DE102007010866A1

DE102007010866A1 - Vorrichtung und Verfahren zur Durchführung von emersen Mikrokultivierungen bei Mikroorganismen und Zellen

Info

Publication number: DE102007010866A1
Application number: DE102007010866A
Authority: DE
Inventors: Peter-Jürgen Dr. Müller; Martin Dr. Roth; Karin Martin; Gudrun Krauter; Jörg-Hermann Dr. Ozegowski; Josef Dr. Metze; Rainer Dr. Riesenberg
Original assignee: IBA INST fur BIOPROZES und AN; Leibniz-Institut fur Naturstoff-Forschung und Infektionsbiologie Ev -Hans-Knoll-Institut-; Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU; Institut fuer Bioprozess und Analysenmesstechnik eV; Leibniz Institut fuer Naturstoff Forschung und Infektionsbiol eVi; Institut fur Photonische Technologien EV
Current assignee: IBA INST fur BIOPROZES und AN; Leibniz-Institut fur Naturstoff-Forschung und Infektionsbiologie Ev -Hans-Knoll-Institut-; Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU; Institut fuer Bioprozess und Analysenmesstechnik eV; Leibniz Institut fuer Naturstoff Forschung und Infektionsbiol eVi; Institut fur Photonische Technologien EV
Priority date: 2007-03-02
Filing date: 2007-03-02
Publication date: 2008-09-04

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Durchführung von emersen Mikrokultivierungen bei Mikroorganismen und Zellen, insbesondere zur Untersuchung von Wachstum, Morphologie und Metabilismus in adressier- und aufbewahrbarer Form. Die Aufgabe der Erfindung, eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Untersuchung von Wachstum, Morphologie und Metabolismus verschiedenster Mikroorganismen oder Zellen in adressier- und aufbewahrbarer Form auf einfache Weise anzugeben, ohne dass es zu einer Vermischung der verschiedenen Zellen und Mikroorganismen kommt, wird dadurch gelöst, dass die Vorrichtung ein zugstabiles eindimensionales Element und eine Nährstoffe für das Wachstum der Mikroorganismen oder Zellen enthaltende hydrokolloide Matrix, wobei die Matrix von dem Element gehaltert wird, indem die Matrix das Element zumindest teilweise umgibt oder das Element die Matrix ummantelt oder die Matrix das Element ist und das Verhältnis der Länge zum mittleren Durchmesser der Kultivierungsvorrichtung größer als 500 ist.

Description

Vorrichtung und Verfahren zur Durchführung von emersen Mikrokultivierungen bei Mikroorganismen und Zellen
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Durchführung von emersen Mikrokultivierungen bei Mikroorganismen und Zellen, insbesondere zur Untersuchung von Wachstum, Morphologie und Metabolismus in adressier- und aufbewahrbarer Form.
Mikroorganismen und Zellen werden seit Jahrzehnten auf/in verschiedensten Medien kultiviert und untersucht.
Die bisherigen Untersuchungen erfolgen anhand von Oberflächenkulturen in Petrischalen (Emerskulturen), die eine Schicht einer hydrokolloiden Wachstumsmatrix (bspw. in Form eines Nähragar) enthalten, auf deren Oberfläche die Kolonien wachsen bzw. in Flüssigkultur (Submerskultur) (Schlegel H. G.: Allgemeine Mikrobiologie, 6. Auflage, unter Mitarbeit von K. Schmidt. Stuttgart, New York: Thieme, 1985).
Dabei ist bei Emerskulturen der plane Boden der häufig trommelförmigen Petrischale von einer Schicht Nähragar als hydrokolloide Wachstumsmatrix bedeckt. Diese enthält die Wachstumssubstrate und liefert sogleich die für das Wachstum notwendige Feuchtigkeit.
Die Wand der Schale ist Teil des sterilisierbaren Raumes, der durch einen überlappenden, aber nicht luftdicht aufliegenden Deckel verschlossen wird. Durch den Verschluss mit dem Deckel bildet sich ein feuchtes Klima und der Zutritt von Kontaminationen wird verhindert. Der Boden der Petrischale schließt zusammen mit der aufliegenden Wachstumsmatrix den sterilen Raum nach unten ab.
Die Submerskulturen werden als Stand- bzw. Schüttelkulturen fermentiert.
Ausgehend davon, dass die Diversität der für den Menschen nützlichen Stoffwechselleistungen von Mikroorganismen bei weitem nicht ausgeschöpft ist, wird auch zukünftig das Screening nach neuen Mikrorganismen von großer Bedeutung sein (R. H. Baltz, Marcel Faber Roundtable: Is our antibiotic Pipeline unproductive because of starvation, constipation or lack of inspiration? J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 33 (2006), 507–513; J. Berdy, Bioactive Microbial Metabolites. J. Antibiot. 58 (2005), 1–26; F. v. Nussbaum et al.: Antibakterielle Naturstoffe in der medizinischen Chemie – Exodus oder Renaissance. Angew. Chem. 118 (2006), 5194–254).
Das Screening nach Mikroorganismen mit neuen Stoffwechselleistungen erfordert die Untersuchung einer großen Zahl von Mikroorganismen. Aus den Koloniezahlen von Plattierungen auf Agarplatten sind durchschnittliche Lebendkeimzahlen von etwa 10⁶ bis 10⁸ Mikroorganismen pro Gramm Erde ermittelt worden. Um ein Überwachsen bzw. Ineinanderwachsen von Mikroorganismen zu verhindern, muss eine geringe Zelldichte pro Flächeneinheit (idealerweise weniger als 100 Keime auf einer Petrischale von 78 cm² Fläche) erreicht werden. D. h. um allen Mikroorganismen aus 1 g Erde ein Wachstum als Reinkultur zu ermöglichen und somit auch die Isolierung selten vorkommender Arten zu gewährleisten, wären eine Millionen Petrischalen notwendig. Um beispielsweise den Produzenten eines neuen Antibiotikums aufzufinden, müssen schätzungsweise 10⁷ Mikroorganismen kultiviert und getestet werden (R. H. Baltz, Marcel Faber Roundtable: Is our antibiotic Pipeline unproductive because of starvation, constipation or lack of inspiration? J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 33 (2006), 507–513).
Bei den traditionellen Isolierungsverfahren werden sehr geringe Mengen einer Suspension einer Bodenprobe in Verdünnungen auf Agarplatten aufgetragen, um Klone bzw. Reinkulturen zu erhalten, die jeweils auf ein Individuum zurückgehen. Daraus resultieren nur eine beschränkte Anzahl von Kolonien, deren Anzahl bei weitem nicht für die Isolierung großer Zahlen neuer Mikroorganismen ausreicht.
Eine Möglichkeit diese Einschränkungen zu umgehen, ist die Erzeugung sehr kleiner Kolonien, so genannter Mikrokulturen, deren Durchmesser im Bereich von 10 μm bis 100 μm liegen sollte.
Die Vereinzelung von Mikroorganismen zur Gewinnung reiner Klone wird von verschiedenen Autoren vorgeschlagen (Brehm-Stecher BF, Johnson EA. Single-cell Microbiology: Tools Technologies, and Applications. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 2004, 68, 538–559 und Chan ECS, Pelczar MJ, Krieg NR, Verwendung von Reinkulturen – Grundvoraussetzung für das Studium der Mikroorganismen. In: Laboratory Exercise in Microbiology. Chan ECS, Pelczar MJ, Krieg N (eds). McCraw-Rill, New York, (1993) 123–152 und Huber R. Die Laserpipette als Basis für Einzelkultivierung. Biospektrum 4, (1999), 289-291).
Zur Vereinzelung von Mikroorganismen werden auch mikrofluidische Systeme genutzt, bei denen kontinuierlich Sequenzen kleiner wässriger Mikrokulturtröpfchen in einen Strom eines mit Wasser nicht mischbaren Trennmittels injiziert. Sie werden mit dem Trennmittelstrom in eine Kapillare transportiert und inkubiert. Nach der Inkubation wird das Wachstum bevorzugt mit optischen Methoden detektiert. Zur Detektion werden beispielsweise Fluoreszenzspektrometer vorgeschlagen (Martin K, Henkel T, Baier V, Grodrian A, Schön, T, Roth M, Köhler JM and Metze J. Generation of larger numbers of separated microbial populations by cultivation in segmented-flow microdevices. Lab an a chip 3 (2003) 202–207).
Eine weitere Methode, Mikrokulturen von vereinzelten Mikroorganismen zu schaffen, besteht in der Herstellung kleiner viskoser Tropfen, sogenannter Gel-Mikrotropfen (gel microdroplets, GMD) aus einer Probe (Weaver JC, Process for measuring microbial active material, US-Patent 4401755 , 1981; Williams GB, Demain AL, Rapid microbial detection and enumeration using gel microdroplets and colorimetric or fluorescence indicator systems. J. Clinical. Microbiol. 1990, 28, 1002–1008; Manome A, Zhang H, Tani Y, Katsuragi T, Kurane R, Tsuchida T, Application of gel microdroplet and flow cytometry techniques to selective enrichment of non-growing cells. FEMS Microbiol. Lett. 2001, 197, 29–33). Die GMD werden zusammen in einer Nährlösung inkubiert und an jedem einzelnen Kügelchen erfolgt die Detektion des Wachstums.
Mit mikrostrukturierten Wafers bzw. Nanoplates können beispielsweise 6000 Kammern (Mayer G, Wohlfart K, Schober A, and Köhler JM (1999) Nanotiterplates for synthesis and screening. In: Micorosystem technology: a powerful tool for biomolecular studies. Eds. Köhler JM, Mejaveia T, Saluz HP. P. 75–128, Birkhäuser Basel) auf einer Platte kultiviert werden.
Mit piezoelektrischen Zerstäubern, die nach dem Inkjet-Prinzip arbeiten und bis zu 10.000 Mikrotropfen pro Sekunde mit einem Volumen zwischen 5 Picoliter und einigen Nanolitern herstellen, können die Platten mit vereinzelten Mikroorganismen beimpft, inkubiert, detektiert und aufbewahrt werden (Schober A, Günther R, Schwinhorst A, Döring M and Lindemann BF. Accurate High-speed liqiud handling of very small biological samples. BioTechniques (1993) 15, 324–329). Ein nicht gelöstes Problem ist bei dieser Technik die schnelle Austrockung der Mikrokulturen.
Textile Flächengebilde der verschiedensten Ausformungen werden für das Wachstum von Mikroorganismen in Form einer Nährstoffe enthaltenden Matrix eingesetzt (Tatsurn T, Shiro I, Katsutoshi A, Carrier for cultivation of cell and microorganisms. WO9821351 und JP 2154685 ). Bekannt ist außerdem, dass auf textilen Flächen ein unerwünschtes Mikroorganismenwachstum stattfinden kann. Anordnungen, bestehend aus Hohlfasern, werden zur Versorgung von Kulturen mit Nährstoffen bzw. als Kultivierungsbehälter eingesetzt (siehe JP 63309177 und JP63071186 ).
Die DE 100 53 394 A1 verwendet eine Vielzahl angeordneter kurzer Fiberelemente, um auf ihnen Substanzen zu binden und nach Einbringen der Elemente in ein Analysengerät auf ihnen analytische Reaktionen durchzuführen. Der longitudinale Bewegungstyp von Fäden, verbunden mit der Behandlung mit flüssigen Agentien, ist typisch für viele Prozesse bei der Herstellung von textilen Fäden und Textilien (siehe EP 1 369 521 A1 ).
Sich longitudinal bewegende, so genannte "eindimensionale" Festphasen-Reaktoren, z. B. in Form eines Fadens, sind aus DE 10 2004 008 319 A1 bekannt. Der Begriff "eindimensional" beschreibt hierbei Elemente, deren Länge im Vergleich zu ihrem mittleren Durchmesser sehr groß ist und die deshalb allgemein auch als Faden, Fiber, Filament oder Draht bezeichnet werden. Mit ihnen werden Substanzen, darunter auch mikrobielle Kontaminationen, an einem Reaktionsort an den Faden bioaffin gebunden und nach Durchlaufen von weiteren Reaktionsorten qualitatitiv oder quantitativ bestimmt.
Der Nachteil dieser technischen Lösung ist, dass eine Durchführung von mikrobiellen Wachstums- und Produktbildungsprozessen über längere Zeiträume auf diesen eindimensionalen Elementen (Fäden) nicht möglich ist und keine kompakte Stapelung und Bevorratung der bewachsenen Fäden erfolgen kann.
Bewegte Fäden wurden auch für die Durchführung einer Abfolge verschiedener chemischer Reaktionen bei mikropräparativen Arbeiten unter dem Mikroskop eingesetzt. (Mészáros L, Mészáros I.; Kontinuierlich arbeitender Fadenreaktor für mikropräparative Zwecke. Fette, Seifen, Anstrichmittel (2006) 70, 940–941).
Die WO 03/025113 offenbart eine Anordnung und ein Verfahren zur Parallelkultivierung von Mikroorganismen, wobei eine von groben Feststoffen befreiten Suspension oder Kultur einer homogen oder heterogen zusammengesetzte Mikroorganismenpopulation, Nährsubstrate und/oder Effektoren und/oder mikrobielle Metabolite zugesetzt werden, anschließend ein Volumen der mikrobiellen Suspension, welche N Mikroorganismen enthält, mit einem Portionierer in n₁ Teilvolumina geteilt wird, wobei die Zahl n₁ zwischen N und 100 N, bevorzugt zwischen N und 10 N gewählt wird, anschließend die Teilvolmina gegebenenfalls unter Zuführung von Nährsubstraten und/oder Effektoren zur Beimpfung von n₂ separaten Mikrokulturen in Mikroarealen oder Mikrokavitäten, wobei n₂ größer/gleich n₁ ist, verwendet werden, anschließend die Mikrokulturen inkubiert und während des Wachstums gegebenfalls weitere Nährsubstrate und/oder Effektoren und/oder Metabolite zugeführt und physiologische Parameter und das Wachstum der einzelnen Mikrokulturen mit geeigneten Messverfahren erfasst werden.
Gemäß dieser Offenbarung wird zum Vereinzeln der Mikroorganismen ein miniaturisierter Fluidschalter in Verbindung mit einer Mikroinjektionseinheit verwendet, wobei die Mikroorganismen in Flüssigkeitssegmenten in einem geschlossenen Mikrokapillarsystem kultiviert werden. (serieller Fluss).
Der serielle Fluss der Flüssigkeitssegmente wird durch periodisches Wechseln der Volumenflußrate durch Gasblasen oder durch mit Wasser nicht mischbare Trennflüssigkeiten erzeugt, wobei die Flüssigkeitssegmente mit einer Wahrscheinlichkeit <5% mehr als eine Zelle pro Segment enthalten.
Nachteilig an dieser technischen Lösung zur Kultivierung von Mikroorganismen oder Zellen in Mikrokapillaren ist jedoch, dass aufwendig einzelne Flüssigkeitssegmente erzeugt werden müssen und die Wand der Kapillaren bzw. die Flüssigkeitssegmente spezielle Oberflächeneigenschaften aufweisen müssen, damit die Mikroorganismen oder Zellen in den Mikrokapillaren nicht vermischt werden bzw. dass nicht die Mikrokapillaren durch an der Wand anhaftende, Kolonie-bildende Mikroorganismen oder Zeltverbände verstopft werden.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Nachteile des Standes der Technik zu vermeiden und eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Untersuchung von Wachstum, Morphologie und Metabolismus verschiedenster emers wachsender Mikroorganismen oder Zellen in adressier- und aufbewahrbarer Form auf einfache Weise zu ermöglichen, ohne dass es zu einer Vermischung der verschiedenen Zellen und Mikroorganismen kommt.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht auch darin, dass eine sehr große Vielzahl von emersen Mikrokulturen von Mikroorganismen in einer Form hergestellbar sind, bei der auf einer möglichst klein dimensionierten Vorrichtung die Mikrokulturen inkubiert, detektiert, adressiert und außerdem für nachfolgende Entnahmen von Beimpfungsmaterial vorgehalten werden. Um dies zu erreichen, müssen die Mikrokulturen sehr klein dimensioniert werden und sie sollen, um keine exzessiv großen. Kultivierungsflächen zu benötigen, in einer kompakten zwei- bzw. dreidimensionalen Anordnung gespeichert werden können.
Zur Lösung der Aufgabe wird eine erfindungsgemäße eindimensionale bzw. fadenförmige Kultivierungsvorrichtung (KV) vorgeschlagen, die mindestens aus einem zugfesten Element und einer das Wachstum fördernden, Nährstoffe enthaltenden Matrix besteht.
Auf oder in der erfindungsgemäßen Kultivierungsvorrichtung sind linear angeordnete Mikrokultursequenzen kultivierbar, so dass die Mikroorganismen oder Zellen adressierbar kultivier- und aufbewahrbar sind.
Erfindungsgemäß werden die auf die KV aufzubringenden Mikroorganismen in einem Beimpfungsraum auf die Oberfläche oder in das Innere der KV mit einer Impfflüssigkeit übertragen, die KV in einen Inkubationsraum und nach einer Kultivierungszeit die KV mit den gewachsenen Mikrokulturen zu einem Detektionsraum transportiert, wo über bevorzugt optische Detektionsvorrichtungen oder beispielsweise unter Anwendung bioaffiner Nachweismethoden das Mikrokoloniewachstum bzw. die lineare Mikrokultursequenz und der Metabolismus der Mikrokulturen in einer die einzelne Mikrokulturen adressierbaren Weise detektiert wird. Anschließend werden die bewachsenen KV in einen Aufbewahrungsraum transportiert, in dem zur Aufbewahrung geeignete Temperaturen, bevorzugt zwischen 0°C und 12°C vorliegen und wo Zugriffsmöglichkeit zu den einzelnen Mikrokulturen bestehen.
Die bevorzugt in den verwendeten Impfkulturen vereinzelt vorliegenden Mikroorganismen werden dabei auf die Oberfläche oder in das Innere einer eindimensionalen Kultivierungseinrichtung eingebracht. Die beimpften KV werden dann durch Bewegung in longitudinaler Richtung in einen Inkubationsraum, der für das Wachstum günstige Bedingungen aufweist, transportiert und dort in einer möglichst kompakten Form angeordnet. Die Luftfeuchtigkeit im Inkubationsraum muss hoch sein, bevorzugt zwischen 90% und 100% relativer Luftfeuchtigkeit, um ein Austrocknen der hydrokolloiden Kultivierungsmatrix zu verhindern.
Gegebenenfalls erfolgt durch Besprühen mit feindispersen Wassernebel eine zusätzliche Befeuchtung.
Die Temperatur im Inkubationsraum liegt in der Regel zwischen 10°C und 80°C, bevorzugt bei 18°C bis 40°C.
Nachdem die Mikroorganismen bzw. Mikrokulturen gewachsen sind, werden sie mit der eindimensionalen Kultivierungseinrichtung bzw. einer Vielzahl von ihnen, aus dem Inkubationsraum in einen Raum transportiert, wo die Analyse der Stoffwechselprodukte sowie die Kontrolle des Wachstums erfolgt (Detektionsraum) und zugleich eine Möglichkeit zur Adressierung besteht. Anschließend erfolgt in einer Weise ähnlich wie in dem Inkubationsraum der Transport in einen Aufbewahrungsraum, der in der Regel gekühlt ist, um weiteres Wachstum sowie Stoffwechseltätigkeit zu unterbinden. Auch hier werden sie, bevorzugt in einer kompakten Form, gelagert. Der Transport kann durch longitudinale Bewegung beispielsweise in Kombination mit dem Transport der gestapelten Flächen als Ganzes erfolgen. Die longitudinale Bewegung erfolgt in der Regel durch Zugkräfte bzw. ihres Vektors.
In einer anderen Ausführung erfolgt Beimpfung, Inkubation und Detektion der KV kontinuierlich. In einer Ausführungsform erfolgt die Beimpfung der Quasi-Kulturfläche durch Besprühen mit Mikrotropfen, in einer anderen durch Kontakt mit einer Beimpfungsflüssigkeit.
Bevorzugt werden vereinzelte Mikroorganismen eingesetzt. Die Vereinzelung wird hierbei durch eine entsprechend hohe Verdünnung der Beimpfungsflüssigkeiten, die als Beimpfungskultur eingesetzt werden, erreicht.
Eine andere Anwendung der Erfindung betrifft den Nachweis von Substraten, Wirkstoffen, Faktoren und Hormonen. Die Mikrokulturen werden diesen Substanzen ausgesetzt und deren Anwesenheit und Konzentration über Veränderungen im Wachstumsverhalten bestimmt.
Das Wesen der erfinderischen Lösung besteht darin, „eindimensionale" bzw. fadenförmige Kultivierungseinrichtungen zu schaffen, die neben der notwendigen Festigkeit gegenüber Zugkräften zugleich die Möglichkeit bieten, in ihnen oder auf ihnen hintereinander einzelne oder auch mehrere Mikroorganismen aufzubringen und deren Wachstum zu fördern.
Erfindungsgemäß werden Mikroorganismen als Mikrokulturen auf einer Kultivierungsvorrichtung (KV) kultiviert, die aus einem zugstabilen eindimensionalen Element und aus einer Nährstoffe für das Wachstum enthaltenden Matrix besteht und deren Verhältnis Länge der KV zum mittleren KV-Durchmesser größer als 500 ist. Die Längenausdehnung der Mikrokolonien auf dem Faden ist, ohne dass dadurch die Erfindung eingeschränkt wird, bevorzugt kleiner als 1000 μm und der Abstand zwischen dem äußeren Rändern benachbarten Wachstumsbereiche soll 1000 μm nicht unterschreiten.
In besonderen Fällen kann das zugstabile Element gleichzeitig die Funktion der Nährstoffe enthaltenden Matrix aufweisen.
Die Nährstoffe enthaltende Matrix besteht aus den als Wachstumssupport bereits seit langem eingesetzten gelbildenden und hydrophilen Substanzen wie Agar, Pektin, Chitosan, Carrageenan, Hyaluronsäure, Alginsäure, Xanthan, Zellulose, Bakterienzellulose oder deren Derivate und Salze oder Polyelektrolytkomplexen oder anderen hydrokolloiden Gelbildnern oder auch aus wasserspeicherndem Silicagel, Tonerde oder Siliziumpolymere.
Die gelbildenden Substanzen sind vorzugsweise durch Immobilisieren, Härten, Vernetzen oder über mechanische Kräfte bzw. Adhäsion mit Strukturunebenheiten mit dem zugstabilen Element verankert.
Die Strukturunebenheiten können beispielsweise Oberflächentopographien in Form von Löchern, Erhebungen, unidirektionale Furchen oder überlagerte Furchen und/oder konvexe oder konkave Profile oder die Form von Spitzen, Wölbungen oder Blöcken aufweisen.
Die Nährstoffe enthaltende Matrix kann im Inneren der KV oder auf der Oberfläche als kontinuierlich ausgebildeter Mantel oder diskontinuierlich angeordnet sein. Bei der diskontinuierlichen Anordnung können beispielsweise Gel-Tröpfchen äquidistant oder auch unregelmäßig auf der Oberfläche der KV verteilt sein.
Die KV kann monofil ausgebildet sein, bevorzugt werden jedoch polyfile eindimensionale Gebilde wie Garne eingesetzt.
Die KV kann aus Stapelfasern oder aus Endlosfilamenten oder Gemischen beider Typen bestehen.
Mehrere der Fasern oder Filamente können in Form eines Gestrickes oder Gewirkes vorliegen. Bevorzugt wird ein Gestrick in Form eines Schlauches, wobei der gewirkte Schlauchmantel regelmäßige Öffnungen bzw. Maschen aufweist, eingesetzt.
Erfindungsgemäß sind auch Kultivierungsvorrichtungen, bei denen das zugstabile Element durch Pressen durch eine ringförmige Düse in Form eines Schlauches hergestellt wird, der gleichzeitig über eine Düse mit einer Nährstoffe enthaltenden Matrix, die lebende Mikroorganismen enthält, gefüllt wird.
Die Fäden können unterschiedliche Profile wie dreieckig, U-förmig oder sternförmig aufweisen. Auch eine Bandform wie bei den Folienfäden ist dann erfindungsgemäß, wenn bei ihnen ein Breiten/Höhen-Verhältnis von 10 nicht überschritten wird.
Erfindungsgemäß ist beispielsweise ein Folienfaden, auf dem sich in äquidistantem Abstand aus einem oder mehreren Geltropfen gebildete Zonen befinden, welche durch geltropfenfreie Zonen getrennt sind, wobei die Geltropfen die Funktion einer Nährstoffe enthaltenden Matrix aufweisen.
Bevorzugt werden oberflächenstrukturierte KV mit Rillen, die in Längsrichtung verlaufen oder durch Fibrillierung aufgeraute Oberflächen oder netzartig zusammenhängende Fibrillen aufweisen. An solchen Oberflächen ist die Nährstoffe enthaltende Matrix besser gegen Abscheren geschützt bzw. ihre Bindung an das zugstabile Element ist fester. Mikroporosität der KV oder auch eine Kapillarisierung der KV, wie sie beispielsweise durch saugfähige Fasern erzeugt wird, ist auch deshalb günstig, weil in den Mikrostrukturen Wasser und Nährstoffe bevorratet werden kann.
Die KV können weiterhin eine bilaterale Struktur wie Seite-Seite-, Kern/Mantel oder Matrix/Fibrillen aufweisen. Fäden mit mehr hydrophilen Eigenschaften sind deshalb auch günstiger als Fäden mit sehr hydrophoben Eigenschaften. Die Durchmesser solcher geeigneter und bekannter technischen Filamente bzw. Fäden liegt in der Regel zwischen 4 bis 60 μm.
Es werden sowohl Stapelfasern als auch endlose natürlich vorkommende Filamente pflanzlicher, tierischer, mineralischer, anorganischer Herkunft bzw. Fasern aus natürlichen Polymeren bestehend aus Keratin, wie Wolle oder Seide, aus Polyaminosäuren, aus Polysacchariden, wie Carrageenan, Chitosan/Chitin, Alginaten, Zellulose, Viskose oder Baumwolle oder deren Derivaten, Salzen oder Polyelektrolytkomplexen, aus Biokunststoffe wie Polylactat oder Polyalkanoate, aus synthetischen Polymeren wie Polyethylen, Polypropylen, Polyacrylamid, Polystyrol, Polyester, Polyvinylalkohol oder Polyamid oder aus Fasern aus Metall oder Glas eingesetzt.
Die Fasern können als Mikrofaser als Fasermischung oder als Verbundwerkstoff vorliegen.
Vorteilhaft an der vorgeschlagenen Vorrichtung und dem vorgeschlagen Verfahren ist, dass eine sehr große Anzahl von Mikrokulturen, bevorzugt in Form von auf festen Oberflächen gewachsenen Kolonien (emers-Wachstum), erzeugt werden kann.
Diese Wachstumsform, die auch bei der herkömmlichen Agarplattenkultivierung auftritt, ist besonders günstig für das Erkennen bzw. die Detektion der mikrobiellen Produkte im Vergleich zu denen bei Wachstum in Flüssigkulturen entstehenden Formen.
Der für die Produktion von Sekundärmetaboliten günstige Differenzierungszustand der ausgereiften Kolonien als auch die generell hohe Zelldichte führt zur Bildung von höheren und dadurch besser nachweisbaren Konzentrationen.
Durch spezielle Anwendungen der Erfindung entsteht weiterhin eine Reihe von Vorteilen:
Bei herkömmlichem Wachstum von mikrobiellen Kolonien auf herkömmlichen Agarplattenkulturen nimmt die nährstoffbereitstellende Fläche mit dem Quadrat des Abstandes zu. Das bedeutet, dass die Kolonien auf Grund des großen Nährstoffdepots relativ groß werden können, weil Nährstoffe sehr lange nachdiffundieren.
Vorteilhaft an der erfindungsgemäßen eindimensionalen Form der KV ist deshalb, dass die nährstoffbereitstellende Fläche in Richtung der Längsausdehnung der KV nur linear mit dem Abstand wächst. Durch die so begrenzte Diffusion von Nährstoffen wird das Wachstum in longitudinaler Richtung stark verlangsamt, sodass die Kultur während der Kultivierungszeit nur den Umfang der KV und einen relativ kurzen Abschnitt des KV bewachsen kann.
Die letzten Endes erreichte Größe der Mikrokulturen steht in einem engen Zusammenhang mit den Kultivierungsparametern wie der Kultivierungszeit, der für unterschiedliche Mikroorganismen spezifischen Wachstumsgeschwindigkeit, Lag-Phasen und besonders mit der Konkurrenz mit benachbarten Kolonien um die Nährstoffe in den sich überlappenden Arealen sowie außerdem mit strukturellen, als Barrieren wirkenden Elementen der KV.
Diese Barriereelemente werden erfindungsgemäß durch die textile Fadenstrukturen oder auch durch eingebrachte Barrieren gebildet und stehen im Zusammenhang mit dem Typ der als Faden eingesetzten KV.
Bevorzugt in den Zwischenräumen zwischen den einzelnen Fäden aus denen die Filamente z. B. als Gestrick zusammengesetzt sind, kann die Nährstoffe enthaltende Matrix aufgebracht werden. Die so entstandenen Wachstumszonen sind dann teilweise durch die Filamente voneinander getrennt. Aber auch monofile KV sind erfindungsgerecht.
In einer speziellen Ausführung der Erfindung wird die lineare Mikrokultursequenz der auf der KV befindlichen Mikrokulturen durch Replizieren vervielfältigt, indem eine zweite oder auch mehrere KV in engem Kontakt zueinander als lose Mehrfachfäden angeordnet werden oder als miteinander verbundene Mehrfachfäden über Sollbruchzonen getrennt werden. Sie stellen dann nach Abtrennung ein identisches Replikat der Mikrokultursequenz dar, das für weitere Untersuchungen genutzt werden kann.
Bei Anwendung herkömmlicher Methoden zur Replikation, beispielsweise bei der Prüfung auf antimikrobielle Aktivitäten der Mikrokulturen werden diese zwangsläufig mit den Testkeimen verunreinigt oder gehen verloren. Durch die Möglichkeit des erfindungsgemäßen identischen Replizierens kann mit dem Replikat auf die unverfälschte Sequenz der Mikrokulturen auf der KV auch später zurückgegriffen werden.
Der Nachweis der Mikrokulturen und/oder der von ihnen gebildeten Substanzen erfolgt mit an sich bekannten, bevorzugt optischen Methoden. So besteht die Möglichkeit, gemäß der Offenbarung von DE 10 2004 008 319 A1 spezifische Bindungen an bioaffine Substanzen, wie beispielsweise fluoreszierende Antikörper, zu nutzen und die Reaktionen direkt am longitudinal bewegten, mit Mikrokulturen bewachsenen Faden auszuführen.
Die Prüfung auf antimikrobielle Aktivität kann auf herkömmliche Weise durch Auflegen der KV auf eine mit einem Testkeim bewachsenen Agraroberfläche, mittels einer zweiten, in engen Kontakt mit der KV gebrachten und mit dem Teststamm beimpften KV oder durch Beschichten der KV mit einem den Testkeim und Nährstoffe enthaltenden gelförmigen Schicht erfolgen. An den Stellen, wo der Testkeim nicht wächst, entsteht wie beim klassischen Hemmhoftest für den Nachweis von Antibiotika ein nicht mit dem mikrobiellen Testkeim bewachsener Hemmhof.
In einer anderen Ausführung wird die Quasi-Kulturfläche mit einer den Testkeim enthaltenden gelförmigen Schicht überschichtet und anschließend die Hemmzonen registriert. Das Hemmhofsignal kann durch Verwendung eines markierten z. B. fluoreszierenden Testkeims oder durch Anwendung von Redox-Indikatoren wie Tetrazoliumverbindungen verstärkt werden.
Weiterhin ist die Verwendung der erfindungsgemäßen KV vorteilhaft bei der Untersuchung der morphologischen Eigenschaften der Kulturen, weil die KV auf einfache Weise unter dem Objektiv eines Mikroskops bzw. anderer optischer Detektoren entlang geführt und dabei untersucht werden kann.
Eine weitere Lösung der erfinderischen Aufgabe, die KV in einer möglichst kompakten Form bzw. miniaturisierbaren Form anzuordnen, besteht darin, eine Vielzahl von parallel verlaufenden eindimensionalen KV's, darunter auch die losen und die gekoppelten Mehrfachfäden in Form einer in der Regel rechteckigen Fläche als sogenannte Quasi- Kulturflächen anzuordnen. Durch diese Anordnung wird im Vergleich zu einer herkömmlichen Agarkulturfläche erreicht, dass sehr viel mehr Mikrokulturen pro Fläche wachsen können.
Die Quasi-Kulturfläche kann wie eine Agarplattenkultur auch als Ganzes mit Beimpfungsmaterial beimpft, inkubiert und detektiert werden. Die KV werden beispielsweise durch Aufspannen in einer Konstruktion des Aufspannrahmens als Fläche fixiert.
Das Fixieren der KV in den Aufspannrahmen erfolgt beispielsweise durch Einklemmen der parallel zueinander angeordneten KV in die oberen und unteren Rahmenteile mit einer Klemmvorrichtung. Die Aufspannrahmen werden nacheinander durch Einbringen der oberen und unteren Rahmenbegrenzungen in die aus der Beimpfungszone austretenden Quasi-Kulturflächen eingeschoben und durch ihr geeignetes Anheben oder Absenken die Quasi-Kulturfläche angehoben oder abgesenkt und zu den Quasi-Kulturfläche nach Einklemmen mit dem Aufspannrahmen formiert.
Das Aufwickeln auf Rahmen führt zu paarigen Quasi-Kulturflächen. Durch die Stärke des Rahmens wird hierbei der Abstand zwischen den paarig auftretenden Quasi-Kulturflächen bestimmt. Die verbindenden Fäden zwischen den einzelnen Flächen können mit Hilfe einer Schneideeinrichtung durchtrennt werden und so die einzelnen Aufspannrahmen mit den in ihnen aufgespannten Quasi-Kulturflächen separat bearbeitet werden.
Der Transport der KV aus dem Beimpfungsraum erfolgt bevorzugt durch das Spannen der KV in dem Aufspannrahmen, der in einer Ausführung dabei eine drehende Bewegung vollführt, bei welchen der Zugkraftvektor, der bei der Drehung des Rahmens entsteht, die KV durch den Beimpfungsraum und gegebenenfalls durch den Beschichtungsraum zieht.
Erfinderisch ist aber auch das Aufwickeln der KV auf eine Spule oder Haspel. Dabei werden möglichst wenig Berührungspunkte zwischen der Spule bzw. Haspel und den KV erzeugt, Abstandshalter eingesetzt bzw. eine inerte Schicht z. B. in Form eines Flächengebildes zwischen den Quasi-Kulturflächen angebracht, um eine partielle Zerstörung der mechanisch instabileren Nährstoffe enthaltenden Matrix zu vermeiden.
Bei Untersuchungen zum Einfluss von Substraten, Wirkstoffen, Puffersubstanzen oder Faktoren werden diese entweder in der Nährstoffe enthaltenden Matrix deponiert oder während der Kultivierung durch Auftropfen, Versprühen oder durch direkte Zugabe zu den KV bzw. Quasi-Kulturflächen zugegeben.
Ein weiterer Vorteil ist eine wesentliche Erhöhung der Mikrokoloniedichte pro Volumeneinheit durch eine dreidimensionale Speicherung der KV. Gemäß der Erfindung wird eine Vorrichtung vorgeschlagen, bei der mit Hilfe beweglicher Anordnungen die Quasi-Kulturflächen parallel zueinander gestapelt werden, so dass sich eine dreidimensionale Anordnung der KV in Form eines Stapels ergibt. Der Stapel stellt eine kompakte Form dar, mit der eine sehr hohe Mikrokulturdichte realisiert werden kann.
Die dreidimensionale Anordnung kann auch durch eine direkte, ohne vorherige Formierung als Quasi-Kulturfläche erfolgte parallele oder durch eine um 90° verschobene dreidimensinale Anordnung der KV erfolgen.
Die Mikrokulturen werden in der dreidimensionalen Anordnungsform beispielsweise inkubiert und aufbewahrt. Vorteilhaft ist, dass bei einem genügend großen Abstand der KV bzw. Quasikulturflächen voneinander, die Versorgung mit Sauerstoff als auch die Aufrechterhaltung von Temperatur und Luftfeuchtigkeit auch im Inneren des Stapels gewährleistet werden kann.
In einer größer dimensionierten Ausführung der Erfindung erfolgen Beimpfung als auch die Wachstums- und Produktbildungsuntersuchungen innerhalb eines Zeitraumes ständig und kontinuierlich.
Die beimpfte KV wird auf eine Verzögerungstrommel bzw. Verzögerungshaspel mit einer Vielzahl von Verzögerungswickelungen aufgespult und das andere Ende gleichzeitig wieder abgespult, dann einem Detektorraum zugeführt, detektiert und gegebenenfalls anschließend der Doppelfaden in zwei Einzelfaden aufgetrennt und unterschiedlich genutzt. Es können auch zwei oder mehrere Fäden über Sollbruchstellen miteinander verbunden vorliegen, die durch mechanische Kräfte oder chemische Behandlungen voneinander getrennt werden.
Potentielle Anwendungsgebiete der Erfindung sind das Hochdurchsatzscreening nach neuen Mikroorganismen sowie Untersuchungen zum Einfluss von Substraten, Wirkstoffen oder Faktoren, die durch Mikroorganismen gebildet werden oder der analytische Nachweis von physiologisch aktiven Substanzen mit Mikroorganismen als Testkeim.
Die Erfindung wird nachstehend an Hand der Zeichnungen und des Ausführungsbeispiels näher erläutert. Es zeigen:
1 eine schematische Darstellung einer ersten Ausführungsform der erfindungsgemäßen eindimensionalen Kultivierungseinrichtung in einer Seitenansicht (zeitlicher Ablauf der Herstellung und Nutzung),
2 eine schematische Darstellung einer zweiten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung in einer Seitenansicht,
3 eine schematische Darstellung einer dritten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung in einer Seitenansicht;
4 eine schematische Darstellung des Ablaufs einer erfindungsgemäßen Verfahrensvariante unter Verwendung einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung in einer Seitenansicht;
5 eine schematische Darstellung einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung mit einem aus mehreren Quasi-Kulturflächen zusammengesetzten Stapel, der sich in einem Detektionsraum befindet, in einer Seitenansicht,
6 eine schematische Darstellung der Beimpfung eines von einer Spule 9 abgewickelten Mehrfachfadens in Form eines Doppelfadens in einer Seitenansicht und
7 eine schematische Darstellung eines mit Mikrokulturen bewachsenen, als Doppelfaden ausgebildeten losen Mehrfachfadens in einem Querschnitt.
Die 1 zeigt in Seitenansicht schematisch den zeitlichen Ablauf der Herstellung und Nutzung eines speziellen Typs der erfindungsgemäßen eindimensionalen Kultivierungseinrichtung 1 (KV). Rechts in der 1 ist die Herstellung einer eindimensionalen Kultivierungseinrichtung 1 (KV) nach einem Stranggussverfahren mittels einer Spinndüse 2, die in ihrem äußeren Hohlraum 3 das Material für den schlauchförmigen zugstabilen Mantel 7 der KV 1 und in einer innen liegenden Düse das Matrixmaterial 4, aus dem die Nährstoffe enthaltenden Matrix 8 entsteht, zusammen mit den zur Beimpfung dienenden vereinzelten Mikroorganismen 6 enthält, dargestellt.
Beim Spinnen des Fadens wird gleichzeitig das Innere mit dem Material der hydrokolloiden Matrix 7, welches außerdem Mikroorganismen als Beimpfungsmaterial enthält, gefüllt.
Nach dem Härten der zugstabilen Matrix, bevorzugt durch Behandlung in einem Fällungsbad 5 oder andere chemische oder physikalische Prozesse entsteht der auf der linken Seite dargestellte Abschnitt der funktionsfähigen KV 1. In ihrem Inneren enthält sie die meist flüssige oder halbfeste Kultivierungsmatrix 8 mit den gewachsenen Kolonien 6. Die Kultivierungsmatrix ist von dem in der Regel sauerstoffdurchlässigen Mantel umgeben, der in diesem Beispiel gleichzeitig das zugstabile Element 7 darstellt.
Ausgewählte Mikrokulturen können bei dieser Art der Ausführung durch Ausschneiden des die ausgewählte Mikrokultur enthaltenden Abschnitts gewonnen und anschließend zur Beimpfung von nachfolgenden Kulturen eingesetzt werden.
Die 2 zeigt in Seitenansicht einen weiteren speziellen Typ der eindimensionalen KV 1, die aus einem innen liegenden zugstabilen Element 7 und einer als Beschichtung ausgeführten, Nährstoffe enthaltenden Matrix 8 besteht und mit mikrobiellen Kolonien 6 bewachsen ist.
Die 3 zeigt in Seitenansicht einen mit Kolonien 6 bewachsenen anderen speziellen Typ der eindimensionalen Kultivierungseinrichtung KV 1, bei dem die Nährstoffe enthaltende Matrix 8 von einem außen liegenden zugstabilen Element 7 in Form eines textilen Geflechts umschlossen wird.
Die 4 zeigt schematisch den Ablauf einer erfindungsgemäßen Verfahrensvariante unter Verwendung einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung in Seitenansicht, bei der von einer Spule zugstabile Elemente 7 in Form eines Faden abgespult werden und die Beschichtung im Imprägnierungsraum 10 mit dem Matrixmaterial 4 erfolgt.
Mittels Andruck- bzw. Umlenkrollen 11 wird hierbei der Faden in das verflüssigte Matrixmaterial 4 gedrückt.
Die nach Verfestigung des Matrixmaterials gebildete eindimensionale Kultivierungsvorrichtung KV 1 wird anschließend in einem Beimpfungsraum 12 durch die Rollen 11 in das Beimpfungsmaterial gedrückt. Die KV 1 wird anschließend durch Zugkräfte 14 in einen Inkubationsraum 13 transportiert, in dem sie für die Dauer der Kultivierungszeit in Form eines Stapels 15 verbleibt.
Die 5 zeigt schematisch einen aus mehreren Quasi-Kulturflächen 17 zusammengesetzten Stapel 15, der sich in einem Detektionsraum 16 befindet.
Jede Quasi-Kulturfläche besteht aus einem Rahmen 18, auf dem die KV 1 parallel nebeneinander aufgespannt sind.
Die Detektion der auf den KV 1 gewachsenen Kulturen bzw. Kolonien 6 erfolgt beispielsweise berührungslos über ein an sich bekanntes optisches Detektorsystem, bestehend aus einer Lichtquelle 19, die mit einem Lichtstrahl 20 die KV 1 bzw. die auf ihnen befindlichen Mikrokulturen abgetastet und mit einem Fluoreszenzempfänger 21 mit einem angeschlossenen Rechner 22 die Fluoreszenzsignale auswertet.
Die 6 zeigt in Seitenansicht die Beimpfung eines von einer Spule 9 abgewickelten Mehrfachfadens in Form eines Doppelfadens 23 bzw. einer doppelten KV 1, der in einem Beimpfungsraum 12 beimpft, auf einer Verzögerungstrommel 24 mit einer Vielzahl von Wicklungen aufgespult und das andere Ende gleichzeitig wieder abgespult, einem Detektorraum 16 zugeführt, detektiert und anschließend der Mehrfachfaden 23 in zwei Einzelfäden abgetrennt wird. Die in der Abbildung unten noch einmal in der Aufsicht 25 dargestellte Verzögerungstrommel zeigt das Wickelungsschema des Doppelfadens.
Die 7 zeigt im Querschnitt einen mit Mikrokulturen 6 bewachsenen, als Doppelfaden ausgebildeten losen Mehrfachfaden 26, bei der sich die Wachstumsmatritzen der beiden Fäden in engen Kontakt befinden und weiterhin gekoppelten Mehrfachfaden 27, bei dem die zugfesten Elemente zweier parallel angeordneter Fäden untereinander durch eine Sollbruchstelle 28 verbunden sind. Die KV bestehen auch hier aus einem zugstabilen Element 7 und einer Nährstoffe enthaltenden Matrix 8.
In einer nicht durch Abbildungen dargestellten Ausführung der erfindungsgemäßen Vorrichtung werden eine, zwei oder eine Mehrzahl von sich in longitudinaler Richtung bewegende Kultivierungseinrichtungen (KV) kontinuierlich beimpft, kultiviert und detektiert. Durch Trennung der sich in einer Ausführung der Erfindung während der Inkubation in engem Kontakt befindlichen eindimensionalen Kultivierungseinrichtungen (Mehrfachfäden) ist es möglich, die Mikrokultursequenz identisch zu replizieren. In einer anderen Ausführung wird eine auf einem Rahmen angeordnete Vielzahl parallel angeordneter eindimensionaler Kultivierungseinrichtungen, die eine Quasi-Kulturfläche bilden, in einer kompakten, zwei- oder nach Stapelbildung auch dreidimensionalen Anordnung inkubiert, dann flächenweise oder in Fadenform detektiert und anschließend in kompakter Form zugriffsbereit aufbewahrt.
Ein bevorzugtes Anwendungsgebiet der Erfindung ist die Kultivierung großer Zahlen von Mikroorganismen, bevorzugt in Form von Klonen, zur Charakterisierung und Typisierung ihrer Wachstums- und Stoffwechseleigenschaften sowie der Entwicklung morphologischer Merkmale im Zusammenhang mit chemischen Einflussgrößen und Kultivierungsparametern. Außerdem ist sie anwendbar für das Hochdurchsatzscreening nach neuen Mikroorganismen mit besonderen metabolischen Leistungen und Produktbildungen.
Alle in der Beschreibung und den nachfolgenden Ansprüchen dargestellten Merkmale können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination miteinander erfindungswesentlich sein.

1: Kultivierungsvorrichtung (KV)
2: Spinndüse
3: äußerer Hohlraum
4: Matrixmaterial
5: Fällungsbad
6: Kulturen, Kolonien
7: zugstabiles Element
8: hydrokolloide Nährstoffe enthaltende Matrix
9: Spule
10: Imprägnierungsraum
11: Umlenk- bzw. Andruckrollen
12: Beimpfungsraum
13: Inkubationsraum
14: Zugkräfte bzw. Bewegungsrichtung
15: Stapel
16: Detektionsraum
17: Quasi-Kulturfläche
18: Aufspannrahmen
19: Lichtquelle
20: Lichtstrahl
21: Fluoreszenzempfänger
22: Rechner
23: Doppelfaden
24: Verzögerungstrommel, Seitenansicht
25: Verzögerungstrommel, Aufsicht
26: loser Mehrfachfaden
27: gekoppelter Mehrfachfaden
28: Sollbruchzone
29: Aufbewahrungsraum

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

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Claims

Vorrichtung zur emersen Mikrokultivierung von Mikroorganismen oder Zellen umfassend ein zugstabiles eindimensionales Element (7) und eine, Nährstoffe für das Wachstum der Mikroorganismen oder Zellen enthaltende hydrokolloide Matrix (8), wobei die Matrix (8) von dem Element (7) gehaltert wird, in dem die Matrix (8) das Element (7) zumindest teilweise umgibt oder das Element (7) die Matrix (8) ummantelt oder die Matrix (8) des Elemente (7) ist, und das Verhältnis der Länge zum mittleren Durchmesser der Kultivierungsvorrichtung (KV, 1) größer als 500 ist.
Vorrichtung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Matrix (8) in Form diskontinuierlich verteilter Zonen oder Flecken oder Tropfen oder Anhäufungen, gegebenenfalls in beimpfter Form, mit regelmäßiger oder unregelmäßiger Verteilung auf der KV (1) vorhanden ist.
Vorrichtungen gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Nährstoffe enthaltende Matrix wasserbindende polysaccharidische Verbindungen wie Agar, Pektin, Chitosan, Alginsäure, Hyaluronsäure, Xanthan, Carrageenan, Zellulose, Bakterienzellulose oder deren Derivate oder Salze oder Polyelektrolytkomplexe oder anorganische Materialien wie Silicagel oder Tonerden oder Siliciumpolymere enthält.
Vorrichtungen gemäß Anspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Element (7) und die Matrix (8) von einem Inkubationsraum (13) umgeben sind.
Vorrichtungen gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Inkubationsraum (13) mit einem Detektionsraum (16) verbunden ist.
Vorrichtungen gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektionsraum (16) mit einem Aufbewahrungsraum (29) verbunden ist, wobei sich der Detektionsraum (16) zwischen dem Inkubationsraum (13) und dem Aufbewahrungsraum (29) befindet.
Vorrichtung gemäß einem oder mehrerer der voran stehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in dem Inkubationsraum (13) eine hohe Luftfeuchtigkeit einstellbar ist.
Vorrichtung gemäß einem oder mehrerer der voran stehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in dem Inkubationsraum (13) eine Temperatur von 10°C bis 80°C einstellbar ist.
Vorrichtung gemäß einem oder mehrerer der voran stehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zwei oder mehrere KV (1) durch eine in Längsrichtung verlaufende Sollbruchzone, die durch mechanische oder chemische/biochemische Einwirkung getrennt werden kann, als gekoppelte Mehrfachfäden (27) miteinander verbunden sind.
Vorrichtung gemäß einem oder mehrerer der voran stehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Element (7) aus Biopolymeren in Form von Keratin, Wolle oder Seide, aus Polyaminosäuren, aus Polysacchariden, in Form Carrageenan, Chitosan/Chitin, Alginaten, Zellulose, aus Viskose oder aus Baumwolle oder deren Derivaten, aus Salzen oder aus Polyelektrolytkomplexen, aus Biokunststoffe in Form Polylactat oder Polyalkanoate, aus synthetischen Polymeren in Form von Polyethylen, Polypropylen, Polyacrylamid, Polystyrol, Polyester, Polyvinylalkohol oder Polyamid oder aus Metall- bzw. Glas- bzw Kohlenstofffasern besteht.
Vorrichtung gemäß einem oder mehrerer der voran stehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Element (7) aus textiltechnischen Fasern oder Filamenten in Form von Stricken, Gestricken, Gewirken oder Geflechten oder schlauchförmige Gewebe, besteht.
Vorrichtung gemäß einem oder mehrerer der voran stehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Element (7) aus textilen Garnen oder Nähseide besteht.
Vorrichtung gemäß einem oder mehrerer der voran stehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Element (7) aus Biokunstoffen in Form von Polyalkanoaten, Polymilchsäure, aus semisynthestischen oder aus synthestischen Kunststoffen in Form von Polyamid, Polyethylen, Polypropylen, Polystyrol oder Polyvinylchlorid besteht.
Vorrichtung gemäß einem oder mehrerer der voran stehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die KV (1) ein flachovales bis kreisförmiges Profil mit einem Höhe/Breite Verhältnis von 0,1 bis 1,0 aufweist.
Vorrichtung gemäß einem oder mehrerer der voran stehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die KV (1) in longitudinaler Richtung verlaufende Längsrillen bzw. ein sternförmiges Profil aufweist.
Vorrichtungen gemäß einem oder mehrerer der voran stehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Element (7) oder das Element (7) mit Matrix (8) auf eine Spule (9) aufwickelbar ist.
Verfahren zur Mikrokultivierung von Mikroorganismen oder Zellen bei dem eine Vorrichtung gemäß einem oder mehrer der voran stehenden Ansprüche verwendet wird.
Verfahren gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die auf die Matrix (8) aufzubringenden Zellen der Mikroorganismen in einem Beimpfungsraum (12) auf die Oberfläche oder in das Innere der Matrix (8) mit einer Impfflüssigkeit übertragen, die Matrix (8) in den Inkubationsraum (13) transportiert und nach einer Kultivierungszeit die Mikrokulturen zu dem Detektionsraum (16) transportiert werden, in dem über Detektionsvorrichtungen (19, 20, 21, 22) das Mikrokoloniewachstum und die lineare Mikrokultursequenz analysiert und Metabolite der Mikrokulturen in einer die einzelnen Mikrokulturen adressierbaren Weise detektiert werden und die Matrix (8) anschließend in einen Aufbewahrungsraum (29) transportiert werden, in dem für das Überleben der zu lagernden Mikroorganismen geeignete Temperaturen vorliegen, so dass auf die einzelnen Mikrokulturen gezielt zugegriffen werden kann.
Verfahren gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass im Inkubationsraum (13) eine hohe Luftfeuchtigkeit, zwischen 90% und 100% relative Luftfeuchtigkeit, vorliegt, bzw. durch Besprühen mit feindispersem Wassernebel eine zusätzliche Befeuchtung der Nährstoffe enthaltenden Matrix (8) erfolgt und die Temperatur zwischen 10°C und 80°C liegt.
Verfahren gemäß einem oder mehrerer der voran stehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass den Mikrokulturen Substrate, Wirkstoffe, Faktoren, unter anderem durch Aufsprühen, zugeführt und deren Anwesenheit und Konzentrationen analytisch über Veränderungen im Wachstumsverhalten der Mikrokulturen bestimmt werden.
Verfahren gemäß einem oder mehrerer der voran stehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass im Verlauf einer Replizierung eine oder mehrere sich in Längsrichtung eng berührende KV (1) als lose Mehrfachfäden (26) gemeinsam inkubiert werden und dass später eine oder mehrere davon abgetrennt und in einem Aufbewahrungsraum (29) als identische Replikate der Mikrokoloniesequenz aufbewahrt bzw. genutzt werden.
Verfahren gemäß einem oder mehrerer der voran stehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die KV (1) vor dem Durchlaufen des Beimpfungsraumes kontinuierlich in einem Imprägnierungsraum (10) mit der Nährstoffe enthaltenden Matrix (8) präpariert wird.
Verfahren gemäß einem oder mehrerer der voran stehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Beimpfung der KV (1), darunter auch sich berührender KV (1) für das Replizieren, Kontakt mit einer Mikroorganismen enthaltenden Beimpfungsflüssigkeit, oder durch Auftragen der Beimpfungsflüssigkeit mit einem Pipettierer erfolgt.
Verfahren gemäß einem oder mehrerer der voran stehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass beim Kontakt der Oberfläche der KV (1) und der Beimpfungsflüssigkeit pro mm Länge der KV (1) durchschnittlich nicht mehr als eine lebende Mikrooorganismenzelle übertragen wird bzw. dass sich in der pro mm Länge übertragenen Flüssigkeitsmenge der Beimpfungsflüssigkeit durchschnittlich nicht mehr als eine Zelle befindet.
Verfahren gemäß einem oder mehrerer der voran stehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Transport der KV (1) bei der Beimpfung in longitudinaler Richtung (14) erfolgt.
Verfahren zur Herstellung einer Vorrichtung gemäß einem oder mehrerer der Ansprüche 1 bis 15 bei dem das Element (7) durch Pressen über den äußeren Hohlraum einer ringförmigen Düse in Form eines Schlauches hergestellt und dieser gleichzeitig über eine innerhalb der ringförmigen Düse angeordnete zweite Düse mit einem Nährstoffe und Mikroorganismen zur Beimpfung enthaltenden Matrix (8) enthält, gefüllt wird.
Verfahren zur Herstellung einer Vorrichtung gemäß einem oder mehrerer der Ansprüche 1 bis 15 gemäß Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass das mit der Matrix (8) ummantelte Element (7) chemisch oder physikalisch gehärtet wird.
Verfahren zur Herstellung einer Vorrichtung gemäß einem oder mehrerer der Ansprüche 1 bis 15 gemäß Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Verfahrensschritte Beimpfen, Inkubieren und Detektieren kontinuierlich an longitudinal bewegten KV (1) erfolgen.
Verwendung einer Vorrichtung gemäß einem oder mehrerer der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass eine Mehrzahl von KV (1) parallel angeordnet, in einem Aufspannrahmen zu einer Quasi-Kulturfläche (17) aufgespannt ist, in dem die KV (1) am Aufspannrahmen (18) befestigt sind und mit diesem gemeinsam transportiert, inkubiert, detektiert und/oder aufbewahrt werden.
Verwendung gemäß einem oder mehrerer der voran stehenden Ansprüche, dadurch, gekennzeichnet, dass der Transport der KV (1) bei der Beimpfung in longitudinaler Richtung (14) erfolgt.
Verwendung gemäß einem oder mehrerer der voran stehenden Ansprüche, dadurch, gekennzeichnet, dass das zugstabile Element der KV (1) oder die komplette KV (1) auf eine Spule (9) aufgewickelt ist, von der sie durch Zugkräfte (14) abgespult wird.
Verwendung gemäß einem oder mehrerer der voran stehenden Ansprüche, dadurch, gekennzeichnet, dass eine Mehrzahl parallel angeordneter KV (1), gegebenenfalls auch gekoppelte Mehrfachfäden (27) oder loser Mehrfachfäden (26), in einem Aufspannrahmen zu einer Quasi-Kulturfläche (17) aufgespannt, am Aufspannrahmen (18) befestigt und mit dem Aufspannrahmen (18) gemeinsam transportiert, inkubiert, detektiert und/oder aufbewahrt werden.
Verwendung gemäß einem oder mehrerer der voran stehenden Ansprüche, dadurch, gekennzeichnet, dass die KV (1) im Inkubationsraum (13) und im Aufbewahrungsraum (29) auf Spulen (9) oder Haspeln aufgespult oder mit Hilfe des Aufspannrahmens (18) in gespannter Form waagerecht oder senkrecht als Stapel (15) angeordnet werden.
Verwendung gemäß einem oder mehrerer der voran stehenden Ansprüche, dadurch, gekennzeichnet, dass bei der Inkubation und/oder beim Aufbewahren ein direkter Kontakt benachbarter KV (1) und benachbarter Quasi-Kultur-flächen (17) durch Zwischenräume verhindert bzw. eine berührungslose Anordnung gegebenenfalls durch Abstandshalter gewährleistet wird.
Verwendung gemäß einem oder mehrerer der voran stehenden Ansprüche, dadurch, gekennzeichnet, dass die Verfahrensschritte Beimpfen, Inkubieren und Detektieren kontinuierlich an longitudinal bewegten KV (1) erfolgt.