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Die
Erfindung betrifft Partikel aus einem polymeren Werkstoff, die zwei
oder mehr monodispers in dem Werkstoff eingebettete Fluorophore
mit Absorptions- und Fluoreszenzmaxima im UV/VIS/NIR-Spektralbereich enthalten.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung derartiger
Partikel sowie ein Testkit, das zwei oder mehr Chargen der Partikel
enthält,
wobei innerhalb der Chargen jeweils die gleichen Fluorophore mit
jedoch abweichendem Konzentrationsverhältnis enthalten sind. Schließlich betrifft
die Erfindung ein Verfahren, mit dem eine Identifikation der Partikel
in einer Probe ermöglicht
wird.
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Technologischer Hintergrund
und Stand der Technik
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Monodisperse
Partikel (i. d. R. Mikropartikel) aus polymeren Werkstoffen werden
in vermehrtem Maße in
der medizinischen Diagnostik, als Träger für immobilisierte Enzyme, als
Marker in der Umweltanalytik sowie in zahlreichen mikrobiologischen
Untersuchungsverfahren genutzt, in denen beispielsweise Zielverbindungen an
der Oberfläche
der Mikropartikel gebunden und auf spektroskopischem Wege identifiziert
werden. Polymere Partikel einheitlicher Form und Größe können durch
Fällungs-,
Suspensions- oder Emulsionspolymerisation erhalten werden.
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Es
ist Stand der Technik, derartigen Partikeln Fluorophore zuzusetzen,
also fluoreszierende Chromophore, deren Fluoreszenz (emittiertes
Fluoreszenzlicht) zur Identifikation der Partikel dienen kann. In
der Regel enthält
das Partikel dabei nur einen einzigen Fluorophor, so dass zur Identifikation
entweder die Lage des Fluoreszenzmaximums oder die absolute Intensität der Fluoreszenz
erfasst werden muss. Letztere Identifikation über die absolute Intensität wurde
bereits mit Partikeln, die zwei Fluorophore enthalten, realisiert.
Die Intensitäten
der Farbstoffe werden dabei jeweils getrennt ermittelt.
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Liegen
mehrere Fluorophore in einem Partikel vor, besteht jedoch grundsätzlich die
Möglichkeit,
dass photophysikalische Prozesse, wie strahlungslose Desaktivierung
oder bimolekulare Prozesse (Sensilibisierung, Quenchen), sowie gegebenenfalls
auch photochemische Primärprozesse
unter Spinumkehr die Fluoreszenz beeinflussen. Bei Aggregation der
Fluorophore im Partikel treten intermolekulare Wechselwirkungen
auf. Es ist mit einem konzentrationsabhängig veränderten spektroskopischen Verhalten
zu rechnen. Zudem ist die gemessene Fluoreszenzintensität von der
absoluten Gesamtstoffmenge der Fluorophore im Partikel und somit auch
von der jeweiligen Größe der Partikel
abhängig.
Liegen in einer zu untersuchenden Probe eine Anzahl n verschiedener
Partikel vor, so müssen
diese fluoreszenzspektroskopisch unterscheidbar sein; entsprechend ist
bei herkömmlicher
Vorgehensweise eine Anzahl n verschiedener und spektroskopisch unterscheidbarer Fluorophore
einzusetzen bzw. bei einem vorgegebenen Fluorophor sind Partikel
mit abgestuften Konzentrationen des Fluorophors herzustellen. Augenscheinlich
nachteilig ist, dass die Anzahl der für die Zwecke tauglichen, in
ausreichendem Maße
zugänglichen,
und in ihren Kosten wirtschaftlich vertretbaren Fluorophore begrenzt
ist. Zu Bedenken ist auch, dass ein Austausch einer Komponente (d.
h. eines Fluorophors oder einer Komponente des Polymermaterials)
des Partikels unter Umständen
eine Modifikation des gesamten Systems erfordert, sei es durch eine
notwendige Anpassung des Herstellungsweges oder den Austausch weiterer
Komponenten, die ansonsten eine die spektroskopische Untersuchung
störende
Interaktion bedingen könnten. Schließlich ist
auch das Identifikationsverfahren für Proben mit einer Vielzahl
verschiedener Partikel mit jeweils verschiedenen Fluorophoren aufwendig:
Es sind geeignete Anregungswellenlängen für die verschiedenen Fluorophore
vorzugeben und die Erfassung der Fluoreszenz ist gleichzeitig für die Vielzahl
der verschiedenen Fluorophore zu optimieren. Die Zuordnung von Partikeln,
die denselben Farbstoff in unterschiedlich hohen Konzentrationen
enthalten, allein mittels Erfassung der absoluten Intensität kann aus
verschiedenen Gründen nachteilig
sein. Bereits geringe Schwankungen hinsichtlich der Partikelgröße oder
Inhomogenitäten
hinsichtlich der Farbstoffverteilung führen zu nicht eindeutigen Ergebnissen
bzw. zu einer sehr eingeschränkten
Anzahl unterscheidbarer Populationen.
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Die
Erfindung soll eine zu bestehenden Systemen zumindest alternative
Methode der Partikelidentifikation bieten und vorzugsweise einen
oder mehrere der zuvor geschilderten Nachteile herkömmlicher
Ansätze überwinden.
Nach Möglichkeit
soll insbesondere ein System von Partikeln bereitgestellt werden,
das hinsichtlich der Beschaffenheit der Partikel und dem angewendeten
Identifikationsverfahren eine besonders große Anzahl sicher unterscheidbarer
Partikelpopulationen ermöglicht.
Sicher bedeutet in diesem Zusammenhang, dass Abweichungen der Partikel
hinsichtlich ihrer Größe oder
der vorliegenden Gesamtfarbstoffmenge die Identifikation weitestgehend
unberührt
lassen und somit eine eindeutige Zuordnung von verschiedenen Partikelpopulationen
einer beliebigen Mischung gewährleistet
ist.
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Erfindungsgemäße Lösung
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Ein
erster Aspekt der Erfindung liegt in der Bereitstellung eines Partikels
aus einem polymeren Werkstoff, der zwei oder mehr monodispers in
dem Werkstoff eingebettete Fluorophore mit Absorptions- und Fluoreszenzmaxima
im UV/VIS/NIR-Spektralbereich enthält. Die Fluorophore sind dabei
derart ausgewählt,
dass
- (i) die Absorptionsmaxima der Fluorophore
um jeweils mindestens 5 nm voneinander beabstandet sind;
- (ii) die Fluoreszenzmaxima der Fluorophore um jeweils mindestens
10 nm voneinander beabstandet sind; und
- (iii) die Absorptionsmaxima und Fluoreszenzmaxima der Fluorophore
um jeweils mindestens 5 nm voneinander beabstandet sind.
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Der
Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, dass mit Hilfe eines Partikelsystems
aus zwei (gegebenenfalls auch mehr) Fluorophoren eine Vielzahl über Fluoreszenzspektroskopie
unterscheidungsfähiger
Partikel bereitgestellt werden können,
wenn die genannten Auswahlkriterien beachtet werden. Dadurch, dass
die Wellenlängen
der Fluoreszenzmaxima der Fluorophore mindestens 10 nm voneinander
beabstandet sind, die Wellenlängen
der Absorptionsmaxima um mindestens 5 nm voneinander entfernt liegen
und Fluoreszenz- und Absorptionsmaxima aller Fluorophore sich um
mindestens 5 nm hinsichtlich ihrer Lage unterscheiden, kann ein
Verhältnis
der Fluoreszenzintensitäten
der einzelnen Fluorophore erfasst werden. Aus diesem Verhältnis kann
eine – wie
weiter unten noch näher
erläuterte – Identifikation
von Partikeln erfolgen. Eine zu untersuchende Probe kann also verschiedene
Arten von Partikeln enthalten, die sich jeweils im Verhältnis der
erfassten Fluoreszenzintensitäten
und damit relativen Anteilen der Fluorophore unterscheiden, ansonsten
jedoch einen identischen Aufbau besitzen. Natürlich können daneben auch Partikel
mit unterschiedlichen Fluorophoren verwendet werden. Die in dem
polymeren Werkstoff verteilten Fluorophore sind monodispers verteilt,
liegen also im Idealfall als homogene Lösung der Fluorophore in der
polymeren Matrix vor, oder sind, wenn es sich um eine Dispersion
handelt, als Farbstoffteilchen weitgehend gleicher Größe in der
polymeren Matrix eingebettet. Vorzugsweise weisen die Absorptionsspektren
der Fluorophore einen Überlappungsbereich
auf, wobei in diesem Bereich für
jeden Fluorophor eine Extinktion größer 0,001 und eine Quantenausbeute
größer Null
ist. Hierdurch kann – in
noch näherer
erläuterter
Weise – das
Identifikationsverfahren durch Anregung mit nur einer Wellenlänge eingeleitet
werden. Gegenüber
herkömmlichen
Verfahren wird eine signifikant reduzierte Anzahl einzelner Partikelexemplare
einer Population zur Identifizierung dieser Population benötigt.
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Vorzugsweise
sind die Absorptionsmaxima der Fluorophore um 10 bis 100 nm voneinander
beabstandet. Unabhängig
oder in Ergänzung
hierzu sind die Fluoreszenzmaxima der Fluorophore um 20 bis 100
nm voneinander beabstandet.
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Die
Absorptions- und Fluoreszenzmaxima liegen im UV/VIS/NIR-Spektralbereich,
dass heißt
im Wellenlängenbereich
von 250 bis 2500 nm. Vorzugsweise liegen die Absorptionsmaxima im
Wellenlängenbereich von
350 bis 850 nm. Unabhängig
oder in Ergänzung
hierzu liegen die Fluoreszenzmaxima vorzugsweise im Wellenlängenbereich
von 400 bis 900 nm.
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Der
polymere Werkstoff sollte in Wasser unlöslich und gegebenenfalls quellbar
sein, so dass der Einsatz der Partikel in wässrigen Medien oder in vivo
möglich
ist. Der polymere Werkstoff kann ein Polymer enthalten, das aus
einem oder mehreren Monomeren ausgewählt aus der Gruppe bestehend
aus substituierten oder unsubstituierten Acrylaten, Vinylen und
Allylen hergestellt ist. Daneben können insbesondere Polysilicate und
Melaminharze Verwendung finden. Der polymere Werkstoff ist vorzugsweise
ausgewählt
aus der Gruppe umfassend Polysilicate, Polyaddukte (insbesondere
Polyurethane, Polyharnstoffe, Polyisocyanate und Polydiole), Polykondensate
(insbesondere Polyester/Polycarbonate, Polyamide, Polyimide, Polysulfone,
Polyethersulfone und Melaminharzen), Polyacrylate (insbesondere
Polymethylmethacrylat, Polymethylacrylat, Polyhydroxyethylmethacrylat,
Polyethylenglycolmonomethacrylate verschiedener Kettenlänge, Poly-N-Isopropylacrylamid,
Polydiethylacrylamid, Polyhexylmethacrylat, Poly-tert.-Butylmethacrylat
und Polyacrylnitril), Polyolefine (insbesondere Polystyrol, Polypropylen,
Polyethylen, alipatische Polyvinyle, aliphatische Polyallyle), deren
Copolymeren oder Elends. Die genannten Materialien erlauben die
Herstellung von Partikeln definierter Größe und sind daher als polymere
Matrix für
die fluoreszenzspektroskopische Untersuchung der Partikel besonders
geeignet, da sie keine oder vernachlässigbare Störeinflüsse auf das chromophore System
und die photophysikalischen Prozesse, insbesondere auf die Fluoreszenz
der Fluorophore zeigen. Besonders bevorzugt besteht der polymere
Werkstoff aus Polymethylmethacrylat (PMMA) oder aus Polystyrol (PS).
Bei der Partikelherstellung werden vorzugsweise zudem Suspensionsstabilisatoren
zugesetzt, wie beispielsweise die im Ausführungsbeispiel aufgeführten Substanzen
PVP K-30 und Aerosol OT.
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Ein
Partikeldurchmesser liegt vorzugsweise im Bereich von 10 nm bis
2000 μm,
insbesondere 1 μm bis
50 μm.
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Als
Fluorophore können
organische oder metallorganische Verbindungen, aber auch aus einem
Halbleitermaterial bzw. Metalloxiden oder Metallsulfiden bestehende
Quantenpunkte Verwendung finden. Vorzugsweise enthält das Partikel
ein oder mehrere Fluorophore ausgewählt aus der Gruppe der Polyene,
Azo-Verbindungen, Carboximide/Nitro-Verbindungen/Chinacridone, Chinoide,
Oxazine, Indigoide, Diphenylmethane/Triphenylmethane und deren Derivate,
Polymethine, Porphyrine/Phthalocyanine, Metallkomplexe, insbesondere der
Edelmetalle, Seltenerden oder Übergangsmetalle,
konjugierten Betaine und multiplen Chromophore. Besonders bevorzugt
enthält
das Partikel eine Kombination aus Coumarin- und Rhodaminderivaten
als Fluorophore.
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Ein
Testkit, das auf den vorgenannten Partikeln aufbaut, enthält zwei
oder mehr Chargen aus Partikeln, wobei die Chargen jeweils die gleichen
Fluorophore mit jedoch abweichendem Konzentrationsverhältnis enthalten.
Natürlich
lassen sich auch verschiedene Testkits mit unterschiedlichen Fluorophoren
oder Fluorophorkombinationen kombinieren. Die Partikel verschiedener
Chargen können
demnach die gleiche Größe aufweisen
und aus den gleichen Komponenten zusammengesetzt sein; sie unterscheiden
sich voneinander im Konzentrationsverhältnis der Fluorophore. Die
Partikel der verschiedenen Chargen lassen sich mit Hilfe des erfindungsgemäßen Identifikationsverfahrens
in noch näher
erläuterter
Art und Weise unterscheiden. Mit anderen Worten, in einer zu vermessenden
Probe kann eine Vielzahl gleich großer Partikel vorliegen, die
allesamt zudem die gleichen Fluorophore enthalten. Durch die besondere
Auswahl und Festlegung der Konzentrationsverhältnisse unabhängig von
der Gesamtstoffmenge der Fluorophore ist es jedoch möglich, einzelne Partikel
den bekannten Chargen zuzuordnen. Ein weiterer Aspekt der Erfindung
richtet sich daher auf ein Testkit, das zwei oder mehr Chargen von
Partikeln der vorgenannten Ausführung
enthält.
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Ein
weiterer Aspekt der Erfindung liegt in der Bereitstellung eines
Verfahrens zur Herstellung derartiger Partikel. Das erfindungsgemäße Verfahren
sieht vor, dass die Partikel durch Polymerisation einer Lösung bzw. molekular
oder kolloid dispersen Dispersion der Fluorophore in einem Monomer/Monomerengemisch
erfolgt. Mit anderen Worten, die Fluorophore liegen zunächst gelöst im Monomer
oder – bei
Herstellung eines Copolymers – im
Monomerengemisch vor. Sofern sie sich nicht hinreichend lösen, liegen
sie vorzugsweise molekular dispers (Teilchengröße < 1 nm) oder zumindest kolloid dispers
(Teilchengröße 1 nm
bis 1 μm)
vor. Hierdurch ist sichergestellt, dass die Fluorophore im herzustellenden
Partikel monodispers verteilt sind, also Interaktionen, die die
Emissionseigenschaften beeinflussen könnten, vermieden werden.
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Vorzugsweise
wird die Polymerisation unter radikalischen Bedingungen durchgeführt, insbesondere erfolgt
eine thermisch induzierte freie radikalische Polymerisation bei
20 bis 90°C.
Die genannten Bedingungen erlauben einerseits den Einsatz einer
Vielzahl bekannter Fluorophore, die unter den genannten Versuchsbedingungen
stabil sind, und ermöglichen
andererseits den Rückgriff
auf bekannte Herstellverfahren für
monodisperse Mikropartikel. Bevorzugt werden für die Polymerisation eines
oder mehrere der Monomere ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus substituierten oder unsubstituierten
Acrylaten, Vinylen und Allylen eingesetzt. Denkbar ist auch eine
ionische Polymerisation.
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Ferner
ist bevorzugt, wenn der Lösung/Dispersion
eine oder mehrere oberflächenaktive
Substanzen zugesetzt werden.
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Schließlich wird
bevorzugt, wenn der Lösung/Dispersion
Polyvinylpyrrolidon (PVP) und/oder eine geringe Menge anderer Polymere
wie Polyethylenglykol (PEG) zugesetzt wird.
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Ein
weiterer Aspekt der Erfindung richtet sich auf ein Identifikationsverfahren
von Partikeln der vorgenannten Ausführungsform in einer Probe.
Das Identifikationsverfahren umfasst die Schritte:
- (i) Bestrahlen von vorzugsweise in Monoschicht vorliegenden
Partikeln mit einer oder mehreren Anregungswellenlängen im Überlappungsbereich
der Absorptionsspektren der Fluorophore bzw. im Bereich der Absorptionsmaxima
der Fluorophore (+/– 10%
der Extinktion);
- (ii) Erfassen der Intensitäten
der Fluoreszenz an vorgegebenen Messpunkten, wobei für jeden
im Partikel enthaltenen Fluorophor wenigstens ein Messpunkt vorgegeben
wird, der in einem Bereich von mindestens 5% der Intensität des Fluoreszenzmaximums
des jeweiligen Fluorophors liegt und wobei die Messpunkte um mindestens
5 nm voneinander beabstandet sind;
- (iii) Bestimmen eines Intensitätsverhältnisses der an den Messpunkten
erfassten Intensitäten;
und
- (iv) Vergleichen des bestimmten Intensitätsverhältnisses mit einem Referenzwert
zur Identifikation des Partikels.
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Nach
dem erfindungsgemäßen Identifikationsverfahren
werden demnach zunächst
im Schritt (i) idealerweise in einer Monoschicht vorliegende Partikel
bestrahlt, und zwar in einem Wellenlängenbereich, in dem die Fluorophore
zur Emission angeregt werden. Die Partikel können nur identifiziert werden,
wenn sie jeweils direkt mit dem Anregungslicht erreichbar sind.
Nicht direkt erreichbare Partikel können die Identifikation u.
U. stören
und stellen in jedem Fall einen ungenutzten Materialeinsatz dar.
Es wird daher angestrebt, die Partikel derart anzuordnen, dass eine
möglichst
große
Anzahl der in einer Probe vorliegenden Partikel direkt angestrahlt
werden kann. Darüber
hinaus wird angestrebt, dass viele Partikel in möglichst kurzer Zeit, d. h.
nach Möglichkeit
mehrere Partikel gleichzeitig, direkt angeregt und identifiziert
werden. Diese Kriterien führen
dazu, dass die optimale Verteilung der Partikel in einer Monoschicht
besteht und nicht, wie in herkömmlichen
Verfahren (z. B. Flowzytometer), in der Vereinzelung der Partikel.
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Zur
Erstellung einer Monoschicht werden sich in einer Lösung befindende
Partikel in einer Mikrotiterplatte verteilt. Der Boden der Kavitäten der
Mikrotiterplatte wird derart präpariert,
dass die Partikel daran haften bleiben. Nicht am Boden haftende
Partikel werden wieder abgenommen und können zu einem anderen Zeitpunkt
zur Auswertung genutzt werden.
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Ein
hinreichend genaues Identifikationsergebnis ist auch erzielbar,
wenn eine zweite Partikelschicht über den Zwischenräumen der
Monoschicht liegt. In dem Fall sind sowohl die unteren als auch
die oben liegenden Partikel identifizierbar. Zuletzt ist es auch
möglich,
die Partikel in Lösung,
also zufällig
verteilt, zuzuordnen. Es ist jedoch insofern nachteilig, als dass
die Erkennung sich bewegender Partikel aufwändiger und zeitintensiver ist
und übereinander
liegende Partikel u. U. nicht eindeutig identifiziert werden können und
zur Auswertung somit nicht zur Verfügung stehen.
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Sofern
die Absorptionsspektren der Fluorophore einen Überlappungsbereich aufweisen,
in dem für
jeden Fluorophor eine Extinktion größer 0,001 und eine Quantenausbeute
größer Null
ist, erfolgt vorzugsweise das Bestrahlen im Schritt (i) unter Verwendung
einer einzigen Anregungswellenlänge,
die im Überlappungsbereich
liegt.
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In
dem sich anschließenden
Schritt (ii) werden die Intensitäten
der Fluoreszenz an vorgegebenen Messpunkten erfasst. Diese Messpunkte
liegen am Fluoreszenzmaxi mum bzw. in einem Wellenlängenbereich, an
dem mindestens 5%, vorzugsweise mindestens 50%, besonders bevorzugt
mindestens 90% der Intensität des
Fluoreszenzmaximums vorliegen für
jeden einzelnen Fluorophor. Mit anderen Worten, enthält die Probe zwei
Fluorophore, so sind wenigstens zwei Messpunkte vorzugeben; je einen
für den
ersten und einen für
den zweiten Fluorophor. Natürlich
können
zur Steigerung der Messgenauigkeit auch mehrere Messpunkte in dem genannten
Wellenlängenbereich
dem jeweiligen Fluorophor zugeordnet werden, jedoch ist dies in
der Regel nicht notwendig. Wenn die weiter oben genannten Bedingungen
für die
Lage der Absorptions- und Fluoreszenzmaxima eingehalten werden,
können
die Intensitäten
an den Messpunkten eindeutig erfasst werden.
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Im
Schritt (iii) werden die zuvor an den Messpunkten erfassten Intensitäten zueinander
ins Verhältnis gesetzt.
Das so bestimmte Intensitätsverhältnis wird
im Schritt (iv) mit einem hinterlegten Referenzwert verglichen und
erlaubt so eine Identifikation des Partikels. Das heißt, für die einzelnen
Chargen aus Partikeln mit Fluorophoren unterschiedlicher Konzentrationsverhältnisse
werden im Vorfeld Referenzwerte erstellt, indem die Intensitäten an den
Messpunkten vermessen und zueinander im Verhältnis gesetzt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren
zeichnet sich dadurch aus, dass anhand der Intensitätsverhältnisse
bereits eine eindeutige Identifikation der Partikel unterschiedlicher
Chargen möglich
ist. Die Apparatur zur Durchführung
der spektroskopischen Untersuchung als auch das Identifikationsverfahren
selbst muss nur einmalig auf ein ganz spezifisches spektrales System
eingestellt/optimiert werden, um eine Vielzahl unterschiedlicher
Partikel zu identifizieren. Darin liegt ein großer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens.
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Als
weiterer Identifikationsparameter kann die Fluroreszenzlebensdauer
herangezogen werden. Mit anderen Worten, im Schritt (ii) kann für ausgewählte Fluorophore
zusätzlich
eine Fluoreszenzlebensdauer erfasst werden. Dies ist insbesondere
dann sinnvoll, wenn ein zusätzlicher
Fluorophor (bspw. n-ter Farbstoff) zur Erweiterung der Anzahl unterscheidbarer
Partikel genutzt wird und dieser Fluorophor nicht hinreichend von den
anderen Fluorophoren verschiedene Eigenschaften bez. Absorption
und Fluoreszenzverhalten aufweist.
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Denkbar
ist weiterhin, dass die zu vermessenen Partikel aus Chargen unterschiedlicher
Durchmesser bestehen und im Schritt (ii) zusätzlich eine absolute Intensität der Fluoreszenz
erfasst wird. Im Schritt (iv) wird dann anhand der erfassten absoluten
Intensität
der Fluoreszenz ein Partikeldurchmesser durch einen Vergleich mit
einem Referenzwert bestimmt. Unter Berücksichtigung dieses Parameters
können
demnach Partikel gleicher Fluorophore und gleicher Konzentrationsverhältnisse
der Fluorophore Einsatz finden, die sich jedoch im Durchmesser unterscheiden.
Der Unterschied im Partikeldurchmesser bedingt eine unterschiedliche
absolute Gesamtstoffmenge der Fluorophore, was wiederum zu Unterschieden
in der absoluten Intensität
der Fluoreszenz (an den Messpunkten oder in einem vorgegebenen Wellenlängenbereich)
führt.
Letztgenannter Unterschied dient dann als das Unterscheidungskriterium
für die
Partikel verschiedener Größe.
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Gleichzeitig
ruft auch eine unterschiedliche absolute Gesamtstoffmenge der Fluorophore
bei gleicher Partikelgröße eine
jeweils verschiedene Intensität
hervor, die auf beschriebenem Wege zur Partikelidentifikation genutzt
werden kann. Mit anderen Worten, die zu vermessenden Mikropartikel
können
denselben Durchmesser aber unterschiedliche absolute Fluorophorenstoffmengen
aufweisen und im Schritt (ii) wird zusätzlich eine absolute Intensität erfasst
und der jeweiligen Charge zugeordnet.
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Liegen
in einer Probe Partikel derselben Farbstoffcodierung und gleicher
absoluter Gesamtchromophorenstoffmengen, aber unterschiedlicher
Partikeldurchmesser vor, kann zusätzlich zur Erfassung der Intensitäten der
Fluoreszenz eine optische Objektidentifikation erfolgen. Mit anderen
Worten, wenn die zu vermessenden Partikel aus Chargen unterschiedlicher
Durchmesser bestehen und gleiche absolute Fluorophorenstoffmengen
aufweisen, kann zusätzlich
zur Erfassung der absoluten Intensität der Fluoreszenz eine optische Objektidentifikation
zur Bestimmung der Partikeloberfläche bzw. des Partikeldurchmessers
durchgeführt
werden.
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Die
erfasste absolute Intensität
der Fluoreszenz als Flächenintegral
ist eine Funktion der Partikelgröße und der
enthaltenen Gesamtstoffmenge der Fluorophore. Eine identische erfasste
Intensität
der Fluoreszenz zweier Partikel kann also sowohl aus der tatsächlichen
Gleichheit der Objekte sowie aus Unterschieden in der Partikelgröße bei gleicher
absoluter Farbstoffmenge resultieren und lässt somit gerade keine eindeutigen Rückschlüsse auf
den Partikeldurchmesser zu.
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Über eine
Auswertung der Projektion des emittierten Lichtes auf eine Bildfläche kann
die Partikeloberfläche
bzw. der Durchmesser in solchen Fällen bestimmt werden. Die Erfassung
der absoluten Intensität
zusammen mit der Ermittlung des Partikeldurchmessers macht dann
eine eindeutige Unterscheidung möglich.
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Eine
alternative Erkennung der Partikelgröße liegt in der Erfassung des
rückgestreuten
Anregungslichtes. Die Erkennung der Partikelgröße kann sowohl, wie beschrieben,
zur Unterscheidung verschiedener Populationen als auch zu Korrekturzwecken
eingesetzt werden. Mit anderen Worten, die zu vermessenden Partikel
können
aus Chargen unterschiedlicher Durchmesser bestehen und im Schritt
(ii) wird dann zusätzlich
eine Intensität
des rückgestreuten
Anregungslichtes erfasst und im Schritt (iv) anhand der erfassten
Intensität
des rückgestreuten
Anregungslichtes ein Partikeldurchmesser durch Vergleich mit einem
Referenzwert bestimmt.
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Im
Schritt (ii) wird vorzugsweise zusätzlich ein Oberflächenpotenzial
(z. B. ζ-Potenzial)
bestimmt.
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Bevorzugt
ist weiterhin, dass die zwei oder mehr Fluorophore eines Partikels
einen überlappenden
Absorptionsbereich aufweisen und das Bestrahlen im Schritt (i) unter
Verwendung einer (im Überlappungsbereich liegenden)
oder mehrer Anregungswellenlängen
erfolgt. Mit einer einzigen Anregungsquelle lassen sich gleichzeitig
im Fall oben genannter Kriterien beide Fluorophore zur Fluoreszenz
anregen, so dass das Identifikationsverfahren beschleunigt werden
kann. In jedem Fall jedoch ist eine sehr hohe Identifikationsgenauigkeit (geringe
Abweichung) gewährleistet.
Vorzugsweise liegt die Anregungswellenlänge im Fall zweier vorliegender Fluorophore
im Schnittpunkt der Absorptionsspektren bzw. im Bereich um den Schnittpunkt
mit einer Differenz von bis zu 10% des Wertes der Extinktion am
Schnittpunkt. Im Fall von drei oder mehr Fluorophoren müssen alle
Fluorophore einen gemeinsamen Anregungswellenlängenbereich aufweisen, wobei
in diesem Bereich für jeden
Fluorophor eine Extinktion von mindestens 0,001, vorzugsweise 0,1
bis 1, und eine Quantenausbeute von mindestens 0,01, vorzugsweise
0,5 bis 1, gilt und das Bestrahlen im Schritt (i) unter Verwendung
einer einzigen Anregungswellenlänge
erfolgt, die im Überlappungsbereich
liegt.
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Die
Anregung kann demnach mit einer einzigen oder mit verschiedenen
Lichtquellen bzw. verschiedenen Wellenlängen erfolgen.
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Als
Lichtquellen können
Lampen (Gasentladungslampen ggf. in Kombination mit entsprechenden
Filtern), Laser, LED's
verwendet werden.
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Kurzbeschreibung der Figuren
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Die
Erfindung wird nachfolgend anhand von zwei Ausführungsbeispielen und den dazugehörigen Figuren
näher erläutert. Es
zeigen:
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1 bis 3 Absorptions-
und Fluoreszenzspektren des Systems Coumarin 314/Rhodamin 6G bei zwei
unterschiedlichen Konzentrationsver hältnissen, das eine mögliche Anregung
mit nur einer Wellenlänge zeigt
(Abszisse: Wellenlänge
[nm]; Ordinate: Intensität);
und
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4 Fluoreszenzverhalten
in PMMA bei 11 unterschiedlichen Mischungsverhältnissen eines Systems der
Fluorophore Coumarin 334/Rhodamin 6G, wobei mit zwei Wellenlängen angeregt
wurde (Abszisse: Konzentrationsverhältnis der Fluoreszenzfarbstoffe;
Ordinate: Intensitätsverhältnis der
ermittelten Intensitäten bei
550 nm und 490 nm).
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5 Partikel
des Farbstoffsystems Coumarin 334/Rhodamin 6G unterschiedlichen
Durchmessers und bei verschiedenen Konzentrations- und somit ermittelten
Intensitätsverhältnissen
(Abszisse: Partikeldurchmesser [μm];
Ordinate: Intensitätsverhältnis der
ermittelten Intensitäten
bei 550 nm und 490 nm).
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Ausführliche Beschreibung Ausführungsbeispiel – Herstellung
der Partikel
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Allgemein
kann auf alle Methoden, bei denen durch Reaktion in der Größe einstellbare
Partikel entstehen, zurückgegriffen
werden; speziell auf Fällungspolymerisation,
Emulsionspolymerisation und Suspensionspolymerisation. Nachfolgend
wird die Herstellung von Partikeln anhand der Fällungspolymerisation näher erläutert.
| Eingesetzte
Reagenzien für
die polymere Matrix: | |
| Methanol | 70
ml |
| Methylmethacrylat
(MMA) | 10
ml |
| Polyvinylpyrrolidon
(PVP K-30) | 5
g |
| Natrium
bis(2-ethylhexyl)sulfosuccinat (Aerosol-OT) | 320
mg |
| Azobisisobutyronitril
(AIBN) | 40
mg |
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PVP
und Aerosol-OT wurden in Methanol gelöst vorgelegt. Der Lösung wurde
eine Lösung
des Radikalstarters AIBN in dem Monomer MMA zugesetzt. Anschließend wurde
bei 65°C
Badtemperatur für
24 h mit zirka 100 rpm gerührt.
Die noch warme Suspension wurde auf 300 ml Wasser gegossen, und
der Niederschlag über
eine Fritte abgesaugt und mit Wasser gewaschen.
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Eingesetzte
Fluorophore:
Rhodamin 6G und Coumarin 314 bzw. 334
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Die
Fluorophore wurden in den in der Tab. 1 angegebenen Mengen der Lösung aus
AIBN im MMA zugesetzt.
| Partikel-Nr. | Rhodamin
6G [mg/g Kunststoff] | Coumarin
334 [mg/g Kunststoff] | ermitteltes
Intensitätsverhältnis |
| 1 | 0,475 | 0,015 | 2748 |
| 2 | 0,375 | 0,075 | 15 |
| 3 | 0,250 | 0,150 | 4 |
| 4 | 0,125 | 0,225 | 1 |
| 5 | 0,063 | 0,270 | 0,5 |
| 6 | 0,031 | 0,356 | 0,18 |
| 7 | 0,028 | 0,422 | 0,17 |
| 8 | 0,016 | 0,366 | 0,12 |
| 9 | 0,006 | 0,422 | 0,04 |
| 10 | 0,004 | 0,422 | 0,02 |
| 11 | 0,002 | 0,422 | 0,01 |
Tab.
1 – Mengenverhältnisse
der Fluorophore
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Insgesamt
wurden 11 verschiedene Konzentrationsverhältnisse von Coumarin 334 und
Rhodamin 6G in der genannten PMMA-Matrix hergestellt (vgl. 4).
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Die
nach dem Verfahren erhaltenen Mikropartikel haben einen mittleren
Durchmesser von ca. 9 μm.
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Identifikationsverfahren
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Nach
oben beschriebenem Verfahren wurden Farbstoffmischungen gem. Tab.
1 in den Werkstoff eingebracht. Die erhaltenen Partikel wurden auf
Glasslides befestigt und im Fluoreszenz-Spektralphotometer analysiert.
Das verwendete Gerät
(Shimadzu RF-5301
PC) ist mit einer standardmäßigen Xenon-Lampe
ausgestattet, die das gesamte UV/VIS-Spektrum abdeckt.
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Jedes
Exemplar wurde mit Licht der Wellenlängen 470 nm und 525 nm belichtet
und die Werte der Intensität
der emittierten Fluoreszenzstrahlung bei jeweils 490 nm und 550
nm ermittelt. Diese Intensitätswerte wurden
dann miteinander ins Verhältnis
gesetzt, der erhaltene Wert ergibt den Identifikationsparameter
(vg. 4).
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Den 1 und 2 sind
exemplarisch Anregungspeaks und überlagerte
Fluoreszenzspektren des Systems Coumarin 314/Rhodamin 6G zu entnehmen.
Es sind Fluoreszenzspektren bei zwei unterschiedlichen Konzentrationsverhältnissen,
nämlich
1:15 (1) und 3:1 (2) abgebildet,
die jeweils bei Einstrahlung mit drei verschiedenen Wellenlängen aufgenommen
wurden.
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Der
Peak bei 449 nm resultiert aus der Einstrahlung bei dieser Wellenlänge und
entspricht dem Absorptionsmaximum von Coumarin 314, 525 nm entspricht
analog dem Absorptionsmaximum von Rhodamin 6G. Bei jeweils unterschiedlichen
vorliegenden Konzentrationsverhältnissen
in einer Mischung dominiert daher die Gesamtfluoreszenzintensität (Integral)
des einen oder des anderen Fluorophors und auch die Intensität an ausgesuchten
Messpunkten, wie zusätzlich
in 3 veranschaulicht.
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Der
Peak bei 470 nm resultiert aus der Einstrahlung bei eben der Wellenlänge, die
das ungefähre
Maximum des gemeinsamen Anregungsbereiches darstellt. Werden die
Mischungen der Fluorophore nur bei dieser einen Wellenlänge bestrahlt,
ergeben sich hinreichend unterschiedliche Fluoreszenzspektren, die
eine Identifikation anhand der Verhältnisbildung von Intensitäten an zwei
ausgesuchten Messpunkten erlauben.
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Für die Fluoreszenz
in den Messpunkten ergaben sich Intensitätsverhältnisse von (i) 2,43 (1:15)
und (ii) 0,30 (3:1).
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In
der 4 sind die Intensitätsverhältnisse bei den verschiedenen
Mischungsverhältnissen
der Partikel-Nr. 1–11
zu entnehmen. Zu erkennen ist der lineare Zusammenhang der beiden
Größen über einen
sehr großen
Bereich der Konzentrationen. Das Verhältnis eignet sich daher als
Identifikationsparameter, ggf. auch ohne Hinterlegung konkreter
Referenzwerte, wenn die Funktion bekannt ist.
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5 zeigt
Partikelpopulationen, die sich sowohl hinsichtlich der eingestellten
Konzentrations- und somit ermittelten Intensitätsverhältnisses als auch hinsichtlich
ihres Partikeldurchmessers unterscheiden.