DE102007003524A1

DE102007003524A1 - Arzneimittel zur Behandlung und/oder Prävention von Arteriosklerose

Info

Publication number: DE102007003524A1
Application number: DE102007003524A
Authority: DE
Inventors: Florian Prof. Dr. Lang; Diana Maria Sandulache
Original assignee: Medice Arzneimittel Puetter & Co KG GmbH; MEDICE ARZNEIMITTEL PUETTER GM
Current assignee: Medice Arzneimittel Puetter & Co KG GmbH; MEDICE ARZNEIMITTEL PUETTER GM
Priority date: 2007-01-19
Filing date: 2007-01-19
Publication date: 2008-09-04
Also published as: EP2120947A1; WO2008087010A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Arzneimittel zur Behandlung und/oder Prävention von Arteriosklerose, ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Arzneimittels sowie ein Verfahren zur therapeutischen und/oder prophylaktischen Behandlung eines Lebewesens, das von Arteriosklerose betroffen ist und/oder bei dem die Gefahr von Arterionsklerose besteht.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Arzneimittel zur Behandlung und/oder Prävention von Arteriosklerose, ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Arzneimittels sowie ein Verfahren zur therapeutischen und/oder prophylaktischen Behandlung eines Lebewesens, das von Arteriosklerose betroffen ist und/oder bei dem die Gefahr von Arteriosklerose besteht.
Arzneimittel zur Behandlung und/oder Prävention von Arteriosklerose, Verfahren zur Herstellung solcher Arzneimittel sowie Verfahren zur therapeutischen und/oder prophylaktischen Behandlung eines von Arteriosklerose betroffenen Lebewesens sind im Stand der Technik allgemein bekannt.
Die Arteriosklerose ist ein hochkomplexer, aktiver pathologischer Prozess, in dessen Zentrum eine inflammatorische Reaktion in den Wänden der blutführenden Gefäße eines betroffenen Individuums steht. Die Entstehung der Arteriosklerose kann in mehrere Phasen unterteilt werden.
Die frühe Phase der Arteriosklerose ist gekennzeichnet durch eine sogenannte endotheliale Dysfunktion. Eine Reihe unterschiedlicher Risikofaktoren wie z. B. Rauchen, Übergewicht, körperliche Inaktivität, Hyperlipoproteinämie und Typ-II-Diabetes sowie andere bislang noch nicht identifizierte Faktoren führen zu einer Schädigung des Endothels. Die Permeabilität des Endothels für Lipoproteine und andere zirkulierende Stoffe im Plasma nimmt hierdurch zu. In der Folge werden Endothelzellen aktiviert und exprimieren vermehrt sogenannte Adhäsionsmoleküle auf der Zelloberfläche. Darunter vermitteln vor allem sogenannte Selektive zunächst den temporären Kontakt bestimmter Blutzellen wie Monocyten und T-Lymphocyten mit dem Endothel. Durch eine weitere Gruppe von Adhäsionsmolekülen, den sogenannten Cellular Adhesion Molecules (CAMs), kommt es zur festen Anheftung dieser Zellen an die Gefäßwand. Insbesondere an Gefäßverzweigungen – den Stellen, an denen gehäuft arteriosklerotische Läsionen entstehen – spielen zudem mechanische Kräfte eine Rolle. Erhöhte Scherkräfte können die Bildung von endothelialem Stickstoff (NO) verringern. NO wirkt Gefäßerweiternd und besitzt antiinflammatorische Eigenschaften. Darüber hinaus führen erhöhte Scherkräfte zu gesteigerter Bildung von Adhäsionsmolekülen mit den oben geschilderten Folgen.
Im weiteren Verlauf dringen vor allem Monocyten und in geringerem Ausmaß T-Lymphocyten in den subintimalen Raum ein. Dieses Eindringen wird durch eine andere Gruppe von Molekülen, zu denen z. B. das Chemokin Monocyte-Chemoattractant-Protein-1(MCP-1) gehört, vermittelt. Es kommt zur Differenzierung der Monocyten in Makrophagen im subintimalen Raum.
Im geschädigten Endothel kommt es ferner zur Oxidation von Lipoprotein mit geringer Dichte (LDL) und dadurch zur Bildung von oxLDL. Das oxLDL wird in den subintimalen Raum abgegeben, wo es die dort aus Monocyten hervorgegangenen Makrophagen belädt. Diese Makrophagen werden durch die Beladung mit oxLDL zu sogenannten Schaumzellen transformiert, den charakteristischen Zellen der arteriosklerotischen Plaques, die als weitere Bestandteile u. a. T-Lymphocyten und aus der Media eingewanderte Glattmuskelzellen enthalten.
Ein solcher arteriosklerotischen Plaque lagert sich an den Arterienwänden ab und wird dabei von einer stabilisierenden fibrösen Kappe bestehend aus Glattmuskelzellen und extrazellulärer Matrix überzogen. Der arteriosklerotischen Plaque steht nun im Zentrum einer inflammatorischen Reaktion, bei der es zur Produktion von verschiedensten Entzündungsmediatoren kommt, wie Cytokinen, Chemokinen, Proteasen etc. Dabei kann es zu Gewebenekrosen kommen, in deren Nachbarschaft Kalksalze abgelagert werden. Dadurch kann das Gefäßlumen bis zum völligen Verschluss mit der Folge von Durchblutungsstörungen verengt werden.
Im weiteren Verlauf der Arteriosklerose kommt es zur Ausschüttung von Matrixmetalloproteinasen (MMP) durch Makrophagen und Schaumzellen. Durch die proteolytische Aktivität der MMP kommt es zu einem verstärkten Abbau von extrazellulärer Matrix in der arteriosklerotischen Umgebung. Der verstärkte Abbau bzw. die verminderte Neubildung der extrazellulären Matrix führen zur Ausdünnung der fibrösen Kappe des arteriosklerotischen Plaques mit konsekutiver Plaqueinstabilität und drohender Rupturgefahr.
Der Plaque kann durch die Ausdünnung der fibrösen Kappe aufreißen, wodurch der thrombogene Lipidkern und Kollagen in der Gefäßwand freigelegt werden. Die dadurch bedingte Aktivierung des Hämostasesystems führt zur okkludierenden und nicht-okkludierenden Thrombusbildung, d. h. zur Aktivierung der Gerinnungskaskade, in dessen Zentrum der sogenannte Tissue Factor (TF) steht. Klinisch manifestiert sich die Plaqueruptur mit Thrombusformation als instabile Angina pectoris oder akuter Myokardinfarkt.
Bekannt ist, dass bei der Arteriosklerose auch dem Calcium-Phosphat-Haushalt eine wichtige Bedeutung zukommt. So ist beschrieben worden, dass Störungen des Calcium-Phosphat-Gleichgewichts zur vaskulären Calcifizierung beitragen, die bei der Arteriosklerose beobachtet wird, vgl.. Ketteler et al.: Novel insights into vascular calcification. Kidney. Int. Suppl. 2006 (105): 5–9; Ketteler et al.: Inhibitors of calcification: general aspects and implications in renal failure, Pediatr. Nephrol. 2005 20(3): 383–8.
Derzeit wird die Arteriosklerose in der Regel über die Verabreichung von Lipidsenkern bzw. Statinen behandelt. Hierbei handelt es sich um eine Gruppe von Wirkstoffen, die letztlich die endogene Cholesterinsynthese hemmen. Zu den Statinen zählen u. a. Atorvastatin, Cerivastatin, Fluvastatin, Lovastatin (Mevinolin), Mevastatin (Compactin), Pravastatin und Simvastatin. Diese Substanzen haben auf verschiedene Weise Einfluss auf den Lipidstoffwechsel, z. B. durch kompetitive Hemmung des Schlüsselenzyms der Cholesterinsynthese, der 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-Coenzym-A-Reductase, durch Verminderung der Cholesterinbiosynthese in der Leber, durch Vermehrung der LDL-Rezeptoren auf der Leberzelle und durch Modifikation der Lipoproteinzusammensetzung. Statine haben einen großen Einfluss auf die Zusammensetzung der Serumlipide und führen u. a. zu einer leichten Anhebung der Konzentration von sogenannten "High Density Lipoproteinen" (HDL) und zu einer starken Senkung der LDL-Konzentration. Insgesamt zirkulieren durch die Wirkung der Statine weniger Fette im Blut, so dass die arteriosklerotischen Plaques weniger Fette einlagern und das Risiko einer Thrombose und der daraus folgenden Gefährdungen sinkt dadurch.
Obwohl den Statinen noch eine Reihe weiterer positiver Eigenschaften zugeschrieben wird, sind diese auf Grund einer auffälligen Häufung von seltenen, jedoch schwerwiegenden Nebenwirkungen an Muskeln und Nieren im Zusammenhang mit der Einnahme in die Kritik geraten. Deshalb wurde insbesondere der Wirkstoff Cerivastatin (z. B. Lipobay^®, Zenas^®) in Deutschland im August 2001 vom Markt genommen und es wird nach Alternativen gesucht.
Criscuoli et al.: Glunicate (Lg 13979) protects the arterial wall from cholesterolinduced arterosclerotic changes in the rabbit without affecting plasma lipids. Arteriosclerosis 1984, 53: 59–68, beschreiben die Verwendung von Nicotinsäure zum Schutz der Arterienwand gegenüber Cholesterin-induzierten Veränderungen bei der Arteriosklerose. Die protektive Wirkung von Nicotinsäure war jedoch in keinem der gezeigten Fälle signifikant.
Feinblatt et al.: Treatment of arteriosclerosis and vague abdominal distress with niacinamide hydroiodide (without side-effects). Amer. jour. Dig. Dis. 1955; Januar: 5–6, schlagen die Behandlung von Arteriosklerose durch eine Kombination von Iodiden und Nicotinsäureamid-Hydroiodiden vor. Eine solche Behandlung hat sich jedoch in der Praxis nicht bewährt.
Vor diesem Hintergrund ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Substanz bereitzustellen, mit der die Arteriosklerose behandelt oder dieser vorgebeugt werden kann, und mit der die vorstehend genannten Nachteile der bekannten Lipidsenker oder sonstigen Substanzen reduziert oder weitgehend vermieden werden können.
Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung von Nicotinsäureamid gelöst.
Die Erfinder haben erkannt, dass Nicotinsäureamid die zelluläre Aufnahme von Phosphat und die Akkumulation von Calciumphosphat in der Zelle hemmt. Dadurch wird die Gefahr reduziert, dass das Löslichkeitsprodukt von Calciumphosphat überschritten wird, weniger Calciumphosphat ausfällt und die Gefahr der Arteriosklerose und das Auftreten verkalkter arteriosklerotischer Plaques deutlich vermindert wird.
Diese Erkenntnis der Erfinder war überraschend, da dem Nicotinsäureamid, das auch als Nicotinamid, Pyridin-3-carbamid oder Niacinamid bezeichnet wird, bislang völlig andere Eigenschaften zugeschrieben werden.
So beschreiben bspw. Eto et al.: Nicotinamide prevents the development of hyperphosphataemia by suppressing intestinal sodium-dependent phosphate transporter in rats with adenine-induced renal failure. Nephrol. Dial. Transplant. 2005; 20: 1378–1384, dass Nicotinsäureamid in Ratten den natriumabhängigen Phosphattransporter NaPiIIb und damit die Aufnahme von Phosphat in den Organismus hemme.
Tenenhouse H. S. und Chu Y. L.: Hydrolysis of nicotinamide-adenine dinucleotide by purified renal brush-border membranes. Mechanism of NAD+ inhibition of brushborder membrane phosphate-transport activity. Biochem. J. 1982; 204: 635–638, behaupten ferner, dass Nicotinsäureamid die renale Resorption von Phosphat hemme und damit die renale Ausscheidung von Phosphat steigere.
Die von Eto et al. (a. a. O.) und Tenenhouse und Chu (a. a. O.) beschriebenen Wirkungen des Nicotinsäureamids sollten deshalb die Plasmakonzentration von Phosphat reduzieren, was von Eto et al auch behauptet wird. Die Erfinder haben jedoch genau den gegenteiligen Effekt von Nicotinsäureamid beobachten können. So wurde von den Erfindern nämlich überraschenderweise festgestellt, dass Nicotinsäureamid die Konzentration von Phosphat im Plasma erhöht.
Bei den Erkenntnissen der Erfinder handelt es sich deshalb um eine Abkehr von der im Stand der Technik vertretenen Auffassung bezüglich der Eigenschaften des Nicotinsäureamids.
Für Nicotinsäureamid ist ferner beschrieben worden, dass ein Mangel hiervon zum Krankheitsbild der sog. Pellagra führen kann, das sich als Dermatitis mit Hyperpigmentierung im Bereich sonnenexponierter Haut manifestiert. Die Verabreichung von Nicotinsäureamid wird deshalb zur Behandlung von Pellagra vorgeschlagen.
Verschiedene Autoren schlagen die Verabreichung von Nicotinsäureamid zur Verlängerung der Lebensdauer bzw. zur Verzögerung von Altersprozessen vor; vgl. Crane und Low: Plasma membrane redox and control of sirtuin. Age 2005; 27: 147–152, Bitterman et al.: Inhibition of silencing and accelerated aging by nicotinamide, a putative negative regulator of yeast sir2 and human SIRT1. J. Biol. Chem. 2002; 277: 45099–45107 (in Hefe), und Kang et al.: Nicotinamide extends replicative lifespan of human cells. Aging Cell 2006; 5: 423–436 (in humanen Zellen).
Obgleich Feinblatt et al. (a. a. O.) und Criscuoli et al. (a. a. O.) einen Zusammenhang zwischen Arteriosklerose und Niacinamidhydroiodid bzw. Arteriosklerose und Nicotinsäure herstellen, war wegen der von Eto et al. (a. a. O.) und Tenenhouse und Chu (a. a. O.) beschriebenen Wirkungen nicht zu erwarten, dass auch Nicotinsäureamid antiarteriosklerotische Wirkung zeigt. Hinzu kommt, dass Nicotinsäure und Nicotinsäureamid-Hydroiodid niedermolekulare Verbindungen sind, bei denen kleine Modifikationen bereits zu einer vollständigen Änderung ihrer biologischen Wirkungen führen können. So haben die Erfinder bspw. auch Isonicotinsäureamid auf etwaige antiarteriosklerotische Wirkungen getestet und dabei festgestellt, dass eine solche gegenüber Nicotinsäureamid nur gering modifizierte Verbindung als Substanz gegen Arteriosklerose ungeeignet ist.
Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird durch die Bereitstellung von Nicotinsäureamid vollkommen gelöst.
Die Aufgabe wird ferner gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prävention von Arteriosklerose, das die folgenden Schritte aufweist: (1) Bereitstellung von Nicotinsäureamid, und (2) Formulierung des Nicotinsäureamids in einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Pharmazeutisch akzeptable Träger sind im Stand der Technik umfassend beschrieben. Beispielhaft wird verwiesen auf Bauer et al.: Lehrbuch der pharmazeutischen Technologie, 6. Aufl., Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH Stuttgart 1999; Rowe et al.: Handbook of pharmaceutical excipients 5. Aufl., Pharmaceutical Press and American Pharmacist Association 2006. Der Inhalt der vorstehend genannten Publikationen ist durch Inbezugnahme Bestandteil der Anmeldung.
Bei der erfindungsgemäßen Verwendung bzw. dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es bevorzugt, wenn das Arzneimittel für eine Applikation ausgebildet ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: oral, rektal, parenteral, lokal, transdermal.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass das Arzneimittel je nach gewünschter Applikationsform bereits auf geeignete Weise ausgestaltet ist. Dem behandelnden Arzt steht dadurch eine Auswahl verschiedenster Ausgestaltungsformen des Arzneimittels zur Verfügung, wobei sich die konkrete Form an dem Zustand des Patienten, dem jeweiligen Behandlungsprogramm und weiteren Faktoren orientieren kann.
Vor diesem Hintergrund ist es auch bevorzugt, wenn das Arzneimittel in einer Form ausgebildet ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Pulver, Tablette, Saft, Tropfen, Kapsel, Zäpfchen, Lösung, Injektionslösung, Aerosol, Salbe, Spülung, Pflaster, Pellet, Dragee.
Mit dieser Maßnahme wird auf vorteilhafte Art und Weise bereits eine Formulierungsvariante bereitgestellt, die den unmittelbaren Einsatz von Nicotinsäureamid zur Behandlung bzw. Prävention von Arteriosklerose ermöglicht.
Bei der erfindungsgemäßen Verwendung bzw. dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es außerdem bevorzugt, wenn das Arzneimittel Nicotinsäureamid in einer Konzentration aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus (jeweils angegeben in Gewicht des Wirkstoffs Nicotinsäureamid bezogen auf das Gesamtgewicht des Arzneimittels): 1 μg/g, 10 μg/g, 100 μg/g, 1 mg/g, 10 mg/g, 100 mg/g, 1 g/g.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass das Arzneimittel den Wirkstoff Nicotinsäureamid bereits in einer Konzentration aufweist, die sich zur Behandlung bzw. Prävention von Arteriosklerose besonders eignet.
Ferner ist es bevorzugt, wenn die Absolutmenge des Wirkstoffs Nicotinsäureamid in einer Dosierungseinheit des Arzneimittel zwischen ca. 1 und ca. 3000 mg, vorzugs weise zwischen ca. 10 und ca. 1500 mg, weiter bevorzugt zwischen ca. 100 und ca. 750 mg, und höchst bevorzugt bei ca. 500 mg liegt.
Mit dieser Maßnahme wird Nicotinsäureamid bereits in einer solchen Menge bereitgestellt, dass in dem Patient ohne weiteres die gewünschten Nicotinsäureamidspiegel erzielt werden können. Unter einer Dosierungseinheit wird erfindungsgemäß eine oben genannte Formulierungsvariante bezeichnet, bspw. eine Tablette, ein Dragee, eine Kapsel etc.
Weiter ist es bei der erfindungsgemäßen Verwendung bzw. dem erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt, wenn das Arzneimittel zusätzlich eine weitere gegen Arteriosklerose wirksame Substanz aufweist.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass durch den Zusatz die antiarteriosklerotischen Wirkungen des erfindungsgemäßen Arzneimittels noch verbessert werden können. So ist es möglich, durch die Kombination mit einer weiteren Substanz einen Eingriff in die Arteriosklerose an einer anderen Stelle zu bewirken, um das Krankheitsbild durch synergistische Effekte noch wirksamer zu bekämpfen.
Bei der weiteren Substanz handelt es sich erfindungsgemäß vorzugsweise um einen Lipidsenker (Statin), der weiter vorzugsweise ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Atorvastatin, Cerivastatin, Fluvastatin, Lovastatin (Mevinolin), Mevastatin (Compactin), Pravastatin und Simvastatin.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass das Arzneimittel eine solche weitere Substanz beinhaltet, die nachweislich antiarteriosklerotische Wirkung zeigt und routinemäßig eingesetzt wird. Erfindungsgemäß können durch das Zusammenwirken von Nicotinsäureamid und der weiteren Substanz ggf. synergistische Effekte erzielt werden.
Vor diesem Hintergrund betrifft ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur therapeutischen und/oder prophylaktischen Behandlung eines Lebewesens, das von Arteriosklerose betroffen ist oder/und bei dem die Gefahr von Arteriosklerose besteht, das folgende Schritte aufweist: (1) Bereitstellung von Nicotinsäureamid, (2) Einbringung des Nicotinsäureamids in das Lebewesen, und (3) ggf. mehrfaches Wiederholen der Schritte (1) und (2).
Das Nicotinsäureamid kann bei diesem Verfahren in Form des erfindungsgemäßen Arzneimittels bereitgestellt und in das Lebewesen eingebracht werden. Die vorstehend beschriebenen Eigenschaften, Merkmale und Vorteile gelten insofern für dieses Verfahren entsprechend.
Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Die Erfindung wird nun anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert, aus denen sich weitere Eigenschaften, Merkmale und Vorteile ergeben. Dabei wird Bezug genommen auf die beigelegten Figuren, in denen Folgendes dargestellt ist:
1 zeigt die Flüssigkeitsaufnahme der Versuchstiere vor und nach der Verabreichung von Nicotinsäureamid,
2 zeigt die Nahrungsaufnahme der Versuchstiere vor und nach der Verabreichung von Nicotinsäureamid,
3 zeigt das Kot-Trockengewicht der Versuchstiere vor und nach der Verabreichung von Nicotinsäureamid,
4 zeigt das Körpergewicht der Versuchstiere vor und nach der Verabreichung von Nicotinsäureamid,
5 zeigt die Harnflussrate der Versuchstiere vor und nach der Verabreichung von Nicotinsäureamid,
6 zeigt die Phosphatkonzentrationen im Harn der Versuchstiere vor und nach der Verabreichung von Nicotinsäureamid,
7 zeigt die Phosphatausscheidung über den Harn der Versuchstiere vor und nach der Verabreichung von Nicotinsäureamid,
8 zeigt die Phosphatausscheidung über den Kot der Versuchstiere vor und nach der Verabreichung von Nicotinsäureamid,
9 zeigt die Abundanz des Transportproteins NaPiIIb in der ersten und zweiten Hälfte des Dünndarmes der Versuchstiere vor und nach der Verabreichung von Nicotinsäureamid,
10 zeigt die Phosphatkonzentration im Plasma der Versuchstiere vor und nach der Verabreichung von Nicotinsäureamid,
11 zeigt eine Eichkurve zur Messung von freiem Phosphat an Kulturen von Darmepithelzellen,
12 zeigt die Phosphataufnahme durch Darmepithelzellen in der Kontrolle (Kulturmedium mit Phosphat und ohne Testsubstanz) im Vergleich zu Zellen in Kulturmedium (Kulturmedium ohne Phosphat und ohne Testsubstanz),
13 zeigt den Einfluss von drei verschiedenen Konzentrationen von Nicotinsäureamid auf die Phosphataufnahme durch Darmepithelzellen,
14 zeigt den Einfluss von drei verschiedenen Konzentrationen von Isonicotinsäureamid auf die Phosphataufnahme durch Darmepithelzellen, und
15 zeigt den Einfluss von drei verschiedenen Konzentrationen von Thiaminhydrochlorid auf die Phosphataufnahme durch Darmepithelzellen.
Ausführungsbeispiele
1. Material und Methoden
1.1 Tierversuche
1.1.1 Experimente an den Tieren
Sämtliche Tierversuche wurden gemäß der Richtlinien der Amerikanischen Physiologischen Gesellschaft und in Übereinstimmung mit dem Deutschen Tierschutzgesetz durchgeführt und von den lokalen Behörden genehmigt.
1.1.2 Stoffwechselkäfige
Die Experimente wurden an 6–10 Monate alten Mäusen durchgeführt, die bei einer Kontrolldiät gehalten wurden (C1314; 0,2% Na⁺, 1% K⁺, 0,9% Ca, Altromin, Heidenau, Deutschland). Vor und während den Experimenten hatten die Mäuse freien Zugang zu Leitungswasser mit und ohne Nicotinsäureamid (0,1–2 mg/g), wie angegeben. Zur Bewertung der renalen und fäkalen Exkretion wurden die Mäuse einzeln für 24 Stunden zur Harnsammlung mit freiem Zugang zu Trinkwasser in Stoffwechselkäfige (Tecniplast Hohenpeissenberg, Deutschland) gesetzt. Die innere Wand der Stoffwechselkäfige war silikonisiert und der Urin wurde unter Wasser-gesättigtem Öl gesammelt.
Um Blutproben zu erhalten, wurden die Tiere mit Diethylether (Roth, Karlsruhe, Deutschland) anästhesiert und etwa 150 μl Blut wurde durch Punktieren des retro-orbitalen Plexus in heparinisierte Kapillaren entnommen.
Kot wurde bei etwa 80°C für etwa 3 Stunden getrocknet und anschließend wurde das Kot-Trockengewicht bestimmt. 5 ml von 0,75 M HNO₃ wurde zu dem Kot hinzugegeben und die Probe wurde für 48 Stunden auf einem elektrischen Schüttler geschüttelt. Die Proben wurden dann bei 3500 rpm für 10 Minuten zentrifugiert und 1 ml des Überstandes wurde gesammelt. Der Überstand wurde erneut bei 14.000 rpm für 5 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde bei –20°C bis zur Analyse gelagert. Der Überstand wurde analysiert, wie unten beschrieben.
1.1.3 Bestimmung der Phosphatkonzentrationen im Plasma, Harn und Kot
Die Konzentration von Phosphat (P_i) in Plasma, Harn und Kot erfolgte unter Verwendung eines photometrischen Kits (Roche, Mannheim, Deutschland) gemäß der Anweisungen des Herstellers mit Anpassungen an den unterschiedlichen Ursprung der Proben.
Sämtliche Substanzen stammten von Sigma (Taufkirchen, Deutschland) oder Roth (Karlsruhe, Deutschland).
1.1.4 Western-Blot-Analyse der Abundanz des NaPiIIb-Proteins
Aus der ersten und zweiten Hälfte des Dünndarmes wurde Darmgewebe entnommen. Im Folgenden wurde das Epithelgewebe abgeschabt und das Gesamtprotein aus unbehandelten und mit Nicotinsäureamid behandelten Mäusen isoliert (jeweils n = 3 Tiere, gepoolt und doppelt bestimmt). Die kleinen Darmsegmente wurden mit eiskalter Salinelösung gespült und der Länge nach geöffnet. Die Mucosa wurde mit einem Glasobjektträger in Puffer abgeschabt, der Folgendes enthielt (in mM): 250 Saccharose, 20 Tris (pH 7,5), 5 EGTA und Proteaseinhibitor-Cocktail (Roche, Mannheim, Deutschland). Die Suspension wurde mit einem Omnimixer für 7 Sekunden homogenisiert. MgCl₂ wurde zu dem Homogenat in einer Endkonzentration von 10 mM hinzugegeben. Die Suspension wurde auf Eis geschüttelt und anschließend bei 1600 g für 15 Minuten zentrifugiert. Die Plasmamembranen, die in dem Überstand verblieben, wurden durch Zentrifugation bei 20.000 g für 30 Minuten gesammelt. Das resultierende Pellet wurde in einem Puffer bei pH 7,4 suspendiert, der Folgendes enthielt (in mM): 125 Saccharose, 10 Tris (pH 7,5), 2,5 EGTA, 2,5 MgSO₄. Diese Suspension wurde mit 50 "up-down" strokes mit einem Glashomogenizer homogenisiert und bei 20.000 g für 30 Minuten zentrifugiert. Das End-Pellet, das die gereinigten Bürstensaummembranvesikel („brush border membrane vesicles", BBMV) enthielt, wurde durch Hindurchdrücken der Suspension durch 25- und 28-gauge-Nadeln und anschließende Solubilisierung homogenisiert. Sämtliche Schritte wurden bei 4°C durchgeführt. Anschließend wurden die Proben bei –80°C für die spätere Verwendung eingefroren. Das Membranprotein wurde bestimmt, wie von Bradford beschrieben. Das Gesamtprotein (20–30 μg/μl) wurden durch SDS-Page (8% Tris-Glycin) aufgetrennt, auf Nitrocellulosemembranen transferiert, über Nacht in Blockierungspuffer (5% fettfreie Milch in PBS enthaltend 0,15% Tween) blockiert und über Nacht bei 4°C mit einem monoklonalen Anti-NaPiIIb-Antikörper (verdünnt 1:1000 in B10-ckierungspuffer) inkubiert (Alpha Diagnostics, Deutschland). Nach der Inkubation mit Meerrettich-Peroxidase (HRP)-konjugiertem Anti-Maus-Sekundärantikörper (Amersham, Freiburg, Deutschland) wurden die Banden mit verstärkter Chemolumineszenz (ECL) gemäß der Anweisungen des Herstellers visualisiert.
1.1.5 Statistische Analyse
Die Daten sind dargestellt als Mittelwerte ± SEM, n stellt die Anzahl der unabhängigen Experimente dar. Sämtliche Daten wurden auf ihre Signifikanz unter Verwendung des ungepaarten Student's t-Test mit Welch-Korrektur getestet, sofern erforderlich.
1.2 Zellkulturversuche
1.2.1 Testsubstanzen
Nicotinsäureamid (NA): DSM Nutritional Products, Produkt-Nr. 0587848, CAS-Nr. 98-92-0, Lot 404023; Stammlösung: 10 mg/ml in Kulturmedium (MEM) ohne Zusätze; Substanz ist problemlos löslich, pH-neutral
Isonicotinsäureamid (INA): Acros Organics, Produkt-Nr. 12258,0000, CAS-Nr. 1453-82-3, Lot A0214246; Stammlösung: 10 mg/ml in Kulturmedium (MEM) ohne Zusätze; Substanz ist problemlos löslich, pH-neutral
Thiaminhydrochlorid (THC): DSM Nutritional Products, Produkt-Nr. 0413038, CAS-Nr. 67-03-8, Lot UQ50308195; Stammlösung: 10 mg/ml in Kulturmedium (MEM) ohne Zusätze; Substanz ist problemlos löslich, jedoch saurer pH-Wert von 4,82. Daher durch Zugabe von wenigen Tropfen 1 N NaOH neutralisiert.
Aus den Stammlösungen wurden durch weitere Verdünnung mit Kulturmedium Inkubationslösungen mit einer Konzentration von 5 mg/ml und 1 mg/ml hergestellt. Alle Lösungen waren 10fach konzentriert, d. h. die Konzentrationen im zellbiologischen Test waren somit 100 μg/ml, 500 μg/ml und 1000 μg/ml.
1.2.2 Verwendete Zelllinie und Routinekultur
Humane Darmepithelzellen, Zelllinie Caco-2 (Human Caucasian colon adenocarcinoma; ECACC 86010202, DSMZ ACC 169); Passage 67 intern. Die Caco-2-Zellen wurden als Massenkulturen in Minimum Essential Medium mit L-Glutamin (MEM) unter Zusatz von 5% fetalem Rinderserum sowie 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin und 1% NEAA (nichtessentielle Aminosäure-Lösung, 100fach) inkubiert.
1.2.3 Phosphat-Stammlösung zur Exposition der Zellen
Die 100fach konzentrierte Phosphat-Stammlösung zur Inkubation der Zellen enthielt in Anlehnung an die Phosphatkonzentration in Dulbecco's Phosphatgepufferter Saline für die Zellkultur:

• KH₂PO₄ wasserfrei 10,0 g/l = 100 μg/ml im Kulturmedium zur Inkubation
• Na₂HPO₄ × 2H₂O 57,5 g/l = 575 μg/ml im Kulturmedium zur Inkubation

1.2.4 Bestimmung von anorganischem Phosphat
Reagenzien und Lösungen

• 1 mM Na₂HPO₄ zur Erstellung der Eichkurve (Lösung 1): 178 mg Na₂HPO₄ × 2H₂O in 1 Liter Aqua dest. gelöst Lagerung bei 4°C im Kühlschrank.
• 0,5 M H₂SO₄ aus konz. H₂SO₄ (18 M): 28 ml konz. H₂SO₄ in 900 ml Aqua dest. unter Rühren und ggf. Kühlung eingegossen und auf 1000 ml mit Aqua dest. aufgefüllt
• 0,42% (NH₄)₆Mo₇O₂₄ × 4H₂O: 4,2 g (NH₄)₆Mo₇O₂₄ × 4H₂O in 0,5 M H₂SO₄ gelöst und auf 1000 ml mit 0,5 M H₂SO₄ aufgefüllt. Lagerung in einer braunen Glasflasche bei 4°C im Kühlschrank.
• 10%ige Ascorbinsäure-Lösung (jeweils am Versuchstag frisch hergestellt): 1,11 g Ascorbinsäure in 10 ml Aqua dest. gelöst
• Phosphatreagenz (jeweils am Versuchstag frisch angesetzt): 10%ige Ascorbinsäure-Lösung und 0,42%ige Molybdat-Lösung im Verhältnis 1+6 gemischt (6 ml 10%ige Ascorbinsäure-Lösung + 36 ml Molybdat-Lösung)

Eichkurven und Durchführung der Bestimmung

• Probe A: 10 μl Lösung 1 + 990 μl Aqua dest. = 1 μM im Test
• Probe C: 50 μl Lösung 1 + 950 μl Aqua dest. = 5 μM im Test
• Probe D: 100 μl Lösung 1 + 900 μl Aqua dest. = 10 μM im Test
• Probe F: 200 μl Lösung 1 + 800 μl Aqua dest. = 20 μM im Test
• Probe G: 300 μl Lösung 1 + 700 μl Aqua dest. = 30 μM im Test
• Probe H: 500 μl Lösung 1 + 500 μl Aqua dest. = 50 μM im Test

Zu 100 μl der Probe bzw. Aqua dest. für den Leerwert wurden 900 μl Phosphatreagenz pipettiert und für 60 min bei 37°C im Schüttelwasserbad im Dunkeln inkubiert. Danach erfolgte die Messung der Extinktion bei 820 nm mit einem ATI Unicam UV/Vis UV4 Spektrometer.
1.2.5 Durchführung der Zellkulturversuche

• Caco-2-Zellen wurden in einer Dichte von 750.000 Zellen/Kulturschale (Wachstumsfläche pro Kulturschale 55 cm) ausgesät und für 3 Tage bis zum Erreichen einer etwa 90%igen Konfluenz in Minimum Essential Medium (MEM) unter Zusatz von 5% fetalem Kälberserum sowie 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin und 1% NEAA (nichtessentielle Aminosäure-Lösung, 100fach) inkubiert.
• Die Caco-2-Zellen wurden dann mit Kulturmedium (Minimum Essential Medium; MEM) ohne weitere Zusätze (enthält 140 mg/l Natriumdihydrogenphosphat × H₂O) ± 100, 500 resp. 1000 μg/ml Testsubstanz für 15 min bei 37°C im Brutschrank präinkubiert.
• Das Kulturmedium wurde abgesaugt und frisches MEM mit 100 μg/ml Kaliumdihydrogenphosphat und 575 μg/ml Dinatriumhydrophosphat-Dihydrat aus der 100fach konzentrierten Phosphat-Stammlösung ± 100, 500 resp. 1000 μg/ml Testsubstanz zugegeben und für 60 min bei 37°C im Brutschrank inkubiert.
• Das Inkubationsmedium wurde abgesaugt, einmal mit jeweils 10 ml pro Schale 0,9%iger Kochsalzlösung gewaschen, die Zellen durch kurzzeitige Trypsin/EDTA-Behandlung abgelöst (5 ml Trypsin/EDTA für 5 min bei 37°C) und suspendiert (+ 5 ml Kochsalzlösung)
• Die Zellsuspension wurde zentrifugiert (7 min bei 240 × g), der Überstand mit einer Pasteurpipette abgesaugt und das Zellsediment in 1 ml Kochsalzlösung aufgenommen
• Die Proben wurden in Eppendorfcups bei –20°C eingefroren und bis zur Phosphatbestimmung gelagert
• Nach dem Auftauen am Tag der Phosphatbestimmung wurden die Eppendorfcups mit den Zellproben zum Zerstören der Zellmembranen kurz in Flüssigstickstoff schockgefroren (ca. 30 sec) und die Proben anschließend wieder bei Raumtemperatur aufgetaut
• Das entsprechende Volumen (Verdünnung 1:10) zur Phosphatbestimmung wurde zugegeben
• Messung am ATI Unicam UV/Vis Spectrometer UV4 bei einer Wellenlänge von 820 nm
• Die Untersuchungen wurden in dreifachem Parallelansatz durchgeführt

1.2.6 Interne Probenbezeichnungen

• Unbehandelte Zellen in Kulturmedium (KM)
• Kochsalzlösung (NaCl)
• 15 min MEM ohne TS + 60 min IM ohne TS (K)
• 15 min MEM mit 100 μg/ml TS + 60 min IM mit 100 μg/ml TS (TS100)
• 15 min MEM mit 500 μg/ml TS + 60 min IM mit 500 μg/ml TS (TS500)
• 15 min MEM mit 1000 μg/ml TS + 60 min IM mit 1000 μg/ml TS (TS1000)

Abkürzungen: IM = Inkubationsmedium = Kulturmedium mit Phosphat 1:100; TS = Testsubstanz, d. h. NA = Nicotinamid, INA = Isonicotinamid und THC = Thiaminhydrochlorid.

2. Ergebnisse
2.1 Tierversuche
In den 1 bis 8 sind die arithmetischen Mittel ± SEM der Flüssigkeitsaufnahme (ml/24 Stunden; 1), der Nahrungsaufnahme (mg/24 h; 2), des Kot-Trockengewichts (g/24 Stunden, 3), des Körpergewichts (g; 4), der Harnflussrate (ml/24 Stunden; 5), der Harnphosphatkonzentration (mg/dl; 6), der Harnphosphatausscheidung (mg/24 h; 7) und der Kotphosphatausscheidung (mg/24 h; 8) der Versuchstiere vor (Kontrolle) oder ein oder zwei Wochen nach der Verabreichung von 0,1, 0,3, 0,5, 1 oder 2 [mg/g Körpergewicht] Nicotinsäureamid dargestellt. * zeigt eine statistisch signifikante (p < 0,05) Differenz gegenüber dem Wert vor der Verabreichung von Nicotinsäureamid an.
2.1.1 Flüssigkeitsaufnahme
Wie in 1 illustriert, folgt auch die Verabreichung von niedrigen Dosen von Nicotinsäureamid eine leichte Abnahme der Flüssigkeitsaufnahme der Versuchstiere, wobei der Effekt bei 0,3 mg/g Körpergewicht für eine Woche die Signifikanz erreicht. Umgekehrt führt die Verabreichung von 0,5 mg/g Körpergewicht Nicotinsäureamid eher zu einer leichten, aber signifikanten Zunahme der Flüssigkeitsaufnahme.
2.1.2 Nahrungsaufnahme
Gleichermaßen nimmt die Nahrungsaufnahme der Versuchstiere nach der Verabreichung von 0,1 bis 0,3 mg/g Körpergewicht Nicotinsäureamid leicht ab und nach der Verabreichung von 0,5 mg/g Körpergewicht Nicotinsäureamid leicht zu; vgl. 2.
2.1.3 Kot-Trockengewicht
Parallel zu der Auswirkung auf die Nahrungsaufnahme führt die Verabreichung von 0,1 bis 0,3 mg/g Körpergewicht Nicotinsäureamid eher zu einer Abnahme des Kot-Trockengewichts der Versuchstiere, wobei dieser Effekt jedoch keine statistische Signifikanz erreicht; vgl. 3.
2.1.4 Körpergewicht
Die Verabreichung von Nicotinsäureamid führte nicht zu signifikanten Veränderungen des Körpergewichts der Versuchstiere; vgl. 4.
2.1.5 Harnfluss
Die Harnflussrate der Versuchstiere nahm nach zwei Wochen der Verabreichung von 0,1 bis 0,3 mg/g Körpergewicht Nicotinsäureamid signifikant ab; vgl. 5.
2.1.6 Harnphosphatkonzentration
Die Verabreichung von 0,1 und 0,3 mg/g Körpergewicht Nicotinsäureamid erhöhte die Harnphosphatkonzentration der Versuchstiere, wobei die Effekte eine bzw. zwei Wochen nach dem Beginn der Behandlung signifikant waren; vgl. 6.
2.1.7 Harnphosphatausscheidung
Gleichermaßen erhöhte 0,1 mg/g Körpergewicht Nicotinsäureamid die Harnphosphatausscheidung der Versuchstiere, wobei dieser Effekt eine Woche nach Beginn der Behandlung signifikant war; 7.
2.1.8 Fäkalphosphatausscheidung
Nach der Verabreichung von 0,3 mg/g Körpergewicht Nicotinsäureamid nimmt die Fäkalphosphatausscheidung der Versuchstiere signifikant zu; 8.
2.1.9 Expression des Phosphattransporters NaPiIIb
Anschließend wurden Western-Blot-Experimente durchgeführt, um zu untersuchen, ob die Nicotinsäureamid-Behandlung die Expression des Phosphattransporters NaPiIIb im Darm beeinflusst. Das Ergebnis eines solchen Experimentes ist in 9 dargestellt. Die oberen Balken zeigen die Original-Blots, die unteren Balken die arithmetischen Mittel ± SEM der NaPiIIb-Abundanz (willkürliche Einheiten) vor der Verabreichung von Nicotinsäureamid (0 Tage) und 7 Tage nach der Behandlung mit 2 mg/g Körpergewicht Nicotinsäureamid. # zeigt statistische Signifikanz (d < 0,05) zwischen der ersten und zweiten Hälfte des Dünndarms an.
Wie in dieser Abbildung illustriert, war die Proteinabundanz deutlich höher in der ersten (jejunalen) als in der zweiten (ilealen) Hälfte des Dünndarms vor der Verabreichung von Nicotinsäureamid. Die Nicotinamidbehandlung führt zum vollständigen Verschwinden des NaPiIIb-Proteins von den Grenzen des Dünndarmborstensaums.
2.1.10 Phosphatkonzentration im Plasma
Als Nächstes wurde untersucht, ob die Verabreichung von Nicotinsäureamid zu einer Abnahme der Phosphatkonzentration im Plasma der Versuchtiere führt. Das Ergebnis eines entsprechenden Experimentes ist in 10 dargestellt. Gezeigt sind die arithmetischen Mittel ± SEM der Plasmaphosphatkonzentration (mg/dl) vor (Kontrolle) oder eine oder zwei Wochen nach der Verabreichung von 0,1, 0,3, 0,5, 1 oder 2 [mg/g Körpergewicht] Nicotinsäurea mid. * zeigt einen statistisch signifikanten (p < 0,05) Unterschied gegenüber dem Wert vor der Verabreichung von Nicotinsäureamid an.
Dabei zeigt sich, dass es bei höheren Dosen (≥ 0,5 mg/g) Nicotinsäureamid zu einer Abnahme der Plasmaphosphatkonzentration kommt. Dieser Effekt erreicht statistische Signifikanz zwei Wochen nach dem Beginn der Verabreichung von 0,5 und 1 mg/g Körpergewicht Nicotinsäureamid und eine Woche nach der Verabreichung von 2 mg/g Körpergewicht Nicotinsäureamid. Im Gegensatz zu dem erniedrigenden Effekt von Nicotinsäureamid bei ≥ 0,5 mg/g, erhöhte die Verabreichung von Nicotinsäureamid bei niedriger Dosierung (0,1 mg/g und 0,3 mg/g) die Plasmaphosphatkonzentration. Dieser Effekt erreichte statistische Signifikanz zwei Wochen nach 0,1 und 0,3 mg/g Körpergewicht Nicotinsäureamid-Verabreichung.
2.2 Zellkulturversuche
Um zu überprüfen, ob der Anstieg der Plasmaphosphatkonzentration bei niedrigen Dosen von Nicotinsäureamid mit einer verringerten Aufnahme von Phosphat in die Zellen einhergeht, haben die Erfinder ein zelluläres Testsystem mit Darmepithelzellen (Zelllinie Caco-2) etabliert, an welchem die Phosphataufnahme der Zellen in Abhängigkeit von Nicotinsäureamid quantitativ bestimmt werden kann. Ferner wurden zwei weitere Testsubstanzen in ihrer Fähigkeit untersucht, die Phosphataufnahme der Zelle zu beeinflussen, nämlich Isonicotinsäureamid und Thiaminhydrochlorid.
2.2.1 Phosphateichkurve

Zunächst wurde eine Phosphateichkurve zur Dokumentation des linearen Messbereiches erstellt. In der nachfolgenden Tabelle 1 sind die Phosphatmesswerte bei einer Verdünnung von 1:10 dargestellt.

Eichkurve Phosphatbestimmung (1:10)
Probe	[Pi] in μM	Messwerte	OD 820 nm	Mittel	wert	S. D.
A	1	0,112	0,103	0,111	0,112	0,005
C	5	0,179	0,171	0,172	0,179	0,004
D	10	0,245	0,257	0,251	0,245	0,006
F	20	0,362	0,365	0,359	0,362	0,003
G	30	0,482	0,473	0,459	0,482	0,012
H	50	0,804	0,786	0,816	0,804	0,015

Tab. 1: Tabellarische Darstellung der Phosphat-Messwerte bei einer Verdünnung von 1:10 zur Dokumentation des linearen Messbereiches

11 zeigt eine graphische Darstellung der Phosphatmesswerte aus Tabelle 1 zur Dokumentation des linearen Messbereiches.
Bei den anschließenden Phosphatmessungen lagen die maximalen optischen Dichten (OD) bei 820 nm bei 0,8 und waren damit noch im linearen Bereich der Eichkurve.
2.2.2 Phosphataufnahme durch Darmepithelzellen (Kontrollen)
In 12 ist die Phosphataufnahme durch Darmepithelzellen (Caco-2) in der Kontrolle (K = Kulturmedium mit Phosphat 1:100 ohne Testsubstanz) im Vergleich zu Zellen in Kulturmedium (KM = Kulturmedium ohne Phosphat 1:100 und ohne Testsubstanz) dargestellt. Die Phosphataufnahme der Zellen beträgt 27,63 ± 6,6% (Mittelwert ± Standardabweichung) und ist signifikant (p < 0,05; Student's t-Test). Somit ist gezeigt, dass alle mit den Testsubstanzen gemessenen Wirkungen tatsächlich auf einer durch die einstündige Inkubation mit Phosphat 1:100 erhöhten basalen Phosphataufnahme durch die Zellen beruhen.
2.2.3 Phosphataufnahme durch Darmepithelzellen in Gegenwart von Nicotinsäureamid
In 13 ist der Einfluss von drei verschiedenen Konzentrationen von Nicotinsäureamid (NA) auf die Phosphataufnahme durch Darmepithelzellen (Caco-2) dargestellt. Angegeben ist der Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3). Dabei ist eindeutig zu erkennen, dass Nicotinsäureamid eine Dosis-abhängige Reduktion der Phosphataufnahme mit steigender Nicotinsäureamidkonzentration um ca. 22 bis 26% bewirkt. Selbst bei der niedrigsten Testkonzentration von 100 μg/ml ist die Reduktion bereits signifikant (p < 0,05; Student's t-Test).
Dieses Experiment bestätigt demnach, dass eine Erhöhung der Plasmaphosphatkonzentration mit einer Reduktion der Phosphataufnahme durch Nicotinsäureamid einhergeht.
Die Erfinder haben nun erkannt, dass die herabgesetzte zelluläre Aufnahme von Phosphat die zelluläre Akkumulation von Calciumphosphat (CaHPO₄) und damit die Gefahr der Arteriosklerose mindert.
2.2.4 Phosphataufnahme durch Darmepithelzellen in Gegenwart von Isonicotinsäureamid
In 14 ist der Einfluss von drei verschiedenen Konzentrationen von Isonicotinsäureamid (INA) auf die Phosphataufnahme durch die Darmepithelzellen dargestellt. Angegeben ist wieder der Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3).
Dabei zeigt sich, dass Isonicotinsäureamid die Phosphataufnahme der Zelle weitgehend unbeeinflusst lässt. So ist bei den Konzentrationen 500 μg/ml bzw. 1000 μg/ml keine Abweichung gegenüber der Kontrolle feststellbar (p < 0,05; Student's t-Test).
2.2.5 Phosphataufnahme durch Darmepithelzellen in Gegenwart von Thiaminhydrochlorid
In 15 ist der Einfluss von drei verschiedenen Konzentrationen von Thiaminhydrochiorid (THC) auf die Phosphataufnahme durch die Darmepithelzellen dargestellt. Angegeben ist der Mittelwert ± Standardabweichungen (n = 3).
Dabei zeigt sich, dass Thiaminhydrochlorid eine Dosis-abhängige Förderung der Phosphataufnahme um ca. 29 bis 9% mit umgekehrter Proportionalität bewirkt, d. h. je geringer die Testkonzentration, desto größer wird die Förderung der Phosphataufnahme. Nur bei der niedrigsten Testkonzentration von 100 μg/ml ist allerdings die Förderung signifikant (p < 0,05; Student's t-Test).
2.2.6 Alle Testsubstanzen im Vergleich/Zusammenfassung

Die mit den drei getesteten Substanzen erzielten Ergebnisse zur Phosphataufnahme in die Zellen sind in der nachfolgenden Tabelle 2 zusammengefasst.

Phosphataufnahme unter Nicotinsäureamid
Probe	Messwerte OD 820 nm korrigiert, d. h. abzgl. OD der 0,9%igen Kochsalzlösung			Mittelwert	S. D.	Mittelwert Pi-Aufnahme in % (K = 100%)	S. D. Pi Aufnahme in %
NaCl	0,08	0,112	0,094	0,095	0,016
KM	0,257	0,226	0,241	0,241	0,016	72,37	6,43
K	0,352	0,309	0,339	0,333	0,022	100,00	6,62
NA100	0,278	0,234	0,269	0,260	0,023	78,08	8,94
NA500	0,266	0,236	0,262	0,254	0,016	76,38	6,40
NA1000	0,270	0,247	0,224	0,247	0,023	74,07	9,32

Phosphataufnahme unter Isonicotinsäureamid
Probe	Messwerte OD 820 nm korrigiert, d. h. abzgl. der OD 0,9%igen Kochsalzlösung			Mittelwert	S. D.	Mittelwert Pi-Aufnahme in % (K= 100%)	S. D. Pi Aufnahme in %
NaCl	0,08	0,112	0,094	0,095	0,016
KM	0,257	0,226	0,241	0,241	0,016	72,37	6,43
K	0,352	0,309	0,339	0,333	0,022	100,00	6,62
INA100	0,238	0,287	0,263	0,262	0,025	78,78	9,34
INA500	0,307	0,331	0,348	0,328	0,021	98,60	6,27
INA1000	0,321	0,369	0,335	0,342	0,025	102,56	7,20

Phosphataufnahme unter Thiaminhydrochlorid
Probe	Messwerte OD 820 nm korrigiert, d. h. abzgl. OD der 0,9%igen Kochsalzlösung			Mittelwert	S. D.	Mittelwert Pi-Aufnahme in % (K 100 %)	S. D. Pi Aufnahme in %
NaCl	0,08	0,112	0,094	0,095	0,016
KM	0,257	0,226	0,241	0,241	0,016	72,37	6,43
K	0,352	0,309	0,339	0,333	0,022	100,00	6,62
THC100	0,396	0,459	0,430	0,428	0,032	128,53	7,37
THC500	0,361	0,428	0,394	0,394	0,034	118,32	8,50
THC1000	0,330	0,394	0,362	0,362	0,032	108,61	8,85

Tab. 2: Tabellarische Darstellung aller Messwerte zur Phosphataufnahme unter dem Einfluss der drei verschiedenen Konzentrationen der drei verschiedenen Testsubstanzen.

Die Erfinder konnten anhand von Tierversuchen und mittels eines zellulären Testsystems nachweisen, dass Nicotinsäureamid die Aufnahme von Phosphat in die Zelle aus dem Plasma signifikant reduzieren kann und dadurch eine wirksame Substanz zur Behandlung und Prophylaxe von Arteriosklerose darstellt. Beeindruckenderweise ist Nicotinsäureamid die einzige Testsubstanz, die die Phosphataufnahme in die Zellen bei allen getesteten Konzentrationen reduziert.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Nicht-Patentliteratur

- Ketteler et al.: Novel insights into vascular calcification. Kidney. Int. Suppl. 2006 (105): 5–9 [0010]
- Ketteler et al.: Inhibitors of calcification: general aspects and implications in renal failure, Pediatr. Nephrol. 2005 20(3): 383–8 [0010]
- Criscuoli et al.: Glunicate (Lg 13979) protects the arterial wall from cholesterolinduced arterosclerotic changes in the rabbit without affecting plasma lipids. Arteriosclerosis 1984, 53: 59–68 [0013]
- Feinblatt et al.: Treatment of arteriosclerosis and vague abdominal distress with niacinamide hydroiodide (without side-effects). Amer. jour. Dig. Dis. 1955; Januar: 5–6 [0014]
- Eto et al.: Nicotinamide prevents the development of hyperphosphataemia by suppressing intestinal sodium-dependent phosphate transporter in rats with adenine-induced renal failure. Nephrol. Dial. Transplant. 2005; 20: 1378–1384 [0019]
- Tenenhouse H. S. und Chu Y. L.: Hydrolysis of nicotinamide-adenine dinucleotide by purified renal brush-border membranes. Mechanism of NAD+ inhibition of brushborder membrane phosphate-transport activity. Biochem. J. 1982; 204: 635–638 [0020]
- Crane und Low: Plasma membrane redox and control of sirtuin. Age 2005; 27: 147–152 [0024]
- Bitterman et al.: Inhibition of silencing and accelerated aging by nicotinamide, a putative negative regulator of yeast sir2 and human SIRT1. J. Biol. Chem. 2002; 277: 45099–45107 [0024]
- Kang et al.: Nicotinamide extends replicative lifespan of human cells. Aging Cell 2006; 5: 423–436 [0024]
- Bauer et al.: Lehrbuch der pharmazeutischen Technologie, 6. Aufl., Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH Stuttgart 1999 [0028]
- Rowe et al.: Handbook of pharmaceutical excipients 5. Aufl., Pharmaceutical Press and American Pharmacist Association 2006 [0028]

Claims

Verwendung von Nicotinsäureamid zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prävention von Arteriosklerose.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel für eine Applikation ausgebildet ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: oral, rektal, parenteral, lokal, transdermal.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel in einer Form ausgebildet ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Pulver, Tablette, Saft, Tropfen, Kapsel, Zäpfchen, Lösung, Injektionslösung, Aerosol, Salbe, Spülung, Pflaster, Pellet, Dragee.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel Nicotinsäureamid in einer Konzentration aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus (jeweils angegeben in Gewicht des Wirkstoffs Nicotinsäureamid bezogen auf das Gesamtgewicht des Arzneimittels): 1 μg/g, 10 μg/g, 100 μg/g, 1 mg/g, 10 mg/g, 100 mg/g, 1 g/g.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Absolutmenge des Wirkstoffs Nicotinsäureamid in einer Dosierungseinheit des Arzneimittels zwischen ca. 1 und ca. 3000 mg, vorzugsweise zwischen ca. 10 und ca. 1500 mg, weiter bevorzugt zwischen ca. 100 und ca. 750 mg, und höchst bevorzugt bei ca. 500 mg liegt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel zusätzlich eine weitere gegen Arteriosklerose wirksame Substanz aufweist.
Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die weitere Substanz ein Lipidsenker (Statin) ist.
Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Lipidsenker ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Atorvastatin, Cerivastatin, Fluvastatin, Lovastatin (Mevinolin), Mevastatin (Compactin), Pravastatin und Simvastatin.
Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prävention von Arteriosklerose, das die folgenden Schritte aufweist: (1) Bereitstellung von Nicotinsäureamid, und (2) Formulierung des Nicotinsäureamids in einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel für eine Applikation ausgebildet ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: oral, rektal, parenteral, lokal, transdermal.
Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel in einer Form ausgebildet ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Pulver, Tablette, Saft, Tropfen, Kapsel, Zäpfchen, Lösung, Injektionslösung, Aerosol, Salbe, Spülung, Pflaster, Pellet, Dragee.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel Nicotinsäureamid in einer Konzentration aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus (jeweils angegeben in Gewicht des Wirkstoffs Nicotinsäureamid bezogen auf das Gesamtgewicht des Arzneimittels): 1 μg/g, 10 μg/g, 100 μg/g, 1 mg/g, 10 mg/g, 100 mg/g, 1 g/g.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Absolutmenge des Wirkstoffs Nicotinsäureamid in einer Dosierungseinheit des Arzneimittels zwischen ca. 1 und ca. 3000 mg, vorzugsweise zwischen ca. 10 und ca. 1500 mg, weiter bevorzugt zwischen ca. 100 und ca. 750 mg, und höchst bevorzugt bei ca. 500 mg liegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel zusätzlich eine weitere gegen Arteriosklerose wirksame Substanz aufweist.
Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die weitere Substanz ein ein Lipidsenker (Stalin) ist.
Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass der Lipidsenker ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Atorvastatin, Cerivastatin, Fluvastatin, Lovastatin (Mevinolin), Mevastatin (Compactin), Pravastatin und Simvastatin.
Verfahren zur therapeutischen oder/und prophylaktischen Behandlung eines Lebewesens, das von Arteriosklerose betroffen ist oder/und bei dem die Gefahr von Arteriosklerose besteht, das folgende Schritte aufweist: (1) Bereitstellung von Nicotinsäureamid, (2) Einbringung des Nicotinsäureamids in das Lebewesen, und (3) ggf. mehrfaches Wiederholen der Schritte (1) und (2).