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Die
Erfindung betrifft eine Vorrichtung zum möglichst universellen
Handling, das heißt für die Aufnahme, die unterschiedlichsten
Behandlungen und zur Aufbewahrung von Proben in μl-Volumina.
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Wesentliche
Bestandteile biologischer Proben, Biomoleküle, Analyte,
sowie wesentliche Analyte sind im Sinne der Erfindung synonym verwendete
Begriffe, insbesondere für diejenigen Bestandteile in zu
untersuchenden Proben, die im Fokus des Interesses des Untersuchers
bzw. Anwenders stehen und zusammen mit der sog. Matrix enthalten
sind. Dies sind beispielsweise Metabolite, Nukleinsäuren,
Peptide, Proteine, Partikel, Zellen, Viren, Mikroorganismen, Sporen,
Markierungsstoffe, Enzymsubstrate oder -Produkte und weitere, sowohl
in ihrer Ganzheit, bzw. Teile davon und/oder Komplexe daraus.
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Unter
Matrix im Sinne der Erfindung werden diejenigen Bestandteile einer
Probe verstanden, die nicht im Fokus des Interesses stehen und die
oftmals Analyseverfahren stören, wie insbesondere das Lösungsmittel und
weitere Begleitstoffe, wie beispielsweise Salze, Detergenzien, Puffer,
Metallionen, Antibiotika und weitere.
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Meistens
unterscheiden sich die wesentlichen Bestandteile einer Probe von
den Matrixbestandteilen durch ihre Größe bzw.
Molekülgröße.
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Biologische
Proben müssen im Verlauf von präparativen und
analytischen Verfahren bezüglich ihrer wesentlichen Bestandteile
vielfältig behandelt werden.
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Solche
Behandlungen sind der Zusatz von Hilfsreagenzien, wie beispielsweise
Harnstoff oder Guanidin zum Denaturieren, Mercaptoethanol oder Dithiotreitol
zum Reduzieren, Jodacetamid zum Modifizieren, Enzyme und deren Cofaktoren
für die selektive Elimination von Modifikationen oder den
selektiven Verdau von wesentlichen Analyten, Substrate zum Nachweis
von enzymatischen Aktivitäten, Inhibitoren zur Unterdrückung
unerwünschter enzymatischer Reaktionen, Capture-Reagenzien
zum Binden unerwünschter Stoffe und andere mehr.
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Häufig
ist es erforderlich, die wesentlichen Bestandteile biologischer
Proben in ein anderes Medium, eine andere Matrix (s. o.), zu bringen,
um die Kompatibilität zu nachfolgenden Reinigungsschritten
bzw. zu Analyseverfahren herzustellen. Da oftmals nur geringe Mengen
von mitunter sehr kostbaren Proben zur Verfügung stehen
sowie meist mehrere Analyseverfahren für eine Probe zur
Anwendung kommen, empfiehlt es sich, möglichst nur sehr
geringe Teilmengen der Probe in das entsprechende zur jeweiligen
Analyse kompatible Medium zu transferieren. Für massenspektrometrische
Untersuchungen ist darüber hinaus eine sog. Entsalzung,
d. h. eine sehr drastische Verminderung der Salz- und Detergenz-Konzentration
der Matrix bei Erhalt oft niedermolekularer wesentlicher Bestandteile
im Bereich von 1000 bis zu 3000 Da erforderlich.
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Massenspektrometrische
Verfahren kommen zwar mit sehr geringen Volumina (1–5 μl)
aus, benötigen jedoch relativ hohe Analytkonzentrationen.
Um den Sensitivitätsbereich zu erreichen, ist es häufig
erforderlich, die wesentlichen Bestandteile der Proben präanalytisch
stark aufzukonzentrieren. Dabei dürfen jedoch die Konzentrationen
störender Begleitstoffe nicht gleichermaßen wachsen.
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Bei
analytischen Screening-Verfahren und bei Proteomics-basierten Technologien
fallen häufig sehr große Zahlen von gleichartigen
Proben an, die jeweils einer Behandlung oder mehreren gleichartigen
Behandlungen, beispielsweise Medienwechseln, Entsalzungen bzw. Konzentrierungsprozeduren
unterzogen werden müssen.
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Üblicherweise
wird der Mediumwechsel, der auch die Entsalzung einschließen
kann, durch drei alternativ einsetzbare Verfahren realisiert: Gelchromatographie,
Reverse-Phase-Chromatographie und Dialyse.
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Der
Gelchromatographie liegt die chromatographische Abtrennung von Matrixbestandteilen
nach der Molekulargewichts-Größe zu Grunde. Sie
erfordert saubere Chromatographiebedingungen und gegenwärtig relativ
große Probenvolumina. Die Probenbestandteile liegen nach
dem Mediumwechsel stets in größeren Volumina als
das Ausgangsmaterial und gegenwärtig meist im ml-Bereich
vor. Für eine Parallelisierung in dem Sinn, dass eine Pluralität
gleichartiger Proben gleichzeitig hantiert wird, ist der Fachwelt
derzeit keine Lösung bekannt.
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Eine
Miniaturisierung wäre denkbar, erfordert jedoch Probenvolumen-abhängige
Mindest-Trennlängen der Säulchen und damit auch
nicht zu unterschreitende Minimal-Volumina der entsalzten Proben.
In
WO 9502182 wird beispielsweise
ein solches Verfahren in miniaturisertem Maßstab zur Präfraktionierung
für Capillarelektrophorese-Verfahren beschrieben.
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Demgegenüber
sind analytische chromatographische Trennungen parallelisiert bis
in den nano-fluidic-Maßstab möglich (z. B.
WO 2004101151 ). Für
eine präparative Anwendung im Rahmen der Probenvorbehandlung
ist dies jedoch nicht verwendbar, da die Probenmengen den Sensitivitätsbereich
z. B. massenspektrometrischer Verfahren unterschreiten und die Probenbestandteile
nach der Chromatographie stets in größeren Volumina,
also zusätzlich verdünnt im Vergleich zur Ausgangsprobe,
vorliegen.
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Durch
Reverse-Phase-Chromatographie werden vorzugsweise hydrophobe Probenbestandteile
an einer festen hydrophoben Phase gebunden. Diese Träger
werden danach mit dem potentiellen Verlust von wesentlichen, insbesondere
hydrophilen Analyten gewaschen und nachfolgend im gewünschten
salzfreien Medium eluiert. Hierbei sind durch die geschickte Wahl
der Adsorptions- und Elutionsvolumina auch Aufkonzentrierungsschritte
möglich. Es wurden Mikroverfahren für Proben-
und Elutionsvolumina im μl-Bereich in sog. Zip-Tips der
Fa. Millipore (
WO 9837949 )
bzw. Perfect Pure (Fa. Eppendorf) entwickelt. Eine Parallelisierung dieser
Mikroverfahren ist auf Grund des durch den Untersucher zu kontrollierenden
Laufverhaltens der in Pipettenspitzen untergebrachten Mikrosäulchen,
Membranen bzw. monolithischer Strukturen nicht oder nur erschwert
möglich.
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Es
gibt parallelisierbare spin-down Vorrichtungen, die in Arrays hydrophober
Membranen angeordnet sind. Diese Verfahren kommen, wenngleich unter
Einbeziehung einer Zentrifuge, einem praktikablen parallelisierten
Hantieren nahe (
US 6,998,047 ).
Hierfür werden jedoch deutlich größere
Volumina benötigt, als mit Zip-Tips.
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Die
Festphasenextraktion ist meist eine Sonderform der Reverse-Phase-Chromatographie
und kann ebenfalls in stark miniaturisiertem Maßstab zur
Anwendung kommen (
EP 1139087 ).
In
US 2006198765 ist
eine Lösung beschrieben, die für kleinste Volumina
eine 96-fach parallelisierte Festphasenextraktion oder wahlweise
auch Affinitätschromatographie anbietet. Auch in
WO 02082051 werden parallelisierte
Affinitätsmatrices zur Probenvorbehandlung für
die Massenspektrometrie eingesetzt. Dieses Prinzip wird in zahlreichen
weiteren Patentschriften angewendet.
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Reverse-Phase-Chromatorgraphie,
Festphasenextraktion und Affinitätschromatographie haben
zum Prinzip, den/die Analyten aus den Begleitstoffen herauszureinigen
und gegebenenfalls dadurch auch aufzukonzentrieren. Diese Verfahren
selektieren jedoch dadurch stets spezielle Analyte in Abhängigkeit
von den Eigenschaften der Analyte und denen der festen Phase.
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In
dem nachfolgend beschriebenen Dialyseverfahren werden die Begleitstoffe
und das Lösungsmittel entfernt, ohne dabei die Zusammensetzung
der wesentlichen Analyte der Probe zu beeinflussen.
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Dialyseverfahren
und entsprechende Vorrichtungen gibt es gegenwärtig für
jeden gewünschten Volumenbereich von ca. 10 μl
bis zu mehreren Litern. Üblicherweise werden im Labor Dialyseschläuche,
-säckchen oder Kartuschen verwendet. Der Mediumwechsel
erfolgt hier via Diffusion der niedermolekularen Matrix-Bestandteile
durch eine sog. semipermeable Membran bei Zurückhaltung
von wesentlichen Probenbestanteilen.
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Semipermeable
Membranen im Sinne der Erfindung sind Membranen die Partikel, Zellen
oder Moleküle ab einer bestimmten Größe
(cut-off) nicht mehr hindurch lassen, d. h. permeiren. Dies geschieht
aufgrund der in den Membranen eingebrachten Poren, wobei die Porengrößen
meist in einem engen Größen-Bereich realisiert
sind. Dies können Fritten mit Poren von mehreren 100 μm,
Filtrationsmembranen mit Poren im μm- und sub-μm-Bereich
und Molekularsiebmembranen im Molekulargewichtsbereich von wenigen
hundert Da bis mehreren 100 kDa sein.
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Die
Diffusion ist ein Vorgang der auf Grund der Brown'schen Molekularbewegung
entsprechend dem Fick'schen Diffusionsgesetz (1) zustande kommt.
wobei:
- dm
- = Menge des diffundierenden
Stoffes,
- D
- = Diffusionskoeffizient
- q
- = Diffusionsquerschnitt
oder -Fläche,
- dc
- = Konzentrationsunterschied
und
- dl
- = Diffusionsweg
- dt
- = Diffusionszeit
bedeuten.
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An
Membranen wirken zusätzliche Faktoren, die von den Eigenschaften
des diffundierenden Stoffes als auch von denen der Membran abhängen.
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Für
niedermolekulare Matrixbestandteile sind dabei die reinen Diffusionszeiten
vom Konzentrationsgradienten, der zur Verfügung stehenden
Fläche direkt und vom Diffusionsweg umgekehrt proportional
abhängig und betragen üblicherweise für
einen Diffusionsweg von 1,3 cm ca. 100 h, für 1,3 mm ca.
1 h und für 13 μm ca. 0,3 sec (S. M. Rappoport,
Medizinische Biochemie, Verl. Volk und Gesundheit, 1983, S. 39/40).
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Durch
eine geeignete Geometrie (große wirksame Fläche,
kleine Diffusionswege) und durch geeignete Membranen (keine Interaktion
der zu tauschenden Stoffe mit der Membran) ist daher die Diffusion
für den effizienten Mediumwechsel insbesondere für
kleine Volumina nutzbar. Durch die Erzeugung von Turbulenzen in
Probe und/oder Dialyseaußenflüssigkeit durch geeignete
mechanische Vorrichtungen, können zusätzlich die
Konzentrationsunterschiede (dc in Formel 1) groß gehalten
und dadurch die Diffusion durch die Membran beschleunigt werden.
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Auch
Bündel von sog. Hollow-Fasern mit definierten Poren, durch
welche die Probenflüssigkeit hindurchfließt, kommen
für die Dialyse im Labor und bevorzugt für die
Hämodialyse zur Anwendung. Dabei strömt die gleiche,
meist großvolumige Probe durch eine gebündelte
hohe Zahl von Hollow-Fasern, wodurch die wirksame Oberfläche
stark vergrößert ist. Auch Kartuschen mit semipermeablen
Membranen werden im Durchfluss zum Mediumwechsel im Labor eingesetzt.
Kartuschen und Hollow-Fasern haben durch die Anbindung an Pumpen
große Totvolumina und erfordern hohe Drücke, da
durch die kleinen Querschnitte große Flusswiderstände
und die relativ dicken Wände lange Diffusionsbarrieren
vorhanden sind. Dadurch lassen sich beide technische Lösungen
nur schwer in stark miniaturisierte oder gar parallelisierte Systeme
integrieren.
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Im
Labor ist die Dialyse in Säckchen oder Containern mit einfachen
Pipettierschritten durchzuführen. Es kommt üblicherweise
nur zu unwesentlichen Volumenänderungen der Probe. Bei
geschickter Wahl des Membrantyps und der Porengröße
(Molekulargewichtscut-off) gehen keine wesentlichen Bestandteile
biologischer Proben verloren. Für die gleichzeitige Dialyse
einer großen Zahl von zwar gleichartigen, in der Zusammensetzung von
wesentlichen Analyten und Matrixbestandteilen jedoch verschiedenen
kleinvolumigen Proben gibt es jedoch bisher keine befriedigende
Lösung.
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Die „drop-dialysis",
d. h. Dialyse mittels vergleichsweise grobporigen auf der Dialyseflüssigkeit schwimmenden
Filtrationsmembranen ist zwar zur schnellen Entsalzung kleinster
Volumina bis wenige μl konzipiert, jedoch nicht zu parallelisieren
und hinsichtlich der zurück zu gewinnenden Probenmenge
sowie der darin enthaltenen wesentlichen Bestandteile nicht quantitativ.
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Es
gibt singuläre Dialysevorrichtungen bis zu einem minimalen
Volumen von gegenwärtig 10 μl (z. B.
US 5,503,741 ) wobei das Oberflächen-Volumen-Verhältnis
keinesfalls optimal und eine Parallelisierung nicht vorgesehen ist.
Daneben sind spezielle Mikrodialyseeinheiten für noch kleinere
Volumina, jedoch nicht für den Mediumwechsel von wesentlichen
Probenbestandteilen entwickelt worden, sondern zur Diffusions-basierten in-vivo-Gewinnung
von niedermolekularen Soluten (
WO
2004032735 ). Hierbei wird in der kleinen mit einer semipermeablen
Membran teilweise gebildeten Innenkammer ein maximales Oberflächen-Volumenverhältnis
erreicht, jedoch in dieser eine Flüssigkeit transportiert,
die aus der außen befindlichen lebenden Gewebsprobe diffusible
Stoffe aufnehmen und so einer Analyse zuführen soll. Hier
ist eine Parallelisierung ausgeschlossen.
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Mit
US 6,458,275 wird eine Möglichkeit
zur parallelisierten Gleichgewichtsdialyse zur Untersuchung von
Bindungskonstanten im Mikroplattenraster aufgezeigt, die für
jede Probe eine eigene Außenflüssigkeit realisiert
und wegen des geringen Volumenverhältnisses Außenflüssigkeit/Probe
prinzipiell nicht zum effizienten Mediumwechsel bzw. zum Entsalzen
einsetzbar ist.
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Die
parallelisierte Durchführung von Dialysen ist in verschiedenen
Lösungen realisiert. Bis zu 12 Proben und einem Volumen
von minimal 20 μl (Pierce: Microdialyzer System) bzw. von
bis zu 96 Proben und einem minimalen Volumen von ca. 24 μl
(vorteilhafter Weise im Mikroplattenraster) sind möglich
(z. B.
US 2004195163 ,
US 2005019774 ,
US 2005148066 , SpectrumLabs:
Spectra/PorMicrodialyzer). Auf Grund der dabei vorliegenden ungünstigen
Oberflächen-Volumen-Verhältnisse, der relativ
kleinen Diffusionsflächen und der daraus resultierenden
relativ großen Diffusionswege sind für einen vollständigen
Mediumwechsel mit diesen Verfahren viele Stunden erforderlich. In
dieser Zeit kommt es sogar bei Decke lung der Probengefäße
zu Verdunstungsverlusten durch die Verdunstungsfähigkeit
an der großen Oberfläche in die eingeschlossene
Luftkammer hinein, und es können sich wesentliche Bestandteile
der Proben verändern, beispielsweise Proteine denaturieren.
Zudem sind die Proben aus den Mikroplatten-well-förmigen
Probengefäßen mit fragilen Membranen nur schwer
parallelisiert und verlustarm rückgewinnbar. Eine Standardisierung
der Dialysebedingungen für alle Proben ist durch die Zufälligkeit
der Ausbildung des effektiven Diffusionsweges durch Volumentoleranzen,
Meniskusbildung sowie durch schwer zu kontrollierende Luftblaseneinschlüsse
und Luftpolster-Bildung nicht gegeben.
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Es
sind Probenplatten zur Verwendung in Dialysesystemen bekannt (
DE 101 60 975 A1 ),
womit eine Vielzahl von Mikroproben im μl-Bereich dialysiert
werden können. Die Probengefäße, deren
obere Enden offen und deren untere Enden, d. h. die Stirnflächen
der Probengefäße durch eine für die „drop-dialysis"
verwendete Filtrationsmembran verschlossen sind, wurden im zur Anwendung
der Liquidhandlingtechnik für die Mikroplattentechnologie
passenden Raster angeordnet. Wünschenswert wären
allerdings eine weitere Verkürzung der Dialysezeit und
eine Verringerung der Beschädigungsgefahr, insbesondere
der semipermeablen Membran bei Beschickung (Pipettierbewegung).
Darüber hinaus ist die Dialysezeit abhängig von
der Füllstandshöhe (Diffusionsweg dl in Formel
1) und damit vom Probenvolumen sowie von der Pipettierpräzision.
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Zusammengefasst
gibt es noch immer kein vollständig zufrieden stellendes
praktikables, schnelles, reproduzierbares Verfahren, mit dem unselektiv
für wesentliche Bestandteile von Proben im Volumenbereich
von < 1 μl
bis 500 μl ein Mediumwechsel in kurzer Zeit verlustfrei
durchgeführt werden kann. Dialyseverfahren, die in den
unteren des genannten Volumenbereiches gelangen, sind nicht quantitativ
und nicht parallelisierbar, diejenigen die parallelisiert werden
können, benötigen größere Volumina
und haben wesentliche Nachteile bezüglich des Handlings,
der zu erwartenden Präzision und der benötigten
Dialysezeiten.
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Aufkonzentrierungen
sind prinzipiell mittels Fällungsreaktionen, Ultrazentrifugation,
Ultrafiltration, Lyophyllisation, incl. der Sonderform mittels SpeedVac,
und Adsorptionsverfahren möglich.
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Fällungen
mittels Neutralsalzen, Säuren und organischen Lösungsmitteln
sind effiziente Verfahren der Konzentrationserhöhung für
viele Analyte, wie beispielsweise Proteine. Diese Verfahren eignen
sich jedoch nicht für niedermolekulare Stoffe und Peptide,
sind ebenfalls nicht „unselektiv" für viele weitere
Analyte, da Analyt- und Matrixeigenschaften die Fälleffizienz
bestimmen, und denaturieren darüber hinaus meist eine Vielzahl
von Proteinen. Zudem sind Fällungsrektionen nur schwer
miniaturisier- und parallelisierbar, und die zur Fällung
eingesetzten Mittel müssen vor der eigentlichen Analyse
in der Regel wieder aus der Probe entfernt werden.
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Ultrazentrifugation
und Ultrafiltration sind nicht in μl-Volumina möglich,
erfordern Flusshilfen, wie Zentrifugen oder Vakuum, und sind nur
schwer parallelisiert zu realisieren.
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In
US 2005133425 wird ein
Kit vorgeschlagen, der Einzelelemente zur Ultrafiltration zum Zweck
der Molekulargewichtsselektiven Konzentrierung und damit selektiven
Anreicherung von ausgewählten Analyten enthält.
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Mit
dem Verfahren der Lyphyllisation, auch mittels SpeedVac, steht zwar
ein gut parallelisierbares und miniaturisierbares Verfahren zur
Verfügung, jedoch mit dem Nachteil, dass dabei mit dem
genutzten physikalischen Prinzip des Verdunstens des Lösungsmittels
auch alle störenden Begleitstoffe mit aufkonzentriert werden.
Wird das Verfahren bis zum vollständigen Lösungsmittelentzug,
d. h. zur sog. Trockne geführt, besteht die Gefahr, dass
die wesentlichen Analyte, insbesondere Proteine oder spezielle Peptide
oftmals nicht/oder nur partiell wieder lösbar sind.
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Adsorptionen
mittels spezifischer Capture-Verbindungen sind elegante Methoden,
Analyte auf Oberflächen hoch anzureichern, implizieren
jedoch ebenfalls eine Vorauswahl gebundener Analyte. Dies sind Verfahren,
die leicht parallelisierbar sind. Solche Verfahren sind beispielsweise
für zahlreiche SELDI-Träger in unterschiedlicher
Ausgestaltung, in
WO 2005103718 für
Glycoproteine, in
US 2003027216 für
immunoreaktive Analyte, in
WO
2005070141 für verschiedene auszuwählende
Analyte beschrieben, wobei hier zudem eine Parallelisierung bis
zu 96-fach vorgesehen ist.
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Aber
auch unspezifischere Adsorptionsverfahren, wie die oben beschriebene
Reversed-Phase-Chromatographie in Zip-Tips selektieren spezielle,
hier insbesondere hydrophobe, Analyte. Miniaturisierte chromatographische
adsorptive Verfahren (
US 2003027216 ,
WO 2005070141 ) erfordern
meist eine Flusshilfe, wie Zentrifugalbeschleunigung oder Unterdruck.
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Zusammengefasst
gibt es außer den nur bedingt in Betracht kommenden und
oben beschriebenen adsorptiven Vorrichtungen, wie z. B. Zip-Tips
mit den bekannten Nachteilen, keine Vorrichtung und kein praktikables
Verfahren, mit denen auch Mediumwechsel in Kombination mit einer
deutlichen Aufkonzentrierung von einer Vielzahl paralleler Proben
im μl-Bereich und ohne Selektion eines Teils der Probenbestandteile
ermöglicht werden können.
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Der
Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, eine Vorrichtung zu schaffen,
mit welcher Biomoleküle in Proben im Volumenbereich von < 1 μl bis
500 μl auf möglichst einfache, aufwandgeringe
und praktikable Art und ohne Beschädigungsgefahr für
die Vorrichtung schnell, reproduzierbar und verlustfrei aufgenommen,
umfassend behandelt sowie aufbewahrt werden können.
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Die
Aufnahme und Behandlung der Proben soll mit den Vorzügen
der an sich bekannten Liquidhandlingtechnik, wie sie unter anderem
für Mikroplatten bekannt ist, erfolgen können.
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Die
Vorrichtung soll möglichst ohne Änderungen, Umpipettierung
und Umrüstungen etc. gleichermaßen für
Mediumwechsel, Aufkonzentrierungsschritte und andere Probenbehandlungen,
incl. Aufbewahrung, verwendbar sein, um die einmal eingebrachten
Proben reproduzierbar hantieren zu können. Dazu sollen
möglichst allgemein einsetzbare Verfahren ohne Bevorzugung
bzw. Selektion spezieller Analyte durch eventuelle reaktive Oberflächen
einsetzbar sein.
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Erfindungsgemäß wird
die Vorrichtung durch mindestens ein Probengefäß für
universelle Aufnahme, Behandlung und Aufbewahrung kleinvolumiger
Proben realisiert, welches in Größe und Gestalt
als Form- und Lagestabile beidseitig offene Kapillare ausgebildet
ist, deren Längswandung vollständig oder teilweise
aus einer an sich bekannten semipermeablen Membran ausgebildet ist.
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Als
Kapillare im Sinne der Erfindung sind röhrchenförmige
Probengefäße mit sehr kleinem Innendurchmesser
zu verstehen. Diese Kapillare kann als gerade Röhre oder
auch als ein- oder mehrfach gekrümmte Röhre ausgebildet
sein. Zweckmäßig ist beispielsweise eine U-förmig
gekrümmte Kapillare, deren beidseitige Öffnungen
von derselben Seite der Vorrichtung zugänglich sind.
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Zur
ihrer Form- und Lagestabilität kann es zweckmäßig
sein, wenn die Kapillare mit einem oder mehreren stützenden
und somit Form- und Lagestabilisierenden Körpern beispielsweise
aus Edelstahl oder aus einem nichtmetallischen Werkstoff, wie Glas,
Keramik oder Kunststoff, insbesondere in den Bereichen ihrer Kapillarenden
bzw. Stirnflächen, formschlüssig in Verbindung
steht. Andererseits ist es auch möglich, dass das Probengefäß in
Größe und Gestalt unmittelbar als kapillarförmige
Vertiefung, hergestellt beispielsweise durch Gießen, Pressen,
Verformen oder Zerspanen, in einem bereits Form- und Lagestabilen
Körper, der auch aus mehreren Teilkörpern bestehen
kann, eingebracht ist.
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Die
semipermeable Membran kann vorteilhafterweise mit an sich bekannten
Verfahren unlösbar und dichtend mit den Form- und Lagestabilisierenden
Körpern verbunden werden. Solche Verfahren sind beispielsweise
als Overmolding, IR-Schweißen, UV-Bonden bzw. Kleben bekannt.
Diese Verfahren werden seit langem zum unlösbaren Verbinden
verschiedenster polymerer Werkstoffe genutzt.
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In
den Unteransprüchen sind vorteilhafte Ausgestaltungen der
kapillaren Probengefäße aufgeführt.
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Von
Vorteil ist, dass die vorgeschlagenen Kapillaren in einem zur Liquidhandlingtechnik
für die Mikroplattentechnologie passenden Raster (n × 8 × 12
oder n × 8 oder/und m × 12) angeordnet werden
können und damit eine multiple Probenbehandlung ermöglichen.
Damit ist auch die Anwendung und die Kompatibilität an sich
bekannter und in der Praxis etablierter Verfahren der Liquidhandlingtechnik
ohne komplizierte Anpassungen und Umrüstungen oder gesonderte
Methoden des Probenhandlings gegeben.
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Das
vorgeschlagene spezielle Probengefäß gestattet
insbesondere bei seiner vorgenannten multiplen Anordnung im Rastermaß einfach
und praktikabel handhabbare, trotz sehr geringer Probenvolumina äußerst verlustarme
Anwendungen sowie den universellen Einsatz für Aufnahme,
Behandlung und Aufbewahrung von Proben, unter anderem auch zur Aufkonzentrierung
und für den Mediumwechsel. Durch die besagten universellen
Verwendungsmöglichkeiten entfallen ansonsten erforderliche Änderungen,
Umpipettie rung und Umrüstungen etc., die in der Praxis
besondere Aufwendungen im Probenhandling, insbesondere bei vielen
Tausend Proben in Screeningverfahren und auch die zusätzliche
Gefahr von Probenverlusten und -verwechslungen in sich bergen.
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Für
das parallelisierte Dialysieren von Mikrovolumina wurde eine Geometrie
der Probengefäße gefunden, welche nicht nur äußerst
kurze und damit effektive Diffusionswege unabhängig vom
Probenvolumen im Bereich von unter einem Millimeter ermöglicht,
sondern mit der Membrananordnung auch eine sehr effiziente im Vergleich
zum Volumen große wirksame Diffusionsfläche realisiert.
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Darüber
hinaus wird die Verdunstung minimiert und nicht zuletzt eine verlustfreie
und leicht parallelisierbare Rückgewinnung der dialysierten
Probe ermöglicht. Auf diese Weise werden eine drastische
Verkürzung der benötigten Diffusionszeit erreicht
und zusätzlich eine hohe Präzision dieses Probenbehandlungsschrittes
gewährleistet. Daneben können ggf. weitere Behandlungen,
wie beispielsweise der Zusatz von modifizierenden Reagenzien, deren
Reste nach Reaktion ohne weiteren Aufwand durch Dialyse entfernt
werden können, oder der Verdau von Proteinanalyten mittels
spezifischer Proteasen im selben Probengefäß,
in dem zuvor der Mediumwechsel oder eine Konzentrierung stattgefunden
hat, mit anschließender erneuter Konzentrierung und Entsalzung,
durchgeführt werden.
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Die
semipermeable Membran ist im Unterschied zu den eingangs beschriebenen
bekannten Lösungen nicht quer zur Beschickungsrichtung
angeordnet, was aus Erfahrung nicht nur bei unsachgemäßer
Behandlung leicht zu Beschädigungen führen kann,
sondern in Achs- bzw. Längsrichtung der Kapillare als vollständige
oder teilweise Wandung ausgebildet, wodurch das Beschädigungsrisiko
der Membran, insbesondere durch Pipettierbewegung, quasi ausgeschlossen
ist.
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Die
Kapillaren werden vorteilhaft in einem Verhältnis ihrer
Länge zum Innendurchmesser von größer 4
realisiert. Die größte Ausdehnung des Querschnittes
der Kapillaren sollte 5 mm nicht übersteigen. Außerdem können
die Kapillaröffnungen, zum Beispiel durch Deckel, Stopfen
oder Klebefolien ebenfalls gut handhabbar und zuverlässig
verschlossen werden. Durch all diese Merkmale ist auch die Verdunstungsgefahr
während eines Mediumwechsels mittels Dialyse auf ein Minimum
reduziert, was ebenfalls eine hohe reproduzierbare Genauigkeit des
Umgangs und der Analyse der Proben gewährleistet.
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Die
vorgeschlagene kapillare Geometrie mit den empfohlenen Abmessungen
und dem vergleichsweise großen Anteil der semipermeablen
Membran gestattet gut parallelisierbare Verfahrens-kombinierte Anwendungen.
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Zum
Beispiel, ist im Fall des Eintauchens der Vorrichtung in eine Außenflüssigkeit
bei verlustfreiem Erhalt der wesentlichen Analyten in kleinvolumigen
Probenvolumina
- a: die Entfernung primär
in der Probe enthaltener und die Analyse störender Matrixbestandteile,
- b: der Zusatz von Hilfsreagenzien und
- c: die Entfernung von Beiprodukten nach Hilfsreaktionen
relativ
problemlos mittels Dialyse über die Außenflüssigkeit
möglich. Durch die vergleichsweise kleinen Oberflächen
an den offenen Kapillarenden, die zudem auch verschlossen werden
können, ist dabei die Verdunstung minimiert bzw. ausgeschlossen.
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Bei
Aufbewahrung in verdunstungsgeschützter Umgebung ohne kontaktierende
Außenflüssigkeit sind die Vorrichtungen als parallelisierte
Reaktionsgefäße für analytische Hilfsreaktionen
oder zur Lagerung und Transport von Proben verwendbar, wie beispielsweise
Mikroplatten oder Tubes.
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Im
Fall der Aufbewahrung in trockener Umgebung ggf. mit kontrollierter
Konvektion oder Vakuum kann die Verdunstung des in der Probenlösung
vorhandenen Lösungsmittels durch die große Oberfläche
der semipermeablen Membran zum Zwecke der Aufkonzentrierung wesentlicher
Analyten mit hoher Geschwindigkeit und vorteilhafter Weise ohne
Umpipettierung genutzt werden.
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Es
ist auch eine beliebige sequenzielle Kombination der aufgeführten
Anwendungen und auch bei unterschiedlichen Temperaturen möglich.
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Die
Kapillarität der Probengefäße und die
daraus realisierten Kohäsionskräfte der Flüssigkeitssäule sowie
die Nicht-Selektivität der semipermeablen Membran bezüglich
des hydrophoben bzw. hydrophilen Charakters der wesentlichen Probenbestandteile
ermöglichen zudem deren quasi komplette Rückgewinnung.
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Durch
die genannten Möglichkeiten und Merkmale ist die Vorrichtung
für eine Vielzahl parallelisierter Verfahren universell,
praktikabel, aufwandgering sowie mit guter Präzision und
Wiederfindung der wesentlichen Analyte einer Probe einsetzbar.
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Die
Erfindung soll nachstehend anhand von Ausführungsbeispielen
näher erläutert werden. Es zeigen:
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1:
Draufsicht auf eine Kapillare, deren Wandung mit rundem Querschnitt
vollständig aus einer semipermeablen Membran besteht, wobei
die eigenständige Kapillare zwischen zwei stabilisierenden
Körpern angeordnet ist
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2:
Draufsichten auf vier Kapillaren mit unterschiedlichem Querschnitt,
welche jeweils durch eine Vertiefung in einem stabilen Körper
gebildet werden, wobei die Vertiefung jeweils durch eine semipermeable Membran
abgeschlossen wird
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3:
Draufsichten auf vier Kapillaren mit unterschiedlichem Querschnitt,
welche jeweils als Durchbruch in einem stabilen Körper
ausgebildet sind, wobei der Durchbruch jeweils auf beiden Seiten
durch eine semipermeable Membran abgeschlossen wird
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4: Ausbildung von acht U-förmigen
kapillaren Probengefäßen im Mikroplattenrastermaß in
einem stabilen Grundkörper
- a: Vorderansicht
- b: Schnitt X-X entsprechend 4a
- c: Schnitt Y-Y entsprechend 4a
- d: Seitenansicht in Schnittdarstellung eines Stapels von 12
aneinander gereihten stabilen Grundkörpern gemäß 4a mit
je 8 U-förmigen kapillaren Probengefäßen
(vgl. Einzeldarstellung von 4b)
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5:
Zeitverlauf der Abnahme der p-Nitrophenol-Konzentration in sechs
gleichzeitig dialysierten Proben unter Verwendung von U-förmigen
kapillaren Probengefäßen; dargestellt sind Mittelwerte
(Punkte) und Standardabweichungen (Fehlerbalken)
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6:
Zeitverlauf der Abnahme der NaCl-Konzentration in acht gleichzeitig
dialysierten Proben unter Verwendung von U-förmigen kapillaren
Probengefäßen; dargestellt sind die Mittelwerte
(Punkte)
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7:
Zeitverlauf der Volumen-Abnahme von acht gleichzeitig in U-förmigen
kapillaren Probengefäßen im Konvektionsstrom eines
Ventilators aufbewahrten Proben
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8: Massenspektren der drei Proben nach
Ausführungsbeispiel 8
- a: Massenspektrum
von Probe 1, 2 pM Protein, 10 mM Tris/HCl, pH 7.4 mit 150 mM NaCl.
- b: Massenspektrum von Probe 2, 9,4 pM Protein, ca. 53 mM Tris/HCl,
pH 7.4 mit 700 mM NaCl.
- c: Massenspektrum von Probe 3, 19 pM Protein, 10 mM Tris/HCl,
pH 7.4 mit 100 mM NaCl
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9 Lactatproduktion
in humanen Erythrozyten nach Ausführungsbeispiel 10
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Anwendungsbeispiel 1:
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In 1 ist
ein Querschnitt durch ein kapillares Probengefäß 1 mit
einer kreisförmigen Hohlraum-Querschnittsfläche 2 dargestellt.
Die Kapillare ist zu ihrem Schutz zwischen zwei Form- und Lagestabilisierenden
Körpern 3 und 4 angeordnet. Die zylindrische
Mantelfläche (Längswandung) des kapillaren Probengefäßes 1 besteht
vollständig aus einer semipermeablen Membran 5 (angedeutet
in der Schnittdarstellung von 1 als kreisförmige
punktierte Linie).
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Anwendungsbeispiel 2:
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2 zeigt
Darstellungen von ebenfalls Querschnitten durch vier kapillare Probengefäße 6, 7, 8, 9 mit unterschiedlichen
Hohlraum-Querschnittsflächen 10, 11, 12, 13.
Im Unterschied zu 1, bei welcher die Kapillare
eigenständig, d. h. unabhängig von den benachbarten
Form- und Lagestabilisierenden Körpern 3, 4 durch
die semipermeable Membran 5 als zylindrische Mantelfläche
realisiert ist, werden die kapillaren Probengefäße 6, 7, 8, 9 jeweils
als eine beispielsweise durch Gießen, Pressen, Verformen
oder Zerspanen hergestellte Vertiefung in einem Form- und Lagestabilen
Grundkörper 14, 15, 16, 17 gebildet.
Abgedeckt wird jeweils die Vertiefung im Form- und Lagestabilen
Grundkörper 14, 15, 16, 17 mit
einer z. B. aufgeklebten oder gebondeten semipermeablen Membran 18 (wiederum
als punktierte Linie dargestellt), wodurch jeweils der Hohlraum
der kapillaren Probengefäße 6, 7, 8, 9 seitlich
abgeschlossen wird. Auf diese Weise entstehen im Form- und Lagestabilen
Grundkörper 14 ein kapillares Probengefäß 6 mit
einer dreieckigen Hohlraum-Querschnittsfläche 10,
im Form- und Lagestabilen Grundkörper 15 ein kapillares
Probengefäß 7 mit einer halbrunden Hohlraum-Querschnittsfläche 11,
im Form- und Lagestabilen Grundkörper 16 ein kapillares
Probengefäß 8 mit einer rechteckigen
Hohlraum-Querschnittsfläche 12 und im Form- und
Lagestabilen Grundkörper 17 ein kapillares Probengefäß 9 mit
einer trapezförmigen Hohlraum-Querschnittsfläche 13.
-
Anwendungsbeispiel 3:
-
In ähnlicher
Weise wie in 2 zeigt 3 ebenfalls
vier Querschnitte durch kapillare Probengefäße 19, 20, 21, 22 welche
jeweils in einem Form- und Lagestabilen Grundkörper 23, 24, 25, 26 realisiert
sind. Im Gegensatz zu 2 werden in diesem Ausführungsbeispiel
die Kapillaren nicht durch Vertiefungen, sondern jeweils als Durchbruch
durch den Form- und Lagestabilen Grundkörper 23, 24, 25 bzw. 26 ausgebildet.
Die Durchbrüche sind beidseitig durch semipermeable Membranen 27, 28 (auch
hier als punktierte Linien dargestellt) abgedeckt. Auf diese Weise
entstehen die vier kapillaren Probengefäße 19, 20, 21, 22,
deren in 3 gezeigte Hohlraum-Querschnittflächen 29, 30, 31, 32 jeweils
unterschiedliche Formen mit den dargestellten geraden und/oder gekrümmten
Polygonzügen aufweisen.
-
Anwendungsbeispiel 4:
-
4 zeigt eine spezielle Ausbildung von
acht U-förmigen kapillaren Probengefäßen 33 im
Mikroplattenrastermaß n × 8, mit n = 1 in einem
Form- und Lagestabilen Grundkörper 34. Jedes Probengefäß 33 besteht aus
zwei vertikalen Kapillarröhrchen 35, 36,
die der Hohlraum-Querschnittsform von Probengefäß 22 in 3 entsprechen
und welche nach oben offene Röhrchenenden 37 aufweisen
sowie zur besagten U-förmigen Probengefäßausbildung
unten über ein horizontales Kapillarröhrchen 38 in
der Form von Probengefäß 8 (siehe 2)
in Verbindung stehen. Dieses Kapillarröhrchen 38 enthält
vorzugsweise einen stabilisierenden, das Lumen nur teilweise einengenden,
Verbindungssteg 43 zwischen einer Materiallippe 44 und
dem restlichen Grundkörper 34.
-
Die
Röhrchenenden 37 der Kapillarröhrchen 35, 36 stehen
bei jedem Probengefäß 33 jeweils über
ein Verbindungsröhrchen 39 mit der Öffnung 40 (Kapillarröhrchen 35)
zur Befüllung bzw. Entnahme von aus Übersichtsgründen
nicht in der Zeichnung dargestellter Proben oder mit der Belüftungsöffnung 41 (Kapillarröhrchen 36)
für die Probenbefüllung bzw. -entnahme in Verbindung.
-
4b zeigt
zur Verdeutlichung einen Schnitt in der bei 4a angezeigte
Ebene X-X durch das Kapillarröhrchen 35 eines
Probengefäßes 33 mit der Öffnung 40 zur
besagten Probenbefüllung bzw. -entnahme sowie eine durch
Bonden aufgebrachte und dadurch das U-förmige Probengefäß 33 vervollständigende
semipermeable Membran 42.
-
4c zeigt
zur Verdeutlichung einen Schnitt in der bei 4a angezeigte
Ebene Y-Y durch das Kapillarröhrchen 38 eines
Probengefäßes 33 mit dem stabilisierenden,
das Lumen nur teilweise einengenden, Verbindungssteg 43 und
der Materiallippe 44.
-
4d zeigt
in Seitendarstellung einen Schnitt durch einen Stapel von insgesamt
zwölf aneinandergereihten Form- und Lagestabiler Grundkörpern 34 gemäß 4a mit
jeweils (wie in 4a abgebildet) acht U-förmigen
kapillaren Probengefäßen 33. Der in 4b dargestellte
Schnitt X-X entspricht bei 4d dem linken
Probengefäß 33. In 4d rechts
daneben sind weitere elf Form- und Lagestabile Grundkörper 34 angereiht
(realisierbar auch durch einen einzigen Form- und Lagestabilen Grundkörper
für den gesamten Block der insgesamt 96 vorhandenen Probengefäße 33).
-
Dadurch
werden die U-förmigen kapillaren Probengefäße 33 in
mehreren Ebenen in einem Rastermaß von hier n × 8 × 12
mit n = 1 entsprechend dem an sich bekannten Mikroplattenrastermaß angeordnet.
Zwischen den zwölf aneinandergereihten Form- und Lagestabilen
Grundkörpern 34 befinden sich jeweils vergleichsweise
großlumige Kanäle 45, in denen sich eine
nicht dargestellte Dialyseaußenflüssigkeit befinden bzw.
hindurchgeleitet werden kann.
-
Im
Nachfolgenden werden weitere Anwendungsbeispiele aufgeführt,
welche die Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung
verdeutlichen sollen.
-
Anwendungsbeispiel 5:
-
Mediumwechsel am Beispiel der Entfernung
von p-Nitrophenollösung aus einer Lösung im Kapillarmodul
-
In
sechs der acht U-förmigen kapillaren Probengefäße 33 entsprechend 4a,
die durch Ausfräsung eines Form- und Lagestabilen Grundkörpers 34 aus
Polymethylmethacrylat (PMMA) sowie aus aufgeklebten semipermeablen
Membranen 42 (Spektra/Por® 1,
RC, MWCO 6–8 kDa, SpectrumLabs) entstanden sind, werden
je 200 μl einer Lösung aus 6 mM p-Nitrophenol
in 1 M Diethanolamin/HCl, pH 9,8 (Puffer A) pipettiert, in zwei
weitere kapillare Probengefäße 33 ein
Farbstofffreier Puffer A. Das Modul wird bei Raumtemperatur in ein Gefäß mit
150 ml deionisiertem Wasser (Außenflüssigkeit)
gestellt. Nach 30 min wird das deionisierte Wasser gegen frisches
ausgetauscht. Nach jeweils unterschiedlichen Zeiten werden der gesamte
Inhalt aller Kapillaren mit einer Pipette herausgesaugt, Aliquots
davon 1 zu 10 bis 1 zu 100 in Puffer A in Mikroplatten-Wells verdünnt und
die Absorbanz bei 405 nm in einem Reader (Spectramax Plus384) gemessen.
Der Rest wird zurück pipettiert und weiter dialysiert.
-
Aus
dem Diagramm in 5 ist ersichtlich, dass nach
ca. 2 h nur noch 12%, nach ca. 3 h nur noch ca. 7% der ursprünglichen
Farbkonzentration vorhanden ist. Anhand der geringen Streuung der
Einzelwerte ist die hohe Reproduzierbarkeit der Methode erkennbar.
-
Die
geringe Farbkonzentration in denjenigen Kapillaren mit Puffer A
vor Wechsel der Außenflüssigkeit ist auf die retrograde
Diffusion in die Kapillaren hinein zurückzuführen.
Nach dem Wechsel (nach 30 min) ist in den mit Puffer A gefüllten
Kammern keine Absorbanz mehr nachweisbar, d. h. die durch Kleben
der semipermeablen Membran vervollständigten kapillaren
Probengefäße 33 sind dicht, es gibt keine
Kreuzkontamination.
-
Anwendungsbeispiel 6:
-
Entfernung von NaCl mittels Kapillarmodul
-
In
alle acht parallele U-förmige kapillare Probengefäße 33 (vgl. 4a)
werden je 190 μl einer Lösung aus 10 mM Tris/HCl,
pH 7,4 (Puffer B) mit 150 mM NaCl pipettiert. Das Modul wird bei
Raumtemperatur in ein Gefäß mit 150 ml Puffer
B (Außenflüssigkeit) gestellt. Nach 30 min wird
die Außenflüssigkeit gegen frische ausgetauscht.
Nach verschiedenen Zeiten wird der gesamte Inhalt der Kapillaren
mit einer Pipette herausgesaugt. Es wird mit einem Osmometer (Knauer,
Semi-Microosmometer) die Osmolarität der Lösungen
gemessen und mit Eichlösungen verglichen. Danach werden
die Lösungen zurück pipettiert und weiter dialysiert.
-
Im
Diagramm in 6 ist zu erkennen, dass nach
120 min bzw. 180 min nur noch ca. 8% bzw. 4% der Ausgangs-NaCl-Konzentration
vorhanden sind.
-
Die
Methode ist gut reproduzierbar, da die Variationskoeffizienten der
jeweiligen 8-fach-Bestimmungen im Bereich von ≤ 1% liegen.
-
Anwendungsbeispiel 7:
-
Verdunstung von Wasser im Kapillarmodul
-
In
alle acht der U-förmigen kapillaren Probengefäße 33 (vgl. 4a)
werden 200 μl deionisiertes Wasser hinein pipettiert. Das
Modul wird bei üblicher Raumtemperatur an einem Stativ
befestigt und ein im Luftstrom darauf gerichteter Ventilator (Diffusor,
Fa. Braun) in ca. 30 cm Abstand auf der geringsten Stufe und ohne Zusatzheizung
einge schaltet. Nach verschiedenen Zeiten wird jeweils das Modul
gewogen.
-
Aus
dem Diagramm in 7 ist zu sehen, dass nach ca.
2 h etwa noch 5% und nach 3 h nur noch 0,6% der Ausgangsflüssigkeitsmenge
vorhanden ist, was bei Anwesenheit von nichtflüchtigen
Analyten einem Konzentrierungsfaktor von mehr als 20 bzw. ca. 160
entsprechen würde.
-
Anwendungsbeispiel 8:
-
Kombinierte Probenbehandlung: Konzentrierung
und Dialyse
-
In
alle acht der U-förmigen kapillaren Probengefäße 33 (vgl. 4a)
werden 190 μl einer Lösung mit Rinder-IgG (Serva
No. 22550, 0,3 mg/ml, 2,0 μM, in 10 mM Tris/HCl, pH 7,4,
Probe 1) pipettiert. Das Modul wird wie in Anwendungsbeispiel 7
an einem Stativ befestigt und ein Ventilator (Diffusor, Fa. Braun)
in ca. 30 cm Abstand auf der geringsten Stufe und ohne Zusatzheizung
eingeschaltet. Nach Verdunstung des überwiegenden Teils
von Flüssigkeit werden die Restvolumina in einem einzigen
der U-förmigen kapillaren Probengefäße 33 vereinigt
und die entleerten kapillaren Probengefäße 33 sequenziell
mit 100 μl 10 mM Tris/HCl, pH 7,4 gespült. Die
erhaltene Spülflüssigkeit wird in dasselbe kapillare
Probengefäß 33 mit den besagten Restvolumina
dazu gegeben. Es wird erneut mit dem Ventilator konzentriert (Probe
2). Danach wird ohne weites Umpipettieren im gleichen Modul 2 h
gegen 10 mM Tris/HCl, pH 7.4 mit 100 mM NaCl dialysiert (Probe 3).
-
Von
den Proben 1–3 werden Massespektren mittels MALDI-MS aufgezeichnet
(siehe A. Horn et al.: Proteomics, 6, 2006, 559).
-
8a bis 8c zeigen
die Massenspektren der Proben 1 bis 3.
-
In
nachstehender Tabelle sind für die drei Proben jeweils
Probenvolumen, Konzentrierungsfaktor und MALDI-Resultat gegenübergestellt:
| Probe | Gesamt-Volumen
(μl) | Konzentration von
IgG [μM] ca | Konzentration von
Tris/NaCl [mM] ca | Verwertbare Massenspektren
Ja/nein* | Konzentrierungs-Faktor (nach
Volumen) |
| 1 | 1520 | 2,0 | 10/150 | Nein | 1,0 |
| 2 | 65 | 46,8 | 264/3510 | Nein | 23,4 |
| 3 | 80 | 38 | 10/100 | Ja | 19,0 |
- * unter den in 8a–c
angegebenen Bedingungen. Verwertbare Massespektren sind solche,
die ein hohes, zur exakten Bestimmung der Mittleren Masse ausreichendes
Signal/Rausch-Verhältnis aufweisen.
-
Anwendungsbeispiel 9:
-
Proteinmodifikation, Dialyse und Verdau
-
16
Proben von Human-Serumalbumin (Sigma, 3 μM, je 60 μl
in 20 mM Ammonium-Hydrogencarbonat) werden nach Zusatz von 20 μl
8 M Guanidin-HCL und Denaturierung in Polycarbonatgefäßen
20 min bei 90°C auf zwei Sätze zu je 8 Proben
aufgeteilt. Je einer dieser Probensätze wird parallel herkömmlich
in acht Tubes (Methode A) bzw. vorschlagsgemäß als
Methode B in den besagten acht U-förmigen kapillaren Probengefäßen
33 (siehe
wiederum
4a), modifiziert und verdaut.
Das herkömmliche Verfahren (Methode A) in Tubes umfasst
folgende Arbeitsschritte: Nacheinander Zupipettieren von DTT- und
Jodacetamid-Lösung, mit jeweiliger Inkubation, Umpipettieren
in Dialysegefäße, 2 h Dialyse gegen 20 mM Ammonium-Hydrogencarbonat, Umpipettieren
in neue Tubes, Zusatz von Trypsin und Inkubation. In den U-förmigen
kapillaren Probengefäßen
33 (Methode
B) erfolgen prinzipiell die gleichen Reaktionen, jedoch entfällt
das zweimalige Umpipettieren vor bzw. nach Dialyse: Die nach dieser
Behandlung jeweils in den acht Probengefäßen (Tubes
bzw. U-förmige kapillare Probengefäße
33)
erhaltenen Peptidgemische wurden mittels MALDI-MS jeweils als Vierfachbestimmung
pro Reaktionsgefäß analysiert (
Bublitz
et al.: Proteomics 2006, 6, 3909). Die Ergebnisse sind
in nachstehender Tabelle zusammengefasst. Es ist zu erkennen, dass
sowohl die Anzahl der gefundenen Peptide, die erreichten normierten
Höhensummen, welche ein verlässliches quantitatives
massenspektrometrisches Maß darstellen und die Zusammensetzung
der gefundenen Peptidgemische mit beiden Methoden vergleichbar sind.
| Parameter | Methode
A | Methode
B | Maßzahl |
| Umfüllende
Pipettierschritte | 2 | 0 | Anzahl |
| Reaktionsgefäße | 2 | 1 | Stück |
| Anzahl
der gefunden Peptide | 37,1 ± 3,5 | 37,4 ± 5,4 | Mittelwert ± SD
(n = 32) |
| Normierte
Höhensumme der gefundenen Peptide* | 11,91 ± 2,94 | 9,15 ± 4,35 | Mittelwert ± SD
(n = 32) |
| Molekulargewicht der gefundenen Peptide (Mittelwert
der Mittelwerte und der SD) | 1521.02 | 1503.23 | kDa
(n = 8) |
| 498.31 | 508.48 | |
| Molekulargewicht der gefundenen Peptide
(SD der Mittelwerte und der SD) | 56.34 | 45.90 | kDa
(n = 8) |
| 42.33 | 58.42 | |
- * vgl. Bublitz et al.: Proteomics 2006,
6, 3909, SD: Standardabweichung
-
Anwendungsbeispiel 10
-
Untersuchung von Metaboliten lebender
Zellen
-
In
alle acht parallele U-förmige kapillare Probengefäße 33 (vgl. 4a)
werden je 170 μl einer Suspension aus einem Teil Zellsediment
und vier Teilen physiologischer Kochsalzlösung (NaCl) mit
frisch abgenommenen und zuvor dreimal mit NaCl gewaschenen humanen
Erythrozyten pipettiert. Das Modul wird bei Raumtemperatur in ein
Gefäß mit 10,0 ml NaCl mit 10 mM Glukose (Außenflüssigkeit)
gestellt. Nach jeweils etwa 60 min wird die Außenflüssigkeit
gemischt 100 μl davon entnommen und das Modul erneut in
der Außenflüssigkeit platziert. In den entnommenen
Proben wird die Lactatkonzentration nach Bergmeyer, H. U.
in: Methods of Enzymatic Analysis, 3. Ed., Vol. VI, S. 582–588 bestimmt.
Lactat in der Außenflüssigkeit kann nur aus Glukose
gebildet sein, die mittels Diffusion in die Kapillaren gelangt, über
die anaerobe Glycolyse der Erythrozyten entstanden und in die Außenflüssigkeit
zurück diffundiert sein.
-
Im
Diagramm in 9 ist die Lactatkonzentration
in der Außenflüssigkeit für einen Zeitraum
von 5 h aufgetragen. In dieser Zeit ist eine lineare Konzentrationszunahme
dieses Metaboliten zu beobachten. Die Lactatproduktion beträgt
unter diesen Bedingungen 0.0103 μMole/(min × ml
Erythrozytensediment) oder ca. 0.7 μMole/(min × 1011 Zellen).
-
Der
Vorteil dieser Methode ist, dass die gepackten Zellen in der Kapillare
ohne Störung verbleiben können, via Diffusion
versorgt und ebenso von Stoffwechselendprodukten, wie Lactat, befreit
werden können. Außerdem stellt die gewählte
Membran eine mikrobielle Barriere dar. Da die Membran nicht von
Zellen oder Makromolekülen passiert werden kann, ist die
Lactatbestimmung ohne aufwendige Entproteinisierung möglich.
-
- 1,
6, 7, 8, 9, 19, 20, 21, 22, 33
- kapillares
Probengefäß
- 2,
10, 11, 12, 13, 29, 30, 31, 32
- Hohlraum-Querschnittsfläche
des kapillaren Probengefäßes
- 3,
4
- Form-
und Lagestabilisierender Körper
- 5,
18, 27, 28, 42
- semipermeable
Membran
- 14,
15, 16, 17, 23, 24, 25, 26, 34
- Form-
und Lagestabiler Grundkörper
- 35,
36, 38
- Kapillarröhrchen
- 37
- Röhrchenende
- 39
- Verbindungsröhrchen
- 40
- Öffnung
zur Befüllung bzw. Entnahme
- 41
- Belüftungsöffnung
- 43
- Verbindungssteg
- 44
- Materiallippe
des Grundkörpers
- 45
- Kanal
für eine Dialyseaußenflüssigkeit
-
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
-
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des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen
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-
Zitierte Patentliteratur
-
- - WO 9502182 [0012]
- - WO 2004101151 [0013]
- - WO 9837949 [0014]
- - US 6998047 [0015]
- - EP 1139087 [0016]
- - US 2006198765 [0016]
- - WO 02082051 [0016]
- - US 5503741 [0028]
- - WO 2004032735 [0028]
- - US 6458275 [0029]
- - US 2004195163 [0030]
- - US 2005019774 [0030]
- - US 2005148066 [0030]
- - DE 10160975 A1 [0031]
- - US 2005133425 [0036]
- - WO 2005103718 [0038]
- - US 2003027216 [0038, 0039]
- - WO 2005070141 [0038, 0039]
-
Zitierte Nicht-Patentliteratur
-
- - A. Horn et
al.: Proteomics, 6, 2006, 559 [0091]
- - Bublitz et al.: Proteomics 2006, 6, 3909 [0094]
- - Bergmeyer, H. U. in: Methods of Enzymatic Analysis, 3. Ed.,
Vol. VI, S. 582–588 [0095]