weitere Aspekte der Erfindung betreffen die Verwendung von "weniger reinen" und daher weniger kostenintensiven Enzymsystemen in nachfolgenden enzymatischen Behandlungsschritten und Verfahren zur Bestimmung der optimalen Reihenfolge der enzymatischen Behandlungsschritte durch Analyse des verwendeten polymeren Rohsubstrats.

Description

Hintergrund der Erfindung
Die Herstellung biobasierter chemischer Bausteine aus erneuerbaren Quellen erhält aufgrund der globalen Begrenzung fossiler petrochemischer Vorkommen in letzter Zeit steigernde Aufmerksamkeit. Die bevorzugten Rohstoffe zur Erzeugung solcher chemischer Produkte auf biologischer Basis stammen aus erneuerbarer pflanzlicher Biomasse (Kamm et al., 2006).
Derzeitige Herstellungsverfahren für biobasierte Produkte beruhen hauptsächlich auf Substraten aus der Nahrungsmittel- und Futtermittelindustrie, wie beispielsweise Ölen, Zuckern und Stärken. Die meisten Rohstoffe der ersten Generation haben eine gut definierte chemische Zusammensetzung und eine geringe strukturelle Komplexität. Zusätzlich können diese Substrate in relativ hoher Reinheit mit nur geringen Mengen an begleitenden Verunreinigungen erhalten werden. Obwohl ihre Verwendung sowohl technisch als auch wirtschaftlich attraktiv ist, ist ihre dauerhafte Verfügbarkeit in großem Maßstab nicht gesichert, da die Verwendung von Rohstoffen der ersten Generation für biobasierte chemische Verfahren in starkem Wettbewerb mit der stetig wachsenden globalen Nachfrage der Nahrungsmittelindustrie steht.
Alternative Substrate zu den vorstehend genannten Rohstoffen der ersten Generation stammen aus preiswerten Abfallprodukten der Forst- und Agrarwirtschaft, bei denen es sich um pflanzliche Materialien handelt, welche keine Anwendungen als Nahrungsmittelquelle haben. Beispiele dieser sogenannten Rohstoffe der zweiten Generation sind Pflanzenrückstände aus der Landwirtschaft, wie beispielsweise Maisstroh und Weizenstroh, sowie verschiedene holzverwandte Abfallprodukte. Diese Lignocellulose-Biomasse (LCB) unterscheidet sich von den biologischen Rohstoffen der ersten Generation durch ihre komplexe chemische und strukturelle Zusammensetzung. Die Hauptbestandteile von LCB sind hochpolymere Stoffe, wie Cellulose (ca. 35–50 Gew.-%), Hemicellulose (ca. 20–35 Gew.-%) und Lignine (ca. 10–25 Gew.-%). Proteine, Lipide und andere Verbindungen stellen Nebenbestandteile der meisten LCB-Rohstoffe dar (Saha, 2005), können aber in besonderen landwirtschaftlichen Abfallprodukten, wie beispielsweise Rückständen der Ölproduktion, in größeren Mengen enthalten sein. Da LCB aus einer Vielzahl chemisch unterschiedlicher Bestandteile zusammengesetzt ist, sind Abbauverfahren technisch schwierig, wodurch wiederum die wirtschaftliche Umsetzbarkeit derzeitiger auf LCB basierender Bioverfahren begrenzt wird.
Technisches Problem
Um wertvolle chemische Substanzen und Bausteine mit wirtschaftlich durchführbaren Bioverfahren auf der Basis von LCB-Rohstoffen herzustellen, ist es sowohl wichtig, (i) den Hauptteil ihrer unterschiedlichen chemischen Bestandteile zu gewinnen und zu veredeln, als auch (ii) sie in ausreichender Reinheit herzustellen. Im Gegensatz zu den unterschiedlichen und hochpolymeren Einheiten, aus denen LCB besteht, besitzen die bevorzugten Abbauprodukte ein niedriges Molekulargewicht. Im Allgemeinen können wirtschaftlich wertvolle Produkte aus allen Bestandteilen von LCB erzeugt werden: Aus Cellulose gewonnene Glucose ist ein vielseitiges Ausgangsmaterial für die Erzeugung hochwertiger chemischer Zwischenprodukte, wie Sorbit. Aus Hemicellulosefraktionen der LCB gewonnene Pentosezucker, wie Xylose und Arabinose, dienen als Ausgangsmaterial für hochwertige, nährstoffarme und kalorienfreie Süßstoffe, wie Xylit und Arabinit. Proteine aus LCB können zu reinen Enantiomeren von L-Aminosäuren hydrolysiert werden. Lignine können als Quelle für Phenolverbindungen dienen, die in petrochemischen Verfahren erzeugte Aromaten ersetzen können. Die gegenwärtige technische Beschränkung der Verwendung von Rohstoffen der zweiten Generation besteht hauptsächlich in deren komplexer chemischer Zusammensetzung.
Die meisten gängigen Verfahren, bei denen LCBs verwendet werden, konzentrieren sich auf den Celluloseanteil des Substrats. Falls andere Bestandteile verwendet werden, werden sie gewöhnlich in nichtselektiven Verfahrensschritten hydrolysiert, wie durch eine Vorbehandlung mit Schwefelsäure zur Hydrolyse aller Hemicellulosen in einem Verfahrensschritt. Die Produkte dieser nichtselektiven Verfahrensschritte haben im Allgemeinen einen niedrigen und in einigen Fällen sogar einen negativen kommerziellen Wert.
Das derzeitige Iogen-Verfahren zur fermentativen Herstellung von Bioethanol umfasst eine Vorbehandlung mit verdünntem Säuredampf bei 200–250°C zur Freisetzung der Hemicellulosefraktion von LCB, die ein Gemisch unterschiedlicher Hexose- und Pentosezucker enthält. In einem gesonderten enzymatischen Schritt wird die unlösliche Cellulosefraktion zu Hexosezuckern (Glucose) hydrolysiert. Nach der Verflüssigung der Hemicellulose- und der Cellulosefraktionen werden die unlöslichen Lignin-Feststoffe physikalisch von der Maische abgetrennt und verbrannt, um Energie für die weitere Verarbeitung der verbleibenden LCB-Fraktionen zu gewinnen. Die vereinigten Cellulose- und Hemicellulosefraktionen werden zusammen in einem einzigen Schritt fermentiert, um Bioethanol herzustellen. Das gebildete Ethanol wird nachfolgend durch Destillationsverfahren aus der Fermentationslösung gewonnen. Da die Mehrheit der im Handel erhältlichen Organismen (z. B. Bäckerhefe, Saccharomyces cerevisiae), die beim Fermentationsverfahren eingesetzt werden, nicht in der Lage sind, Pentosezucker zu verwerten, werden diese Bestandteile der LCB, obwohl sie, wenn sie in reiner Form vorliegen, einen erheblichen wirtschaftlichen Wert haben, bei dem Verfahren zusammen mit dem verbleibenden Restabfall verworfen (Lawford und Rousseau, 2003).
Seit Kurzem werden Versuche unternommen, die Pentosefraktion von LCBs zur fermentativen Umwandlung in Bioethanol verfügbar zu machen. Bei diesem verbesserten Verfahren wird die verflüssigte Hemicellulosefraktion von den nach dem Vorbehandlungsschritt verbleibenden Bestandteilen der LCB getrennt. Während die verbleibenden LCB-Fraktionen wie vorstehend beschrieben verarbeitet werden, werden besondere gentechnisch veränderte Mikroorganismen (z. B. spezielle Stämme von Zymomonas mobilis) mit der Fähigkeit, Pentose-(Lawford und Rousseau, 2003; Lynd et al., 2005) und Hexosezucker zu verwerten, in einem getrennten Fermentationsschritt eingesetzt, um die verflüssigte und aufbereitete Hemicellulose in Bioethanol umzuwandeln. Die erhaltene Fermentationsmaische wird anschließend dem herkömmlichen Verarbeitungsstrom zur Gewinnung von Bioethanol zugeführt. Obwohl die Erzeugung von Bioethanol aus komplexen Pentosegemischen kommerziell sinnvoll erscheint, stellt die selektive Verarbeitung von Hexosen, Pentosen und Lignin zu hochwertigen Erzeugnissen und chemischen Bausteinen eine attraktive Alternative zur Verwertung der LCB-Bestandteile dar.
Ein allen derzeit verwendeten Vorbehandlungsmethoden anhaftendes Problem ist die gleichzeitige und nicht-selektive Hydrolyse und Freisetzung von verschiedenen chemischen Bausteinen, aus denen die LCB-Bestandteile zusammengesetzt sind (Saha, 2005). Zur Zeit kommerziell eingesetzte und ökonomisch brauchbare Vorbehandlungsmethoden verwenden harsche chemische oder physikalische Verfahren, die eine Kombination von Säure- oder Basenbehandlungen bei erhöhten Temperaturen (Ramos et al., 2005) beinhalten können. Die erhaltenen LCB-Hydrolysate enthalten verschiedene unerwünschte, durch die chemische Modifizierung von LCB-Bausteinen entstandene Nebenprodukte. Die Anwesenheit dieser Verunreinigungen verhindert oftmals eine anschließende enzymatische oder katalytische Verarbeitung oder Ganzzellfermentation der Produkte (Saha, 2005) und verringert daher den kommerziellen Wert der mit diesen Methoden aus LCBs erzeugten Produktströme erheblich.
Die der Erfindung zugrunde liegende technische Aufgabe war folglich, ein Verfahren zur Herstellung chemischer Bausteine aus erneuerbarer pflanzlicher Biomasse bereit zu stellen.
Insbesondere bestand das technische Problem darin, ein Verfahren zur Herstellung von wertvollen chemischen Bausteinen aus LCB bereit zu stellen, welches die Nachteile und Beeinträchtigungen des Standes der Technik vermeidet.
Zusammenfassung der Erfindung
Nach einem ersten Aspekt liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur enzymatischen Behandlung eines polymeren Rohsubstrats, das die nachstehenden Schritte umfasst: (a) Behandlung des polymeren Rohsubstrats mit einem Enzymsystem, um definierte monomere oder oligomere Bausteine aus dem polymeren Rohsubstrat freizusetzen; und (b) Abtrennung der in Schritt (a) erzeugten definierten monomeren oder oligomeren Bausteine vom Rückstand des polymeren Rohsubstrats.
Auf diese Weise wurde gefunden, dass die Abtrennung der freigesetzten monomeren oder oligomeren Bausteine von dem polymeren Rohsubstrat nach einer definierten Behandlung mit einem Enzymsystem wesentliche Vorteile bezüglich der Herstellung von chemisch reinen hochwertigen Grundchemikalien und chemischen Bausteinen aus komplexen natürlichen Substraten, wie LCB, durch den Einsatz von selektiven katalytischen Verfahrensschritten liefert. Diese selektiven katalytischen Verfahrensschritte setzen chemische definierte monomere oder oligomere Bestandteile aus den komplexen polymeren Rohstoffen frei, wobei nur geringe Mengen anderer Verunreinigungen in dem mit dem Verfahrensschritt erzeugten Produkt enthalten sind. Eine bevorzugte technische Lösung erreicht diese Spezifität und Selektivität bei der Hydrolyse von LCB durch den Ablauf selektiver enzymatischer Schritte. Die Grundchemikalien können als Ersatz für Rohstoffe in herkömmlichen petrochemischen Verfahren und als Rohstoffe für neuartige chemische und biochemische Syntheserouten eingesetzt werden und weisen daher einen hohen wirtschaftlichen Wert auf.
Die Erfindung umfasst ein einzelnes konsolidiertes Verfahren oder eine Reihe von aufeinander folgenden Verfahrensschritten. Bei jedem Verfahrensschritt werden aus den unlöslichen polymeren Rohsubstraten durch sukzessive Zugabe eines spezifischen Enzymsystems lösliche monomere oder oligomere Produkte hergestellt, gefolgt von der Abtrennung der löslichen monomeren oder oligomeren Produkte von den unlöslichen polymeren Rohstoffen.
Nach einem bevorzugten Aspekt ist der (sind die) definierte(n) monomere(n) oder polymere(n) Baustein(e), die aus dem polymeren Rohsubstrat in Schritt (a) freigesetzt werden, ein spezifisches "Produkt" aus der linken Spalte der nachstehenden Tabelle 1. Mit anderen Worten wird aus dem polymeren Rohsubstrat in jedem Be handlungsschritt (a) unter Verwendung eines Enzymsystems oder einer Kombination von Enzymsystemen, die das gleiche Produkt erzeugen, nur ein einziger spezifischer monomerer oder oligomerer Baustein freigesetzt. Beispiele entsprechender Kombinationen von Enzymen sind in Tabelle 1 aufgelistet.
Weitere bevorzugte Aspekte und Ausführungsformen sind nachstehend im Detail beschrieben.
Definitionen
Der Begriff "polymeres Rohsubstrat" bedeutet komplexe Gemische verschiedener polymerer Substrate, wie Kohlenhydrate, polymere Lipide, Polypeptide, Polynukleotide und polymere Phenylpropanoide in schwankenden Gewichtsverhältnissen, die gewöhnlich aus pflanzlichem Material stammen. Polymere Rohsubstrate umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Abfallprodukte aus der Forst- und Landwirtschaft und der Nahrungsmittel verarbeitenden Industrie sowie kommunale Abfälle. Handelt es sich bei den hauptsächlichen Polymeren um Cellulose und Lignin, werden die polymeren Rohsubstrate als "lignocellulosische Rohsubstrate" oder "lignocellulosische Biomasse" oder "LCB" bezeichnet. Lignocellulosische Rohsubstrate aus der Landwirtschaft umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Weizenstroh, Maisstroh, Stallmist von Wiederkäuern, Zuckerrohr-Presskuchen, Zuckerrüben-Pulpe und krautige Materialien, wie Gertengras, Sericea Lespedeza Serala und Sudangras. Abfallprodukte aus der Forstwirtschaft umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Baumrinde, Hackschnitzel und Holzverschnitt. Lignocellulosische Rohsubstrate aus der Nahrungsmittelindustrie umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Fruchtpulpe, Agavenrückstände, Kaffeerückstände und Ölmühlen-Abfälle, wie Rapssamen-Presskuchen und Mühlen-Abwässer. Rohsubstrate aus der Zellstoff- und Papierindustrie umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Papierbrei und Papiermühlen-Abwässer. Rohsubstrate aus kommunalen Abfällen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Papierabfälle, Gemüserückstände und Fruchtrückstände.
Der Begriff "polymeres Substrat" bezeichnet Substanzen, die entweder aus einem bestimmten monomeren Bestandteil oder einer begrenzten Auswahl an bestimmten monomeren Bestandteilen bestehen, wobei die Monomere in einer linearen oder teilweise verzweigten Molekülstruktur kovalent miteinander verbunden sind. Die unlösliche Fraktion des lignocellulosischen Rohsubstrats enthält bedeutende Mengen solcher polymerer Substrate, wie Cellulose, Xylan, Mannan und Galactan. Zusätzlich enthält sie polymere Substrate, wie Lignin, Arabinoxylan, Glucoronoxylan, Glucomannan und Xyloglucan.
Der Begriff "Enzymsysteme" bezeichnet proteinöse Einheiten, die polymere oder oligomere Substrate katalytisch in kleinere oligomere oder monomere Bestandteile (Bausteine) zerlegen können. Zusätzlich zur Verwendung eines einzigen Enzyms zur Herstellung monomerer oder oligomerer Produkte aus einem polymeren Substrat beinhaltet der Ausdruck Enzymsystem auch Gemische, die mehr als ein Enzym umfassen und die ein bestimmtes monomeres oder oligomeres Produkt durch synergistische oder parallele Aktivität aus einem polymeren Substrat erzeugen. Die Begriffe "Enzymsystem" und "Enzymgemische" sind daher hier untereinander austauschbar und beide können ein oder mehrere Enzym(e) bzw. Enzymaktivität(en) umfassen.
Der Begriff "monomere oder oligomere Bausteine" bezeichnet monomere oder oligomere Produkte, die unter Verwendung eines Enzymsystems aus dem polymeren Rohsubstrat freigesetzt werden. Der Begriff "Oligomer" umfasst Verbindungen mit zwei oder mehr monomeren Einheiten.
Der Begriff "enzymatische Aktivität" eines Enzyms bezieht sich auf die katalytische Aktivität des Enzyms bei geeigneten Bedin gungen, bei denen das Enzym als Proteinkatalysator wirkt und bestimmte polymere oder künstliche Substrate in bestimmte oligomere oder monomere Produkte umwandelt.
Der Begriff "verunreinigende enzymatische Aktivität" beschreibt enzymatische Aktivitäten eines verwendeten Enzymsystems, welche zu anderen oligomeren oder monomeren Produkten als dem (den) erwünschten oligomeren oder monomeren Produkt(en) führen, die nach der beabsichtigten (hauptsächlichen oder ersten) enzymatischen Aktivität des Enzymsystems erzeugt werden.
Der Begriff "künstliches Substrat" bezeichnet eine Substanz mit gewöhnlich niedrigem Molekulargewicht, die nach dem Kontakt des künstlichen Substrats mit einem Enzymsystem eine messbare Änderung der physikalisch-chemischen Eigenschaften des künstlichen Substrats erfährt, die auf die Aktivität eines ausgewählten Enzymsystems zurückgeführt werden kann. Diese physikalisch-chemischen Eigenschaften und die künstlichen Substrate, die diese Änderungen der physikalisch-chemischen Eigenschaften nach dem Kontakt mit einem Enzymsystem bewirken, sind dem Fachmann bekannt und umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Änderungen der spektrophotometrisch messbaren Absorption oder Fluoreszenzemission, Änderungen der chromatographischen Mobilität, die durch Flüssig- oder Gaschromatographen bestimmt werden können, und Änderungen des Molekulargewichts, die durch Massenspektroskopie bestimmt werden können.
Geeignete künstliche Substrate für Enzyme und Enzymsysteme und messbare Reaktionsprodukte sind in der nachstehenden Tabelle 2 aufgeführt.
Der Begriff "freisetzen" bedeutet die Umwandlung eines unlöslichen polymeren Substrats in ein lösliches monomeres oder oligomeres Produkt durch ein physikalisches, chemisches oder kataly tisches Verfahren, wie beispielsweise Hydrolyse, oxidative oder reduktive Depolymerisierung usw.
Detailbeschreibung der Erfindung
Allgemeines
Die Erfindung betrifft ein einziges konsolidiertes Verfahren oder eine Reihe von aufeinander folgenden Verfahrensschritten zur Herstellung von Grundchemikalien oder chemischen Bausteinen aus polymeren Rohsubstraten wie LCB. Bei jedem Verfahrensschritt werden lösliche monomere oder oligomere Produkte (Bausteine) aus dem unlöslichen polymeren Rohsubstrat gebildet, indem das polymere Rohsubstrat mit einem spezifischen Enzymsystem zusammen gebracht wird, das vorzugsweise im Wesentlichen frei von enzymatischen Aktivitäten ist, die andere als die beabsichtigten Reaktionsprodukte (monomere oder polymere Bausteine) erzeugen, gefolgt von der Abtrennung des (der) löslichen monomeren oder oligomeren Baustein(e) von dem unlöslichen polymeren Rohsubstrat.
Verfahren zur Abtrennung von löslichen und unlöslichen Bestandteilen sind dem Fachmann bekannt und umfassen Verfahrensschritte wie Sedimentation, Dekantation, Filtration, Mikrofiltration, Ultrafiltration, Zentrifugation, Evaporieren flüchtiger Produkte und Extraktion mit organischen Lösungsmitteln. Nach einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der physikalisch-chemische Behandlungsschritt eine Behandlung mit wässrigen Lösungsmitteln, organischen Lösungsmitteln oder jeder Kombination oder jedem Gemisch dieser, vorzugsweise mit Ethanol oder Glycerin.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die enzymatische Behandlung in einem wässrigen Medium durchgeführt, und die definierten monomeren oder oligomeren Bausteine, die aus dem polymeren Rohsubstrat freigesetzt werden, sind in dem wäss rigen Medium löslich und die Abtrennung gemäß dem obigen Schritt (b) wird durch Fest/Flüssig-Abtrennung der löslichen Bausteine in dem wässrigen Medium von dem unlöslichen polymeren Rohsubstrat durchgeführt.
Einschlägige Beispiele polymerer Substrate, die Hauptbestandteile von polymeren Rohstoffe darstellen, ihre monomeren oder oligomeren Abbauprodukte (Bausteine) und Enzymsysteme, die bei der Herstellung von im Wesentlichen reinen Produkten aus jedem polymeren Substrat, das in einem polymeren Rohsubstrat enthalten ist, brauchbar sind, sind in der nachstehenden Tabelle 1 angegeben.
Bei den erfindungsgemäßen Verfahrensschritten werden chemische Bausteine der polymeren Substrate, wie Hemicellulose, Cellulose, Lignine, Glucane, Proteine und Lipide, durch Zusammenbringen des polymeren Substrats mit spezifischen Enzymsystemen freigesetzt. Der enzymatische Abbau der einzelnen Bestandteile des Substrats zu im Wesentlichen reinen, löslichen Produkten basiert auf der Anwendung von substratspezifischen Enzympräparationen, die nach einer bevorzugten Ausführungsform im Wesentlichen frei von Aktivitäten sind, die andere Bestandteile als die beabsichtigten Produkte bei dem jeweiligen Verfahrensschritt freisetzen.
Bestimmung der Zusammensetzung des polymeren Rohsubstrats
Die molekulare Zusammensetzung des Rohsubstrats, das in den hier beschriebenen Verfahren eingesetzt werden soll, kann mit Methoden bestimmt werden, die dem Fachmann bekannt sind. Beispielsweise kann die Zusammensetzung lignocellulosischen Materials durch eine Kombination von Pyrolyse, Gaschromatographie und Massenspektroskopie bestimmt werden. Eine Übersicht der Methoden, die mögliche analytische Verfahren zur Bestimmung von LCB-Bestandteilen beschreiben, findet sich unter:
http://www1.eere.energy.gov/biomass/analytical procedures.html#samples.
Nach einer Ausführungsform können Standardverfahren, die mehrere physikalische und enzymatische Reaktionsschritte umfassen, eingesetzt werden, um die Bestandteile des Substrats auf der Basis der erhaltenen Reaktionsprodukte empirisch zu quantifizieren.
Für herkömmliche Substrate findet sich eine Datenbank, die die Massenverteilung für die meisten gängigen Rohstoffklassen aufführt, unter:
http://www1.eere.energy.gov/biomass/feedstock databases.html.
In einer Darstellung zur Analyse der Bestandteile des Substrats muss zunächst das polymere Rohsubstrat teilweise hydrolysiert werden, bevor eine weitere Analyse durchgeführt werden kann.
Vor der Hydrolyse des Substrats wird die Probe des Substrats (1 g) in einen Schmelztiegel eingebracht und bei 50°C bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Das Trockengewicht wird auf drei Kommastellen notiert, um das Ofen-Trockengewicht (oven dry weight, ODW) der Probe zu erhalten.
Für das Hydrolyseverfahren wird 1 g des fein vermahlenen Substrats (2 μm) in ein Druckröhrchen eingebracht und 3 ml 72%-iger Schwefelsäure (v/v) zugegeben. Das Druckröhrchen wird in ein Wasserbad bei 30°C gebracht und 1 h inkubiert. Mit Hilfe eines Rührstabes wird die Probe alle 5 bis 10 Minuten gerührt, ohne dass die Probe aus dem Bad genommen wird. Das Rühren ist wesentlich, um eine gleichmäßige Säure-Partikel-Verteilung zu gewährleisten. Die Säure wird auf 4% verdünnt, indem 84 ml doppelt destilliertes Wasser unter Verwendung einer Bürette zugegeben werden, und die Probe wird vermischt, indem die Röhrchen mehrmals umgedreht werden, um eine Phasentrennung zu unterbinden.
Um die säure-unlösliche Ligninfraktion des Substrats zu bestimmen, wird die autoklavierte Hydrolyselösung durch einen zuvor gewogenen Filtertiegel vakuumfiltriert.
Das Filtrat wird in einer Filterflasche aufgefangen und ein 50 ml-Aliquot wird in eine Proben-Aufbewahrungsflasche überführt. Diese Probe wird in dem nachstehenden Verfahren verwendet, um den Lignin- und Kohlenhydratgehalt zu bestimmen. Die Bestimmung des säure-unlöslichen Lignins muss innerhalb von sechs Stunden nach der Hydrolyse durchgeführt werden.
Zur Bestimmung des säure-unlöslichen Lignins wird doppelt destilliertes Wasser zugegeben, um alle verbleibenden unlöslichen Substanzen aus dem Druckröhrchen quantitativ in den Filtertiegel zu überführen. Die unlöslichen Stoffe müssen mit mindestens 50 ml doppelt destilliertem Wasser gespült werden, und anschließend muss der Tiegel und die säure-unlöslichen Rückstände 4 Stunden bei 105°C oder bis zur Gewichtskonstanz getrocknet werden. Nach der Inkubation werden die Proben aus dem Ofen entnommen und in einem Exsikkator abgekühlt. Das Gewicht "w2" des Tiegels und des getrockneten Rückstands müssen auf 0,1 mg genau notiert werden, bevor Tiegel und Rückstände 24 Stunden in einen Muffelofen bei 575°C gebracht werden.
Der Tiegel wird vorsichtig aus dem Ofen entnommen, direkt in einen Exsikkator überführt und eine bestimmte Zeit gekühlt, die der anfänglichen Kühlzeit des Tiegels entspricht. Der Tiegel und die Asche werden gewogen (Gewicht "w3") und wieder in den Ofen gebracht, bis ein konstantes Gewicht erreicht ist. Das mit der verbleibenden Asche ("w3") korrigierte Gewicht "w2" entspricht dem Gewicht des säure-unlöslichen Lignins, das in dem Rohsubstrat enthalten ist.
Im Gegensatz zu den aufwändigen Messungen, die erforderlich sind, um die Menge des säure-unlöslichen Lignins zu erhalten, kann die Menge des säurelöslichen Lignins leicht spektrophotometrisch festgestellt werden. Zunächst wird eine Messung des Leerwerts mit 4%-iger Schwefelsäure (v/v) auf einem beliebigen Spektrophotometer durchgeführt. Unter Verwendung des anfänglichen Hydrolysats wird die Absorption bei 320 nm und die maximale Absorption des filtrierten Hydrolysats, die gewöhnlich bei ungefähr 198 nm liegt, gemessen. Die Probe muss, falls notwendig, verdünnt werden, damit die Absorption in den Bereich von 0,7–1,0 A Einheiten fällt. Die Absorption der Probe auf 3 Dezimalstellen wird verwendet, um die Menge des in der Probe vorhandenen säurelöslichen Lignins entsprechend der nachstehenden Gleichung zu berechnen: %ASL = (UVabs·VolumenFiltrat·Verdünnung)/(e·ODWProbe)·100

ODW: = Ofen-Trockengewicht der Probe des Rohsubstrats
UV_abs: = mittlere UV-vis-Absorption der Probe bei 320 nm
Volumen: _Filtrat = Volumen des filtrierten Hydrolysats
e: = Extinktionskoeffizient des Hydrolysats der Biomasse bei maximaler Absorption der Probe (zahlreiche Werte der Extinktionskoeffizienten für eine große Anzahl von polymeren Rohsubstraten können gefunden werden unter http://wwwl.eere.energy.gov/biomass/analytical procedures.html#samples)

Das flüssige Hydrolysat der Probe kann auch verwendet werden, um die strukturgebenden Kohlenhydrate, die in der Hemicellulosefraktion des Substrats enthalten sind, unter Verwendung eines Verfahrens auf HPLC-Basis zu bestimmen.
Diese Bestimmung erfordert zunächst ein Kalibrationsgemisch für jeweils D-Cellobiose, Glucose, Xylose, Galactose, Arabinose und Mannose. Die für jeden Zuckerstandard hergestellten Konzentrationen sollten in einem Bereich von 0,1–4 mg/ml liegen. Für jeden Satz Kalibrationsstandards sollte ein unabhängiger Kalibra tions-Verifizierungsstandard (calibration verification standard, CVS) hergestellt werden, der in die Mitte des validierten Bereichs der Kalibrationskurve fällt (z. B. 2,5 mg/ml). Die CVS sollten in der HPLC nach jedem Kalibrationssatz und in regelmäßigen Abständen während der Analysesequenz analysiert werden, wobei Probengruppen zusammengefasst werden. Die CVS werden verwendet, um die Qualität und Stabilität der Kalibrationskurven jedes Durchlaufs zu verifizieren.
20 ml der in den anfänglichen Schritten nach der Hydrolyse der Probe erhaltenen Hydrolyse-Flüssigkeit werden in einen 50 ml-Erlenmeyer-Kolben überführt. Es wird Calciumcarbonat zugegeben, um die Probe auf einen pH-Wert von 5–6 zu neutralisieren, und nach dem Absetzen der Lösung kann der Überstand dekantiert werden. Nach dem Absetzen hat die Lösung einen annähernd neutralen pH-Wert.
Die Zucker-Kalibrationsstandards (sugar calibration standards, CVS) und die Proben können nun auf einer Shodex Zucker SP0810-(Phenomenex) oder einer AMinex HPX-87P-Säule (BioRad), die mit der geeigneten Schutzsäule ausgestattet ist, mittels HPLC analysiert werden.
Das Probeninjektionsvolumen sollte in Abhängigkeit von der Konzentration und den Nachweisgrenzen zwischen 10 und 50 μl liegen. Die Proben werden mit doppelt destilliertem Wasser bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,6 ml/min und einer Säulentemperatur von 80°C eluiert. Die Probenelution kann am Besten mit der Messung des Brechungsindexes überwacht werden.
Die Chromatogramme sollten vor der Analyse integriert werden, und die einzelnen Zuckergehalte sollten unter Bezugnahme auf die geeigneten Standardkurven für jeden Saccharidbestandteil bestimmt werden.
Enzymsysteme
Bei den hier beschriebenen Ausführungsformen werden die Spezifizitäten der eingesetzten Enzymgemische angepasst, um reine monomere Produktströme (definierte(n) monomere(n) oder polymere(n) Baustein(e)) aus unterschiedlichen polymeren Substratklassen zu erhalten.
Bei einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform dürfen Enzymsysteme, die bei einem bestimmten polymeren Ausgangsmaterial angewendet werden, nicht mehr als 50% andere enzymatische Aktivitäten enthalten, die zu einem anderen als dem bevorzugten Produkt aus dem bestimmten polymeren Substrat führen.
Bei einer stärker bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform dürfen Enzymsysteme, die bei einem polymeren Substrat eingesetzt werden, nicht mehr als (oder weniger als) 20%, vorzugsweise nicht mehr als (oder weniger als) 10%, insbesondere bevorzugt nicht mehr als (oder weniger als) 5%, und ganz insbesondere bevorzugt nicht mehr als (oder weniger als) 2%, und am meisten bevorzugt nicht mehr als (oder weniger als) 1% andere Enzymaktivitäten enthalten, die zu einem anderen als dem bevorzugten Produkt aus dem bestimmten polymeren Substrat führen.
Der Prozentsatz anderer enzymatischer Aktivitäten kann unter Verwendung von Standardverfahren zur Bestimmung der jeweiligen Enzymaktivität routinemäßig bestimmt werden. Die in dem Enzymsystem anwesende enzymatische "Haupt"aktivität, welche zur Freisetzung des gewünschten monomeren oder polymeren Bausteins aus dem polymeren Substrat führt, sollte daher mindestens 50%, vorzugsweise mindestens 80%, besonders bevorzugt mindestens 90%, besonders bevorzugt mindestens 95%, besonders bevorzugt mindestens 98%, besonders bevorzugt mindestens 99% aller in dem Enzymsystem vorhandenen Enzymaktivitäten betragen.
Die Enzymaktivitäten können mit dem Fachmann bekannten Standardverfahren und wie hier beschrieben bestimmt werden.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform können die vorstehenden Prozentsätze einfach bestimmt werden, indem das polymere Substratmit dem Enzymsystem gemäß Schritt (a), vorstehend, behandelt wird und die freigesetzten monomeren oder oligomeren Bausteine nach der Abtrennung von dem polymeren Substrat gemäß Schritt (b) analysiert werden. Wenn daher die freigesetzten monomeren oder oligomeren Bausteine mehr als 50 Mol-% des bestimmten gewünschten Bausteins umfassen (basierend auf dem Gesamt-Feststoffgehalt), wird angenommen, dass die anderen enzymatischen Aktivitäten in dem Enzymsystem weniger als 50% betragen. Wenn gleichermaßen die freigesetzten monomeren oder oligomeren Bausteine mehr als 80, 90, 95, 98 oder 99 Mol-% des bestimmten gewünschten Bausteins umfassen, wird angenommen, dass die anderen enzymatischen Aktivitäten in dem Enzymsystem weniger als 20, 10, 5, 2 bzw. 1% betragen. Entsprechend wird angenommen, dass die enzymatische "Haupt"aktivität, die in dem Enzymsystem vorliegt und die zur Freisetzung des gewünschten monomeren oder oligomeren Bausteins aus dem polymeren Rohsubstrat führt, in diesem Fall mindestens 50%, vorzugsweise mindestens 80%, besonders bevorzugt mindestens 90%, besonders bevorzugt mindestens 95%, besonders bevorzugt mindestens 98%, besonders bevorzugt mindestens 99% aller in dem Enzymsystem vorliegenden enzymatischen Aktivitäten beträgt. Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird in der vorstehenden Bestimmung des Prozentsatzes der enzymatischen Aktivität(en) "Mol-%" durch "Gew.-%" ersetzt.
Gemäß einer Ausführungsform können die enzymatischen Aktivitäten bestimmt werden, indem die Umwandlungsrate eines ausgewählten polymeren Substrats wie vorstehend definiert bestimmt wird. Gemäß einer alternativen Ausführungsform können die in dem Enzymsystem vorliegenden enzymatischen Aktivitäten bestimmt werden, indem künstliche Substrate verwendet werden. Je nach Durchführ barkeit und Zuverlässigkeit des angewendeten Bestimmungsverfahrens kann entweder die Umwandlung eines Substrates selbst oder die Bildung eines durch die enzymatisch katalysierte Reaktion erhaltenen bestimmten Produktes gemessen werden. In besonderen Fällen können katalytische Zwischenprodukte des Enzyms selbst (z. B. Oxidoreduktasen) spektrophotometrisch gemessen werden.
Die Bestimmung von enzymatischen Aktivitäten in vorgefertigten Enzymgemischen ist dem Fachmann bekannt. Eine Übersicht geeigneter Testverfahren für bestimmte enzymatische Aktivitäten ist aufgeführt unter:
http://www.sigmaaldrich.com/Area of Interest/Biochemicals/Enzyme Explorer/Key Resources/Assay Library/Assays by Enzyme Name.html
Beispiele spezifischer Testverfahren zur Bestimmung der enzymatischen Aktivitäten von bestimmten Enzymklassen sind nachstehend aufgeführt.
In einem bestimmten Fall kann sowohl die Endo- als auch die Exocellulaseaktivität in 0,5 ml eines 50 mM MES-Reaktionspuffers (pH 6), enthaltend 10 mM CaCl₂, 4 mM p-Nitrophenyl-beta-D-cellobiosid und 200 μl einer verdünnten Enzymlösung, gemessen werden. Die Reaktionslösung sollte 30 min. bei 50°C inkubiert werden. Es wird Glycinpuffer (100 mM, pH 4) zugegeben, um die Reaktion zu stoppen. Die enzymatische Aktivität kann dann bestimmt werden, indem die Menge des freigesetzten p-Nitrophenols spektrophotometrisch bei 430 nm gemessen wird. Die Absorptionswerte für p-Nitrophenol werden unter Verwendung einer Standardkurve, die Mikromol Nitrophenol zur Absorption ins Verhältnis setzt, in Mikromol Nitrophenol umgerechnet. Eine Einheit Cellulaseaktivität ist die Menge des Enzyms, die benötigt wird, um 1 μmol Nitrophenol/min unter den Testbedingungen freizusetzen (Wood, T. M. und Bhat, K., 1988).
In einem anderen bestimmten Fall kann die Arabinofuranosidaseaktivität in 1 ml 50 mM Natriumphosphat (pH 7), enthaltend 4-100 μM 4-Nitrophenyl-alpha-L-arabinofuranosid (PNP-Araf) und verdünnte Enzymlösung (4 nM-8 μM) bestimmt werden. Die Reaktionslösung wird bei 37°C inkubiert und die Menge des freigesetzten 4-Nitrophenols bei 400 nm gemessen. Die enzymatische Aktivität kann unter Verwendung des Extinktionskoeffizienten von 4-Nitrophenol (10500 M^–1cm^–1) bei 400 nm berechnet werden (Taylor et al., 2006).
In einem anderen bestimmten Fall kann die Xylosidaseaktivität unter Verwendung von mit o-Nitrophenol substituiertem beta-D-Xylopyranosid (ONP-β-D-Xylopyranosid) als Substrat bestimmt werden (Chen et al., 1986). Es wird eine Stammlösung des Substrats (10 mM) in 100 mM Citratpuffer (pH 5) hergestellt. Die zu testende verdünnte Enzymlösung wird in bidestilliertem Wasser hergestellt. Die Reaktionslösung enthält gleiche molare Mengen an Substrat- und Enzymlösung in 200 mM Boratpuffer bei 25°C und pH 9,8. Um die enzymatische Aktivität zu bestimmen, wird die Freisetzung des o-Nitrophenols spektrophotometrisch bei einer Wellenlänge von 410 nm aufgezeichnet. Die enzymatische Aktivität in Einheiten/mg Enzym ist direkt proportional zu der freigesetzten Menge von o-Nitrophenol und kann wie für die Bestimmung der Cellulaseaktivität beschrieben berechnet werden.
In einem anderen bestimmten Fall wird die Laccaseaktivität unter Verwendung des Guiacol-Oxidations-Assays bestimmt. Es wird eine Stammlösung von 10 mM Guiacol frisch in 50 mM Citratpuffer (pH 4,3, 40°C) hergestellt. Die Reaktion wird in 2 ml 50 mM Citratpuffer unter Verwendung von 10 μl verdünnter Enzymlösung (1–3 nM) und verschiedenen Mengen an Substrat (5–20 μl) durchgeführt. Die Rate der Guiacol-Oxidation wird spektrophotometrisch bei 465 nm gemessen. Die Rate der Guiacol-Oxidation kann unter Verwendung des Extinktionskoeffizienten von 5200 M^–1 cm^–1 für Guiacol-Oxidationsprodukte bestimmt werden (Smirnov et al. 2001).
In einem anderen bestimmten Fall kann die Manganperoxidase (MnP) -Aktivität in 50 mM Tartratpuffer (pH 3, 25°C) gemessen werden, indem 100 μM H₂O₂ einem Reaktionsgemisch, enthaltend 0,5 μM/ml MnP und 5–200 μM Mn² ⁺, zugegeben wird. Die Bildung von Mn³⁺ wird spektrophotometrisch bei 238 nm aufgezeichnet (Kmaitisuji et al., 2005).
Um festzustellen, ob ein bestimmtes Enzymsystem (wie in Tabelle 1 aufgeführt), welches zur Herstellung eines gewünschten Produkts brauchbar ist, unerwünschte Aktivitäten anderer Enzymsysteme (wie in Tabelle 1 aufgeführt) enthält, die ein unterschiedliches, unerwünschtes Produkt aus dem selben oder einem verschiedenen polymeren Substrat erzeugen, kann ein Test für diese Aktivität durchgeführt werden, indem ein spezifisches polymeres Substrat oder ein künstliches Substrat, wie vorstehend beschrieben, und eines der wie vorstehend beschriebenen Verfahren verwendet wird.
Wird beispielsweise vermutet, dass ein bestimmtes Enzymsystem, welches, wie in Tabelle 1 aufgeführt, Cellulasen enthält, unerwünschte Xylosidaseaktivität (wie in Tabelle 1 aufgeführt) enthält, kann zunächst die primäre Cellulaseaktivität bestimmt werden, indem ein künstliches Cellulosesubstrat verwendet und die Menge an Glucose, die nach Zugabe einer bestimmten Menge des Enzymsystems pro Zeiteinheit freigesetzt wird, bestimmt wird. Ist die Cellulaseaktivität der Zusammensetzung bestimmt, kann die Xylosidaseaktivität der gleichen Enzymaufbereitung bestimmt werden, indem das Enzymsystem mit einem künstlichen Xylansubstrat kontaktiert und anschließend die Menge an Xylose, die durch eine bestimmte Menge des Enzyms pro Zeiteinheit freigesetzt wird, gemessen wird. Durch Messung der relativen Umwandlungsraten in einer bestimmten Zeiteinheit mit einer bestimmten Enzymmenge mit Substraten sowohl für Cellulase als auch Xylosidase können die spezifischen Aktivitäten für jede Substratklasse berechnet werden.
Geeignete Substrate für die Bestimmung aller in Tabelle 1 aufgeführten enzymatischen Aktivitäten sind in Tabelle 2 aufgeführt.
Bei einer alternativen Ausführungsform werden zur Bestimmung, ob ein Enzymsystem eine unabhängige Verunreinigung enzymatischer Aktivität enthält, die Komponenten der Präparation mit Verfahren, wie beispielsweise Elektrophorese oder Chromatographie, aufgetrennt. Die einzelnen Bestandteile der Präparation können durch Verwendung spezifischer Verfahren, wie beispielsweise Farbreaktionen oder Detektion von Bestandteilen durch Absorption oder andere, dem Fachmann bekannte Verfahren, bestimmt werden. Die relative prozentuale Verteilung der proteinösen Bestandteile kann unter Verwendung quantitativer Verfahren, wie beispielsweise Densitometrie oder jedes andere gleichwertige, dem Fachmann bekannte Verfahren, in Verbindung mit geeigneten mathematischen Berechnungen bestimmt werden.
Bestimmung der Reihenfolge
Wahlweise können Verfahren zur Vorbehandlung des polymeren Substrats, wie Heißwasser-Extraktion, Niedrigtemperatur-Dampfexplosion, saure Dampfexplosion, Ammoniak-Dampfexplosion oder Ultraschall angewendet werden, um polymere Substrate physikalisch so zu verändern, dass die Oberflächen-Zugänglichkeit von pflanzlichen Fasern erhöht und die Kristallinität der Cellulosefraktion verringert wird (Puls et al., 1985; Ramos et al., 2005; Kinley et al., 2005). Vorzugsweise verändern die vorstehend erwähnten Verfahren die physikalischen Eigenschaften des polymeren Rohsubstrats derart, dass das Substrat für nachfolgende enzymatische Schritte besser aufgeschlossen wird, aber entweder nur begrenzte Mengen oder keine chemischen Bausteine freigesetzt werden.
Wahlweise kann eine Vorbehandlung, wie Heißwasser-Extraktion, Niedrigtemperatur-Dampfexplosion, saure Dampfexplosion, Ammoniak-Dampfexplosion oder Ultraschall eingesetzt werden, um in dem polymeren Rohsubstrat enthaltene lösliche Substanzen zu entfernen, bevor das polymere Rohsubstrat mit einem Enzymsystem kontaktiert wird, um eine Verunreinigung der Produkte des enzymatischen Verfahrensschritts durch in dem Rohsubstrat enthaltene lösliche Substanzen zu vermeiden.
Werden zwei oder mehr Verfahrensschritte nacheinander angewendet, hängt die Reihenfolge dieser Verfahrensschritte und daher die Reihenfolge der Zugabe der Enzymgemische, wie in Tabelle 1 beschrieben, von der spezifischen Zusammensetzung des verwendeten polymeren Rohsubstrats ab. Die Reihenfolge der Verfahrensschritte und Enzymsysteme wird so gewählt, dass Menge und Kosten der katalytischen Enzyme und die Kontaktzeit mit dem Substrat, welche zur Freisetzung der gewünschten Produkte führt, minimiert werden. Zusätzlich gewählte Schritte in dem Verfahren sollten sowohl die Reinheit als auch den Ertrag der aus dem polymeren Substrat freigesetzten monomeren oder oligomeren Reaktionsprodukte optimieren. Die Reihenfolge der Verfahrensschritte ist daher abhängig von dem Ausgangsmaterial und dem Produkt.
Die spezifische Reihenfolge der enzymatischen Behandlungen, die zum Abbau eines bestimmten Substrats in seine Bestandteile notwendig ist, kann empirisch bestimmt werden, auch wenn die Zusammensetzung des Substrats unbekannt ist. Es ist daher möglich, das polymere Rohsubstrat in getrennten Behandlungsschritten mit einer Anzahl von Enzymgemischen verschiedener Produkte, wie sie in Tabelle 1 aufgeführt sind, zu zerlegen. Nach jedem der Behandlungsschritte wird die Reinheit und die Zusammensetzung des erhaltenen Produktstroms durch Verwendung dem Fachmann bekannter analytischer Verfahren, umfassend, aber nicht beschränkt auf spektroskopische und chromatographische Verfahren, wie sie vorstehend bei der Analyse der Zusammensetzung des Substrats und der Bestimmung der enzymatischen Aktivität beschrieben wurden, bestimmt.
Anhand der Ergebnisse dieser Messungen ist es dann möglich, das kinetisch bevorzugte Enzymgemisch auszuwählen, das als erster Behandlungsschritt des Ausgangsmaterials zum reinsten Produktstrom führt. Nach wiederholtem Waschen der unlöslichen Rückstände, die nach dieser bestimmten enzymatischen Behandlung verbleiben, werden die Rückstände mit einem anderen Enzymgemisch behandelt, außer mit dem Enzymgemisch, welches für die erste Behandlung ausgewählt wurde. Bei allen diesen enzymatischen Behandlungen wird die Zusammensetzung des erhaltenen Produkts mit den vorstehend beschriebenen Verfahren bestimmt. Das Enzymgemisch, das zum reinsten Produktstrom führt, wird als zweiter Behandlungsschritt für das bestimmte Substrat ausgewählt. Das nach dem zweiten Verfahrensschritt verbleibende unlösliche Material wird wiederum gründlich gewaschen und abermals mit allen verbleibenden Enzymsystemen getestet, wie vorstehend beschrieben. Dieses Verfahren der analytischen Bestimmung und Auswahl der reinsten Produktströme, die mit jedem der verbleibenden Enzymgemische aus Tabelle 1 erhalten werden, wird wiederholt, bis das Ausgangsmaterial entweder vollständig abgebaut ist oder die unlöslichen Rückstände des Ausgangsmaterials, die nach wiederholten enzymatischen Behandlungen verbleiben, im Vergleich zu den Kosten weiterer Behandlungsmöglichkeiten keinen großen ökonomischen Gewinn mehr erzielen.
Als weitere Möglichkeit wird die Zusammensetzung des Substrats mit den vorstehend erwähnten analytischen Verfahren bestimmt, bevor die Reihenfolge der enzymatischen Behandlungsmöglichkeiten gewählt wird. Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die einzusetzenden Enzymsysteme und die Reihenfolge ihres Gebrauchs daher bestimmt, indem zunächst das polymere Rohsubstrat analysiert wird.
Eine bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsform richtet sich auf ein Verfahren insbesondere zur Bestimmung der zu verwendenden Enzymsysteme und deren Reihenfolge, wobei das polymere Rohsubstrat

(a) zuerst in getrennten enzymatischen Behandlungen mit jedem einer Vielzahl von Enzymsystemen(-gemischen), wie sie in Tabelle 1 aufgeführt sind, behandelt wird;
(b) für jede enzymatische Behandlung die definierten monomeren oder oligomeren Bausteine, die aus dem polymeren Rohsubstrat freigesetzt werden, auf Reinheit der definierten monomeren oder polymeren Bausteine untersucht werden, vorzugsweise nach der Abtrennung der (löslichen) definierten monomeren oder oligomeren Bausteine von dem (unlöslichen) polymeren Rohsubstrat;
(c) das Enzymsystem, das zur höchsten Reinheit führt, für den ersten enzymatischen Behandlungsschritt gemäß Schritt a) von Anspruch 1 ausgewählt wird;
(d) wahlweise die Reihenfolge der Schritte a. bis c. mit dem Rückstand des polymeren Rohsubstrats wiederholt wird, um das Enzymsystem für den folgenden enzymatischen Behandlungsschritt zu bestimmen.

Nach einer alternativen Ausführungsform werden ausgewählte Enzymgemische, wie sie in Tabelle 1 aufgeführt sind, verwendet, die den Bestandteil des Substrats angreifen, welcher den größten Massenanteil an der Zusammensetzung des Substrats hat. Nach der enzymatischen Behandlung muss die Reinheit des erhaltenen Produktstroms, wie vorstehend bei der analytischen Bestimmung der Bestandteile des Substrats beschrieben, bestimmt werden. Nach einer bevorzugten Ausführungsform ist es erwünscht, dass die Reinheit so hoch ist, dass mehr als 75 Gew.-%, vorzugsweise mehr als 90 Gew.-%, besonders bevorzugt mehr als 95 Gew.-%, besonders bevorzugt mehr als 99 Gew.-% des Gesamt-Feststoffgehalts (vorzugsweise der löslichen Fraktion) aus den definierten monomeren oder oligomeren Bausteinen bestehen.
Wenn der enzymatische Abbau des Bestandteils des Substrats mit dem höchsten Massenanteil zu einem reinen Produktstrom (wie vorstehend definiert) führt, kann diese Behandlung als erster Schritt für die Bearbeitung des Substrats angewendet werden. Durch Waschen der erhaltenen unlöslichen Pulpe und anschließende Abtrennung der Partikel von dem Überstand werden die nächsten Verfahrensschritte vorbereitet. Die nach der ersten Behandlung des Substrats verbleibenden Rückstände werden mit spezifischen Enzymsystemen, wie den in Tabelle 1 aufgeführten Enzymsystemen, behandelt, welche den Bestandteil des Substrats angreifen, der den zweitgrößten Massenanteil an der Zusammensetzung des Substrats hat. Der erhaltene Produktstrom muss abermals mit den genannten analytischen Verfahren analysiert werden, um die Produktreinheit zu bestimmen, bevor die ausgewählte enzymatische Behandlung für die zweite enzymatische Behandlung des Substrats ausgewählt werden kann. Die erhaltenen unlöslichen Rückstände aus der zweiten enzymatischen Behandlung werden dann gewaschen und wie vorstehend beschrieben verarbeitet. Durch wiederholte Behandlungen mit den in Tabelle 1 aufgeführten spezifischen Enzymsystemen, welche immer den Bestandteil des Substrats angreifen, der den größten Massenanteil an dem verbleibenden unlöslichen Rückstand des Substrats hat, der durch die vorhergehenden enzymatischen Behandlungszyklen erhalten wird, kann das Substrat schrittweise in die Einheiten seiner Bestandteile abgebaut werden.
Ein weiterer bevorzugter Aspekt der Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren insbesondere zur Bestimmung der zu verwendenden Enzymsysteme und ihre Reihenfolge, wobei das polymere Rohsubstrat

(a) zunächst in getrennten enzymatischen Behandlungen mit jedem einer Vielzahl von Enzymsystemen(-gemischen), wie sie in Tabelle 1 aufgeführt sind, behandelt wird, um die monomeren oder oligomeren Bausteine zu bestimmen, die den größten Massenanteil an der Zusammensetzung des polymeren Rohsubstrats darstellen;
(b) die definierten monomeren oder oligomeren Bausteine, die den größten Massenanteil an dem polymeren Rohsubstrat darstellen, auf Reinheit untersucht werden, vorzugsweise nach der Trennung von dem polymeren Rohsubstrat;
(c) falls die bestimmte Reinheit ergibt, dass mehr als 75 Gew.-%, vorzugsweise mehr als 90 Gew.-%, besonders bevorzugt mehr als 95 Gew.-%, besonders bevorzugt mehr als 99 Gew.-% des Gesamt-Feststoffgehalts aus den definierten monomeren oder oligomeren Bausteinen besteht, das betreffende Enzymsystem für den ersten enzymatischen Behandlungsschritt gemäß Schritt a) von Anspruch 1 ausgewählt wird;
(d) falls die nach Schritt b) bestimmte Reinheit niedriger als die nach Schritt c) erforderliche Reinheit ist, die definierten monomeren oder oligomeren Bausteine, die den nächstgrößten Massenanteil an dem polymeren Rohsubstrat darstellen, auf Reinheit untersucht werden, vorzugsweise nach der Abtrennung von dem (unlöslichen) polymeren Rohsubstrat, bis eine Reinheit die Forderungen nach Schritt c) erfüllt und das betreffende Enzymsystem für den ersten enzymatischen Behandlungsschritt gemäß Schritt a) von Anspruch 1 ausgewählt wird;
(e) wahlweise die Reihenfolge der Schritte (a) bis (d) mit dem Rückstand des polymeren Rohsubstrats wiederholt wird, um das Enzymsystem zu bestimmen, das bei dem anschließenden enzymatischen Behandlungsschritt eingesetzt wird.

Ein weiterer bevorzugter Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren, insbesondere zur Bestimmung der zu verwendenden Enzymsysteme und ihrer Reihenfolge, wobei das polymeren Rohsubstrat

(a) zunächst in getrennten enzymatischen Behandlungen mit jedem einer Vielzahl von Enzymsystemen(-gemischen), wie sie in Tabelle 1 aufgeführt sind, behandelt wird, um die enzymatische Behandlung zu bestimmen, welche zum höchsten Ertrag an monomeren oder oligomeren Bausteinen führt, welche in dem polymeren Rohsubstrat enthalten sind;
(b) die enzymatischen Behandlungen ausgewählt werden, die zu einem definierten monomeren oder oligomeren Produkt mit einer Reinheit von mehr als 75 Gew.-%, vorzugsweise mehr als 90 Gew.-%, besonders bevorzugt mehr als 95 Gew.-%, besonders bevorzugt mehr als 99 Gew.-% der Gesamt-Feststoffe führen (vorzugsweise nach der Abtrennung von dem unlöslichen polymeren Rohsubstrat);
(c) unter den verbleibenden enzymatischen Behandlungen die Behandlung mit dem höchsten Ertrag an monomeren oder oligomeren Bausteinen bestimmt wird;
(d) wahlweise die Reihenfolge der Schritte (a) bis (c) mit dem Rückstand des polymeren Rohsubstrats wiederholt wird, um das Enzymsystem zu bestimmen, das bei dem anschließenden enzymatischen Behandlungsschritt eingesetzt wird.

Wie vorstehend erwähnt, sollten nach einem bevorzugten Aspekt der Erfindung die eingesetzten Enzymsysteme nur einen geringen Gehalt an verunreinigenden enzymatischen Aktivitäten haben, die andere als die beabsichtigten monomeren oder oligomeren Bausteine aus dem polymeren Rohsubstrat freisetzen, oder vollständig frei davon sein.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform enthält das in einem bestimmten enzymatischen Behandlungsschritt eingesetzte Enzymsystem nicht mehr als 50%, vorzugsweise nicht mehr als 20%, besonders bevorzugt nicht mehr als 10%, besonders bevorzugt nicht mehr als 5%, besonders bevorzugt nicht mehr als 2%, besonders bevorzugt nicht mehr als 1% verunreinigender (anderer) enzymatischer Aktivitäten, die nicht in einem vorhergehenden enzymatischen Behandlungsschritt bei Verwendung eines unterschiedlichen Enzymsystems eingesetzt wurden, oder die zur Freisetzung von anderen definierten monomeren oder oligomeren Bausteinen, die nicht in vorhergehenden enzymatischen Behandlungsschritten freigesetzt wurden, führen, oder die, nach einer weiteren Ausführungsform, nur zur Freisetzung von Produkten aus polymeren Substraten führen, die ursprünglich in dem polymeren Ausgangsmaterial nicht im Wesentlichen vorhanden sind. Der Prozentsatz der anderen oder verunreinigenden enzymatischen Aktivitäten in dem Enzymsystem kann wie vorstehend erläutert berechnet werden. Nach einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet "im Wesentlichen nicht anwesend" weniger als 20 Gew.-%, vorzugsweise weniger als 10 Gew.-%, vorzugsweise weniger als 5 Gew.-%, vorzugsweise weniger als 2 Gew.-%, vorzugsweise weniger als 1 Gew.-% des gesamten polymeren Substrats.
Nach einer vorteilhaften und bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält das bei einem bestimmten enzymatischen Behandlungsschritt eingesetzte Enzymsystem als verunreinigende enzymatische Aktivitäten eine oder mehrere solche enzymatische Aktivitäten, wie sie in einem vorhergehenden enzymatischen Behandlungsschritt unter Verwendung eines unterschiedlichen Enzymsystems eingesetzt wurden, oder, nach einer weiteren Ausführungsform, Enzymsysteme, die nur zur Freisetzung von anderen monomeren oder oligomeren Bausteinen aus polymeren Substraten führen können, die ursprünglich in dem polymeren Rohsubstrat im Wesentlichen nicht vorhanden sind. Mit anderen Worten wurde gefunden, dass, wenn ein bestimmter monomerer oder oligomerer Baustein aus dem polymeren Rohsubstrat zuvor in einem vorhergehenden enzymatischen Behandlungsschritt freigesetzt wurde (oder von Anfang an in dem polymeren Rohsubstrat nicht vorhanden war), es nicht wesentlich ist, dass das in einem anschließenden Schritt verwendete Enzymsystem im Wesentlichen frei von derjenigen enzymatischen Aktivität ist, die als Hauptaktivität in einem der vorhergehenden enzymatischen Behandlungsschritte verwendet wurde. Ein Vorteil dieser Ausführungsform ist, dass weniger reine und daher weniger kostenintensive Enzymsysteme für den zweiten und die nachfolgenden enzymatischen Behandlungsschritte verwendet werden können.
In einem spezifischen Fall eines solchen Verfahrens wird die enzymatische Umwandlung von Xylan in Xylose in einem Verfahrensschritt nach der enzymatischen Verarbeitung von Cellulose mit anschließender Entfernung des Produktes Glucose in einem vorhergehenden Verfahrensschritt durchgeführt. Entsprechend können die Enzymgemische in Tabelle 1, die der Verarbeitung von Xylan zu Xylose dienen, auch verunreinigende enzymatische Aktivitäten enthalten, die spezifisch für die Verarbeitung von Cellulose sind.
Zusätzlich können nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung Enzymsysteme, die zur Verarbeitung eines bestimmten Bestandteils des polymeren Rohsubstrats verwendet werden, verunreinigende (andere) enzymatische Aktivitäten enthalten, wenn diese auf bestimmte Reaktions-Zwischenprodukte wirken, die in früheren enzymatischen Reaktionen erhalten wurden, und wenn die Endprodukte identisch sind. Mit anderen Worten betrifft eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ein Verfahren, bei dem das Enzymsystem, das in einem bestimmten enzymatischen Behandlungsschritt verwendet wird, eine enzymatische Hauptaktivität (wie vorstehend beschrieben) und mindestens eine zusätzliche enzymatische Aktivität aufweist, die zu den gleichen definierten monomeren oder oligomeren Bausteinen aus dem polyme ren Rohsubstrat wie die enzymatische Hauptaktivität des Enzymsystems führt, insbesondere ausgehend von einem unterschiedlichen polymeren Substrat, das in dem polymeren Rohsubstrat vorhanden ist.
In einem bestimmten Fall enthält das polymere Rohsubstrat sowohl Cellulose und Stärke (Amylose), und das Zielprodukt in dem betreffenden Verfahrensschritt ist Glucose. Hier kann die Verunreinigung eines Enzymgemischs, welches in Tabelle 1 für die Umwandlung von Cellulose (Cellulaseaktivität) mit begleitenden Nebenaktivitäten für die Umwandlung von Stärke (Amylaseaktivität) aufgeführt ist, toleriert werden. Das Enzymsystem darf daher keine anderen Enzymaktivitäten oberhalb eines bestimmten Verhältnisses, außer Amylaseaktivitäten, enthalten. Hier können sich die Edukte für die unterschiedlichen enzymatischen Reaktionen unterscheiden, aber das Produkt ist in beiden Fällen Glucose.
In dem bevorzugten Fall müssen die angewendeten Enzymgemische im Wesentlichen frei von spezifischen Enzymaktivitäten sein, die eine Verunreinigung des erhaltenen Produktstroms bewirken könnten.
In einem weiteren spezifischen Fall ist Glucose das Zielprodukt, das polymere Rohsubstrat enthält Cellulose als polymeres Substrat (z. B. Weizenstroh), und es wird ein Enzymgemisch von Cellulasen eingesetzt. Brauchbare Enzymgemische sind in Tabelle 1 angeführt. Derartige Cellulasegemische können in Verbindung mit β-Glycosidasen, Glucohydrolasen und alpha- oder beta-Amylasen eingesetzt werden, wie in Tabelle 1 aufgelistet, um die Cellulosefraktion des polymeren Rohsubstrats in monomere Glucoseeinheiten umzuwandeln. Um einen reinen Produktstrom an Glucose zu erhalten, muss das der Cellulosefraktion zugesetzte Enzymgemisch frei von jeglicher Hemicellulaseaktivität sein, welche umfasst, ohne darauf beschränkt zu sein, Enzymaktivitäten der Arabinofu ranosidase, Arabinase, Galactosidase, Mannanase, Mannanosidase, Xylanase und Xylosidase. Bei diesem enzymatischen Verfahren wird die polymere Cellulose in lösliche Glucoseeinheiten umgewandelt, welche physikalisch von dem unlöslichen Ausgangsmaterial getrennt werden kann, wie vorstehend beschrieben ist. Das verbleibende unlösliche Material kann weiter verarbeitet werden, um verschiedene Pentosezucker aus der Hemicellulosefraktion zu erzeugen.
In einem weiteren spezifischen Fall sind Arabinose und Xylose die Zielprodukte, das polymere Rohsubstrat enthält polymere Substrate, u. a. heterogene Hemicellulosepolymere wie Arabinoxylan, und es wird ein Enzymgemisch, welches in Tabelle 1 zur Umwandlung und Mobilisation von verzweigten Arabinoseeinheiten angeführt ist, zuerst eingesetzt. Anschließend werden die löslichen Arabinoseeinheiten von dem verbleibenden unlöslichen Substrat getrennt, bevor ein zweites Enzymgemisch, welches in Tabelle 1 zur Mobilisation der in Xylanpolymeren enthaltenen Xyloseeinheiten angeführt ist, eingesetzt. Die löslichen Xyloseeinheiten werden dann ebenfalls von dem verbleibenden unlöslichen Substrat abgetrennt.
Enzymatische Verfahrensschritte können mit physikalisch-chemischen Verfahrensschritten kombiniert werden. Solche physikalisch-chemischen Verfahrensschritte können entweder unselektiv sein, um Bestandteile mit geringem kommerziellen Wert zu extrahieren, die anderenfalls hochwertige Produktströme aus dem Verfahren verunreinigen würden. Nach einer Ausführungsform werden daher ein oder mehrere physikalisch-chemische Verfahrensschritte durchgeführt, um definierte Bestandteile zu extrahieren oder anders zu entfernen. Alternativ können selektive physikalisch-chemische Verfahrensschritte verwendet werden, die beim Aufschluss individueller chemischer Bestandteilen des polymeren Rohsubstrats eine vergleichbare Selektivität zu enzymatischen Verfahrensschritten bereitstellen. Nach einer Ausführungsform werden daher ein oder mehrere physikalisch-chemische Verfahrensschritte verwendet, um die Selektivität nachfolgender enzymatischer Behandlungsschritte zu erhöhen. Beispiele solcher Verfahrensschritte sind der Aufschluss der Ligninfraktion von LCB durch organische Lösungsmittel, wie Ethanol oder Glycerin (Itoh et al., 2003; Demirbas, A., 1998). Diese einzelnen Verfahrensschritte und Bedingungen sind dem Fachmann bekannt. In einer zusätzlichen Alternative werden die beschriebenen unselektiven physikalisch-chemischen Verfahrensschritte auf unlösliche Rückstände angewendet, die in vorhergehenden selektiven Verfahrensschritten von Verunreinigungen befreit wurden. Ein Beispiel für einen derartigen Verfahrensschritt ist die vollständige Hydrolyse der Proteinfraktion durch Säurebehandlung nach selektivem Aufschluss der Hemicellulose-, Cellulose- und Ligninfraktionen von LCB durch die vorstehenden selektiven Verfahrensschritte.
Ein weiteres spezifisches Beispiel für eine Ausführungsform der Erfindung ist in 1 gezeigt. 1 zeigt daher ein Fließdiagramm für die schrittweise enzymatische Verarbeitung von LCB.
Bei der in 1 gezeigten Darstellung der Verarbeitung eines Substrats mit hohem Gehalt an Cellulose, Hemicellulose und Lignin und mit geringen Mengen an Proteinen und Lipiden, wie Weizenstroh, Maisstroh oder Weichholz, wird der Aufschluss der verschiedenen Pentosebestandteile, die in der Hemicellulosefraktion enthalten sind, durch schrittweise Behandlung mit Xylanase-, Arabinase- und Mannase-Enzymen erreicht, welche spezifisch Xylose-, Arabinose- bzw. Mannosezucker freisetzen. Geeignete Enzyme und Verfahrensbedingungen, um optimale Verfahrensbedingungen für die Enzyme bereit zu stellen, sind dem Fachmann bekannt. Die lösliche Fraktion wird nach jedem Verfahrensschritt entfernt und die unlöslichen Bestandteile mit dem nachfolgenden Enzym behandelt. Nach der Verarbeitung der Pentosefraktion wird ein ähnlicher Verfahrensschritt angeschlossen, um Cellulose in Glucose umzuwandeln, indem ein Gemisch von Exo- und Endocellulasen, wahlweise in Kombination mit Cellobiase oder β-Glucosidase verwendet wird, um Glucose und Cellobiose aus der Cellulosefraktion des LCB-Substrats freizusetzen. Diese löslichen Reaktionsprodukte werden mit dem Überstand aus dem Reaktionsgemisch entfernt. In ähnlicher Weise wird die in der unlöslichen Phase verbleibende Ligninfraktion in ihre verschiedenen phenolischen Bausteine unter Verwendung spezifischer Enzymsysteme umgesetzt, wie beispielsweise durch Laccasen und Ligninperoxidasen. Diese phenolischen und oligophenolischen Verbindungen werden dann mit dem Überstand oder durch Lösungsmittelextraktion aus dem Reaktionsgemisch extrahiert. Die Bedingungen zur Durchführung dieses Verfahrensschritts sind dem Fachmann bekannt. Jedes der einzelnen Produkte, die bei der enzymatischen Umwandlung von Hemicellulose, Cellulose oder Lignin oder anderen LCB-Bestandteilen entstehen, kann nach jeder aufeinander folgenden Enzymanwendung isoliert werden (siehe 1). Die erhaltenen, im Wesentlichen reinen chemischen Bausteine an phenolischen Substanzen, Pentose- und Hexosezuckern können dann zu hochwertigen kommerziellen Produkten weiter verarbeitet werden (siehe 1). Im Allgemeinen werden nach einer Ausführungsform die definierten monomeren oder oligomeren Bausteine, die aus dem polymeren Rohsubstrat freigesetzt werden, aufgereinigt und wahlweise weiter verarbeitet.
In einer weiteren Darstellung werden landwirtschaftliche Rückstände, die reich an Proteinen und Lipiden sind, wie Rückstände aus der Produktion von Rapskeim-, Sonnenblumen- oder Olivenölen, anschließend mit den vorstehenden Hemicellulasen und Cellulasen und wahlweise Pektinasen kontaktiert, gefolgt von einer Kontaktierung der Rückstände dieser Verfahrensschritte mit einer unspezifischen Protease. Solche unspezifischen Proteasen sind dem Fachmann bekannt und können in großem Maßstab hergestellt werden. Die Proteasebehandlung löst Aminosäuren und Peptide aus dem komplexen Ausgangsmaterial. Diese Aminosäuren und Peptide können anschließend als Gemisch verwendet oder durch dem Fachmann bekannte Verfahren in individuelle Substanzen getrennt werden.
In einem Fall sind die Zielprodukte Arabinose, Xylose, Glucose, Oligophenylpropanoide, Monolignole und/oder monophenolische Substanzen, und diese Produkte werden durch sequentielle enzymatische Umwandlung des polymeren Rohsubstrats Weizenstroh in seine Bestandteile hergestellt.
Im ersten Schritt eines solchen schrittweisen Verfahrens wird fein gemahlenes Weizenstroh (1 kg Gewicht, 0,2 μm) mit einem Feuchtigkeitsgehalt von etwa 5 Gew.-% in einen Stahlbehälter gebracht. Es werden mindestens 2 l Wasser zugesetzt und mit dem Substrat vermischt. Die erhaltene Slurry wird 4 h bei Raumtemperatur eingeweicht. Überschüssige Flüssigkeit wird bis auf etwa 200 ml der Lösung entfernt. Der Behälter wird abgedichtet und bei 10 bar Druck 1 h auf 121°C in einem herkömmlichen Autoklavensystem zur Sterilisierung erhitzt (Puls et al., 1985; Harms, 1989, Foody et al., 1998). Der Druck im Behälter wird schnell abgelassen und der Inhalt auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Unter diesen Bedingungen nimmt der Polymerisationsgrad der Bestandteile des Substrats ab, aber nur eine kleine Fraktion seiner Bestandteile wird in löslicher Form freigesetzt. Die erhaltene flüssige Phase (enthaltend Salze und kleine Mengen verschiedener löslicher Bestandteile) und die unlösliche Phase (enthaltend unlösliche polymere Substrate, wie Cellulose, Hemicellulose und Lignin) wird durch Filtration, Sieben oder Zentrifugation getrennt, und die unlösliche Phase wird weiter verarbeitet.
Im nächsten Schritt wird ein Gemisch von alpha-L-Arabinofuranosidasen eingesetzt, um die in der unlöslichen Hemicellulosefraktion enthaltenen Arabinosebestandteile freizusetzen. Alle der nachstehend beschriebenen Reaktionen werden über 24 h bei einem Minimum von 40°C in 50 mM Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 5–7 durchgeführt. 0,08–1 g GH51 alpha-L-Arabinofuranosidase aus Clostridium thermocellum/kg Ausgangsmaterial werden zugesetzt, um die alpha-1,2/1,3-Arabinofuranosylgruppen von Arabinan und Xylan zu hydrolysieren (Taylor et al., 2006). Anschließend werden 0,08–1 g GH43 alpha-L-Arabinofuranosidase aus Humicola insolens/kg Ausgangsmaterial zugesetzt, um die alpha-1,5-Arabinofuranosyleinheiten zu hydrolysieren (Sorensen et al., 2006). Aufgrund der Spezifität des Enzymgemischs enthält die resultierende flüssige Phase hauptsächlich Arabinose. Die freigesetzten und löslichen Arabinoseeinheiten werden von der unlöslichen Pulpe durch Filtration oder Zentrifugation abgetrennt. Die verbleibende unlösliche Fraktion wird zur weiteren Verarbeitung zurück behalten.
Im nächsten Schritt wird ein Gemisch von Xylanasen und Xylosidasen eingesetzt, um die unlöslichen Xylanbestandteile in lösliche Xyloseeinheiten umzusetzen. Alle diese Reaktionen werden über 24 h bei einem Minimum von 40°C in 50 mM Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 5–7 durchgeführt. 0,08–1 g endo-1,4-beta-Xylanase (GH 10 oder 11) aus Humicola insolens/kg Ausgangsmaterial und 0,08–1 g beta-Xylosidase (GH 3) aus Trichoderma reesei/kg Ausgangsmaterial werden zugesetzt, um Xylo-Oligosaccharide bzw. Xylanoseeinheiten freizusetzen. Aufgrund der Spezifität des Enzymgemischs enthält die resultierende flüssige Phase hauptsächlich Xylose. Die lösliche Xylose wird von der unlöslichen Pulpe durch Filtration oder Zentrifugation getrennt.
Im nächsten Schritt werden die unlöslichen Bestandteile mit einem optimierten Enzymgemisch, enthaltend Endo- und Exocellulasen, versetzt, um die in der Hemicellulose- und Cellulosefraktion verbleibenden Hexosezucker zu mobilisieren. Alle Reaktionen werden über 16 h bei einem Minimum von 50°C in 50 mM Natriumacetatpuffer (pH 5–6) durchgeführt. Gemische von jeweils 0,005–1 g 1,4-beta-Endoglucanasen (Cel5A, Cel7B, Cel12A, Cel61A) und 1,4-beta-Cellobiohydrolasen (Cel7A, Cel6A) aus Trichoderma reesei/kg unlöslichem Ausgangsmaterial werden zugesetzt, um die Hexosezucker zu mobilisieren (Irwin et al., 1993; Kim et al., 1998).
Die Effizienz und Kinetik der Umwandlung von Cellulose in monomere Zuckereinheiten kann wahlweise durch Zugabe von 0,0005–0,01 g Cellobiose-Dehydrogenase aus Phanerocaete chrysosporium in Kombination mit 0,05–1 g Ferrocyanid und 0,0005–0,1 g β-Glycosidase (10 Gew. Enzymgemisch) aus Aspergillus niger/kg Ausgangsmaterial (Igarashi et al., 1998; Rosgaard et al., 2006) gesteigert werden. Aufgrund der Spezifität des Enzymgemischs enthält die resultierende flüssige Phase hauptsächlich Hexosen, vorwiegend Glucose. Diese werden weiter durch Filtration oder Zentrifugation von den feinen teilchenförmigen Rückständen des verbleibenden Substrats getrennt.
Im nächsten Schritt wird das nach vorhergehenden Enzymbehandlungen verbleibende unlösliche Lignin durch sequentiellen Kontakt mit Ligninperoxidase- und Laccase-Enzymsystemen in seine Bestandteile zerlegt. Die Reaktionen mit Ligninperoxidase werden in einem Minimum von 50 mM Natriumtartrat (pH 3,5) bei einer maximalen Temperatur von 32°C durchgeführt. Hochpolymere unlösliche Lignine werden durch Kontaktieren mit jeweils 0,5–1 g Ligninperoxidase (LIP) aus Phanerocaete chrysosporium/kg Ausgangsmaterial (Ward et al., 2003) oxidativ abgebaut. Um die katalytische Inaktivierung von LIP (Bildung von Komponente III; Wariishi und Gold, 1990) durch einen vorhandenen Überschuss an H₂O₂ im Reaktionsgemisch zu vermeiden, wird ein H₂O₂-erzeugendes lösliches enzymatisches System verwendet, um eine kontrollierte und kontinuierliche Umgebung der H₂O₂-Bildung bereit zu stellen. Es kann die H₂O₂-Erzeugung durch Glyoxaloxidase (GLOX), ein natürliches Hilfsenzym, welches synergistisch mit Ligninperoxidasen wirkt (Kersten, 1990), eingesetzt werden. Die Reaktion von GLOX benötigt das gleiche Profil an pH, Innenstärke und Temperatur wie für LIP beschrieben. Die Erzeugung von H₂O₂ wird durch Zugabe von 0,05–1 g GLOX und 0,01–1 g des GLOX-Substrats Methylglyoxal/kg Ausgangsmaterial induziert. Um den oxidativen Abbau von polymerem Lignin durch LIP zu induzieren und zu verstärken, wird Verartylalkohol (3,4-Dimethoxybenzylalkohol) als Redox-Mediator bis zur Vervollständigung zugegeben (Ferapontova et al., 2006). Ein wirksamerer Abbau von unlöslichem Lignin kann durch Zugabe von 2 g Verartylalkohol/kg Substrat (Barr et al., 1993) erreicht werden. Die Hauptreaktionsprodukte des LIPkatalysierten oxidativen Abbaus von unlöslichem Lignin sind Oligophenylpropanoide, während Monolignole nur Nebenbestandteile des Produktgemischs darstellen.
Um die Menge an monophenolischen Substanzen in dem Reaktionsgemisch zu erhöhen, wird das mit LIP erhaltene Produktgemisch weiter mit Laccase umgesetzt (d'Acunzo et al., 2002). Die Reaktion wird über 6 h bei einem Minimum von 40°C in 100 mM Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 5–6 durchgeführt. 0,0004 g Laccase aus Trametes versicolor und 0,0005 g 2,2,6, 6-Tetramethylpiperidin-1-yloxy (TEMPO) werden als Reduktionsmittel/kg Substrat zugesetzt (Arias et al., 2003), um Oligophenole zu monophenolischen Lignineinheiten zu oxidieren. Aufgrund der Spezifität des Enzymgemischs enthält die resultierende flüssige Phase hauptsächlich monophenolische Lignineinheiten. Das erhaltene Produktgemisch wird von der verbleibenden Pulpe durch Membranfiltration und einfache Zentrifugation abgetrennt.
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Tabelle 1 Enzymsysteme

Produkt	Polymeres Substrat	Enzymaktivität	Nummer des Enzymgemischs
1-Acylglycerophosphocholin	Phosphatidylcholin	Phospholipase	1
1,5-Anhydro-D-fruktose + D-Glucose	Alpha-Glucan	Exo-alpha-1,4-D-Glucan-Lyase	1
Alkohol + Acetat	Xyloglucan	Acetylesterase	1
	Rhamnogalacturonan
Aminosäuren	Proteine	Protease	1
Arabinose	Arabinan	Arabinofuranosidase	2, 5
	Arabinoxylan	Endo-alpha-1,3-L-Arabinanase	1, 3, 4
	Xyloglucan	Endo-alpha-1,5-L-Arabinanase	1
		Exo-alpha-1,3-L-Arabinanase	1, 2, 3
		Exo-alpha-1,5-L-Arabinanase	1, 2, 5
Cholin	Essigsäureester	Acetylcholinesterase	1, 2
Cholin	Cholinester	Cholinesterase	1, 3
D-Xylonat	Xylono-1,4-Lacton	Xylono-1,4-Lactonase	1
Diacylglycerol	Triglyceridester	Triacylglycerol-Lipase	1
Fucose	Xyloglucan	Endo-alpha-1,2-L-Fucosidase	1, 2
	Xyloglucan	Exo-alpha-1,2-L-Fucosidase	1, 2, 3, 4
	Pektin	Pektinase	1, 3
Galactose	Galactan	Endo-beta-1,4-D-Galactosidase	1
	Galactomannan	Exo-beta-1,4-D-Galactosidase	1, 2
	Xyloglucan
Gallat	Digallat	Acylglycerollipase	1, 3
Gallat	Glycerinmonoester von langkettigen Fettsäuren	Tannase	1, 2
Glucose	Cellulose	Cellulase	1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8
	Glucomannan	Alpha-Amylase	1, 2, 3, 4, 6
	Glucoronoxylan	Beta-Amylase	1, 2, 3, 5, 6
	Xyloglucan	Beta-Glucosidase	1, 2, 3, 4, 6
		Cellobiohydrolase I	1, 3, 4, 6, 7
		Cellobiohydrolase II	2, 3, 4, 6, 8
		Endo-beta-1-4-D-Glucanase	1, 2, 3, 4, 5, 6
		Endoglucanase I	1, 2, 4, 6
		Endoglucanase II	1, 2, 4, 5, 6
		Endoglucanase III	1, 2, 3, 5, 6
		Endoglucanase IV	1, 2, 3, 5, 6
		Endoglucanase V	1, 3, 4, 6
		Endoglucanase VI	1, 3, 4, 6
		Endoglucanase VII	1, 3, 4, 6
		Exo-beta-1,4-D-Glucanase	1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8
		Glucohydrolase	1, 2, 3, 4, 6
	Stärke	Alpha-Amylasen	1, 2
	Stärke	Beta-Amylasen	1, 3
Glycerophosphocholin	2-Lysophosphatidylcholin	Lysophospholipase	1
L-Arabinonat	L-Arabinono-1,4-Lacton	L-Arabinonolactonase	1
Langkettige Alkohole	Wachsester	Wachsester-Hydrolase	1
Langkettige Fettsäuren	Langkettige Fettsäureacylethylester	Fettsäureacylethylester-Synthase	1
Mannose	Galactomannan	Beta-1,4-D-Mannosidase	2
	Mannan	Endo-beta-1,4-D-Mann anase	1
	Mannan	Exo-beta-1,4-D-Mannanase	1, 2, 3
Methanol + Pektat	Pektin	Pektinesterase	1, 2, 3
		Pektindemethoxylase	1
		Pektinmethoxylase	1, 2
Oligolignan, Monolignole, phenolische Verbindungen, Oligophenylpropanoide	Lignin	Laccase(TEMPO)	1, 2, 6
		Ligninperoxidase (Veratrylalkohol) + Glyoxaloxidase (primäre Aldehyde oder Methylglyoxal)	1, 3, 4
		Manganperoxidase (Mn²⁺ organische Säuren)	1, 2, 3, 5
Oligopeptide	Proteine	Aminopeptidase	1, 2, 8
		Carboxypeptidase	1, 3, 8
		Carboxylproteinase	1, 4
		Endopeptidase	1, 4, 5, 6, 7
		Exopeptidase	1, 2, 3, 8
		Metalloproteinase	1, 5
		Serinproteinase	1, 6
		Thiolproteinase	1, 7
Oligosaccharide mit endständigen- 4-Deoxy-alpha-D-galact-4-Enuronosyl-Gruppen	Alpha-1,4-D-Galacturonan	Pektatlyase (alpha-1,4-D-Endopolygalacturonsäure-Lyase)	1
Phytol	Chlorophyll	Chlorophyllase	1
Ribonucleotides	RNA	Endoribonuclease	1, 2, 3
		Exoribonuclease	1, 2, 4, 5
		Ribonuclease	1, 3, 4, 5
Sterol	Sterylester	Sterolesterase	1, 2
Sterol	Sterylester	Triterpenolesterase	1, 3
Xylose	Arabinoxylan	Endo-beta-1,3-D- Xylanase	1, 3, 6
	Glucoronoxylan	Endo-alpha-1,6-D-Xylosidase	1, 2
	Xylan	Endo-beta-1,4-D-Xylanase	1, 2, 3
	Xyloglucan	Exo-alpha-1,6-D Xylanase	1, 2, 7
		Exo-beta-1,3-D-Xylanase	1, 3, 5, 6
		Exo-beta-1,4-D-Xylanase	1, 2, 3, 4
		Xylosidase	1, 2, 3
Beispielhafte Enzymkombinationen für die Erzeugung eines spezifischen Produktes aus einem spezifischen Bestandteil des polymeren Ausgangsmaterials sind einzeln durch Nummern von 1 bis 8 gekennzeichnet.

Tabelle 2

Substrat	Sigma Kat. Nummer	Enzyme	Produkt
Cellulose	C6288	Endocellulase, Exocellulase, β-Glycosidase	Glucose
Cellodextrine	C4642	Endocellulase, Exocellulase, β-Glycosidase	Glucose
β-Methlylumbelliferyl-Oligosaccharide	M6018	Endocellulase, Exocellulase, β-Glycosidase	Glucose
p-Nitrophenol-Oligosa ccharide	N0145	Endocellulase, Exocellulase, β-Glycosidase	Glucose
CMC	C9481	Endocellulase	Oligoscaccharide
Avicel PH-101	11365	Exocellulase	Glucose
4-Nitrophenyl-β-D-Cellobiosid	N5759		Glucose und pNP
Xylan	X4252	Xylanase, Xylanosidase	Xylose
4-Nitrophenyl-β-D-Xylopyranosid	N2132	Cellulase	Xylose und pNP
Mannan aus Hefe	M7504	Mannanase	Mannanosid und Mannose
D-Galacto-D-Mannan aus Ceratonia siliqua	48230	Galactase und Mannanase	Galactose und Mannose
4-Nitropheny-α-L-Arabinofuranoside	N3641	Arabinofucosidase	Arabinose und pNP
2,3-Dimethoxybenzylalkohol (Veratrylalkohol)	38700	Ligninperoxidase (LIP)	Veratrylalcohol-Radikalkation
Lignin, hydrolytisch	371076	Ligninperoxidase (LIP)	Phenylpropanoide
Lignin, organosolv	371017	Ligninperoxidase (LIP)	Phenylpropanoide
2,2'- Azino-bis(3-Ethylbenzo-thiazolin-6-sulfonsäure (ABTS)	A1227	Ligninperoxidase (LIP)	ABTS-Radikalkation
2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzo-thiazolin-6-sulfon säure (ABTS)	A1227	Laccase	ABTS-Radikalkation
Manganchlorid (MnCl₂)	416479	Manganperoxidase (MnP)	Mn³⁺-Ion

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Claims

Verfahren zur enzymatischen Behandlung eines polymeren Rohsubstrats, umfassend die folgenden Schritte: a. Behandlung des polymeren Rohsubstrats mit einem Enzymsystem, um definierte monomere oder oligomere Bausteine aus dem polymeren Rohsubstrat freizusetzen; b. Abtrennung der in Schritt a. erzeugten definierten monomeren oder oligomeren Bausteine von dem Rest des polymeren Rohsubstrats.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das in Schritt a. verwendete Enzymsystem nicht mehr als 50%, vorzugsweise nicht mehr als 20%, besonders bevorzugt nicht mehr als 10%, besonders bevorzugt nicht mehr als 5%, besonders bevorzugt nicht mehr als 2%, besonders bevorzugt nicht mehr als 1% anderer enzymatischer Aktivitäten außer der enzymatischen Aktivität enthält, welche die Freisetzung der definierten monomeren oder oligomeren Bausteine aus dem polymeren Rohsubstrat gemäß Schritt a. bewirkt.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Schritte a. und b. ein- oder mehrmals mit verschiedenen Enzymsystemen wiederholt werden, um andere definierte monomere oder oligomere Bausteine aus dem polymeren Rohsubstrat freizusetzen.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die enzymatische Behandlung in einem wässrigen Medium durchgeführt wird, die aus dem polymeren Rohsubstrat freigesetzten definierten monomeren oder oligomeren Bausteine in dem wässrigen Medium löslich sind und die Abtrennung gemäß Schritt b. in dem wässrigen Medium durch Fest/Flüssig-Trennung der löslichen Bausteine von dem unlöslichen polymeren Rohsubstrat durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die gemäß Schritt a. definierten monomeren oder oligomeren Bausteine ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Glucose, Xylose, Arabinose, Galactose, Mannose, Aminosäuren oder phenolischen Verbindungen oder anderen, in Tabelle 1 aufgelisteten Produkten.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das bei einem bestimmten enzymatischen Behandlungsschritt verwendete Enzymsystem nicht mehr als 50%, vorzugsweise nicht mehr als 20%, besonders bevorzugt nicht mehr als 10%, besonders bevorzugt nicht mehr als 5%, besonders bevorzugt nicht mehr als 2%, besonders bevorzugt nicht mehr als 1% verunreinigender enzymatischer Aktivitäten, die nicht in einem vorhergehenden enzymatischen Behandlungsschritt bei Verwendung eines unterschiedlichen Enzymsystems eingesetzt wurden, oder die zur Freisetzung von anderen definierten monomeren oder oligomeren Bausteinen, die nicht in vorhergehenden enzymatischen Behandlungsschritten freigesetzt wurden, führen, oder die nur zur Freisetzung von Produkten aus polymeren Substraten führen, die ursprünglich in dem polymeren Ausgangsmaterial nicht im Wesentlichen vorhanden sind.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das polymere Rohsubstrat Cellulose und Hemicellulose als polymere Substrate umfasst und das bei einem bestimmten enzymatischen Behandlungsschritt verwendete Enzymsystem Cellulaseaktivität, und wahlweise Beta-Glycosidase-, Glucohydrolase- und/oder Alpha- oder Beta-Amylaseaktivität aufweist, aber im Wesentlichen frei von Hemicellulaseaktivität ist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das bei einem bestimmten enzymatischen Behandlungsschritt verwendete Enzymsystem als verunreinigende enzymatische Aktivitäten eine oder mehrere solche enzymatische Aktivitäten enthält, die in einem vorhergehenden enzymatischen Behandlungsschritt bei Verwendung eines unterschiedlichen Enzymsystems eingesetzt wurden oder die nur zur Freisetzung von Produkten aus polymeren Substraten führen, die ursprünglich in dem polymeren Ausgangsmaterial nicht im Wesentlichen vorhanden sind.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das bei einem bestimmten enzymatischen Behandlungsschritt verwendete Enzymsystem eine erste enzymatische Aktivität aufweist und mindestens eine weitere enzymatische Aktivität hat, welche aus dem polymeren Rohsubstrat die gleichen definierten monomeren oder oligomeren Bausteine wie die erste enzymatische Aktivität des Enzymsystems bewirkt, insbesondere aus einem unterschiedlichen, in dem polymeren Rohsubstrat enthaltenen polymeren Substrat.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das polymere Rohsubstrat vor dem Schritt a. oder vor der Wiederholung des Schritts a. gemäß Anspruch 6 einem selektiven oder nichtselektiven physikalisch-chemischen Behandlungsschritt unterzogen wird.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei der physikalisch-chemische Behandlungsschritt eine Behandlung mit wässrigen Lösungsmitteln, organischen Lösungsmitteln oder jede Kombination oder jedes Gemisch dieser, vorzugsweise mit Ethanol oder Glycerin, umfasst.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die einzusetzenden Enzymsysteme und die Reihenfolge ihres Gebrauchs bestimmt wird, indem zunächst das polymere Rohsubstrat analysiert wird.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei, um die einzusetzenden Enzymsysteme und ihre Reihenfolge zu bestimmen, das polymere Rohsubstrat a. zunächst in getrennten enzymatischen Behandlungen mit jedem einer Vielzahl von Enzymsystemen(-gemischen), wie sie in Tabelle 1 aufgeführt sind, behandelt wird; b. für jede enzymatische Behandlung die definierten monomeren oder oligomeren Bausteine, die aus dem polymeren Rohsubstrat freigesetzt werden, nach der Abtrennung der (löslichen) definierten monomeren oder oligomeren Bausteine von dem (unlöslichen) polymeren Rohsubstrat auf Reinheit der definierten monomeren oder polymeren Bausteine geprüft werden; c. das Enzymsystem, welches die höchste Reinheit erzielt, für den ersten enzymatischen Behandlungsschritt gemäß Schritt a. von Anspruch 1 ausgewählt wird; d. wahlweise die Reihenfolge der Schritte a. bis c. mit dem Rückstand des polymeren Rohsubstrats wiederholt wird, um das Enzymsystem zu bestimmen, welches in dem anschließenden enzymatischen Behandlungsschritt verwendet werden soll.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei, um die einzusetzenden Enzymsysteme und ihre Reihenfolge zu bestimmen, das polymere Rohsubstrat a. zunächst in getrennten enzymatischen Behandlungen mit jedem einer Vielzahl von Enzymsystemen(-gemischen), wie sie in Tabelle 1 aufgeführt sind, behandelt wird, um die monomeren oder oligomeren Bausteine zu bestimmen, die den größten Massenanteil an der Zusammensetzung des polymeren Rohsubstrat darstellen; b. die definierten monomeren oder oligomeren Bausteine, die den größten Massenanteil in dem polymeren Rohsubstrat darstellen, nach der Abtrennung von dem polymeren Rohsubstrat auf Reinheit untersucht werden; c. falls die bestimmte Reinheit ergibt, dass mehr als 75 Gew.-% vorzugsweise mehr als 90 Gew.-%, besonders bevorzugt mehr als 95 Gew.-% besonders bevorzugt mehr als 99 Gew.-% des Gesamt-Feststoffgehalts aus den definierten monomeren oder oligomeren Bausteinen besteht, das betreffende Enzymsystem für den ersten enzymatischen Behandlungsschritt gemäß Schritt a. von Anspruch 1 ausgewählt wird; d. falls die nach Schritt b. bestimmte Reinheit niedriger als die nach Schritt c. erforderliche Reinheit ist, die definierten monomeren oder oligomeren Bausteine, die den nächstgrößten Massenanteil an dem polymeren Rohsubstrat darstellen, nach der Abtrennung von dem (unlöslichen) polymeren Rohsubstrat auf Reinheit untersucht werden, bis eine Reinheit die Forderungen nach Schritt c. erfüllt und das betreffende Enzymsystem für den ersten enzymatischen Behandlungsschritt gemäß Schritt a. von Anspruch 1 ausgewählt wird; e. wahlweise die Reihenfolge der Schritte a. bis a. mit dem Rückstand des polymeren Rohsubstrats wiederholt wird, um das Enzymsystem zu bestimmen, das bei dem anschließenden enzymatischen Behandlungsschritt eingesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei, um die einzusetzenden Enzymsysteme und ihre Reihenfolge zu bestimmen, das polymere Rohsubstrat a. zunächst in getrennten enzymatischen Behandlungen mit jedem einer Vielzahl von Enzymsystemen(-gemischen), wie sie in Tabelle 1 aufgeführt sind, behandelt wird, um die enzymatische Behandlung zu bestimmen, welche zum höchsten Ertrag an monomeren oder oligomeren Bausteinen führt, welche in dem polymeren Rohsubstrat enthalten sind; b. die enzymatischen Behandlungen ausgewählt werden, die ein definiertes monomeres oder oligomeres Produkt mit einer Reinheit von mehr als 75 Gew.-%, vorzugsweise mehr als 90 Gew.-%, besonders bevorzugt mehr als 95 Gew.-%, besonders bevorzugt mehr als 99 Gew.-% der Gesamt-Feststoffe ergeben; c. unter den verbleibenden enzymatischen Behandlungen die Behandlung mit dem höchsten Ertrag an monomeren oder oligomeren Bausteinen bestimmt wird; d. wahlweise die Reihenfolge der Schritte a. bis c. mit dem Rückstand des polymeren Rohsubstrats wiederholt wird, um das Enzymsystem zu bestimmen, das bei dem anschließenden enzymatischen Behandlungsschritt eingesetzt wird.